Name: Ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do ilościowego określania wiązania cząstek wirusopodobnych norowirusa z bakteriami komensalnymi. Technika umożliwia badanie interakcji wirus-bakteria bez użycia żywego wirusa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Sutonuce Bhar i Chanel Mosby-Haundrup za ich krytyczną recenzję pisemnego manuskryptu, a także Alfonso Carrillo za pomoc w generowaniu wzorcowych krzywych bakteryjnych. Praca ta jest częściowo finansowana z grantu z Narodowego Instytutu Zdrowia (R21AI140012) oraz z grantu nasiennego z Instytutu Nauk o Żywności i Rolnictwie Uniwersytetu Florydy.

UWAGA: Warunki wzrostu bakterii opisane w protokole są standardowymi warunkami hodowli dla Enterobacter cloacae i Lactobacillus gasseri. Aby przeprowadzić test przyłączenia wirusa-bakterii z innymi gatunkami bakterii, wybrane bakterie należy hodować w standardowych warunkach odpowiednich dla bakterii.
1. Przygotowanie pożywki do wzrostu bakterii
<ol>
	<li>Pożywka wzrostowa Enterobacter cloacae
	<ol>
		<li>Przygotować płynne podłoże, rozpuszczając 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g chlorku sodu (NaCl) w 1 l wody dejonizowanej (DI) (patrz tabela materiałów). Dokładnie wymieszaj wszystkie podłoża i sterylizuj w autoklawie przez 30 minut.</li>
		<li>Przygotować stałe podłoże, rozpuszczając 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl i 15 g agaru w 1 l wody detonowanej. Dokładnie wymieszaj wszystkie podłoża i sterylizuj w autoklawie przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywki wzrostowe Lactobacillus gasseri
	<ol>
		<li>Przygotować płynne podłoże, rozpuszczając 55 g proszku De Man, Rogosa i Sharpe (MRS; patrz tabela materiałów) w 1 l wody demineralizowanej. Pożywkę zużyć w ciągu miesiąca od przygotowania. Aby wysterylizować, podgrzewaj podłoże przez 15 minut, aż do wrzenia, a następnie autoklawuj przez 15 minut.</li>
		<li>Przygotować stałe podłoże, rozpuszczając 55 g proszku MRS i 15 g agaru w 1 l wody demineralizowanej. Aby wysterylizować, podgrzewaj podłoże przez 15 minut, aż do wrzenia, a następnie autoklawuj przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ustalanie krzywej standardowej korelującej gęstość optyczną (OD) i stężenie bakterii
<ol>
	<li>Zaszczepić 5 ml odpowiedniej płynnej pożywki pojedynczą, wyizolowaną kolonią z płytki agarowej (E. cloacae) lub bezpośrednio z zamrożonego bulionu glicerolowego (L. gasseri).</li>
	<li>Hodować bakterię przez noc, w odpowiednich warunkach atmosferycznych (Enterobacter cloacae: 37 °C z wytrząsaniem tlenowym przy 200 obr./min; L. gasseri: łaźnia wodna o temperaturze 37 °C bez wstrząsania w hermetycznym pojemniku).</li>
	<li>Przenieś 2 porcje po 1,3 ml hodowli przez noc do dwóch oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i odwiruj bakterie przy 10 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć próbki 1 ml sterylnego 1x buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS). Powtórz ten krok prania, w sumie 2 prania.</li>
	<li>Ponownie odwirować próbki przy 10 000 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1,3 ml sterylnego 1x PBS.</li>
	<li>Zaczynając od 0,5 ml umytej kultury, seryjnie rozcieńczaj bakterie w 1x PBS od 10-1 do 10-4.</li>
	<li>Za pomocą spektrofotometru zmierzyć gęstość optyczną przemytej, nierozcieńczonej kultury i każdego z czterech rozcieńczeń przy 600 nm (OD600).</li>
	<li>Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia w 1x PBS dla każdego rozcieńczenia z kroku 2.6. Rozprowadzić płytkę 100 μl ostatnich 3 rozcieńczeń dla każdej serii na odpowiednim podłożu stałym, aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr (CFU/ml) każdej próbki. Każde rozcieńczenie należy rozłożyć trzykrotnie.</li>
	<li>Pozostawić płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odwrócić płytki i inkubować w odpowiednich warunkach atmosferycznych (E. cloacae: tlenowy w temperaturze 37 °C, inkubować płytki przez noc; L. gasseri: beztlenowy w temperaturze 37 °C, inkubować płytki przez 48 godzin w hermetycznym pojemniku z beztlenowymi saszetkami powietrznymi (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Stosować 1 saszetkę z powietrzem beztlenowym na słoik o pojemności 2,5 l lub 3 saszetki na słoik o pojemności 7,0 l (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Użyj liczby płytek, aby oznaczyć jtk/ml dla każdej z 5 próbek (tj. nierozcieńczonych, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Wygeneruj krzywą wzorcową porównującą OD600 i CFU/ml. Równanie dla tej linii zostanie wykorzystane w testach przyłączania bakterii VLP do określenia CFU / ml na podstawie OD600.</li>
</ol>
3. Test przyłączenia bakterii VLP
UWAGA: VLP ludzkiego norowirusa stanowią zagrożenie na poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-2 i wszystkie prace związane z VLP powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przygotowanie kultur bakteryjnych przed przystąpieniem do próby przyłączania powinno być przeprowadzone w warunkach bezpieczeństwa odpowiednich dla organizmu.
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynnika
	<ol>
		<li>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
		<ol>
			<li>Przygotuj 1 l 10x PBS, rozpuszczając całe opakowanie w 1 l wody DI.</li>
			<li>Roztwór w autoklawie przez 30 min.</li>
			<li>Przygotuj 1x roztwór, rozcieńczając powyższy roztwór w stosunku 1:10 w wodzie DI.</li>
			<li>Filtr: wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,22 μm i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>5% BSA
		<ol>
			<li>Dodać 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w proszku do 100 ml PBS, aby uzyskać 5% (w/v) roztwór.</li>
			<li>Wymieszaj roztwór, wirując lub na płytce mieszającej za pomocą metalowego mieszadła, aż grudki się rozpuszczą.</li>
			<li>Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
			<li>Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bufor barwiący cytometrii przepływowej (FCSB)
		<ol>
			<li>Przefiltruj zakupiony FCSB (patrz tabela materiałów) przez filtr 0,22 μm.</li>
			<li>Pozostały roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>5% bufor blokujący (BB) 
		UWAGA: Za każdym razem przygotuj świeże.
		<ol>
			<li>Dodać 0,5 g BSA do 10 ml sterylnego FCSB.</li>
			<li>Wirować, aby całkowicie wymieszać próbkę i pozostawić na lodzie do użycia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Koniugacja przeciwciał
	<ol>
		<li>Sprzęż ludzkie przeciwciało GII przeciwko norowirusowi (patrz tabela materiałów) z r-fikoerytryną (PE) za pomocą zestawu do znakowania przeciwciał R-PE zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Sprzężone przeciwciało należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości w teście przyłączania bakterii VLP. 
