Name: Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych. Ta technika umożliwia badanie biologii rotawirusów i rozwój wektorów ekspresyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH R03 AI131072 i R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding oraz Lawrence M. Blatt Endowment. Dziękujemy członkom laboratorium IU Rotahoosier, Ulrichowi Desselbergerowi i Guido Papa za ich wkład i sugestie w opracowaniu protokołu genetyki odwrotnej.

<ol><li>Crawford, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).</li>
<li>Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+model+of+an+infectious+rotavirus+particle%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic model of an infectious rotavirus particle.</a> The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).</li>
<li>International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://talk.ictvonline.org/taxonomy">https://talk.ictvonline.org/taxonomy</a> (2019).</li>
<li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Health+Organization-Coordinated+Global+Rotavirus+Surveillance+Network.+Global%2C+regional%2C+and+national+estimates+of+rotavirus+mortality+in+children+%3C5+years+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age.</a> Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).</li>
<li>Troeger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+vaccination+and+the+global+burden+of+rotavirus+diarrhea+among+children+younger+than+5+years%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years.</a> JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).</li>
<li>Matthijnssens, J., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+constellation+and+evolution+of+group+A+rotaviruses+infecting+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans.</a> Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).</li>
<li>McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassortment+in+segmented+RNA+viruses%3A+mechanisms+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).</li>
<li>Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+diversity+and+evolution+in+the+post-vaccine+world%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world.</a> Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entirely+plasmid-based+reverse+genetics+system+for+rotaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).</li>
<li>Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+coupling+of+virion+assembly+and+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).</li>
<li>Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intraparticle+synthesis+of+the+rotavirus+double-stranded+RNA+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).</li>
<li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+rotaviruses+expressing+fluorescent+proteins+by+using+an+optimized+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system.</a> Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).</li>
<li>Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+selection+mechanisms+drive+efficient+single-gene+reverse+genetics+for+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).</li>
<li>Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+non-structural+rotavirus+proteins%2C+NSP2+and+NSP5%2C+form+viroplasm-like+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo.</a> Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).</li>
<li>Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+rotavirus+NSP2%2FNSP5+interactions+and+the+dynamics+of+viroplasm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation.</a> Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).</li>
<li>Kawagishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+system+for+a+human+group+A+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics system for a human group A rotavirus.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+infectious+recombinant+human+rotaviruses+from+just+11+cloned+cDNAs+encoding+the+rotavirus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome.</a> Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).</li>
<li>Mohanty, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point+mutation+in+the+rhesus+rotavirus+VP4+protein+generated+through+a+rotavirus+reverse+genetics+system+attenuates+biliary+atresia+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model.</a> Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).</li>
<li>Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genetically+stable+recombinant+rotaviruses+containing+novel+genome+rearrangements+and+heterologous+sequences+by+reverse+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics.</a> Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).</li>
<li>Duarte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection+alters+splicing+of+the+stress-related+transcription+factor+XBP1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).</li>
<li>Philip, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+rotavirus+expressing+NSP3-UnaG+fusion+protein+by+a+simplified+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system.</a> Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).</li>
<li>Papa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+rotaviruses+rescued+by+reverse+genetics+reveal+the+role+of+NSP5+hyperphosphorylation+in+the+assembly+of+viral+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+system+demonstrates+that+rotavirus+nonstructural+protein+NSP6+is+not+essential+for+viral+replication+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture.</a> Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).</li>
<li>Philip, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+recombinant+rotaviruses+expressing+fluorescent+reporter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Resource+Announcements%22%5BJournal%5D)">Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins.</a> Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+stable+rotavirus+reporter+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of stable rotavirus reporter expression systems.</a> Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).</li>
<li>Donnelly, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27cleavage%27+activities+of+foot-and-mouth+disease+virus+2A+site-directed+mutants+and+naturally+occurring+%272A-like%27+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences.</a> Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).</li>
<li>Kumagai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bilirubin-inducible+fluorescent+protein+from+eel+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle.</a> Cell. 153, 1602-1611 (2013).</li>
<li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+microbiological+and+biomedical+laboratories+%28BMBL%29%2C+5th+edition%22">Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition</a>. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).</li>
<li>Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing%2C+storage%2C+and+quantification+of+rotaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Culturing, storage, and quantification of rotaviruses.</a> Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).</li>
<li>Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+is+associated+with+the+rotavirus+capsid+and+is+activated+by+solubilization+of+outer+capsid+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins.</a> Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W naszym laboratorium rutynowo polegamy na opisanym tutaj protokole genetyki odwrotnej w celu wytworzenia rekombinowanych rotawirusów SA11. Dzięki takiemu podejściu osoby z niewielkim doświadczeniem w technikach biologii molekularnej lub pracy z rotawirusami odzyskują rekombinowane wirusy już przy pierwszej próbie. Wygenerowano blisko 100 rekombinowanych wirusów zgodnie z tym protokołem, w tym te z genomami, które zostały przeprojektowane w celu ekspresji obcych białek (np. FP) i które zawierają dodatki sekwencji, delecj...

