Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

Protokół ten opisuje niezawodny i wydajny system genetyki odwrotnej do wytwarzania rekombinowanych rotawirusów. Wyjaśniono również, jak wytwarzać rekombinowane rotawirusy, które wyrażają fluorescencyjne białka markerowe. Ta metoda jest prosta, wymaga minimalnej liczby plazmidów i może generować rekombinowane rotawirusy, które wyrażają oddzielne białka fluorowe, a także białka wirusowe.

Zacznij od wysiewu komórek BHKT7 na 12-dołkowych płytkach. Przepłucz świeżo zlewającą się monowarstwę komórek za pomocą PBS. Następnie rozbić monowarstwę roztworem trypsyny-EDTA i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach kompletnego podłoża GMEM.

Określ stężenie żywotnych komórek BHKT7 za pomocą błękitu trypanowego i automatycznego licznika komórek. Następnie wysiewaj dwa razy 10 do piątych komórek w jednym mililitrze GMEM do każdej studzienki 12-dołkowej płytki do hodowli komórek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez noc.

Następnego dnia przygotuj mieszaninę plazmidu do transfekcji zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Następnie dodaj 110 mikrolitrów wstępnie podgrzanej zredukowanej pożywki surowicy do każdej mieszaniny plazmidów i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Do mieszaniny dodać 32 mikrolitry odczynnika do transfekcji.

Wykonaj krótkie wirowanie po wirowaniu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. W międzyczasie przepłucz komórki BHKT7 dwoma mililitrami niekompletnego podłoża GMEM. Dodaj jeden mililitr niekompletnej pożywki SMEM do każdej studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora.

Po 20-minutowej inkubacji użyj pipetora o pojemności 200 mikrolitrów, aby dodać mieszaninę transfekcji kropla po kropli do każdej studzienki. Delikatnie kołysz płytką i włóż ją z powrotem do inkubatora. Dwa dni po transfekcji przepłukać świeżo zlewającą się monowarstwę komórek MA104 za pomocą PBS.

Rozbić monowarstwę roztworem trypsyny-EDTA i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach kompletnego podłoża DMEM. Policz komórki i dostosuj stężenie do ośmiu razy 10 do piątych komórek na mililitr niekompletnego podłoża DMEM. Dodaj kroplami 0,25 mililitra komórek MA104 do studzienek z transfekowanymi komórkami BHKT7.

Dostosuj stężenie trypsyny do 0,5 mikrograma na mililitr, dodając 0,8 mikrolitra do jednego miligrama na mililitr roztworu podstawowego trypsyny do każdej studzienki. Rozcieńczyć pozostałe komórki MA104 do stężenia 1,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr w kompletnym pożywce DMEM i umieścić dwa mililitry w każdym dołku sześciodołkowej płytki. Sześć dni po transfekcji odzyskać rekombinowanego wirusa z transfekowanych komórek.

Poddaj komórki BHKT7 MA104 trzem cyklom zamrażania/rozmrażania w sterylnych warunkach, przesuwając płytki między zamrażarką o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza a temperaturą pokojową. Przenieś lizaty do probówek o pojemności 1,5 mililitra. Wirować probówki przez 10 minut w temperaturze 500 razy g i czterech stopniach Celsjusza, aby osadzać resztki komórkowe.

Zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj trypsynę do 100 mikrolitrów oczyszczonego lizatu komórkowego do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr i inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie przygotować 10-krotną serię seryjnych rozcieńczeń w zakresie od 10 do ujemnej od 10 do ujemnej siódemki w niekompletnym podłożu DMEM.

Przepłukać monowarstwy MA104 dwukrotnie dwoma mililitrami PBS i raz niekompletnym podłożem DMEM. Dodaj 400 mikrolitrów rozcieńczeń lizatu po kolei do płytek i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, kołysząc co 10 do 15 minut, aby rozprowadzić rozcieńczenia po monowarstwie. Przygotuj roztwór nakładki MEM z agarozy, łącząc równe objętości wstępnie podgrzanego 2X EMEM z 1,5% stopioną i schłodzoną agarozą.

Utrzymuj ten roztwór w temperaturze 42 stopni Celsjusza w łaźni wodnej i dostosuj stężenie trypsyny do 0,5 mikrograma na mililitr bezpośrednio przed umieszczeniem go na komórkach. Odsysać roztwory lizatu z płytki sześciodołkowej. Następnie przepłucz komórki raz dwoma mililitrami niekompletnego podłoża.

Delikatnie dodaj trzy mililitry roztworu nakładki agarozy MEM na monowarstwę komórek w każdym dołku. Pozwól agarozie stwardnieć w temperaturze pokojowej. Następnie włóż płytki z powrotem do inkubatora.

