Name: Model in vitro ludzkich blizn przerostowych skóry z wykorzystaniem stłoczenia makromolekularnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj technikę stłoczenia makromolekularnego do tworzenia in vitro modelu ludzkich blizn przerostowych. Ta metoda pozwala badać zachowanie fibroblastów skórnych w środowisku przypominającym warunki in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez fundusze z Singapurskiej Agencji ds. Nauki, Technologii i Badań "SPF 2013/004: Biologia skóry Podstawowe badania" oraz "Innowacje w leczeniu ran w tropikach" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Autorzy dziękują za rady i pomoc dr Pauli Benny i dr Michaela Raghunatha.

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Utrzymuj hHSF i prawidłowe fibroblasty skóry pochodzące z tkanki niepatologicznej (hNSF) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1% v/v roztworu penicyliny/streptomycyny (P/S) w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2/95% powietrzem.</li>
	<li>Kup Ficoll 70, Ficoll 400 i kwas askorbinowy od odpowiednich firm.</li>
</ol>
2. Budowa modelu blizny przerostowej MMC
<ol>
	<li>Zasiaj hHSF lub hNSF (50 000 / dołek) na 24-dołkowej płytce zawierającej 1 ml pożywki w każdym dołku.</li>
	<li>Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37°C przy 5% CO2 i pozostawić na noc.</li>
	<li>Przygotuj nośnik programu MMC. W oparciu o całkowitą objętość wymaganą do eksperymentu, wyprodukuj 10% pożywki FCS/DMEM, mieszając Ficoll 70 (18,75 mg / ml), Ficoll 400 (12,5 mg / ml) i kwas askorbinowy (100 μM).</li>
	<li>Umieść mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 1 godzinę, aby rozproszyć tłumy w roztworze, a następnie wysterylizuj media MMC za pomocą filtra 0,2 μm.</li>
	<li>Odessaj zużyty nośnik i zastąp go świeżo wyprodukowanym nośnikiem MMC.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 6 dni w temperaturze 37°C i 5% CO2 , zmieniając pożywkę co 3 dni.</li>
</ol>
3. Wyrażenie całkowitej ilości kolagenu
<ol>
	<li>Przygotować czerwony roztwór Syriusza (0,1% w/v). Rozpuścić 0,2 g proszku Direct Red 80 w 200 ml destylowanej wody dejonizowanej (ddH2O) w 1 ml kwasu octowego.</li>
	<li>Odessać pożywkę MMC i dodać 300 μl roztworu Sirius Red do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 min.</li>
	<li>Delikatnie spłucz roztwór Sirius Red wodą z kranu i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez noc.</li>
	<li>Ekstrahuj czerwoną plamę Syriusza, dodając 200 μl wodorotlenku sodu (0,1 M) do każdej studzienki. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 5–10 minut, aby całkowicie usunąć czerwoną plamę Syriusza.</li>
	<li>Przenieść 100 μl wyekstrahowanego barwnika Sirius Red na przezroczystą płytkę 96-dołkową i zmierzyć absorbancję przy 620 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
</ol>
4. Ekspresja kolagenu I (barwienie immunologiczne)
<ol>
	<li>Umyć studzienki za pomocą 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH = 7,35).</li>
	<li>Utrwalić komórki za pomocą metanolu (500 μl/basenik) w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Blokuj niespecyficzne interakcje z 3% albuminą surowicy bydlęcej przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Odessać roztwór blokujący i inkubować z 200 μl przeciwciała antykolagenowego I (10 μg/ml) przez 90 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć 3x PBS przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Inkubować z 200 μl koziego przeciwciała drugorzędowego anty-królika-FITC (rozcieńczenie 1:400) i 4',6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI; rozcieńczenie 1:2000) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przykryć płytkę folią aluminiową.</li>
	<li>Odrzuć zarówno przeciwciało drugorzędowe, jak i DAPI i przemyj 3x PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Wizualizacja barwienia fluorescencyjnego bezpośrednio pod mikroskopem.</li>
</ol>
5. Western blotting
<ol>
	<li>Umyj komórki 2x PBS.</li>
	<li>Dodać 40 μl buforu do lizy do każdej studzienki i zeskrobać warstwę komórek końcówką pipety. Bufor do lizy zawiera bufor RIPA, koktajl inhibitorów proteazy (), 2 mM wanadan sodu i 10 mM fluorek sodu.</li>
	<li>Przenieś lizat białkowy do probówek mikrowirówkowych i zmierz stężenie białka za pomocą testu białka zgodnie z instrukcjami producenta16.</li>
	<li>Załaduj 10 μg białka z każdej grupy do studzienek z 4%-12% żelami białkowymi Bis-Tris. Wykonać elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) przy 200 V przez 30 minut.</li>
	<li>Przenieść białko do membrany nitrocelulozowej, uruchamiając western blot przy napięciu 90 V przez 90 minut. Unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza między żelem a membraną nitrocelulozową.</li>
	<li>Zablokuj membranę 10 ml buforu blokującego.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze 4°C przez noc. Podstawowymi przeciwciałami są: anty-kolagen I, anty-kolagen III, anty-kolagen IV, anty-αSMA, anty-MMP-1, anty-MMP-2, anty-MMP-9, anty-MMP-13 i dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego (GAPDH).</li>
	<li>Umyj membranę 0,1% TBS-Tween 20 (5x po 5 min). TBS/Tween 20 (1 L) zawiera: 50 ml 1 M Tris (pH = 7,4), 30 ml 5 M chlorku sodu, 1 ml Tween 20 i 920 ml ddH2O.</li>
	<li>Inkubować z odpowiednim dla gatunku przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Powtórz krok 5.8 i zwizualizuj fluorescencję za pomocą systemu obrazowania.</li>
</ol>
6. RT-PCR
<ol>
	<li>Zebrać całkowite RNA za pomocą buforu do lizy zmieszanego z 2-merkaptoetanolem zawartym w zestawie do oznaczania ekstrakcji RNA.</li>
	<li>Oczyść RNA zgodnie z instrukcjami producenta17.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.</li>
	<li>Wykonaj pierwszą syntezę nici cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Startery oligonukleotydowe RT-PCR są dostarczane (wstępnie powlekane) w niestandardowych płytkach 96-dołkowych. Wymieszaj 100 ng próbek cDNA z 10 μl zielonego supermiksu SYBR na niestandardową płytkę.</li>
	<li>Zwiększyć całkowitą objętość do 20 μl/studzienkę za pomocą ddH2O.</li>
	<li>Uruchom RT-PCR za pomocą termocyklera zgodnie z instrukcjami producenta: 40 cykli denaturacji w temperaturze 98°C przez 15 s i wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 60°C przez 60 s. Geny badane w RT-PCR to: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 i VEGF.</li>
</ol>