		UWAGA: Przeciwciało pierwszorzędowe należy miareczkować przed użyciem w teście przyłączania bakterii VLP w celu określenia właściwego stężenia niezbędnego do analizy cytometrii przepływowej. Miareczkowanie przeciwciał należy wykonywać za każdym razem, gdy przeprowadzana jest reakcja koniugacji i dla każdej bakterii użytej w teście przyłączania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miareczkowanie przeciwciał
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć sprzężone przeciwciało GII przeciwko ludzkiemu norowirusowi 100-krotnie, z początkowym rozcieńczeniem 1:100 i końcowym 1:600 (w sumie sześć rozcieńczeń).</li>
		<li>Wykonać test przyłączenia wirusa zgodnie z poniższym opisem z następującym wyjątkiem: w kroku 3.5.7 ponownie zawiesić osad bakteryjny w 350 μl 5% BB.</li>
		<li>Podzielić próbkę na siedem podwielokrotności o objętości 50 μl.</li>
		<li>Dodać 50 μl każdego rozcieńczenia przeciwciała do jednej probówki.</li>
		<li>Dodaj 50 μl 5% BB do siódmej probówki jako niebarwioną kontrolę.</li>
		<li>Przeprowadzić cytometrię przepływową na wszystkich próbkach zgodnie z poniższym opisem.</li>
		<li>Porównaj rozcieńczone próbki przeciwciał z niebarwionymi kontrolami i ze sobą nawzajem. Najniższe stężenie przeciwciał, które nie powoduje spadku lub utraty sygnału dodatniego, powinno być wybrane do stosowania w kolejnych testach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bakterii
	<ol>
		<li>Hoduj bakterie w 40 ml odpowiedniej płynnej pożywki w odpowiednich warunkach atmosferycznych, aż bakterie znajdą się w fazie stacjonarnej.
		<ol>
			<li>Kultury E. cloacae hodować tlenowo przez noc w bulionie Luria w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min, aby osiągnąć fazę stacjonarną.</li>
			<li>Hodować kultury L. gasseri w bulionie MRS w czarnych probówkach z nakrętką bez wstrząsania w łaźni wodnej ustawionej na 37 °C przez 18 godzin, aby osiągnąć fazę stacjonarną.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przenieść kultury w fazie stacjonarnej do oczyszczenia stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować próbki o masie 2 288 x g przez 10 minut w celu osadzenia bakterii.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 13 ml sterylnego 1x PBS. Powtórz ten krok prania, w sumie dwa prania.</li>
		<li>Ponownie odwirować próbki, usunąć supernatant i ponownie zawiesić próbki w 20 ml 1x PBS. 
		UWAGA: Jeśli osad komórek jest mały, objętość ponownego zawieszenia można zmniejszyć.</li>
		<li>Zmierz OD600 kultury.</li>
		<li>Korzystając z wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej, oznacz jtk na ml przemytej kultury.</li>
		<li>Rozcieńczyć bakterie w razie potrzeby 1x PBS, aby dostosować stężenie kultury do 1 x 108 CFU/ml.</li>
		<li>Przenieść 1 ml kultury bakteryjnej 1 x 108 jtk/ml do wymaganej liczby probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad bakteryjny w 1 ml sterylnego 5% BSA.</li>
		<li>Inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C ze stałym obrotem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załącznik wirusa
	<ol>
		<li>Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2, dodaj 10 μg VLP HuNoV (patrz Tabela materiałów) do każdej probówki zawierającej bakterie zawieszone w PBS i dokładnie wymieszaj, pipetując. 
		UWAGA: Stężenie VLP różni się w zależności od preparatu VLP. W związku z tym objętość dodawana do bakterii będzie się różnić w zależności od partii preparatu i powinna być odpowiednio dostosowana, tak aby 10 μg było dodawane do każdej probówki w eksperymencie. W przypadku kontroli tylko bakterii (np. próbek bez VLP) dodać objętość PBS równą objętości VLP dodanej do próbek eksperymentalnych.</li>
		<li>Inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C ze stałą rotacją. 
		UWAGA: Podczas inkubacji używany jest rewolwer rurowy (patrz Tabela materiałów) ustawiony na 40 obr./min.</li>
		<li>Po inkubacji odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1 ml PBS.</li>
		<li>Powtórzyć kroki prania 3.5.3 i 3.5.4.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad bakteryjny w 150 μl 5% BB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie przeciwciałami
	<ol>
		<li>Przygotuj świeże 5% BB. 
		UWAGA: Wszystkie prace z użyciem przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie powinny być wykonywane w ciemności, a przeciwciało, BB i FCSB powinno być trzymane na lodzie.</li>
		<li>Rozcieńczyć ludzkie przeciwciało GII przeciwko norowirusowi w stosunku 1:125 dla próbek E. cloacae i 1:150 dla próbek L. gasseri w 5% BB, przygotowując 50 μl rozcieńczonego przeciwciała na próbkę.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało izotypu w taki sam sposób, w jaki ludzkie przeciwciało GII norowirusa rozcieńczono dla każdej bakterii w 5% BB, przygotowując 50 μl rozcieńczonej kontroli izotypu na próbkę.</li>
		<li>Podzielić każdą próbkę testową z etapu 3.3.7 na trzy podwielokrotności o pojemności 50 μl, przenosząc je do czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Do pierwszego zestawu próbek dodać 50 μl BB. Ten zestaw będzie zawierał niesplamione (Uns) kontrolki.</li>
		<li>Do drugiego zestawu dodać 50 μl rozcieńczenia przeciwciała GII. Daje to końcowe stężenie przeciwciał 1:250 dla E. cloacae i 1:300 dla L. gasseri. Ten zestaw próbek będzie zawierał próbki barwione (AB).</li>
		<li>Do trzeciego zestawu dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała izotypowego. Ten zestaw będzie kontrolkami izotypu (IC). Dobrze wymieszać przez pipetowanie. Próbki należy inkubować na lodzie i w ciemności przez 30 minut.</li>
		<li>Odwirować wszystkie próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbki w 100 μl FCSB.</li>
		<li>Odwirować wszystkie próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbki w 100 μl FCSB.</li>
		<li>Odwirować wszystkie próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbki w 150 μl FCSB.</li>
		<li>Przenieść każdą próbkę do probówki FCSB zawierającej 400 μl buforu FCSB o całkowitej objętości 550 μl.</li>
		<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ich analizy metodą cytometrii przepływowej. 
		UWAGA: Cytometrię przepływową wykonuje się w ciągu 4 godzin od barwienia przeciwciał.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
UWAGA: Ustawienia napięcia opisane poniżej są oparte na cytometrze przepływowym i oprogramowaniu wymienionym w Tabeli Materiałów i prawdopodobnie będą się różnić w zależności od różnych cytometrów przepływowych. Ustawienia powinny być zoptymalizowane dla każdej bakterii. Upewnij się, że osie wszystkich wykresów są w fazie dwuwykładniczej.
<ol>
	<li>Konfigurowanie workspace 
