Name: Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj mikroprzepływowy model in vitro do badania interakcji pełnej krwi z komórkami śródbłonka pacjenta. Ta metoda umożliwia ocenę zakrzepowości i skuteczności terapii przeciwzakrzepowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Janowi Voorbergowi z Wydziału Białek Osocza, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Holandia, za jego wkład w ten manuskrypt. Prace te były wspierane przez Dutch CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] przyznany konsorcjum Phaedra i Reconnect, a także grant Impulse 2018 przyznany konsorcjum Phaedra IMPACT. Granty te są finansowane wspólnie przez Holenderską Fundację Kardiologiczną, Holenderską Federację Uniwersyteckich Centrów Medycznych, Holenderską Organizację Badań i Rozwoju Zdrowia oraz Królewską Holenderską Akademię Nauk. Ponadto praca ta została sfinansowana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach programu Advanced Grant "VESCEL" (numer grantu: 669768). XDM jest finansowany z grantu badawczego Instytutu Badań Sercowo-Naczyniowych (ICaR-VU) w Uniwersyteckim Centrum Medycznym VU w Amsterdamie, Holandia.

<ol><li>Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+control+of+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cardiovascular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell control of thrombosis.</a> BMC Cardiovascular Disorders. 15, 130(2015).</li>
<li>Pearson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+function+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell function and thrombosis.</a> Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).</li>
<li>Bochenek, M. L., Schafer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Endothelial+Cells+in+Acute+and+Chronic+Thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hamostaseologie%22%5BJournal%5D)">Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis.</a> Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).</li>
<li>Swieringa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Control+of+Fibrin+Distribution+and+Microelasticity+in+Thrombus+Formation+Under+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).</li>
<li>Macfarlane, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Enzyme+Cascade+in+the+Blood+Clotting+Mechanism%2C+and+Its+Function+as+a+Biochemical+Amplifier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier.</a> Nature. 202, 498-499 (1964).</li>
<li>Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fundamentals+in+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">New fundamentals in hemostasis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 327-358 (2013).</li>
<li>Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+platelets%2C+the+coagulation+and+fibrinolytic+systems+to+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing.</a> Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).</li>
<li>Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+the+cellular+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis.</a> Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).</li>
<li>Karino, T., Motomiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+through+a+venous+valve+and+its+implication+for+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation.</a> Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).</li>
<li>ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis%3A+a+major+contributor+to+global+disease+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Thrombosis: a major contributor to global disease burden.</a> Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).</li>
<li>Witkin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+pulmonary+embolism%3A+the+role+of+the+pulmonary+embolism+response+team%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team.</a> Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> European Respiratory Journal. 53 (1), 1801915(2019).</li>
<li>Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+biomarkers+in+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480(2019).</li>
<li>Giri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interventional+Therapies+for+Acute+Pulmonary+Embolism%3A+Current+Status+and+Principles+for+the+Development+of+Novel+Evidence%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).</li>
<li>Sharma, S., Lang, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+pathophysiology+of+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).</li>
<li>Eisenberg, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinopeptide+A+levels+indicative+of+pulmonary+vascular+thrombosis+in+patients+with+primary+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension.</a> Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).</li>
<li>Bochenek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+thrombosis+to+fibrosis+in+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).</li>
<li>Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+microfluidics+to+assess+the+platelet-based+control+of+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation.</a> Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).</li>
<li>Barendrecht, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+Imaging+of+Platelet+Degranulation+and+Secretion+Under+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55658(2017).</li>
<li>Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+Flow-based+Assays+to+Investigate+Leukocyte+Recruitment+on+Cultured+Vascular+Cells+and+Adherent+Platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57009(2018).</li>
<li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e55917(2017).</li>
<li>Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stasis+Promotes+Erythrocyte+Adhesion+to+von+Willebrand+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429(2012).</li>