<ol><li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li>
<li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen%5Bmdash%5DThe+Role+of+Tissue+Transglutaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li>
<li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+TGF-beta+family+in+wound+healing%2C+burns+and+scarring%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Burns+and+Trauma%22%5BJournal%5D)">The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review.</a> International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+correlation+of+in+vivo+burn+scar+contraction+with+the+level+of+alpha-smooth+muscle+actin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression.</a> Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).</li>
<li>Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-depleted+fetal+bovine+and+human+sera+have+reduced+capacity+to+support+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373(2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+enhancement+of+collagen+matrix+formation+and+crosslinking+for+applications+in+tissue+engineering%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).</li>
<li>Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+macromolecular+crowding+can+do+to+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">What macromolecular crowding can do to a protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).</li>
<li>Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li>
<li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+Crowding+Directs+Extracellular+Matrix+Organization+and+Mesenchymal+Stem+Cell+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior.</a> PloS one. 7 (5), 37904(2012).</li>
<li>Chen, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Scar-in-a-Jar%3A+studying+potential+antifibrotic+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+%22macromolecular+crowding%22+in+vitro+to+investigate+the+naphthoquinones+shikonin%2C+naphthazarin+and+related+analogues+for+the+treatment+of+dermal+scars%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars.</a> Chemico-Biological Interactions. 310, 108747(2019).</li>
<li>Canty, E. G., Kadler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procollagen+trafficking%2C+processing+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis.</a> Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+Excluded+Volume+Interaction+between+an+Unfolded+Protein+and+Rigid+Macromolecular+Cosolutes%3A+Macromolecular+Crowding+and+Protein+Stability+Revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).</li>
<li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Linearization of the bradford protein assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), e1918(2010).</li>
<li>Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+RNeasy+Mini+Kit+to+obtain+high-quality+total+RNA+from+sessile+cells+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Medical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).</li>
<li>Xue, M., Jackson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+Reorganization+During+Wound+Healing+and+Its+Impact+on+Abnormal+Scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+wound+care+%28New+Rochelle%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring.</a> Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).</li>
<li>Rohani, M. G., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+remodeling+by+MMPs+during+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrix remodeling by MMPs during wound repair.</a> Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).</li>
<li>Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+in+patients+with+different+types+of+scars+and+keloids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).</li>
<li>Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Implications+of+the+IL-6+Signaling+Pathway+in+Keloid+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).</li>
<li>Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+scar+formation+by+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor.</a> Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).</li>
<li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li>
<li>Lago, J. C., Puzzi, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165(2019).</li>
<li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746(2016).</li>
<li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li>
<li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70(2015).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li>
<li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Protokół ten ma na celu optymalizację i uwierzytelnienie ulepszonego modelu in vitro "blizna w słoiku" dla ludzkiej tkanki bliznowatej skóry. Wcześniejsze badania donosiły o zastosowaniu techniki MMC do ludzkich fibroblastów płuc12, mezenchymalnych komórek macierzystych ludzkiego szpiku kostnego23 i ludzkich fibroblastów skóry23 przy użyciu dekstranu12, Ficollu12 i PVP23 jako cro...

