Ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie wiązania eukariotycznego patogenu ludzkiego norowirusa z bakteriami. Po wykonaniu wstępnego testu przyłączenia wirusa-bakterii, cytometria przepływowa jest stosowana do wykrywania bakterii związanych z wirusem w populacji.

Interakcje wirus-bakteria mogą być ważne dla powodzenia infekcji wirusowej i stymulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Jednak obecnie w laboratorium nie można wyprodukować wysoce skoncentrowanego i oczyszczonego materiału ludzkiego norowirusa. Technika ta może być stosowana w przypadku każdego wirusa, który wiąże się z bakteriami, dla których dostępne są cząsteczki wirusopodobne lub żywy wirus.

Pozwala nam to na ilościowe określenie interakcji między tymi wirusami i bakteriami. Zaszczepić pięć mililitrów płynnej pożywki pojedynczą izolowaną kolonią Enterobacter cloacae z płytki agarowej bezpośrednio z zamrożonego bulionu glicerynowego. Rozwijaj bakterie przez noc.

Następnego dnia przenieś 1,3 mililitra porcji kultury do dwóch oddzielnych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez pięć minut. Usunąć supernatanty, a następnie umyć próbki dwukrotnie, używając jednego mililitra sterylnego 1X PBS do każdego przemycia.

Ponownie odwirować próbki przy 10 000 x g przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1,3 mililitra sterylnego 1X PBS. Zaczynając od 0,5 mililitra umytej kultury, seryjnie rozcieńczaj bakterie w 1X PBS od 10 do minus jeden do 10 do minus cztery.

Za pomocą spektrofotometru zmierzyć gęstość optyczną przemytej, nierozcieńczonej kultury i każdego z czterech rozcieńczeń w temperaturze 600 nanometrów. Wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia w 1X PBS dla każdego z poprzednich rozcieńczeń. Rozprowadzić 100 mikrolitrów ostatnich trzech rozcieńczeń dla każdej serii na płytkach agarowych, aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr dla każdej próbki.

Pozostaw płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na pięć minut. Odwróć płytki i inkubuj je w inkubatorze. Po przygotowaniu odczynników, przeciwciał i bakterii zgodnie z opisem w manuskrypcie, zbierz wszystkie materiały w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2.

Cząsteczki wirusopodobne do ludzkiego norowirusa są wymienione jako patogeny BSL-2, a wszystkie prace wykonywane przy użyciu VLP powinny być wykonywane w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodać 10 mikrogramów ludzkich norowirusów VLP do każdej probówki z bakteriami i dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Inkubuj probówki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza ze stałą rotacją.

Po inkubacji odwirować probówki o masie 10 000 x g przez pięć minut. Odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w jednym mililitrze PBS. Po jednokrotnym powtórzeniu etapów mycia, należy ponownie odwirować probówki o stężeniu 10 000 X g przez pięć minut.

Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakterii VLP w 150 mikrolitrach 5% buforu blokującego. Częstym błędem, który występuje, jest zamiana rurek i dodanie niewłaściwej obróbki. Aby temu zapobiec, ułóż wszystkie probówki w liniach odpowiadających prawidłowemu leczeniu i dodaj jeden zabieg na raz do probówek.

Dla każdej próbki bakteryjnej należy przygotować 50 mikrolitrów rozcieńczonego ludzkiego przeciwciała GII przeciwko norowirusowi. Używając buforu blokującego 5%, rozcieńczyć przeciwciało jeden do 125 dla próbek E.cloacae. Przygotować 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała izotypowego dla każdej próbki bakteryjnej przy użyciu tych samych proporcji rozcieńczenia.

Podziel każdą próbkę testową załącznika na podwielokrotności o pojemności 350 mikrolitrów, przenosząc je do czystych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych. Aby utworzyć niebarwione kontrole, dodaj 50 mikrolitrów buforu blokującego do pierwszej porcji z każdej próbki bakteryjnej. W przypadku barwionych próbek dodać 50 mikrolitrów rozcieńczenia przeciwciała GII do drugiego zestawu podwielokrotności.

Utwórz kontrole izotypu, dodając 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała izotypu do trzeciego zestawu podwielokrotności. Inkubować wszystkie próbki na lodzie i w ciemności przez 30 minut. Następnie odwirować wszystkie próbki o stężeniu 10 000 x g przez pięć minut.

Odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić każdą próbkę w 150 mikrolitrach FCSB. Ponownie odwirować wszystkie próbki o masie 10 000 x g przez pięć minut. Ponownie wyrzucić supernatanty i ponownie zawiesić próbki w 100 mikrolitrach FCSB.

Po odwirowaniu próbek po raz ostatni i odrzuceniu supernatantów, ponownie zawiesić próbki w 150 mikrolitrach FCSB. Przenieść każdą próbkę do probówki zawierającej 400 mikrolitrów FCSB, co daje całkowitą objętość 550 mikrolitrów. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Przyłączenie VLP mierzono za pomocą cytometrii przepływowej. Najpierw wykorzystano wykresy zagęszczenia do odbramowania szczątków komórkowych, a następnie do bramkowania na wykresie kropkowym w celu usunięcia bakteryjnych dubletów i grudek komórkowych. Reprezentatywne histogramy wskazują na brak sygnału PE w próbkach zawierających wyłącznie bakterie oraz zmianę intensywności sygnału PE w próbkach VLP:bacterium w porównaniu z próbkami niebarwionymi i kontrolnymi izotypami.

Po godzinie inkubacji z 10 mikrogramami VLP, cytometria przepływowa wykryła wiązanie cząstek zarówno z E. colacae, jak i L. gasseri. Aby określić granicę kwantyfikacji wiązania dla tego testu, przed dodaniem do bakterii wygenerowano serię rozcieńczeń VLP. Zmniejszenie ilości VLP spowodowało odpowiednie zmniejszenie procentu bakterii związanych przez VLP.

Znajomość stosunku wirusa do bakterii i utrzymanie stałego stosunku między eksperymentami jest ważne w interpretacji wyników. Mutanty bakteryjne i wirusowe mogą być generowane w celu specyficznego określenia struktur powierzchniowych drobnoustrojów, które pośredniczą w tej interakcji. Technika ta pozwala naukowcom odpowiedzieć na pytania dotyczące okoliczności i warunków, które wpływają na interakcje norowirus-bakteria, w tym tego, jak zmiany w genotypie wirusa, warunki wzrostu bakterii i zmiany w strukturach powierzchni bakterii wpływają na wiązanie wirusa.