<li>Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brothers+and+sisters%3A+molecular+insights+into+arterial-venous+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity.</a> Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).</li>
<li>Szulcek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Microvascular+Shear+Adaptation+in+Pulmonary+Arterial+Hypertension.+Role+of+Platelet+Endothelial+Cell+Adhesion+Molecule-1+Cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).</li>
<li>Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+high+shear+rate+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Role of high shear rate in thrombosis.</a> Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+whole+blood+thrombosis+in+a+microfluidic+device+lined+by+fixed+human+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium.</a> Biomedical Microdevices. 18 (4), 73(2016).</li>
<li>van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+prolonged+increase+in+endothelial+permeability+induced+by+histamine+and+thrombin%3A+role+of+protein+kinases%2C+calcium%2C+and+RhoA%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA.</a> Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).</li>
<li>Smits, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Outgrowth+and+Proliferation+of+Endothelial+Colony+Forming+Cells+are+Related+to+Markers+of+Disease+Severity+in+Patients+with+Pulmonary+Arterial+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763(2018).</li>
<li>Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+serial+hemodilution+with+hydroxyethyl+starch%2C+albumin%2C+and+0.9%25+saline+on+whole+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Anesthesia%22%5BJournal%5D)">Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation.</a> Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Lung+Alveolus-on-a-chip+Model+of+Intravascular+Thrombosis+for+Assessment+of+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li>
<li>Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+peptides+enhance+single+cell+adhesion+and+viability+on+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir-ACS%22%5BJournal%5D)">Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays.</a> Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).</li>
<li>Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+size-dependent+cell+adhesion+on+nanostructured+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces.</a> Journal of Nanobiotechnology. 12, 54(2014).</li>
<li>McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weibel-Palade+bodies+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Weibel-Palade bodies at a glance.</a> Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).</li>
<li>Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mast+Cell%2C+Contact%2C+and+Coagulation+System+Connection+in+Anaphylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 846(2017).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).</li>
<li>Huveneers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinculin+associates+with+endothelial+VE-cadherin+junctions+to+control+force-dependent+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling.</a> Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).</li>
<li>Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+cell-substrate+impedance+sensing+for+the+quantification+of+endothelial+proliferation%2C+barrier+function%2C+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).</li>
<li>Yamasaki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+arterial+stiffness+and+platelet+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Association between arterial stiffness and platelet activation.</a> Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).</li>
<li>Tsai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).</li>
<li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3958(2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Krzepnięcie jest wynikiem złożonej i kontrolowanej czasowo interakcji między śródbłonkiem a składnikami krwi. Ten test in vitro przedstawia metodę badania właściwości trombogennych komórek śródbłonka w czasie rzeczywistym. Można stosować różne typy pierwotnych komórek śródbłonka ludzkiego, ułatwiając zakrzepicę in situ w sposób specyficzny dla narządu i pacjenta. W tym badaniu zilustrowaliśmy zastosowanie tego protokołu, porównując właściwości trombogenne PAEC wyizolowanych od zdrowych dawców w porównaniu z pacjentami z CTEPH. Żywe tworzenie skrzepliny badano przez perfuzję krwi pełnej od zdrowych osób przez śródbłonek aktywowany histaminą, podczas gdy działanie DOAC testowano jako środek przeciwzakrzepowy.
Oprócz wykorzystania dostępnych na rynku mikrokanałów, jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, wprowadzenie niestandardowych kanałów mikroprzepływowych umożliwia badanie wpływu zmian geometrii naczyń krwionośnych na powstawanie skrzeplin. Na przykład spadek przepływu w punkcie rozgałęzienia lub zwężenie powoduje wzrost naprężeń ścinających i większą aktywację płytek krwi36. Jednak istotnym ograniczeniem tych niestandardowych kanałów mikroprzepływowych jest wymóg dużej liczby komórek w celu utworzenia stabilnej monowarstwy EC, jak opisano w kroku 2.3.2. Może to stanowić czynnik ograniczający, gdy komórki pochodzące od pacjenta są rzadkie. Zaletą dostępnych na rynku mikroszkiełek jest to, że powierzchnie są modyfikowane na potrzeby hodowli komórkowych, a obszary wzrostu są większe, co pozwala EC na tworzenie zlewającej się i stabilnej monowarstwy. Z drugiej strony, większa powierzchnia spowoduje większy prześwit. Zgodnie z równaniem 1 wymaga to większej objętości krwi, aby osiągnąć podobne prędkości przepływu, jak w mikrofluidyce wykonanej na zamówienie.