Tkanka bliznowata reprezentuje punkt końcowy naprawy tkanki. Jednak u wielu osób, zwłaszcza tych cierpiących z powodu oparzeń lub urazów1, blizny mogą być nadmierne i wywierać niepożądany wpływ na morfologię i funkcjonowanie zagojonej skóry. Chociaż dokładne mechanizmy powstawania blizn patologicznych (blizny przerostowe i bliznowce) nie są w pełni poznane, wykazano, że nadmierne odkładanie się kolagenu podczas gojenia się ran jest istotnym wkładem2.
Jest powszechnie wiadomo, że transformujący czynnik wzrostu beta 1 (TGF-β1) i alfa aktyna mięśni gładkich (αSMA) odgrywają kluczową rolę w tworzeniu blizn przerostowych. Dowody sugerują, że podwyższony TGF-β1 bezpośrednio stymuluje nadmierne odkładanie kolagenu poprzez regulację szlaku sygnałowego SMAD3. Ponadto stwierdzono, że αSMA przyczynia się do powstawania blizn przerostowych poprzez regulację skurczu komórek i reepitelializacji w procesie gojenia się ran4. Brak odpowiednich modeli in vitro i in vivo jest główną przeszkodą w opracowywaniu i ocenie interwencji i terapii w celu remediacji blizn. Celem tego badania jest wykorzystanie istniejącej techniki MMC do skonstruowania "in vivo" modelu blizny przerostowej, który jest odpowiedni do oceny nowych i pojawiających się interwencji związanych z bliznami.
Rozmnażanie żywej tkanki poza ciałem było celem od lat w społeczności naukowej. Rozwój technik in vitro na początku XX wieku częściowo osiągnął ten cel. Obecne techniki in vitro nieznacznie ewoluowały od pierwotnej demonstracji Roux, że komórki embrionalne mogą przetrwać ex vivo przez kilka dni w ciepłym roztworze soli fizjologicznej5. Jednak metodologie in vitro są w większości ograniczone do pojedynczych typów komórek hodowanych w 2D i nie odzwierciedlają dokładnie tkanek in vivo. Chociaż jest to przydatne do badania biochemii komórek, fizjologii i genetyki, tkanki natywne są trójwymiarowe i zawierają wiele typów komórek. Proste systemy 2D in vitro poddają komórki ssaków wysoce sztucznemu środowisku, w którym zatracana jest natywna architektura specyficzna dla tkanki6. To z kolei wpływa na zdarzenia wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe, powodując nieprawidłową morfologię, fizjologię i zachowanie komórek7.
Zainteresowanie tym protokołem polega na rozwoju i klinicznym leczeniu blizn przerostowych i bliznowców. Chociaż powszechnie wiadomo, że fibroblasty skóry są w dużej mierze odpowiedzialne za obfitą produkcję kolagenu obecnego w tkance bliznowatej, hodowla fibroblastów skóry przy użyciu systemów 2D in vitro nie jest w stanie odtworzyć obrotu kolagenu obserwowanego in vivo8. Współczesne metody in vitro nadal zasadniczo wykorzystują "ciepłą sól fizjologiczną", środowisko zupełnie inne niż w żywych tkankach. Tkanki in vivo są niezwykle zatłoczone, a białka, kwasy nukleinowe, rybonukleoproteiny i polisacharydy zajmują od 5% do 40% całkowitej objętości. Ponieważ żadne dwie cząsteczki nie mogą zajmować tej samej przestrzeni w tym samym czasie, dostępna jest niewielka ilość wolnej przestrzeni i prawie całkowity brak wolnej wody9.