	UWAGA: Ustawienia dla wykresów używanych do wyznaczania obszaru roboczego różnią się od tych używanych do bramkowania i analizy danych. Celem skonfigurowania przestrzeni roboczej jest wizualizacja populacji komórek, upewnienie się, że nie ma nadmiernego zlepiania się komórek bakteryjnych, które mogłoby mieć wpływ na dalszą analizę, oraz rozróżnienie komórek barwionych i niebarwionych podczas zbierania danych.
	<ol>
		<li>Aby upewnić się, że bakterie nie zlepiają się ze sobą, ustaw serię wykresów gęstości.
		<ol>
			<li>Wygeneruj obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) w porównaniu z obszarem rozproszenia bocznego (SSC-A), aby zobrazować całkowitą populację.</li>
			<li>Skonfiguruj wykresy, aby ocenić pojedyncze komórki w porównaniu z zagęszczeniami komórek, tworząc dwa wykresy, które porównują odpowiednio szerokość rozproszenia do przodu (FSC-W) i szerokość rozproszenia bocznego (SSC-W) do przodu (FSC-H) i wysokość rozproszenia bocznego (SSC-H).</li>
			<li>Utwórz wykres, który pokazuje tylko populację z dodatnim wynikiem PE (PE-A vs. SSC-A).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustaw napięcie podstawowe na 500 dla E. cloacae i 340 dla L. gasseri. Zostaną one później jeszcze dostosowane.</li>
		<li>Ustaw łączną liczbę zdarzeń na 10 000 zdarzeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie próbek
	<ol>
		<li>Utwórz trzy oddzielne wykresy histogramu, które pokazują liczbę wykreśloną względem SSC-A, FSC-A lub PE-A.</li>
		<li>Umieścić niebarwioną próbkę na cytometrze przepływowym i pobrać próbki ze zdarzeniami, upewniając się, że maksymalny pik na histogramie dla SSC-A mieści się w zakresie od 102 do 103, a maksymalny pik na histogramie dla FSC-A mieści się w przedziale od 10 4 do 105 na osi x. Jeśli nie, szczyty nie mieszczą się w określonych zakresach, odpowiednio dostosuj napięcia FSC i SSC.</li>
		<li>Umieścić wybarwioną próbkę (AB) na cytometrze przepływowym i wyregulować napięcie PE, aby maksymalny pik przekroczył 10:3 na osi x.</li>
		<li>Na podstawie tych pomiarów ustaw dodatnią bramkę PE i ustaw bramkę na wykresie gęstości PE-A w funkcji SSC-A.</li>
		<li>Uruchomić wszystkie próbki przy określonych ustawieniach przy niskiej lub średniej prędkości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li>
<li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li>
<li>Baldridge, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+microbes+and+interferon-lambda+determine+persistence+of+enteric+murine+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection.</a> Science. 347 (6219), 266-269 (2015).</li>
<li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterobacter+cloacae+inhibits+human+norovirus+infectivity+in+gnotobiotic+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs.</a> Scientific reports. 6, 25017(2016).</li>
<li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Protective+Efficacy+of+Probiotics+and+Rice+Bran+against+Human+Norovirus+Infection+and+Diarrhea+in+Gnotobiotic+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1699(2016).</li>
<li>Rodríguez-Díaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+secretor+status+genotype+and+microbiota+composition+in+susceptibility+to+rotavirus+and+norovirus+infections+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans.</a> Scientific Reports. 7, 45559(2017).</li>
<li>Erickson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+Facilitate+Enteric+Virus+Co-infection+of+Mammalian+Cells+and+Promote+Genetic+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination.</a> Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).</li>
<li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li>
<li>Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipopolysaccharide+binding+enhances+virion+stability+and+promotes+environmental+fitness+of+an+enteric+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).</li>
<li>Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+bacterial+envelope+components+enhance+mammalian+reovirus+thermostability%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability.</a> PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768(2017).</li>
<li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li>
<li>Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> PLOS One. 12 (3), (2017).</li>
<li>Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Related+enteric+viruses+have+different+requirements+for+host+microbiota+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
<li>Van Dycke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+human+norovirus+replication+model+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae.</a> PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009(2019).</li>
<li>Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+to+histo-blood+group+antigen-expressing+bacteria+protects+human+norovirus+from+acute+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 659(2015).</li>
<li>Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+norovirus+binding+to+gut-associated+bacterial+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 607(2019).</li>
<li>Debbink, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Within-host+evolution+results+in+antigenically+distinct+GII.4+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses.</a> Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).</li>
<li>Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Norwalk+virus-like+particles+to+ABH+histo-blood+group+antigens+is+blocked+by+antisera+from+infected+human+volunteers+or+experimentally+vaccinated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).</li>
<li>Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+capture+with+histo-blood+group+antigens+reveals+novel+virus-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions.</a> Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).</li>
<li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GII.4+Human+Norovirus%3A+Surveying+the+Antigenic+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li>
<li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).</li>
<li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li>
<li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586(2014).</li>
<li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles%2C+the+small+P+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Zdolność do ilościowego określenia wiązania wirusów jelitowych z bakteriami jest kluczowym pierwszym krokiem do wyjaśnienia mechanizmów, za pomocą których bakterie te zmieniają infekcję wirusową. Metody opisane w niniejszym dokumencie zostały zoptymalizowane do pomiaru interakcji ludzkiego norowirusa VLP zarówno z E. cloacae (bakteria Gram-ujemna), jak i L. gasseri (bakteria Gram-dodatnia), ale mogą być dostosowane do stosowania z dowolnym wirusem ssaków i bakterią będąc...