Ulepszeniem tego protokołu może być zbadanie utraty EC w czasie rzeczywistym lub zmian w integralności bariery. Uszkodzenia EC w tym protokole są mierzone dopiero na końcu eksperymentu. W celu śledzenia na żywo, EC można oznaczyć mCherry VE-cadherin, na przykład37. Ponieważ jednak wymagałoby to wysoce zoptymalizowanego protokołu z wydajną transfekcją wirusa, wykrywanie impedancji elektrycznej komórki komórkowej (ECIS) może być wykorzystane jako alternatywa do badania integralności śródbłonka i funkcji bariery38. Perfuzja przez specjalne kanały przepływu ECIS umożliwia wzdłużne monitorowanie integralności bariery śródbłonka pod przepływem. Te szczególne cechy ECIS pozwalają na równoległe pomiary właściwości bariery śródbłonkowej i tworzenia skrzeplin. Alternatywne sposoby równoległych pomiarów bariery EC, zwłaszcza w matrycach wykonanych na zamówienie, obejmują zastosowanie fluorescencyjnego dekstransu w perfuzacie, który dyfunduje ze światła, w zależności od właściwości bariery EC.
Ograniczeniem opisanego protokołu jest to, że EC są usuwane z organizmu ludzkiego i hodowane na plastiku do hodowli tkankowej, który jest sztywnym, sztucznym podłożem. Komórki przystosowują się do swojego środowiska biofizycznego. Może to wpływać na odpowiedź śródbłonka na aktywację płytek krwi, ponieważ istnieje związek między aktywacją płytek krwi a sztywnością ścian39. Pomimo tych adaptacji do tworzyw sztucznych do hodowli, komórki zachowują cechy specyficzne dla choroby, które można zidentyfikować w bezpośrednim porównaniu z EC pochodzącymi od zdrowych dawców, jak pokazano w przypadku kontroli, CTEPH-PAEC i HUVEC, które wywierały różne wzorce adhezji płytek krwi i odkładania fibryny po 5 minutach perfuzji krwi.
W przeciwieństwie do innych protokołów, system ten wykorzystuje krew pełną, podczas gdy inne badają interakcję EC z pojedynczym składnikiem krwi, takim jak płytki krwi i leukocyty 19,20,21. Opracowano bardziej zaawansowane modele mikroprzepływowe, które umożliwiają badanie funkcji śródbłonka w modelu naczyniowym z okrągłą geometrią naczynia i miękką macierzą zewnątrzkomórkową. Są one jednak zoptymalizowane za pomocą HUVEC 40,41,42. Nowatorstwem opisanego protokołu jest zastosowanie pierwotnych EC w połączeniu z krwią pełną, co przybliża modelowanie zakrzepicy in situ o krok do warunków in vivo. Zoptymalizowanie protokołu pod kątem stosowania EC pochodzących od pacjenta i krwi pochodzącej od pacjenta jeszcze bardziej optymalizuje modelowanie choroby in vitro, umożliwiając ocenę spersonalizowanego tworzenia się skrzeplin i leczenia farmakologicznego.
Opisany protokół można zastosować do badania wpływu terapii przeciwzakrzepowych na komórki pochodzące od pacjenta. Podczas gdy stosowaliśmy dabigatran w celu zahamowania tworzenia skrzepliny, możliwe jest stosowanie innych leków przeciwzakrzepowych, takich jak rywaroksaban, który bezpośrednio hamuje czynnik Xa w kaskadzie krzepnięcia. Można również badać bezpośrednie inhibitory płytek krwi, takie jak klopidogrel lub aspiryna, ponieważ działają one na pierwotną fazę hemostazy, w której płytki krwi wiążą się z EC. Ostatecznie zdolności trombogenne specyficznych dla pacjenta EC w interakcji z własną krwią pacjenta można wykorzystać do przewidywania osobistego wpływu terapii przeciwzakrzepowej na indywidualnego pacjenta. Co więcej, knockdown określonych białek może dostarczyć dodatkowych informacji funkcjonalnych.