Technika MMC nakłada ograniczenia wpływające na właściwości termodynamiczne cytozolu i płynów śródmiąższowych. Interakcje molekularne, kompleksy sygnalizacyjne receptor-ligand, enzymy i organelle są ograniczone i nie mogą ze sobą swobodnie oddziaływać9. Interakcje w środowisku okołokomórkowym (tj. śródmiąższu) są również ograniczone. Najnowsze dowody potwierdzają, że wysokie stężenia obojętnych makrocząsteczek w zatłoczonych roztworach zaburzają dyfuzję, asocjację fizyczną, lepkość i właściwości hydrodynamiczne10.
Ciekawe, kilka popularnych czynników tłumiących (np. Ficoll, dextran, poliwinylopirolidon [PVP] i 4-styrenosulfonian sodu [PSS]) nie są równoważne, gdy są stosowane do różnych typów komórek i w różnych ustawieniach. W jednym z poprzednich badań stwierdzono, że Ficoll jest mniej cytotoksyczny dla mezenchymalnych komórek macierzystych w porównaniu z PVP. Wyniki te zostały zinterpretowane jako konsekwencja jego neutralnego ładunku i stosunkowo małego promienia hydrodynamicznego11. Natomiast drugie badanie wykazało, że dekstran jest bardziej skuteczny w stymulowaniu odkładania kolagenu I przez ludzkie fibroblasty płuc w porównaniu z Ficoll12. Dane z naszego własnego badania sugerują, że Ficoll zwiększa odkładanie kolagenu przez fibroblasty pochodzące z blizn przerostowych, podczas gdy PVP jest toksyczny dla tych komórek13.
Wykazano, że konwersja prokolagenu do kolagenu jest szybsza w bardzo zatłoczonym środowisku in vivo14, podczas gdy tempo reakcji biologicznych jest opóźnione w rozcieńczonym systemie hodowli 2-D15. Zoptymalizowaliśmy tutaj protokół in vitro, włączając MMC, aby pokazać hodowlę fibroblastów skóry służącej jako bardziej "in vivo" model zwłóknienia skóry i tworzenia blizn. W przeciwieństwie do powszechnego systemu hodowli 2D, hodowla hHSF z MMC znacznie stymuluje biosyntezę i odkładanie kolagenu13. Warto zauważyć, że inne cechy zwłóknienia (tj. zwiększona ekspresja metaloproteinaz macierzy [MMP] i cytokin prozapalnych) są również widoczne w tym zoptymalizowanym protokole MMC13. Podczas hodowli tą metodą wykazano, że komórki skóry właściwej podsumowują parametry fizjologiczne, biochemiczne i funkcjonalne mierzone in vivo.
Zoptymalizowany protokół MMC in vitro został wykorzystany do oceny ekspresji kolagenu i innych białek ECM przez fibroblasty skóry wyizolowane z przerostowej blizny skóry właściwej i niezaangażowanej sąsiedniej skóry właściwej. Podczas hodowli w środowiskach MMC in vitro zaobserwowano, że hHSF wyrażają pewne cechy (tj. mRNA, biochemię, fizjologię i fenotyp) podobne do przerostowej tkanki bliznowatej skóry in vivo. Dowody wskazują, że właściwości fizyczne i chemiczne są ważnymi czynnikami przy wyborze tłumników i optymalizacji warunków MMC do uprawy in vitro.
Dla dowodu zasady, protokół MMC jest tutaj stosowany do jakościowej i ilościowej oceny zdolności Shikoninu i jego analogów do wywoływania apoptozy. Pozwala to na ocenę potencjalnych zastosowań tych naturalnie pochodzących związków Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (TCM) do radzenia sobie z bliznami skórnymi13. Niezależnie od tego, prostota, opłacalność i terminowość tego protokołu MMC in vitro spełnia również najnowsze przepisy mające na celu wyeliminowanie eksperymentów na ssakach, wynikające z dyrektywy UE 2010/63/UE i amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (EPA).