Rotawirusy są głównymi przyczynami ciężkiego zapalenia żołądka i jelit u niemowląt i małych dzieci, a także u młodych wielu innych gatunków ssaków i ptaków1. Jako członkowie rodziny Reoviridae, rotawirusy mają segmentowany genom dwuniciowego RNA (dsRNA). Segmenty genomu są zawarte w bezotoczkowym dwudziestościennym wirionie utworzonym z trzech koncentrycznych warstw białka2. Na podstawie sekwencjonowania i analizy filogenetycznej segmentów genomu zdefiniowano dziewięć gatunków rotawirusów (A−D, F−J)3. Szczepy zawierające rotawirusy typu A są odpowiedzialne za zdecydowaną większość chorób u ludzi4. Wprowadzenie szczepionek przeciwko rotawirusom do programów szczepień dziecięcych począwszy od ostatniej dekady jest skorelowane ze znacznym zmniejszeniem śmiertelności i zachorowalności na rotawirusy. Przede wszystkim liczba zgonów w dzieciństwie związanych z rotawirusami zmniejszyła się z około 528 000 w 2000 r. do 128 500 w 2016 r4,5. Szczepionki przeciwko rotawirusom są opracowywane z żywych atenuowanych szczepów wirusa, przy czym dzieciom do 6 miesiąca życia podaje się od 2 do 3 dawek. Duża liczba genetycznie zróżnicowanych szczepów rotawirusów krążących wśród ludzi i innych gatunków ssaków, w połączeniu z ich zdolnością do szybkiej ewolucji poprzez mutagenezę i reasortację, może prowadzić do zmian antygenowych w typach rotawirusów infekujących dzieci6,7,8. Takie zmiany mogą podważyć skuteczność istniejących szczepionek, wymagając ich wymiany lub modyfikacji.
Dopiero niedawno udało się osiągnąć rozwój w pełni opartych na plazmidach systemów genetyki odwrotnej, umożliwiających manipulację dowolnym z 11 segmentów genomu rotawirusa9. Dzięki dostępności tych systemów możliwe stało się odkrycie szczegółów molekularnych replikacji i patogenezy rotawirusów, opracowanie ulepszonych, wysokoprzepustowych metod badań przesiewowych dla związków przeciw rotawirusom oraz stworzenie nowych, potencjalnie skuteczniejszych klas szczepionek przeciwko rotawirusom. Podczas replikacji rotawirusa, zamknięte wirusowe (+)RNA nie tylko kierują syntezą białek wirusowych, ale także służą jako matryce do syntezy segmentów genomu potomstwa dsRNA10,11. Wszystkie opisane do tej pory systemy genetyki odwrotnej rotawirusów opierają się na transfekcji wektorów transkrypcyjnych T7 do linii komórkowych ssaków jako źródła (+)RNA pochodzących z cDNA, używanych do odzyskiwania rekombinowanych wirusów9,12,13. W wektorach transkrypcyjnych wirusowe cDNA o pełnej długości są umieszczane między rybozymem wirusa T7 w górę a rybozymem wirusa zapalenia wątroby typu delta (HDV) w taki sposób, że wirusowe (+) RNA są syntetyzowane przez polimerazę RNA T7, która zawiera autentyczne 5' i 3'-końce (<silna klasa = "xfig">Figura 1A). W systemie genetyki odwrotnej pierwszej generacji rekombinowane wirusy wytworzono poprzez transfekcję komórek nerki chomika młodego eksprymującego polimerazę RNA T7 (BHK-T7) z 11 wektorami transkrypcyjnymi T7 (pT7), z których każdy kierował syntezą unikalnego (+)RNA małpiego szczepu wirusa SA11 i trzech plazmidów ekspresyjnych promotora CMV, jednego kodującego białko fuzyjne p10FAST reowirusa ptaków i dwie podjednostki kodujące kompleks enzymów cappingujących wirusa krowianki D1R-D12L9. Rekombinowane wirusy SA11 generowane w transfekowanych komórkach BHK-T7 amplifikowano przez nadmierne wysiewanie komórkami MA104, linią komórkową dopuszczającą wzrost rotawirusa. Opisano zmodyfikowaną wersję systemu genetyki odwróconej pierwszej generacji, która nie używa już plazmidów pomocniczych12. Zamiast tego zmodyfikowany system z powodzeniem generuje rekombinowane rotawirusy po prostu poprzez transfekcję komórek BHK-T7 z 11 wektorami transkrypcyjnymi SA11 T7, z zastrzeżeniem, że wektory dla bloków budulcowych fabryki wirusa (wiroplazmy) (białka niestrukturalne NSP2 i NSP5) są dodawane na poziomach 3-krotnie wyższych niż inne wektory14,15. Opracowano również zmodyfikowane wersje systemu genetyki odwrotnej, które wspierają regenerację ludzkich szczepów rotawirusa KU i Odelia16,17. Genom rotawirusa jest niezwykle podatny na manipulacje za pomocą odwrotnej genetyki, z rekombinowanymi wirusami wygenerowanymi do tej pory z mutacjami wprowadzonymi do VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, oraz NSP522,23. Do najbardziej użytecznych wirusów wygenerowanych do tej pory należą te, które zostały zaprojektowane do ekspresji fluorescencyjnych białek reporterowych (FPs)9,12,21,24,25.
W tej publikacji przedstawiamy protokół dla systemu genetyki odwrotnej, którego używamy w naszym laboratorium do generowania rekombinowanych szczepów rotawirusa SA11. Kluczową cechą naszego protokołu jest kotransfekcja komórek BHK-T7 z 11 wektorami transkrypcyjnymi pT7 (zmodyfikowanymi tak, aby obejmowały 3-krotne poziomy wektorów pT7/NSP2SA11 i pT7/NSP5SA11) oraz wektorem ekspresyjnym CMV kodującym enzym cappingujący wirusa afrykańskiego pomoru świń (ASFV) NP868R21 (Rysunek 2). W naszych rękach obecność plazmidu NP868R prowadzi do wytwarzania wyższych mian rekombinowanych wirusów przez transfekowane komórki BHK-T7. W tej publikacji przedstawiamy również protokół modyfikacji plazmidu pT7/NSP3SA11 w taki sposób, aby można było wytworzyć rekombinowane wirusy, które wyrażają nie tylko produkt białkowy segmentu 7 NSP3, ale także oddzielny FP. Osiąga się to poprzez przeprojektowanie otwartej ramki odczytu NSP3 (ORF) w plazmidzie pT7/NSP3SA11 tak, aby zawierała dalszy translacyjny element zatrzymujący-restartujący 2A, po którym następuje FP ORF (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B) 24,26. Dzięki takiemu podejściu wygenerowaliśmy rekombinowane rotawirusy wykazujące ekspresję różnych FP: UnaG (zielony), mKate (daleki czerwony), mRuby (czerwony), TagBFP (niebieski), CFP (cyjan) i YFP (żółty)24,27,28. Te rotawirusy z ekspresją FP są wytwarzane bez usuwania ORF NSP3, co daje wirusy, które mają kodować pełny zestaw funkcjonujących białek wirusowych.