Ludzkie norowirusy (HuNoVs) są główną przyczyną chorób przewodu pokarmowego na całym świecie, odpowiedzialne za 685 milionów infekcji i ponad 200 000 zgonów rocznie1. Podobnie jak w przypadku innych wirusów jelitowych, wykazano, że obecność bakterii komensalnych nasila infekcję tym patogenem, a także jego zastępczym wirusem, mysim norowirusem2,3. Istnieją również sprzeczne doniesienia, że bakterie mogą hamować infekcję ludzkim norowirusem4,5,6. W przypadku kilku wirusów bezpośrednia interakcja między wirusem a bakterią wydaje się leżeć u podstaw mechanizmów wpływających na infekcję wirusową2,7,8,9,10, a mikroskopia elektronowa wykazała, że ludzkie norowirusy wiążą się bezpośrednio z powierzchniami bakterii11,12. Dlatego scharakteryzowanie tych interakcji stało się kluczowe dla określenia mechanizmów, za pomocą których bakterie wpływają na infekcję wirusową. Ta charakterystyka klasycznie rozpoczęła się od ilościowego określenia wiązania wirusa z szeregiem gatunków bakterii, które są składnikami mikrobiomu gospodarza7,12,13. Te testy przyłączenia nie tylko ujawniają ilość wirusa związanego z bakteriami, ale także pomagają w określeniu wpływu tej interakcji na sprawność i przeżycie wirusa.
Aby określić ilościowo przyczepienie wirusa, tradycyjnie stosowane metody obejmują testy oparte na PCR, które określają ilościowo genomy wirusów12 lub generowanie wirusa znakowanego radioaktywnie oraz wykorzystanie zliczania scyntylacyjnego do ilościowego oznaczania cząsteczek wirusa7,8,9,13. Stosowanie tych metod na ogół wymaga dostępu do zasobów wirusów o wysokim mianie i technik hodowli in vitro, za pomocą których można je wygenerować. Chociaż obecnie istnieje kilka systemów hodowli ludzkiego norowirusa2,14,15, żaden z nich nie obsługuje solidnej replikacji wymaganej do wygenerowania tych wysoce skoncentrowanych zasobów, co ogranicza lub eliminuje stosowanie PCR i zliczania scyntylacyjnego do ilościowego określania interakcji ludzkiego norowirusa z bakterią.
Aby obejść ten problem, cząsteczki wirusopodobne (VLP) mogą być używane jako substytut żywego wirusa do badania interakcji między ludzkim norowirusem a bakteriami16,17. VLP to niezakaźne cząstki, które bardzo przypominają wirusa, z którego pochodzą. W przypadku ludzkiego norowirusa cząsteczki te są generowane z ekspresji białka VP1 (a czasami VP2), które samoorganizują się, tworząc nienaruszone kapsydy wirusowe pozbawione materiału genetycznego (tj. RNA w przypadku norowirusów). Te VLP zostały dobrze scharakteryzowane, są strukturalnie i antygenowo podobne do wirusów typu dzikiego, z których pochodzą18,19,20,21,22,23. Dlatego VLP służą jako idealny substytut do badania interakcji powierzchniowych między ludzkim norowirusem a bakteriami komensalnymi. Biorąc pod uwagę, że VLP nie mają materiału genetycznego, testy oparte na PCR nie mogą być stosowane do ilościowego określenia wiązania wirusa. Wcześniej opisano metodę cytometrii przepływowej opartej na przeciwciałach, która jest w stanie wykryć niskie poziomy wiązania VLP z bakteriami w sposób półilościowy16. Metoda ta została zoptymalizowana, aby umożliwić dokładne określenie ilościowe wiązania VLP ludzkiego norowirusa zarówno z bakteriami komensalnymi Gram-ujemnymi, jak i Gram-dodatnimi16.