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; Filtr m</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 800</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11371</td><td></td></tr><tr><td>pierwszorzędowe przeciwciało alfa aktyny mięśni gładkich (&alfa;SMA)</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym (termocykler)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Wako</td><td>#013-12061</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A2153</td><td></td></tr><tr><td>Test białka Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe kolagenu I (do barwienia immunologicznego)</td><td>Abcam</td><td>6308</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe kolagenu I (dla Western blot)</td><td>Abcam</td><td>ab21286</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe kolagenu III</td><td>Abcam</td><td>ab7778</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe kolagenu IV</td><td>Abcam</td><td>ab6586</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień bezpośrednia 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2610108</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11996-065</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>6000-044</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE HealthCare</td><td>#17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 70</td><td>GE HealthCare</td><td>#17-0310-10</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne GAPDH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Wtórne przeciwciało przeciw królikowi Kozie</td><td>Abcam</td><td>ab97050</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka blizna przerostowa/normalne fibroblasty (hHSF/hNSF)</td><td>Cell Research Corporation</td><td>106, 107, 108</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>#1708890</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe MMP-1</td><td>Abcam</td><td>ab38929</td><td></td></tr><tr><td>MMP-13 przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Abcam</td><td>ab39012</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe MMP-2</td><td>Abcam</td><td>ab37150</td><td></td></tr><tr><td>MMP-9 przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Abcam</td><td>ab38898</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometry mikroobjętościowe NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Bio-Rad</td><td>10484060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący Odyssey</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927&ndash; System obrazowania 40000</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey FC</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus IX-81 HCS (do barwienia immunologicznego)</td> <td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny (P/S)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Testy PrimePCR</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Indywidualne startery wstępnie powlekane w 96-dołkowe płytki w zależności od wymagań</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy ()</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>PVP 360</td><td>Sigma</td><td>#PVP360</td><td></td></tr><tr><td>PVP 40</td><td>Sigma</td><td>#PVP40</td><td></td></tr><tr><td>bufor RIPA</td><td>Merck</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>#74134</td><td></td></tr><tr><td>Wanadan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>Sód wanadan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Wielotrybowy czytnik mikropłytek SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced uniwersalny SYBR zielony supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5270</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