<table><tbody><tr><td>Nerka chomika - T7 RdRP (BHK-T7) Kontakt z komórkami</td><td></td><td></td><td>: ubuchholz@niaid.nih.gov</td></tr><tr><td>Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Poliakrylamid Mini-Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>45608105</td><td></td></tr><tr><td>Celometr AutoT4 Żywotny licznik komórek</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System obrazowania żelu</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MP</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>Przejrzystość Zachodni Wzmocniony substrat chemiluminescencji (ECL)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5060</td><td></td></tr><tr><td>Kompetentne bakterie E.coli DH5alpha</td><td>Lucigen</td><td>60602-2</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny inhibitor proteazy</td><td>Pierce</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety transferowe, ultracienkie przedłużone końcówki</td><td>MTC Bio</td><td>P4113-11</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)</td><td>Quality Biological</td><td>115-073-101</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Absolutny (200 proof)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny (10 mg / ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowane termicznie</td> przeciwciało <td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Flag M2, mysi monoklonalny</td><td>zestaw plazmidowy Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>GenEluate HP Plasmid Midiprep</td><td>Sigma</td><td>NA0200-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin (G-418)</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Gibco FluroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td>DMEM z niskim tłem fluorescencja</td></tr><tr><td>Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM)</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Królicza, Peroksydaza Chrzanowa (HRP) Sprzężona</td><td>technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Świnka morska Anti-NSP3 Antysurowica</td><td>Pattona partia laboratoryjna</td><td>55068</td><td></td></tr><tr><td>Świnka morska Anti-VP6 Antierum</td><td>Patton lab</td><td>lot 53963</td><td></td></tr><tr><td>Koń Anty-Pig PigG Świnia Morska, Peroksydaza chrzanowa (HRP) Sprzężona</td><td>KPL</td><td>5220-0366</td><td></td></tr><tr><td>Końska IgG Przeciw Myszy, eroksydaza chrzanowa (HRP) Sprzężona</td><td>technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>iNtRON Biotechnologia e-Myco Mycoplasma PCR Detection</td><td>JH Science</td><td>25235</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Macron</td><td>3032-02</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy ( 100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Luria Agar Powder (Miller's LB Agar)</td><td>Produkty badawcze RPI</td><td>L24020-2000.0</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 (M199) Pożywka</td> hodowlana <td>Hyclon</td><td>Sh30253.01</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM)</td><td>Lonza</td><td>04-719Q</td><td></td></tr><tr><td>Komórki Monkey Kidney (MA104)</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-2378.1</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop One</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutralny czerwony roztwór (0,33%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N2889-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Nieistotny roztwór aminokwasów (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10% Tris-glicynowy mini-żel poliakryloamidowy</td><td>Invitrogen</td><td>XP00102BOX</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy biologii molekularnej bez nukleaz</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia żelu NucleoSpin i PCR</td><td>Takara</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Zredukowane podłoże surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek do granulek (bez RNaz, jednorazowe)</td><td>Fisher</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny, (100x penn-strep)</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan Buforowana sól fizjologiczna (PBS), 10x</td><td>Bioodczynniki Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna wieprzowa, typ IX-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0303</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>SA11 pT7 Wektory transkrypcyjne</td><td>Addgene</td><td>89162-89172</td><td></td></tr><tr><td>SA11 pT7 / NSP3 Wektory transkrypcyjne wyrażające białka</td><td></td><td></td> fluorescencyjne <td>Kontakt: jtpatton@iu.edu</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50000</td><td>Do elektroforezy</td></tr><tr><td>żelowej SeaPlaque agaroza</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>Do oznaczania</td></tr> <tr><td>płytki nazębnejIndeks górny III Jednoetapowy zestaw RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>12574-035</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transferu nitrocelulozy Trans-Blot Turbo</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4270</td><td></td></tr><tr><td>System Turbotransferu Trans-Llot</td><td>Odczynnik</td> do transfekcji Trans-Rad <td></td><td></td></tr><tr><td>Mirus</td><td></td><td>MIR2306</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine-SDS Żelowy bufor do biegania (10x)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0772</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Bioodczynniki Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do ekstrakcji RNA Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (0,05%)-EDTA (0,1%) Jakość roztworu do dysocjacji komórek</td><td>Biologiczny</td><td>118-087-721</td><td></td></tr><tr><td>Rosół z fosforanu tryptozy</td><td>Gibco</td><td>18050-039</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>VWR</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>Rozpuszczalnik Vertrel VF</td><td>Zoro</td><td>G0707178</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny obrazownik żywych komórek</td><td>Zoe Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins

Rotawirusy to duża i rozwijająca się populacja segmentowanych dwuniciowych wirusów RNA, które powodują ciężkie zapalenie żołądka i jelit u młodych ssaków i ptaków, w tym u ludzi. Wraz z niedawnym pojawieniem się systemów odwróconej genetyki rotawirusów, możliwe stało się wykorzystanie mutagenezy ukierunkowanej do badania biologii rotawirusów, modyfikowania i optymalizacji istniejących szczepionek przeciwko rotawirusom oraz opracowywania wielodocelowych wektorów szczepionkowych rotawirusów. W tym raporcie opisujemy uproszczony system genetyki odwrotnej, który umożliwia wydajną i niezawodną regenerację rekombinowanych rotawirusów. System opiera się na kotransfekcji wektorów transkrypcyjnych T7 wyrażających pełnowymiarowe RNA rotawirusa (+) oraz wektora CMV kodującego enzym cappingujący RNA do komórek BHK konstytutywnie wytwarzających polimerazę T7 RNA (BHK-T7). Rekombinowane rotawirusy są amplifikowane przez nadmierne wysiewanie transfekowanych komórek BHK-T7 komórkami MA104, linią komórkową nerki małpy, która jest wysoce pobłażliwa dla wzrostu wirusa. W tym raporcie opisujemy również podejście do generowania rekombinowanych rotawirusów, które wyrażają oddzielne fluorescencyjne białko reporterowe poprzez wprowadzenie translacyjnego elementu zatrzymania-ponownego uruchomienia 2A do segmentu genomu 7 (NSP3). Takie podejście pozwala uniknąć usuwania lub modyfikowania którejkolwiek z otwartych ramek odczytu wirusa, umożliwiając w ten sposób produkcję rekombinowanych rotawirusów, które zachowują w pełni funkcjonalne białka wirusowe podczas ekspresji białka fluorescencyjnego.