<table><tbody><tr><td>5 ml probówki z okrągłym dnem Polystrene z nasadką</td> sitową <td>Corning</td><td>352235</td><td>Po zabarwieniu przeciwciał próbka jest przenoszona do probówek w celu analizy cytometrii przepływowej.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A7002</td><td>Używany do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>AnaeroPack</td><td>Thermo Scientific</td><td>R681001</td><td>Zestaw gazów beztlenowych używany do hodowli Lactobacillus gasseri</td></tr><tr><td>Oprogramowanie BD FacsDiva Cytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>przepływowy LSR Fortessa</td></tr><tr><td>Albumina bydlęca</td><td>Bioreagenty Fisher</td><td>BP1605</td><td>Używany do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Bufor barwnikowy do cytometrii przepływowej (FCSB)</td> <td>BD Biosciences</td><td>554657</td><td>Używany do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Mysia kontrola izotypu IgG2b kappa (eBMG2b), PE, eBioscience</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12473281</td><td>kontrola izotypu. To przeciwciało jest kupowane w postaci sprzężonej od producenta.</td></tr><tr><td>MRS Powder</td><td>BD Biosciences</td><td>288130</td><td>Służy do przygotowania pożywek i hodowli Lactobacillus gasseri.</td></tr><tr><td>Norowirus kapsyd G2 Przeciwciało monoklonalne (L34D)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-18241</td><td>Przeciwciało GII norowirusa. Przeciwciało to jest dostępne tylko w postaci niesprzężonej i dlatego musi być fluorescencyjnie sprzężone przed użyciem w opisanych testach cytometrii przepływowej. W tym protokole wybrano PE, jednak inne cząsteczki fluorescencyjne mogą być wybrane tak, jak najlepiej pasują do cytometru przepływowego używanego przez badacza.</td></tr><tr><td>Norowirus GII.4 VLP</td><td>Kreatywna biostruktura</td><td>CBS-V700</td><td>cząsteczka podobna do ludzkiego wirusa norowirusowego, VLP zostały wygenerowane przy użyciu systemu bakulowirusa i ponownie zawieszone w buforowanym fosforanami soli fizjologicznej z 10% glicerolem. Autorzy przeprowadzili niezależną analizę śledzenia nanosightu w celu określenia stężenia cząstek w VLP. Stężenie wynosi około 1011 VLP na mililitr. W oparciu o stężenie białka w VLP, w testach przyłączania VLP dodaje się około 200 cząstek na bakterię.</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665</td><td>Rozcieńczyć do 1X przed użyciem.</td></tr><tr><td>SiteClick R-PE Zestaw do znakowania przeciwciał</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S10467</td><td>Zestaw do koniugacji służący do oznaczania przeciwciał niesprzężonych.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271</td><td>Używany do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>Używany do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>Rewolwer rurowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88881001</td><td>Stosowany w teście przyczepiania wirusa: bakterii. Ustaw maksymalną prędkość (40 obr./min).</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td>Używany do przygotowania pożywek</td></tr></tbody></table>

ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Bakterie komensalne są dobrze przystosowane do wpływania na infekcję wirusami eukariotycznymi. Bezpośrednie wiązanie między patogenem a mikrobiomem gospodarza jest odpowiedzialne za zmianę infekcji wielu z tych wirusów. Tak więc scharakteryzowanie natury wiązania wirus-bakteria jest podstawowym krokiem potrzebnym do wyjaśnienia mechanizmu (mechanizmów), za pomocą którego bakterie zmieniają infekcję wirusową. W przypadku ludzkiego norowirusa bakterie komensalne nasilają infekcję komórkami B. Wirus bezpośrednio wiąże się z tymi bakteriami, co wskazuje, że ta bezpośrednia interakcja jest zaangażowana w mechanizm nasilania infekcji. Do ilościowego określenia interakcji między bakteriami i wirusami można wykorzystać różne techniki, w tym zliczanie scyntylacyjne wirusów znakowanych radioaktywnie i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). Obie metody wymagają użycia żywego wirusa, który może wymagać wytworzenia w laboratorium. Obecnie żaden z istniejących systemów hodowli in vitro dostępnych dla ludzkiego norowirusa nie jest wystarczająco solidny, aby umożliwić wytwarzanie wysoce skoncentrowanych stad wirusa. Zamiast żywego wirusa, do scharakteryzowania interakcji między norowirusem a bakteriami użyto cząstek wirusopodobnych (VLP). W niniejszym artykule opisano metodę cytometrii przepływowej, w której wykorzystuje się przeciwciała specyficzne dla wirusa do ilościowego określenia wiązania VLP z bakteriami Gram-ujemnymi i Gram-dodatnimi. Włączenie zarówno samych bakterii, jak i kontroli izotypów pozwoliło na optymalizację testu w celu zmniejszenia wiązania przeciwciał w tle i dokładnego określenia ilościowego przyłączenia VLP do badanych bakterii. Wysokie proporcje VLP do bakterii powodują, że VLP wiążą się z dużym odsetkiem populacji bakterii. Jednak gdy ilości VLP są zmniejszane, zmniejsza się również procent związanych bakterii. Ostatecznie metoda ta może zostać zastosowana w przyszłych eksperymentach wyjaśniających specyficzne warunki i składniki strukturalne, które regulują interakcje norowirusa-bakterii.