model in vitro ludzkich blizn przerostowych skóry z wykorzystaniem stłoczenia makromolekularnego

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Wykazano, że in vivo tkanki są bardzo zatłoczone przez białka, kwasy nukleinowe, rybonukleoproteiny, polisacharydy, itp. Poniższy protokół stosuje technikę stłoczenia makromolekularnego (MMC) w celu naśladowania tego fizjologicznego stłoczenia poprzez dodanie neutralnych polimerów (tłumów) do kultur komórkowych in vitro. Wcześniejsze badania z użyciem Ficollu lub dekstranu jako tłumów pokazują, że ekspresja kolagenu I i fibronektyny w liniach komórkowych WI38 i WS-1 jest znacznie zwiększona przy użyciu techniki MMC. Jednak technika ta nie została zwalidowana w pierwotnych fibroblastach ludzkiej skóry pochodzących z blizn przerostowych (hHSF). Ponieważ blizny przerostowe powstają w wyniku nadmiernego odkładania się kolagenu, protokół ten ma na celu skonstruowanie bogatego w kolagen modelu blizny przerostowej in vitro poprzez zastosowanie techniki MMC z hHSF. Wykazano, że ten zoptymalizowany model MMC ma więcej podobieństw z tkanką bliznowatą in vivo w porównaniu z tradycyjnymi dwuwymiarowymi (2D) systemami hodowli komórek. Ponadto jest opłacalny, efektywny czasowo i etycznie pożądany w porównaniu z modelami zwierzęcymi. W związku z tym opisany tutaj zoptymalizowany model oferuje zaawansowany model "podobny do in vivo" do badań związanych z bliznami przerostowymi.

W każdym eksperymencie wykonano próbki w trzech powtórzeniach, a każdy eksperyment powtórzono 3x z wykorzystaniem komórek od trzech poszczególnych pacjentów. Dane przedstawiono jako wartości procentowe w stosunku do grupy kontrolnej. Do analizy różnic statystycznych zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) oraz test post-hoc Tukeya (*p ˂ 0.05).
MMC z zastosowaniem Ficollu przy 9% FVO (ułamkowej objętości zajmowanej) zwiększa całkowitą ilość kolagenu oraz depozycję kolagen...

Ten protokół opisuje użycie makromolekularnego stłoczenia do stworzenia in vitro modelu ludzkiej przerostowej tkanki bliznowatej, która przypomina warunki in vivo. Uprawiane w zatłoczonym środowisku makromolekularnym fibroblasty ludzkiej skóry wykazują fenotypy, biochemię, fizjologię i cechy funkcjonalne przypominające tkankę bliznowatą.

Model in vitro ludzkich blizn przerostowych skóry z wykorzystaniem stłoczenia makromolekularnego