Protokół genetyki odwrotnej opisany w niniejszym artykule składa się z kilku odrębnych etapów: (1) kotransfekcji komórek BHK-T7 wektorami transkrypcyjnymi pT7 rotawirusa oraz plazmidem ekspresyjnym pCMV/NP868R, (2) nadnaczytania przetransfekowanych komórek BHK-T7 komórkami MA104, (3) amplifikacji wirusów rekombinowanych obecnych w lizatach komórek BHK-T7/MA104 przy użyciu komórek MA104 oraz (4) izolacji wirusa rekombinowanego metodą płytek przy użyciu komórek MA104 (Rycina 2). W naszych bada...

Generowanie rekombinowanych rotawirusów z plazmidowego DNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania replikacji i patogenezy rotawirusów oraz rozwoju wektorów ekspresyjnych rotawirusów i szczepionek. W niniejszym artykule opisano uproszczone podejście genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych rotawirusów, w tym szczepów eksprymujących fluorescencyjne białka reporterowe.

Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian ...

Protokół ten opisuje niezawodny i wydajny system genetyki odwrotnej do wytwarzania rekombinowanych rotawirusów. Wyjaśniono również, jak wytwarzać rekombinowane rotawirusy, które wyrażają fluorescencyjne białka markerowe. Ta metoda jest prosta, wymaga minimalnej liczby plazmidów i może generować rekombinowane rotawirusy, które wyrażają oddzielne białka fluorowe, a także białka wirusowe.Zacznij od wysiewu komórek BHKT7 na 12-dołkowych płytkach. Przepłucz świeżo zlewającą się monowarstwę komórek za pomocą PBS. Następnie rozbić monowarstwę roztworem trypsyny-EDTA i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach kompletnego podłoża GMEM.Określ stężenie żywotnych komórek BHKT7 za pomocą błękitu trypanowego i automatycznego licznika komórek. Następnie wysiewaj dwa razy 10 do piątych komórek w jednym mililitrze GMEM do każdej studzienki 12-dołkowej płytki do hodowli komórek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez noc.Następnego dnia przygotuj mieszaninę plazmidu do transfekcji zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Następnie dodaj 110 mikrolitrów wstępnie podgrzanej zredukowanej pożywki surowicy do każdej mieszaniny plazmidów i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Do mieszaniny dodać 32 mikrolitry odczynnika do transfekcji.Wykonaj krótkie wirowanie po wirowaniu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. W międzyczasie przepłucz komórki BHKT7 dwoma mililitrami niekompletnego podłoża GMEM. Dodaj jeden mililitr niekompletnej pożywki SMEM do każdej studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora.Po 20-minutowej inkubacji użyj pipetora o pojemności 200 mikrolitrów, aby dodać mieszaninę transfekcji kropla po kropli do każdej studzienki. Delikatnie kołysz płytką i włóż ją z powrotem do inkubatora. Dwa dni po transfekcji przepłukać świeżo zlewającą się monowarstwę komórek MA104 za pomocą PBS.Rozbić monowarstwę roztworem trypsyny-EDTA i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach kompletnego podłoża DMEM. Policz komórki i dostosuj stężenie do ośmiu razy 10 do piątych komórek na mililitr niekompletnego podłoża DMEM. Dodaj kroplami 0,25 mililitra komórek MA104 do studzienek z transfekowanymi komórkami BHKT7.Dostosuj stężenie trypsyny do 0,5 mikrograma na mililitr, dodając 0,8 mikrolitra do jednego miligrama na mililitr roztworu podstawowego trypsyny do każdej studzienki. Rozcieńczyć pozostałe komórki MA104 do stężenia 1,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr w kompletnym pożywce DMEM i umieścić dwa mililitry w każdym dołku sześciodołkowej płytki. Sześć dni po transfekcji odzyskać rekombinowanego wirusa z transfekowanych komórek.Poddaj komórki BHKT7 MA104 trzem cyklom zamrażania/rozmrażania w sterylnych warunkach, przesuwając płytki między zamrażarką o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza a temperaturą pokojową. Przenieś lizaty do probówek o pojemności 1,5 mililitra. Wirować probówki przez 10 minut w temperaturze 500 razy g i czterech stopniach Celsjusza, aby osadzać resztki komórkowe.Zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj trypsynę do 100 mikrolitrów oczyszczonego lizatu komórkowego do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr i inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie przygotować 10-krotną serię seryjnych rozcieńczeń w zakresie od 10 do ujemnej od 10 do ujemnej siódemki w niekompletnym podłożu DMEM.Przepłukać monowarstwy MA104 dwukrotnie dwoma mililitrami PBS i raz niekompletnym podłożem DMEM. Dodaj 400 mikrolitrów rozcieńczeń lizatu po kolei do płytek i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, kołysząc co 10 do 15 minut, aby rozprowadzić rozcieńczenia po monowarstwie. Przygotuj roztwór nakładki MEM z agarozy, łącząc równe objętości wstępnie podgrzanego 2X EMEM z 1,5% stopioną i schłodzoną agarozą.Utrzymuj ten roztwór w temperaturze 42 stopni Celsjusza w łaźni wodnej i dostosuj stężenie trypsyny do 0,5 mikrograma na mililitr bezpośrednio przed umieszczeniem go na komórkach. Odsysać roztwory lizatu z płytki sześciodołkowej. Następnie przepłucz komórki raz dwoma mililitrami niekompletnego podłoża.Delikatnie dodaj trzy mililitry roztworu nakładki agarozy MEM na monowarstwę komórek w każdym dołku. Pozwól agarozie stwardnieć w temperaturze pokojowej. Następnie włóż płytki z powrotem do inkubatora.Trzy dni później przygotuj roztwór nakładki agarozy MEM, jak opisano wcześniej, i dodaj neutralną czerwień do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr bezpośrednio przed użyciem. Dodać dwa mililitry roztworu nakładki na istniejącą agarozę na płytkach sześciodołkowych. Poczekaj, aż agaroza stwardnieje i włóż płytkę z powrotem do inkubatora, upewniając się, że płytki są chronione przed światłem o neutralnym kolorze czerwonym.W ciągu następnych sześciu godzin zidentyfikuj blaszki rotawirusowe za pomocą kasetonu świetlnego. Użyj jednorazowych pipet transferowych, aby wybrać wyraźnie zdefiniowane płytki nazębne, odzyskując czopy agarozowe, które rozciągają się całkowicie do warstwy komórkowej. Wyrzuć zatyczkę do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 0,5 mililitra niekompletnego podłoża DMEM i wiruj próbkę przez 30 sekund.Amplifikować wyizolowanego wirusa płytki nazębnej eluowanego do pożywki przez namnażanie na monowarstwach MA104 lub kolbie AT25 z niekompletnym podłożem DMEM i 0,5 mikrograma na mililitr trypsyny. Dodaj 600 mikrolitrów oczyszczonych lizatów zakażonych komórek i 400 mikrolitrów tiocyjanianu guanidyny do 1,5 mililitrowych probówek wirówek. Wiruj je przez 30 sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu. Wiruj roztwór przez 30 sekund i inkubuj go przez trzy minuty. Po pięciominutowym mikrowirowaniu w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza, przenieś 550 mikrolitrów górnej fazy wodnej do świeżej probówki.Dodaj dwie objętości zimnego alkoholu izopropylowego i odwróć probówkę cztery do sześciu razy. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odwiruj go przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza.Odrzucić supernatant pozostawiając osad RNA. Umyj RNA, dodając jeden mililitr 75% etanolu do probówki, odwracając ją raz i odwirowując przez pięć minut w temperaturze 7,500 razy g i czterech stopniach Celsjusza. Po ostrożnym usunięciu etanolu pozostaw RNA do wyschnięcia na powietrzu przez pięć do 10 minut.Następnie rozpuść osad w 15 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Dodaj dwa mikrolitry buforu ładującego 6X DNA do 10 mikrolitrów rozpuszczonej próbki RNA. Załaduj go na prefabrykowany mini żel z 10% poliakryloamidu.Rozpuścić RNA przez elektroforezę w buforze tris-glicyny działającym przez dwie godziny pod stałym prądem 16 miliamperów. Po zakończeniu cyklu żelowego namocz żel przez pięć do 10 minut w wodzie zawierającej jeden mikrogram na mililitr bromku etydyny i wykryj segmenty genomu rotawirusa za pomocą transiluminatora UV. Ten protokół genetyki odwrotnej został wykorzystany do wygenerowania rekombinowanych wirusów SA11, które można łatwo zidentyfikować za pomocą testu płytki nazębnej na komórkach MA104, co pozwala na izolację płytki.Genomy dsRNA oczyszczonych z płytki nazębnej wirusów rSA11 typu dzikiego i SA11-UnaG ekstrahowano roztworem zawierającym fenol i tiocyjanian guanidyny, rozpuszczono przez elektroforezę na 10% żelu poliakryloamidowym i wykryto przez barwienie bromkiem etydyny. Zgodnie z oczekiwaniami, segment siódmy lub NSP3 dsRNA rSA11-UnaG migrował znacznie wolniej niż w przypadku dzikiego typu rSA11 ze względu na obecność sekwencji 2A-3xFLUnaG. Aby sprawdzić ekspresję białka fluorescencyjnego UnaG, komórki MA104 zostały zakażone wirusem typu dzikiego i rekombinowanego i zbadane za pomocą obrazowania żywych komórek.Analiza wykazała, że rSA11-UnaG wytwarzał zieloną fluorescencję, podczas gdy nie wykryto fluorescencji w komórkach zakażonych rSA11 typu dzikiego. Przeprowadzono analizę immunoblot w celu zbadania, czy element 2A rSA11-NSP3-2A-xflUnaG sprzyja ekspresji dwóch oddzielnych białek. Analiza wykazała, że NSP3-2A i 3xFL-UnaG rzeczywiście ulegały ekspresji jako oddzielne białka wskazujące na funkcjonalny element 2A.Aby pomyślnie odzyskać rekombinowanego rotawirusa, ważne jest, aby używać wysokiej jakości, dobrze utrzymanych komórek BHKT7 do transfekcji i komórek MA104 do nadmiernego wysiewu, a także dokładnych ilości wysoce czystych plazmidów. Chociaż protokół ten wyjaśnia, jak używać systemu genetyki odwrotnej do modyfikacji genu NSP3 rotawirusa, to samo podejście można zastosować do modyfikacji innych genów, takich jak SP1.