Trzy dni później przygotuj roztwór nakładki agarozy MEM, jak opisano wcześniej, i dodaj neutralną czerwień do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr bezpośrednio przed użyciem. Dodać dwa mililitry roztworu nakładki na istniejącą agarozę na płytkach sześciodołkowych. Poczekaj, aż agaroza stwardnieje i włóż płytkę z powrotem do inkubatora, upewniając się, że płytki są chronione przed światłem o neutralnym kolorze czerwonym.

W ciągu następnych sześciu godzin zidentyfikuj blaszki rotawirusowe za pomocą kasetonu świetlnego. Użyj jednorazowych pipet transferowych, aby wybrać wyraźnie zdefiniowane płytki nazębne, odzyskując czopy agarozowe, które rozciągają się całkowicie do warstwy komórkowej. Wyrzuć zatyczkę do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 0,5 mililitra niekompletnego podłoża DMEM i wiruj próbkę przez 30 sekund.

Amplifikować wyizolowanego wirusa płytki nazębnej eluowanego do pożywki przez namnażanie na monowarstwach MA104 lub kolbie AT25 z niekompletnym podłożem DMEM i 0,5 mikrograma na mililitr trypsyny. Dodaj 600 mikrolitrów oczyszczonych lizatów zakażonych komórek i 400 mikrolitrów tiocyjanianu guanidyny do 1,5 mililitrowych probówek wirówek. Wiruj je przez 30 sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu. Wiruj roztwór przez 30 sekund i inkubuj go przez trzy minuty. Po pięciominutowym mikrowirowaniu w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza, przenieś 550 mikrolitrów górnej fazy wodnej do świeżej probówki.

Dodaj dwie objętości zimnego alkoholu izopropylowego i odwróć probówkę cztery do sześciu razy. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odwiruj go przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza.

Odrzucić supernatant pozostawiając osad RNA. Umyj RNA, dodając jeden mililitr 75% etanolu do probówki, odwracając ją raz i odwirowując przez pięć minut w temperaturze 7,500 razy g i czterech stopniach Celsjusza. Po ostrożnym usunięciu etanolu pozostaw RNA do wyschnięcia na powietrzu przez pięć do 10 minut.

Następnie rozpuść osad w 15 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Dodaj dwa mikrolitry buforu ładującego 6X DNA do 10 mikrolitrów rozpuszczonej próbki RNA. Załaduj go na prefabrykowany mini żel z 10% poliakryloamidu.

Rozpuścić RNA przez elektroforezę w buforze tris-glicyny działającym przez dwie godziny pod stałym prądem 16 miliamperów. Po zakończeniu cyklu żelowego namocz żel przez pięć do 10 minut w wodzie zawierającej jeden mikrogram na mililitr bromku etydyny i wykryj segmenty genomu rotawirusa za pomocą transiluminatora UV. Ten protokół genetyki odwrotnej został wykorzystany do wygenerowania rekombinowanych wirusów SA11, które można łatwo zidentyfikować za pomocą testu płytki nazębnej na komórkach MA104, co pozwala na izolację płytki.

Genomy dsRNA oczyszczonych z płytki nazębnej wirusów rSA11 typu dzikiego i SA11-UnaG ekstrahowano roztworem zawierającym fenol i tiocyjanian guanidyny, rozpuszczono przez elektroforezę na 10% żelu poliakryloamidowym i wykryto przez barwienie bromkiem etydyny. Zgodnie z oczekiwaniami, segment siódmy lub NSP3 dsRNA rSA11-UnaG migrował znacznie wolniej niż w przypadku dzikiego typu rSA11 ze względu na obecność sekwencji 2A-3xFLUnaG. Aby sprawdzić ekspresję białka fluorescencyjnego UnaG, komórki MA104 zostały zakażone wirusem typu dzikiego i rekombinowanego i zbadane za pomocą obrazowania żywych komórek.

Analiza wykazała, że rSA11-UnaG wytwarzał zieloną fluorescencję, podczas gdy nie wykryto fluorescencji w komórkach zakażonych rSA11 typu dzikiego. Przeprowadzono analizę immunoblot w celu zbadania, czy element 2A rSA11-NSP3-2A-xflUnaG sprzyja ekspresji dwóch oddzielnych białek. Analiza wykazała, że NSP3-2A i 3xFL-UnaG rzeczywiście ulegały ekspresji jako oddzielne białka wskazujące na funkcjonalny element 2A.

Aby pomyślnie odzyskać rekombinowanego rotawirusa, ważne jest, aby używać wysokiej jakości, dobrze utrzymanych komórek BHKT7 do transfekcji i komórek MA104 do nadmiernego wysiewu, a także dokładnych ilości wysoce czystych plazmidów. Chociaż protokół ten wyjaśnia, jak używać systemu genetyki odwrotnej do modyfikacji genu NSP3 rotawirusa, to samo podejście można zastosować do modyfikacji innych genów, takich jak SP1.