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Stworzyliśmy indywidualny model bogaty w kolagen, aby naśladować środowisko, którego doświadczają komórki in vivo, przy użyciu techniki stłoczenia makromolekularnego. Skóra jest zatłoczonym środowiskiem, w przeciwieństwie do środowiska płynnego, którego już używamy do hodowli komórek in vitro. W porównaniu z tradycyjnym jednowarstwowym systemem hodowli komórek, model ten odtwarza zatłoczone środowisko molekularne, którego doświadczają komórki in vivo, zwłaszcza w tkankach bliznowatych, w których obfita macierz zewnątrzkomórkowa wypiera wodę w stanie ciekłym.Oprócz blizn przerostowych, ta technika stłoczenia makromolekularnego może być stosowana do badań, w których macierz zewnątrzkomórkowa jest obfita, takich jak zwłóknienie płuc. Hoduj fibroblasty pochodzące z blizn i normalne zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Następnie zasiej je na 24 dołkach po 50 000 komórek na studzienkę w jednym mililitrze pożywki.Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przygotuj stłoczenie makromolekularne lub pożywki MMC, mieszając Ficoll 70, Ficoll 400 i kwas askorbinowy z 10% FCS DMEM. Inkubuj pożywkę w łaźni wodnej, aby rozproszyć tłumy w roztworze.Następnie wysterylizuj go filtrem 0,2 mikrometra. Odessać zużytą pożywkę z fibroblastów i zastąpić ją świeżo przygotowanymi pożywkami MMC. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć dni, zmieniając pożywkę MMC co trzy dni.Przygotuj roztwór Sirius Red, rozpuszczając 0,2 grama proszku Direct Red 80 w 200 mililitrach destylowanej wody dejonizowanej z jednym mililitrem kwasu octowego. Odessać pożywkę MMC z komórek i dodać 300 mikrolitrów roztworu Sirius Red do każdej studzienki. Następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 90 minut.Po inkubacji delikatnie spłucz roztwór Sirius Red wodą z kranu i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez noc. Następnego dnia wyekstrahuj Sirius Red, dodając 200 mikrolitrów 0,1-molowego wodorotlenku sodu do każdej studzienki i potrząsając płytką przez pięć do 10 minut. Przenieś 100 mikrolitrów wyekstrahowanej plamy na przezroczystą 96-dołkową płytkę i zmierz absorbancję przy 620 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek.Umyj każdą studzienkę 200 mikrolitrami PBS i utrwal komórki metanolem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodaj 3% BSA do dołków i inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór blokujący i dodać 200 mikrolitrów antykolagenu, jedno przeciwciało do każdej studzienki.Inkubować płytkę przez 90 minut. Następnie odessać przeciwciało i umyć studzienki trzy razy PBS przez pięć minut na mycie. Dodaj 200 mikrolitrów koziego przeciwciała wtórnego anty-królika-FITC i DAPI do każdej studzienki.Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić przeciwciało drugorzędowe i DAPI i powtórzyć płukanie z PBS. Następnie zwizualizuj fluorescencję bezpośrednio pod mikroskopem.Po dwukrotnym umyciu komórek PBS, dodaj 40 mikrolitrów buforu do lizy do każdej studzienki i zeskrob warstwę komórek końcówką pipety. Następnie przenieś lizat białkowy do mikroprobówek wirówkowych, aby zmierzyć stężenie białka. Załaduj 10 mikrogramów białka do każdej studzienki od czterech do 12% żelu białkowego Bis-Tris i wykonaj SDS-PAGE przy napięciu 200 woltów przez 30 minut.Po zakończeniu przenieś białko do membrany nitrocelulozowej, uruchamiając western blot przy napięciu 90 woltów przez 90 minut, uważając, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków między żelem a membraną. Zablokuj membranę za pomocą 10 mililitrów buforu blokującego. Następnie inkubuj go z przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia umyj membranę pięć razy 0,1% TBS Tween 20 przez pięć minut na pranie. Następnie inkubować błonę z odpowiednim dla gatunku przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz pranie i zwizualizuj fluorescencję za pomocą systemu obrazowania.Po oczyszczeniu całkowitego RNA za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA, zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Następnie użyj zestawu do syntezy cDNA, aby przeprowadzić syntezę pierwszej nici DNA. Wymieszaj cDNA z 10 mikrolitrami SYBR Green Supermix i przenieś próbki na niestandardową 96-dołkową płytkę wstępnie pokrytą starterami oligonukleotydowymi.Dostosuj całkowitą objętość do 20 mikrolitrów na studzienkę z wodą i uruchom RT-PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Gęstość komórek fibroblastów ludzkiej skóry pochodzących z blizn przerostowych znacznie wzrosła po hodowli za pomocą Ficoll w porównaniu z użyciem PVP lub kontroli. Stłoczenie makromolekularne z Ficollem przy 9% ułamkowym zajętości objętości znacznie poprawiło odkładanie się kolagenu, w tym kolagenu, w porównaniu z innymi preparatami.Zostało to dodatkowo wykazane za pomocą analizy ilościowej. Stwierdzono, że fibroblasty pochodzące z blizn i normalne fibroblasty skóry hodowane w środowiskach MMC regulują ekspresję gatunków ECM oprócz kolagenu. W szczególności stwierdzono, że zwiększona ekspresja metaloproteinaz macierzy lub MMP gromadzi się w przerostowych tkankach bliznowatych w porównaniu z tkankami natywnymi.Zaobserwowano, że ekspresja MMP2, dziewięciu i 13 była znacznie podwyższona w obu kulturach komórkowych hodowanych w warunkach stłoczenia makromolekularnego. MMP odgrywają ważną rolę podczas gojenia się ran i tworzenia blizn, regulując montaż i przebudowę ECM. Synteza interleukiny szóstej i czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych była niewykrywalna w western blot.Jednak analiza RT-PCR wykazała, że ekspresja interleukiny szóstej była znacznie regulowana w górę, podczas gdy ekspresja czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego była regulowana w dół w fibroblastach hodowanych w warunkach MMC. Podczas próbowania tego protokołu bardzo ważne jest, aby wybrać fibroblasty skóry, które mają bardzo mało patogenów CO. Musimy również pamiętać, że kwas askorbinowy jest niezbędnym składnikiem pożywki MMC.Jesteśmy szczególnie zainteresowani dalszym wykrywaniem osadzania się i wyrównania kolagenu w tym modelu MMC. Planujemy wykorzystać zaawansowane techniki mikroskopowe do porównania tego modelu in vitro z natywnymi tkankami bliznowatymi in vivo. Zachęcamy innych do stosowania tej techniki stłoczenia makromolekularnego w celu poprawy autentyczności in vitro pomocniczych tkanek modalnych.Oczywiście, stłoczenie makromolekularne może być również wykorzystane do ponownego obliczenia modeli chorób i patologii in vitro.