simplified-reverse-genetics-method-to-recover-recombinant-rotaviruses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oparty wyłącznie na infekcji komórek, który zwiększa wydajność produkcji rekombinowanego parwowirusa ponad 100-krotnie w porównaniu z innymi stosowanymi protokołami. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu nowego pomocniczego adenowirusa typu 5 zawierającego jednostkę transkrypcyjną VP parwowirusa (Ad-VP).

Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Wirus krowianki (VV) jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych i poprawie zdrowia ludzkiego. W tym artykule opisano prostą, bardzo wydajną metodę edycji genomu VV przy użyciu systemu CRISPR-Cas9.

Proste i skuteczne podejście do konstruowania zmutowanych wektorów wirusa krowianki

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

To jest metoda generowania "bezbliznowatych" rekombinowanych wirusów krowianki przy użyciu wyboru zakresu gospodarzy i wizualnej identyfikacji rekombinowanych wirusów.

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Ten protokół opisuje dynamikę infekcji wirusowych za pomocą rekombinowanego (r)SARS-CoV-2 z ekspresją lucyferazy i fluorescencji oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) u transgenicznych myszy K18 hACE2, aby przezwyciężyć potrzebę wtórnych podejść wymaganych do badania infekcji SARS-CoV-2 in vivo.

Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Poznaj uproszczoną metodę genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych. Ta technika umożliwia badanie biologii rotawirusów i rozwój wektorów ekspresyjnych.

Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

Przeglądaj więcej filmów