W opisanym protokole jest kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla udanego eksperymentu perfuzyjnego. Po pierwsze, podczas izolacji komórek pierwotnych konieczne jest uzyskanie wysoce czystej kultury EC. Po drugie, ważne jest, aby EC tworzyły stabilną, zlewającą się monowarstwę. Jeśli tak nie jest, niewielka zmiana naprężenia ścinającego może spowodować uszkodzenie śródbłonka i aktywację kaskady krzepnięcia lub płytki krwi mogą zacząć wiązać się z błoną podstawną, co zapewni fałszywie dodatnie wyniki. Po trzecie, ważne jest, aby zapobiegać powstawaniu pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one uszkodzić śródbłonek, a tym samym wpłynąć na wyniki.
Po ponownym zwapnieniu krwi cytrynianej chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu ważne jest, aby natychmiast rozpocząć eksperyment perfuzyjny. Ponowne zwapnienie wywołuje szybką reakcję w aktywacji płytek krwi i tworzeniu skrzepliny, co powoduje szybkie krzepnięcie w próbce.
Podsumowując, opisujemy bardzo wszechstronny protokół badania interakcji między krwią pełną a komórkami śródbłonka podczas zakrzepicy.

Śródbłonek tworzy wewnętrzną warstwę komórkową naczyń krwionośnych i oddziela krew od otaczającej tkanki. Został opisany jako dynamiczny narząd, który aktywnie reguluje swoje mikrośrodowisko i reaguje na bodźce zewnętrzne1. Ze względu na bezpośredni kontakt z przepływającą krwią, śródbłonek odgrywa kluczową rolę w kontroli hemostazy i zakrzepicy oraz jest głównym źródłem wielu głównych cząsteczek regulatorowych, które kontrolują agregację płytek krwi, krzepnięcie i fibrynolizę2. Zdrowe, nieaktywowane komórki śródbłonka (EC) wytwarzają kilka cząsteczek, które przeciwdziałają aktywacji płytek krwi i zapobiegają krzepnięciu i tworzeniu się skrzeplin w celu utrzymania przepływu krwi, takich jak prostacyklina, trombomodulina lub inhibitor szlaku czynnika tkankowego (TFPI)2,3. Zapobiega to adhezji płytek krwi, agregacji płytek krwi i tworzeniu się skrzeplin. Uszkodzenie lub aktywacja ściany naczynia powoduje powstanie fenotypu śródbłonka prokoagulacyjnego, który inicjuje miejscową adhezję płytek krwi i tworzenie skrzepów2,4. Po aktywacji śródbłonka płytki krwi przylegają do czynnika von Willebranda (VWF), białka multimerycznego uwalnianego z EC lub do odsłoniętych miejsc wiązania leżącej poniżej macierzy podśródbłonkowej. Następnie zmiany molekularne w płytkach krwi i ekspozycja na czynnik tkankowy (TF) inicjują aktywację układu krzepnięcia, który indukuje tworzenie skrzepliny przez polimeryzację fibryny5,6. Powstały skrzep stanowi podstawę do zamknięcia rany poprzez reendotelializację7. Zaburzenia układu krzepnięcia mogą powodować zaburzenia krzepnięcia, takie jak choroba von Willebranda, hemofilia lub zakrzepica, które często wynikają z rozregulowanej równowagi pro- i przeciwzakrzepowej śródbłonkowego szlaku hemostatycznego2,3.