in-vitro-model-human-cutaneous-hypertrophic-scarring-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Celem tego protokołu jest opisanie generacji i analizy objętościowej unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry przy użyciu dostępnych i prostych technik dla długoterminowej hodowli. W miarę możliwości opisano uzasadnienie kroków, aby umożliwić badaczom dostosowanie ich do ich potrzeb badawczych.

Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowaną technikę oceny gojenia ran za pomocą ludzkiej skóry ex vivo w połączeniu z podejściem polegającym na barwieniu całego wierzchowania. Metodologia ta stanowi przedkliniczną platformę do oceny potencjalnych terapii ran.

Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry

Ten protokół opisuje wytwarzanie eksplantatu skórno-powięziowego, określanego jako "SCar like tissue in A Dish" lub SCAD. Model ten pozwala na niespotykaną dotąd wizualizację pojedynczych fibroblastów podczas tworzenia blizn.

Wizualizacja rozwoju blizn za pomocą testu SCAD - test bliznowacenia skóry ex-situ

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Ten protokół wyjaśni, jak ustanowić model myszy z bliznami przerostowymi, który zwiększa sygnalizację mechanotransdukcji, aby symulować blizny podobne do ludzkich. Metoda ta polega na zwiększeniu napięcia mechanicznego w poprzek gojącego się nacięcia u myszy i użyciu specjalistycznego urządzenia do stworzenia powtarzalnej, nadmiernej tkanki bliznowatej do szczegółowych analiz histologicznych i bioinformatycznych.

Mysi model napędzanych mechanotransdukcją, podobnych do ludzkich blizn przerostowych

Protokół ten określa metodę wytwarzania organoidów skóry zawierających mieszki włosowe pochodzące z ludzko indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, wykorzystując płaski, fizjologicznie istotny system hodowli powietrzno-cieczowy, aby odwzorować architekturę i funkcję skóry.

Generowanie ludzko indukowanych pluripotentnych pluripotentnych organoidów skórnych z komórek macierzystych z użyciem systemu hodowli powietrze-ciecz

Poznaj technikę stłoczenia makromolekularnego do tworzenia in vitro modelu ludzkich blizn przerostowych. Ta metoda pozwala badać zachowanie fibroblastów skórnych w środowisku przypominającym warunki in vivo.

Model in vitro ludzkich blizn przerostowych skóry z wykorzystaniem stłoczenia makromolekularnego

Przeglądaj więcej filmów