Strategie bramkowania wykorzystane do ilościowego oznaczenia wiązania VLP ludzkiego norowirusa z bakteriami komensalnymi przedstawiono na Rysunku 1. Reprezentatywny wykres gęstości kropkowej zapewnia przegląd sposobu bramkowania próbek w celu wyeliminowania debris komórkowego i agregatów komórek, tak aby przyleganie VLP było określane na populacjach singletów (Rysunek 1A). Reprezentatywne histogramy wykazują nisk...

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie wiązania eukariotycznego patogenu ludzkiego norowirusa z bakteriami. Po wykonaniu wstępnego testu przyłączenia wirusa-bakterii, cytometria przepływowa jest stosowana do wykrywania bakterii związanych z wirusem w populacji.

Ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Interakcje wirus-bakteria mogą być ważne dla powodzenia infekcji wirusowej i stymulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Jednak obecnie w laboratorium nie można wyprodukować wysoce skoncentrowanego i oczyszczonego materiału ludzkiego norowirusa. Technika ta może być stosowana w przypadku każdego wirusa, który wiąże się z bakteriami, dla których dostępne są cząsteczki wirusopodobne lub żywy wirus.Pozwala nam to na ilościowe określenie interakcji między tymi wirusami i bakteriami. Zaszczepić pięć mililitrów płynnej pożywki pojedynczą izolowaną kolonią Enterobacter cloacae z płytki agarowej bezpośrednio z zamrożonego bulionu glicerynowego. Rozwijaj bakterie przez noc.Następnego dnia przenieś 1,3 mililitra porcji kultury do dwóch oddzielnych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez pięć minut. Usunąć supernatanty, a następnie umyć próbki dwukrotnie, używając jednego mililitra sterylnego 1X PBS do każdego przemycia.Ponownie odwirować próbki przy 10 000 x g przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1,3 mililitra sterylnego 1X PBS. Zaczynając od 0,5 mililitra umytej kultury, seryjnie rozcieńczaj bakterie w 1X PBS od 10 do minus jeden do 10 do minus cztery.Za pomocą spektrofotometru zmierzyć gęstość optyczną przemytej, nierozcieńczonej kultury i każdego z czterech rozcieńczeń w temperaturze 600 nanometrów. Wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia w 1X PBS dla każdego z poprzednich rozcieńczeń. Rozprowadzić 100 mikrolitrów ostatnich trzech rozcieńczeń dla każdej serii na płytkach agarowych, aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr dla każdej próbki.Pozostaw płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na pięć minut. Odwróć płytki i inkubuj je w inkubatorze. Po przygotowaniu odczynników, przeciwciał i bakterii zgodnie z opisem w manuskrypcie, zbierz wszystkie materiały w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2.Cząsteczki wirusopodobne do ludzkiego norowirusa są wymienione jako patogeny BSL-2, a wszystkie prace wykonywane przy użyciu VLP powinny być wykonywane w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodać 10 mikrogramów ludzkich norowirusów VLP do każdej probówki z bakteriami i dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Inkubuj probówki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza ze stałą rotacją.Po inkubacji odwirować probówki o masie 10 000 x g przez pięć minut. Odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w jednym mililitrze PBS. Po jednokrotnym powtórzeniu etapów mycia, należy ponownie odwirować probówki o stężeniu 10 000 X g przez pięć minut.Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakterii VLP w 150 mikrolitrach 5% buforu blokującego. Częstym błędem, który występuje, jest zamiana rurek i dodanie niewłaściwej obróbki. Aby temu zapobiec, ułóż wszystkie probówki w liniach odpowiadających prawidłowemu leczeniu i dodaj jeden zabieg na raz do probówek.Dla każdej próbki bakteryjnej należy przygotować 50 mikrolitrów rozcieńczonego ludzkiego przeciwciała GII przeciwko norowirusowi. Używając buforu blokującego 5%, rozcieńczyć przeciwciało jeden do 125 dla próbek E.cloacae. Przygotować 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała izotypowego dla każdej próbki bakteryjnej przy użyciu tych samych proporcji rozcieńczenia.Podziel każdą próbkę testową załącznika na podwielokrotności o pojemności 350 mikrolitrów, przenosząc je do czystych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych. Aby utworzyć niebarwione kontrole, dodaj 50 mikrolitrów buforu blokującego do pierwszej porcji z każdej próbki bakteryjnej. W przypadku barwionych próbek dodać 50 mikrolitrów rozcieńczenia przeciwciała GII do drugiego zestawu podwielokrotności.Utwórz kontrole izotypu, dodając 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała izotypu do trzeciego zestawu podwielokrotności. Inkubować wszystkie próbki na lodzie i w ciemności przez 30 minut. Następnie odwirować wszystkie próbki o stężeniu 10 000 x g przez pięć minut.Odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić każdą próbkę w 150 mikrolitrach FCSB. Ponownie odwirować wszystkie próbki o masie 10 000 x g przez pięć minut. Ponownie wyrzucić supernatanty i ponownie zawiesić próbki w 100 mikrolitrach FCSB.Po odwirowaniu próbek po raz ostatni i odrzuceniu supernatantów, ponownie zawiesić próbki w 150 mikrolitrach FCSB. Przenieść każdą próbkę do probówki zawierającej 400 mikrolitrów FCSB, co daje całkowitą objętość 550 mikrolitrów. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej.Przyłączenie VLP mierzono za pomocą cytometrii przepływowej. Najpierw wykorzystano wykresy zagęszczenia do odbramowania szczątków komórkowych, a następnie do bramkowania na wykresie kropkowym w celu usunięcia bakteryjnych dubletów i grudek komórkowych. Reprezentatywne histogramy wskazują na brak sygnału PE w próbkach zawierających wyłącznie bakterie oraz zmianę intensywności sygnału PE w próbkach VLP:bacterium w porównaniu z próbkami niebarwionymi i kontrolnymi izotypami.Po godzinie inkubacji z 10 mikrogramami VLP, cytometria przepływowa wykryła wiązanie cząstek zarówno z E. colacae, jak i L. gasseri. Aby określić granicę kwantyfikacji wiązania dla tego testu, przed dodaniem do bakterii wygenerowano serię rozcieńczeń VLP. Zmniejszenie ilości VLP spowodowało odpowiednie zmniejszenie procentu bakterii związanych przez VLP.Znajomość stosunku wirusa do bakterii i utrzymanie stałego stosunku między eksperymentami jest ważne w interpretacji wyników. Mutanty bakteryjne i wirusowe mogą być generowane w celu specyficznego określenia struktur powierzchniowych drobnoustrojów, które pośredniczą w tej interakcji. Technika ta pozwala naukowcom odpowiedzieć na pytania dotyczące okoliczności i warunków, które wpływają na interakcje norowirus-bakteria, w tym tego, jak zmiany w genotypie wirusa, warunki wzrostu bakterii i zmiany w strukturach powierzchni bakterii wpływają na wiązanie wirusa.