Proces hemostazy występuje zarówno w krążeniu tętniczym, jak i żylnym. Jednak mechanizmy leżące u podstaw zakrzepicy tętniczej i żylnej są zasadniczo różne. Podczas gdy zakrzepica tętnicza, obserwowana w chorobie niedokrwiennej serca, jest głównie spowodowana pęknięciem blaszki miażdżycowej w warunkach dużego stresu ścinającego, zakrzepica żylna rozwija się głównie przy braku uszkodzenia śródbłonka w stanie zastoju8,9,10. Skrzeplina żyły głębokiej może ulec embolicji i przemieszczać się w kierunku tętnic płucnych, gdzie powoduje zatorowość płucną. Może to prowadzić do przewlekłych przeszkód naczyniowych prowadzących do znacznego upośledzenia zdolności funkcjonalnych, które mogą sprzyjać rozwojowi chorób płuc, w tym rozwojowi przewlekłego zakrzepowo-zatorowego nadciśnienia płucnego (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH charakteryzuje się podwyższonym ciśnieniem płucnym spowodowanym niedrożnością tętnic płucnych przez materiał zakrzepowo-zatorowy po co najmniej trzymiesięcznej terapii przeciwzakrzepowej15. Oprócz zatorowości płucnej postuluje się, że śródbłonek płucny zapewnia środowisko prozakrzepowe w CTEPH, które ułatwia zakrzepicę in situ i przewlekłą niedrożność tętnic płucnych, powodując wzrost ciśnienia krwi, który ostatecznie może prowadzić do niewydolności serca, jeśli nie jest leczony16,17.
W ciągu ostatnich lat, różne badania doprowadziły do opracowania testów do badania powstawania skrzeplin poprzez pomiar funkcji płytek krwi i krzepnięcia18. Jednak większość z nich albo bada interakcję krwi pełnej z pojedynczymi składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, takimi jak kolageny lub fibryny, albo funkcję śródbłonka w interakcji z pojedynczymi składnikami krwi, takimi jak interakcja śródbłonek-płytka krwi lub śródbłonek-leukocyty19,20,21,22. Testy te są najczęściej wykonywane na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), ponieważ komórki te są łatwe do uzyskania. Jednak geny hemostatyczne są różnie wyrażane w całym drzewie naczyniowym, typach naczyń i układach narządów23,24, co sprawia, że użycie HUVEC do reprezentowania komórek śródbłonka zaangażowanych w zakrzepicę tętniczą lub zatorowość płucną jest problematyczne23.
Oprócz plastyczności EC, specyficzne dla choroby zmiany hemodynamiczne i zmiany w morfologii naczyń mogą sprzyjać tworzeniu się skrzepliny w normalnym śródbłonku25. Wyższe tempo ścinania, na przykład spowodowane miejscowym zwężeniem naczyń krwionośnych lub zmianami w geometrii naczyń, może skutkować ostrym tworzeniem się skrzepliny, powodując zwężenie, które przyspiesza zatrzymanie przepływu krwi26. Zastosowanie specjalnie zaprojektowanych mikroinżynieryjnych kanałów przepływowych pozwala na specyficzne projektowanie geometrii naczyń krwionośnych, które są reprezentatywne dla (pato)biologii. W ten sposób możliwe jest zbadanie wpływu lokalnych sił biomechanicznych na zdrowych lub chorych EC27.
Dostępne są terapie przeciwzakrzepowe do celowania w różne fazy i cząsteczki w kaskadzie krzepnięcia, które stwarzają szczególne ryzyko i korzyści, które mogą być specyficzne dla niektórych zaburzeń. Podejście do modelowania chorób opisane w tym artykule jest szczególnie przydatne do testowania wpływu różnych terapii przeciwzakrzepowych i przeciwpłytkowych na dynamikę skrzepliny.
