Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Badania nad biologią ludzkich makrofagów są ograniczone, ponieważ opierają się na pobieraniu komórek od dawców. Protokół ten przedstawia metodę, w której możemy wyprodukować ludzkie makrofagi z pluripotencjalnych komórek macierzystych w laboratorium. Jest to solidny protokół, który można skalować w celu produkcji makrofagów w dużych ilościach do terapii komórkowych lub badań.

Pluripotencjalne komórki macierzyste mogą być genetycznie modyfikowane. Tak więc w tym protokole możemy generować makrofagi o określonym fenotypie, znaczniki fluorescencyjne, a także makrofagi do modelowania stanów chorobowych. Wizualna demonstracja tego protokołu jest przydatna, ponieważ korzystanie z narzędzia łatwego przejścia nie będzie znane wielu badaczom.

Również poziom staranności potrzebny podczas uzupełniania pożywki i zbierania komórek jest trudny do wyrażenia słowami. Gdy wyhodowane komórki osiągną 80% konfluencji, zastąp zużytą pożywkę hodowlaną 1,5 mililitra świeżej pożywki. Trzymając naczynie hodowlane w jednej ręce, przetocz jednorazowe narzędzie do pasażowania komórek po płytce w jednym kierunku.

Wszystkie ostrza w rolce muszą stykać się z płytą. Utrzymuj równomierny nacisk podczas toczenia. Powtarzaj zwijanie w tym samym kierunku, aż cała studzienka zostanie pokryta.

Obróć naczynie hodowlane o 90 stopni i powtórz walcowanie. Za pomocą sterylnej pipety użyj pożywki w studzince, aby usunąć wycięte kolonie. Odessać CELLstart i wymienić pożywkę.

Przenieść komórki w stosunku jeden do czterech do wstępnie powlekanych studzienek przygotowanych zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby rozpocząć proces różnicowania w dniu zero, dodaj 2,25 mililitra pożywki pierwszego stopnia do dwóch dołków sześciodołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu. Następnie, w przypadku jednej 80% zlewającej się studzienki iPSC w sześciodołkowej płytce, zastąp pożywkę konserwacyjną 1,5 mililitra pożywki pierwszego stopnia.

Wycinaj kolonie za pomocą nowego narzędzia do pasażowania komórek. Za pomocą pipety przenieś wycięte kolonie do dwóch dołków sześciodołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu. W drugim dniu dostosuj stężenia cytokin, dodając 0,5 mililitra pożywki hESC SFM do sześciodołkowej płytki zawierającej ciała zarodkowe drugiego dnia.

Czwartego dnia pokryj cztery studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej 0,1% żelatyny. Po inkubacji przez co najmniej 10 minut usuń żelatynę i dodaj 2,5 mililitra pożywki drugiego etapu. Zbierz uformowane ciała embrionów z dwóch dołków sześciodołkowej płytki i umieść je w 50-mililitrowej probówce wirówkowej.

Pozwól im osiąść na dnie rurki grawitacyjnie. Następnie ostrożnie odessać pożywkę z probówki i ponownie zawiesić ciała zarodków w dwóch mililitrach pożywki drugiego stopnia. Przenieś od 10 do 15 ciał zarodkowych do pokrytego żelatyną studzienki zawierającej 2,5 mililitra pożywki drugiego stopnia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Przez dwa do trzech tygodni zmieniaj nośnik co trzy do czterech dni. Poszycie EB ma kluczowe znaczenie. Posiadanie mniej niż 10 lub więcej niż 15 EB lub ich nierównomierne rozmieszczenie może prowadzić do niskiej wydajności makrofagów.

Po dwóch, trzech tygodniach ciała zarodkowe zaczynają uwalniać nieprzylegające komórki krwiotwórcze do zawiesiny. Za pomocą sitka o średnicy 40 mikrometrów zbierz te komórki do 50-mililitrowej probówki, a następnie uzupełnij pożywkę. Odwirować zawiesinę komórek krwiotwórczych w ilości 200 g przez trzy minuty.

Ponownie zawiesić komórki krwiotwórcze w pożywce trzeciego etapu. Następnie podaj komórki w gęstości 0,2 razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Zmieniaj nośnik etapu trzeciego co pięć dni.

Po dziewięciu do 11 dniach makrofagi będą w pełni zróżnicowane i w pełni funkcjonalne. Dodaj osiem razy 10 do czwartego makrofagów pochodzących z iPSC do 200 mikrolitrów pożywki trzeciego stopnia do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu kulek do każdej studzienki zawierającej makrofagi pochodzące z iPSC.

Użyj systemu obrazowania o wysokiej zawartości, aby zobrazować płytę. Zdobądź trzy lub więcej pól w każdej studni, aby uzyskać dobrą reprezentację. Kolonie iPSC, ciała zarodkowe, komórki zawiesiny krwiotwórczej i dojrzałe makrofagi były morfologicznie różne.

Makrofagi pochodzące z iPSC były duże, miały pojedyncze małe owalne jądra i obfitą cytoplazmę zawierającą wiele pęcherzyków. Fenotyp makrofagów oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Dojrzałe makrofagi pochodzące z iPSC wykazywały ekspresję markera linii CD45 i markera dojrzewania makrofagów 25F9 i były ujemne dla markera niedojrzałych makrofagów monocytów CD93.

Makrofagi pochodzące z iPSC wykazywały ekspresję kilku markerów szpikowych linii i były dodatnie dla markera modulacji immunologicznej CD86. Niewielka część makrofagów wykazywała ekspresję receptorów chemokinowych CX3CR1, CCR2, CCR5 i CCR8. Zdolność fagocytarną iPSC-DM oceniano za pomocą biocząstek i systemu obrazowania o wysokiej zawartości.

Biocząstki były niefluorescencyjne po dodaniu do kultur makrofagów, ale po fagocytozie fluoryzowały na jasnozielono w wewnątrzkomórkowym kwaśnym pH. Frakcja fagocytarna reprezentuje proporcję makrofagów, które fagocytozowały biocząstki, a indeks fagocytarny jest miarą liczby biocząstek, które spożył każdy makrofag. Makrofagi mogą zmieniać fenotyp w odpowiedzi na sygnały środowiskowe.

RT-PCR wykorzystano do ilościowego określenia podwyższonej ekspresji genów mRNA. Makrofagi traktowane LPS i interferonem gamma lub IL4 wykazywały znacznie niższy odsetek komórek fagocytarnych w porównaniu z wcześniejszymi makrofagami. Makrofagi leczone IL10 wykazały zwiększony odsetek komórek fagocytarnych i zwiększony indeks fagocytarny.

Protokół ten może być wykorzystany do zapewnienia gotowego źródła komórek do leczenia chorób, takich jak przewlekła choroba wątroby, w przypadku której wykazano, że makrofagi są terapeutyczne w modelach zwierzęcych. Makrofagi pochodzące z iPSC można wykorzystać do badania makrofagów związanych z kilkoma stanami chorobowymi. Na przykład używamy tych komórek do badania makrofagów związanych z nowotworami w raku piersi.

Zmodyfikowaliśmy fenotyp makrofagów pochodzących z iPSC poprzez programowanie genetyczne przy użyciu pojedynczego czynnika transkrypcyjnego o nazwie KLF1. W ten sposób wyprodukowaliśmy makrofagi, które wyglądają jak makrofagi wysp erytroidalnych i dostarczyły informacji na temat produkcji i dojrzewania czerwonych krwinek.