quantifying-human-norovirus-virus-like-particles-binding-to-commensal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowego oznaczania cząstek zakaźnych norowirusa mysiego (MNV), który jest jedynym norowirusem efektywnie replikującym się w hodowlach komórkowych. Metoda płytkowa wykorzystuje tropizm MNV do makrofagów mysich i może zostać dostosowana do analizy próbek biologicznych lub środowiskowych zawierających MNV.

Test plackowy dla mysiego norowirusa

Source: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp. (2017)The video demonstrates a protocol for monitoring the heat-induced aggregation of virus-like particles using dynamic light scattering (DLS). It begins with preparing a monodisperse suspension of purified particles. The sample is then loaded into a preheated DLS instrument. As the capsid proteins denature with heat, exposed hydrophobic regions cause particle...

Tracking Aggregation of Virus-Like Particles Using Dynamic Light Scattering

Ten film pokazuje wykrywanie interakcji witronektyny z białkami powierzchniowymi bakterii. Analiza cytometrii przepływowej mierzy sygnał fluorescencyjny znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał związanych z witronektyną, potwierdzając jej obecność na powierzchni bakterii. Technika ta zapewnia wgląd w interakcje gospodarz-patogen i potencjalne terapie infekcji bakteryjnych.

Wykrywanie wiązania witronektyny z powierzchniami bakteryjnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje test do ilościowego oznaczania ludzkich cząsteczek wirusopodobnych do norowirusa (VLP) wiążących się z ludzkimi bakteriami jelitowymi. Zawiesiny bakteryjne miesza się z VLP i inkubuje, aby umożliwić tworzenie kompleksów VLP-bakterii. Kompleksy są następnie znakowane przeciwciałami specyficznymi dla VLP znakowanymi fluoroforem, a następnie wizualizacją i kwantyfikacją opartą na cytometrii przepływowej w celu zidentyfikowania procentu bakterii związanych z VLP.

Test do ilościowego określenia wiązania ludzkich norowirusów VLP z bakteriami jelitowymi

Tutaj prezentujemy procedurę pomiaru całkowitej liczby wirusów zdolnych do hodowli za pomocą linii komórkowej nerki Buffalo Green Monkey. Procedura zapewnia ustandaryzowane narzędzie do pomiaru występowania zakaźnych wirusów w środowisku i wodach pitnych.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

Prezentujemy protokół opisujący półilościową metodę pomiaru zarówno przyczepiania wirusa grypy A do komórek A549, jak i internalizacji cząsteczek wirusa do komórek docelowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy metodę ekspresji i oczyszczania wysokiej jakości domen wystających (P) norowirusa (P) w E. coli do wykorzystania w badaniach krystalografii rentgenowskiej. Metoda ta może być stosowana do innych domen kaliciwirusa P, a także białek niestrukturalnych, tj. białka wirusa sprzężonego z genomem (VPg), proteazy i polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp).

Wytwarzanie wystających domen ludzkiego norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej

Wirusy lub pęcherzyki zewnątrzkomórkowe były wychwytywane immunologicznie za pomocą nanocząsteczek magnetycznych 15 nm sprzężonych z przeciwciałami rozpoznającymi antygeny powierzchniowe. Uchwycone wiriony lub pęcherzyki znakowano fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko innym antygenom powierzchniowym. Powstałe kompleksy rozdzielono w silnym polu magnetycznym i przeanalizowano za pomocą konwencjonalnych cytometrów przepływowych wyzwalanych fluorescencją.

Wirometria przepływowa do analizy widm antygenowych wirionów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Metodologia pobierania próbek oparta na makropianie została opracowana i oceniona pod kątem wykrywania i kwantyfikacji norowirusa na twardych powierzchniach środowiskowych.

Metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do ilościowego określania wiązania cząstek wirusopodobnych norowirusa z bakteriami komensalnymi. Technika umożliwia badanie interakcji wirus-bakteria bez użycia żywego wirusa.

Ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów