Model in vitro ludzkich blizn przerostowych skóry z wykorzystaniem stłoczenia makromolekularnego

Stworzyliśmy indywidualny model bogaty w kolagen, aby naśladować środowisko, którego doświadczają komórki in vivo, przy użyciu techniki stłoczenia makromolekularnego. Skóra jest zatłoczonym środowiskiem, w przeciwieństwie do środowiska płynnego, którego już używamy do hodowli komórek in vitro. W porównaniu z tradycyjnym jednowarstwowym systemem hodowli komórek, model ten odtwarza zatłoczone środowisko molekularne, którego doświadczają komórki in vivo, zwłaszcza w tkankach bliznowatych, w których obfita macierz zewnątrzkomórkowa wypiera wodę w stanie ciekłym.

Oprócz blizn przerostowych, ta technika stłoczenia makromolekularnego może być stosowana do badań, w których macierz zewnątrzkomórkowa jest obfita, takich jak zwłóknienie płuc. Hoduj fibroblasty pochodzące z blizn i normalne zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Następnie zasiej je na 24 dołkach po 50 000 komórek na studzienkę w jednym mililitrze pożywki.

Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przygotuj stłoczenie makromolekularne lub pożywki MMC, mieszając Ficoll 70, Ficoll 400 i kwas askorbinowy z 10% FCS DMEM. Inkubuj pożywkę w łaźni wodnej, aby rozproszyć tłumy w roztworze.

Następnie wysterylizuj go filtrem 0,2 mikrometra. Odessać zużytą pożywkę z fibroblastów i zastąpić ją świeżo przygotowanymi pożywkami MMC. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć dni, zmieniając pożywkę MMC co trzy dni.

Przygotuj roztwór Sirius Red, rozpuszczając 0,2 grama proszku Direct Red 80 w 200 mililitrach destylowanej wody dejonizowanej z jednym mililitrem kwasu octowego. Odessać pożywkę MMC z komórek i dodać 300 mikrolitrów roztworu Sirius Red do każdej studzienki. Następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 90 minut.

Po inkubacji delikatnie spłucz roztwór Sirius Red wodą z kranu i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez noc. Następnego dnia wyekstrahuj Sirius Red, dodając 200 mikrolitrów 0,1-molowego wodorotlenku sodu do każdej studzienki i potrząsając płytką przez pięć do 10 minut. Przenieś 100 mikrolitrów wyekstrahowanej plamy na przezroczystą 96-dołkową płytkę i zmierz absorbancję przy 620 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek.

Umyj każdą studzienkę 200 mikrolitrami PBS i utrwal komórki metanolem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodaj 3% BSA do dołków i inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór blokujący i dodać 200 mikrolitrów antykolagenu, jedno przeciwciało do każdej studzienki.

Inkubować płytkę przez 90 minut. Następnie odessać przeciwciało i umyć studzienki trzy razy PBS przez pięć minut na mycie. Dodaj 200 mikrolitrów koziego przeciwciała wtórnego anty-królika-FITC i DAPI do każdej studzienki.

Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić przeciwciało drugorzędowe i DAPI i powtórzyć płukanie z PBS. Następnie zwizualizuj fluorescencję bezpośrednio pod mikroskopem.

Po dwukrotnym umyciu komórek PBS, dodaj 40 mikrolitrów buforu do lizy do każdej studzienki i zeskrob warstwę komórek końcówką pipety. Następnie przenieś lizat białkowy do mikroprobówek wirówkowych, aby zmierzyć stężenie białka. Załaduj 10 mikrogramów białka do każdej studzienki od czterech do 12% żelu białkowego Bis-Tris i wykonaj SDS-PAGE przy napięciu 200 woltów przez 30 minut.

Po zakończeniu przenieś białko do membrany nitrocelulozowej, uruchamiając western blot przy napięciu 90 woltów przez 90 minut, uważając, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków między żelem a membraną. Zablokuj membranę za pomocą 10 mililitrów buforu blokującego. Następnie inkubuj go z przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia umyj membranę pięć razy 0,1% TBS Tween 20 przez pięć minut na pranie. Następnie inkubować błonę z odpowiednim dla gatunku przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz pranie i zwizualizuj fluorescencję za pomocą systemu obrazowania.

Po oczyszczeniu całkowitego RNA za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA, zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Następnie użyj zestawu do syntezy cDNA, aby przeprowadzić syntezę pierwszej nici DNA. Wymieszaj cDNA z 10 mikrolitrami SYBR Green Supermix i przenieś próbki na niestandardową 96-dołkową płytkę wstępnie pokrytą starterami oligonukleotydowymi.

Dostosuj całkowitą objętość do 20 mikrolitrów na studzienkę z wodą i uruchom RT-PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Gęstość komórek fibroblastów ludzkiej skóry pochodzących z blizn przerostowych znacznie wzrosła po hodowli za pomocą Ficoll w porównaniu z użyciem PVP lub kontroli. Stłoczenie makromolekularne z Ficollem przy 9% ułamkowym zajętości objętości znacznie poprawiło odkładanie się kolagenu, w tym kolagenu, w porównaniu z innymi preparatami.

Zostało to dodatkowo wykazane za pomocą analizy ilościowej. Stwierdzono, że fibroblasty pochodzące z blizn i normalne fibroblasty skóry hodowane w środowiskach MMC regulują ekspresję gatunków ECM oprócz kolagenu. W szczególności stwierdzono, że zwiększona ekspresja metaloproteinaz macierzy lub MMP gromadzi się w przerostowych tkankach bliznowatych w porównaniu z tkankami natywnymi.

Zaobserwowano, że ekspresja MMP2, dziewięciu i 13 była znacznie podwyższona w obu kulturach komórkowych hodowanych w warunkach stłoczenia makromolekularnego. MMP odgrywają ważną rolę podczas gojenia się ran i tworzenia blizn, regulując montaż i przebudowę ECM. Synteza interleukiny szóstej i czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych była niewykrywalna w western blot.

Jednak analiza RT-PCR wykazała, że ekspresja interleukiny szóstej była znacznie regulowana w górę, podczas gdy ekspresja czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego była regulowana w dół w fibroblastach hodowanych w warunkach MMC. Podczas próbowania tego protokołu bardzo ważne jest, aby wybrać fibroblasty skóry, które mają bardzo mało patogenów CO. Musimy również pamiętać, że kwas askorbinowy jest niezbędnym składnikiem pożywki MMC.

Jesteśmy szczególnie zainteresowani dalszym wykrywaniem osadzania się i wyrównania kolagenu w tym modelu MMC. Planujemy wykorzystać zaawansowane techniki mikroskopowe do porównania tego modelu in vitro z natywnymi tkankami bliznowatymi in vivo. Zachęcamy innych do stosowania tej techniki stłoczenia makromolekularnego w celu poprawy autentyczności in vitro pomocniczych tkanek modalnych.

Oczywiście, stłoczenie makromolekularne może być również wykorzystane do ponownego obliczenia modeli chorób i patologii in vitro.