Celem jest przedstawienie modelu zakrzepicy, który obejmuje pierwotne EC, dając wszechstronny model odpowiedni do analizy różnych form zakrzepicy w zależności od rodzaju użytych pierwotnych EC. Jako ilustrację wykorzystaliśmy komórki śródbłonka tętnicy płucnej od pacjentów z CTEPH w interakcji z pełną ludzką krwią zawierającą wszystkie składniki biorące udział w tworzeniu skrzepliny (płytki krwi, leukocyty, erytrocyty, białka krzepnięcia i kofaktory). Podejście to może być stosowane w komercyjnych kanałach przepływu równoległego lub w niestandardowych kanałach przepływu mikroprzepływowego o specyficznej konstrukcji naczyniowej. W związku z tym model może być ostatecznie wykorzystany w badaniach nad powstawaniem i ustępowaniem skrzepliny, do oceny reakcji zapalnych w modelowaniu choroby, do terapii przeciwpłytkowej lub przeciwzakrzepowej, a ostatecznie do medycyny spersonalizowanej.
To badanie opisuje izolację pierwotnych komórek śródbłonka ludzkiej tętnicy płucnej. W celu wyizolowania innych pierwotnych typów ludzkich komórek śródbłonka odnosimy się do wcześniej opublikowanych metod, w tym komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc25, ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej28 oraz krążących krwią komórek tworzących kolonię śródbłonka Rysunek 1A29.

<table><tbody>Strzykawka <tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>20 ml</td><td>Obiektyw BD</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>20X</td><td>Olympus</td><td>N1492900</td><td>LUCPLFLN20XPH/0,45</td></tr><tr><td>2-Propanol (IPA)</td> <td>Boom</td><td>760514555000</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa Aladdin</td><td>Word Precision Instruments</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-Fibrinogen</td><td>Invitrogen</td><td>F13191</td><td>15 ug / ml</td></tr><tr><td>Alexa647-Goat anti Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji o średnicy 1 mm</td><td>Ted Pella</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM-Red</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CD42b-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-208</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Merck</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I, ogon szczura</td><td>Corning</td><td>354249</td><td>0,1 mg/ml</td></tr><tr><td>Corning CellBIND Powierzchnia 60 mm Naczynie hodowlane</td><td>Corning</td><td>3295</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur z przepływem krzyżowym</td><td>Basan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>Duran</td><td>2478269</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merck</td><td>14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka z komórek śródbłonka (ECM)</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna Osocze ludzkie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Rurki przepływowe</td><td>ibidi</td><td>10831, 10841</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Merck</td><td>104070</td><td>0,1%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>mikron-Slide VI 0,4 komory przepływowe</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.49</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Piec laboratoryjny</td><td>Quincy</td><td>10GC</td><td></td></tr><tr><td>LS720 Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>Złącze Luer</td><td>ibidi</td><td>10802, 10825</td><td>Męskie złącza kolankowe, Żeńskie łączniki rurowe</td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne MACS (anty-CD144)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-857</td><td>1:5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, 76 x 26 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAAA000001##12E</td><td></td></tr><tr><td>Negatywny fotorezystant, SU-8</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>4% PFA w PBS</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>bez wapnia lub magnezu</td></tr><tr><td>Osocze komora, CUTE</td><td>Femto Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS), Sylgard 184</td><td>Dow</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>probówki do pobierania krwi z cytrynianu sodu Cytrynian sodu</td><td>363048</td><td>Merck</td> 106448 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300-045</td><td></td></tr><tr><td>VE-Kadheryna (D87F2)-XP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2500</td><td>1:300</td></tr></tbody></table>

model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Powstawanie skrzepów krwi wiąże się ze złożonymi interakcjami między komórkami śródbłonka, ich leżącą u podstaw matrycą, różnymi komórkami krwi i białkami. Śródbłonek jest głównym źródłem wielu głównych cząsteczek hemostatycznych, które kontrolują agregację płytek krwi, krzepnięcie i fibrynolizę. Chociaż mechanizm zakrzepicy jest badany od dziesięcioleci, badania in vitro koncentrują się głównie na sytuacjach uszkodzenia naczyń, w których dochodzi do odsłonięcia macierzy podśródbłonkowej, lub na interakcjach między komórkami z pojedynczymi składnikami krwi. Nasza metoda pozwala na badanie interakcji między krwią pełną a nienaruszoną, zlewającą się siecią komórek naczyniowych.
Wykorzystując pierwotne ludzkie komórki śródbłonka, ten protokół daje unikalną możliwość badania wpływu komórek śródbłonka na dynamikę skrzepliny i daje cenne informacje na temat patofizjologii choroby zakrzepowej. Zastosowanie specjalnie zaprojektowanych mikroprzepływowych kanałów przepływu pozwala na zastosowanie specyficznych dla choroby geometrii naczyń krwionośnych i modelowanie specyficznych morfologicznych zmian naczyniowych. Rozwój skrzepliny jest rejestrowany w czasie rzeczywistym i ilościowo charakteryzowany przez adhezję płytek krwi i odkładanie fibryny. Wpływ funkcji śródbłonka na zmienioną dynamikę skrzepliny określa się za pomocą postanalizy poprzez barwienie immunofluorescencyjne określonych cząsteczek.
Reprezentatywne wyniki opisują konfigurację eksperymentalną, zbieranie danych i ich analizę. W zależności od pytania badawczego, parametry dla każdej sekcji mogą być dostosowywane, w tym typ komórki, szybkość ścinania, geometria kanału, terapia lekowa i procedury postanalityczne. Protokół jest walidowany poprzez ilościowe określenie powstawania skrzepliny w śródbłonku tętnicy płucnej u pacjentów z przewlekłą chorobą zakrzepowo-zatorową.

Reprezentatywne wyniki można podzielić na trzy części, z których każda odpowiada kolejnym etapom: przygotowania eksperymentalnego, gromadzenia danych oraz analizy danych. W zależności od pytania badawczego parametry każdego etapu mogą ulec zmianie. Przedstawione dane zostały zastosowane do badania wpływu śródbłonka na tworzenie się skrzepów.
Układ eksperymentalny 
Powszechnie wiadomo, że komórki śródbłonka są wysoce heterogeniczne pod względem struktury i funkcji, w zależności od lokalizacji i czasu, zarówno w stanie zdrowia, jak i choroby23. Do badania oddziaływań między śródbłonkiem a krwią można wykorzystać różne źródła komórek śródbłonka, którymi w tym przypadku były dostępne komercyjnie HUVEC oraz PAEC (Rycina 1A). Komórki HUVEC są najczęściej stosowane w modelach laboratoryjnych, natomiast PAEC są komórkami izolowanymi od pacjentów z tętnic płucnych. Ponadto istnieją uznane protokoły izolacji komórek śródbłonka mikro naczyniowego (MVEC) z krążenia płucnego lub krążących we krwi komórek tworzących kolonie śródbłonka (ECFC)25,28,29.
Po izolacji komórki śródbłonka scharakteryzowano za pomocą barwienia na VE-cadherin, CD31 i TIE2, aby potwierdzić fenotyp śródbłonkowy. Charakterystyka pod kątem obecności αSMA i cytokeratyny wykazała brak fenotypu fibroblastycznego lub nabłonkowego (Rycina 1B). Po uzyskaniu wysokiej czystości populacji EC, komórki z pasaży 3–5 wykorzystano do zasiewu na komercyjnych mikropłytkach lub wykonanych na zamówienie mikrofluidycznych kanałach przepływowych (Rycina 1C). Podczas gdy dostępne komercyjnie mikropłytki są głównie równoległymi komorami przepływowymi lub kanałami w kształcie litery Y o ściśle określonych parametrach wysokości lub kąta rozgałęzienia, zastosowanie płytek mikrofluidycznych umożliwia dostosowanie parametrów eksperymentalnych do geometrii naczyń in vivo oraz dynamiki przepływu krwi31. Jednakże wykonane na zamówienie rozmiary mikrofluidyczne są mniejsze i mają tendencję do ograniczania rozprzestrzeniania się komórek oraz indukowania większej liczby zgonów komórkowych32,33. Użycie nadmiaru komórek rekompensuje fakt, że przylgnie tylko niewielki procent z nich. Zaobserwowano to w przypadku wprowadzenia stenozy, gdzie komórki śródbłonka wykazały bardziej wydłużony fenotyp w porównaniu do równoległego kanału mikrofluidycznego (Rycina 1D). Komercyjne komory przepływowe mają większą powierzchnię, do której mogą przyłączyć się komórki, co wymaga mniejszej liczby komórek do zasiewu.
W celu zbadania interakcji między komórkami śródbłonka a krwią, krew pełną perfundowano nad monowarstwą śródbłonka. Krew cytratową pobrano w dniu eksperymentu i poddano rekalkcyfikacji bezpośrednio przed perfuzją. Komórki stymulowano histaminą w celu wywołania uwalniania VWF i adhezji płytek krwi na 30 min przed perfuzją (Rysunek 1E)34,35. Dzięki niewielkim wymiarom, wykonane na zamówienie kanały mikrofluidyczne pozwoliły na zastosowanie mniejszych objętości krwi.
Gromadzenie danych 
Aby zbadać tworzenie się zakrzepów na PAEC, przeprowadzono perfuzję komórek krwi znakowanych fluorescencyjnie Calcein AM-Red oraz fibryny koniugowanej z Alexa488 przez 5 min przy naprężeniu ścinającym 2,5 dyne/cm2 (Rysunek 2A–C). Ilościowo określono liczbę przylegających komórek krwi oraz osadzoną fibrynę. Obrazyzowano próbki co 30 s, a następnie wykonano kwantyfikację w programie ImageJ. Istotne było odjęcie tła w celu wyeliminowania autofluorescencji nieprzylegających płytek krwi. Do wyznaczenia minimalnego tła zastosowano algorytm trójkąta do ustalania progu (thresholding). Pozwoliło to na pomiar niewielkich agregatów płytek krwi (Rysunek 2D).
Zgodnie z oczekiwaniami, w warunkach bez stymulacji nie stwierdzono wiązania płytek krwi i fibryny z endotelium. Aby pobudzić uwalnianie VWF i wiązanie płytek, komórki PAECs stymulowano histaminą, co doprowadziło do natychmiastowego wzrostu adhezji płytek, która osiągnęła plateau po 2,5 min. W tym czasie płytki krwi zaczęły wydzielać czynniki autokrynne, które indukowali agregację płytek oraz rozszczepianie fibrynogenu do fibryny. Fibryna została odłożona po 3 min i po 4 min utworzyła stabilny agregat z płytkami krwi (Rycyna 2E).
Aby zbadać, czy efekt ten można zahamować za pomocą bezpośredniego doustnego antykoagulanta (DOAC), krew poddano działaniu 10 nM dabigatrany. Dabigatran dodano do rozcieńczenia krwi, gdzie hamuje on czynnik IIa w kaskadzie krzepnięcia, co zapobiegło rozszczepianiu fibrynogenu i tworzeniu włókien fibryny. Podczas perfuzji krwi traktowanej dabigatranem przez stymulowane PAEC, tworzenie skrzepu zostało bezpośrednio zahamowane, głównie poprzez opóźnienie odkładania fibryny (Rysunek 2F).
Analiza danych 
Aby zbadać wpływ różnych źródeł śródbłonka na tworzenie zakrzepów, przeanalizowano zmiany komórkowe po 5 min perfuzji krwi. Śródbłonek utrwalono, a przylegające płytki krwi znakowano przeciwciałem CD42b przed obrazowaniem pod mikroskopem konfokalnym. Pozwoliło to na szczegółową analizę kolokalizacji płytek krwi i fibryny, co może wskazywać na dysfunkcję czynników krzepnięcia we krwi. Wpływ EC na tworzenie skrzepów określono za pomocą standardowego barwienia immunofluorescencyjnego. Kontakty międzykomórkowe śródbłonka zostały zachowane, co potwierdzono barwieniem VE-kadheryny, co wskazuje, że skrzepy krwi tworzyły się na powierzchni jednowarstwy śródbłonka, a nie na leżącej poniżej macierzy w przerwach między komórkami śródbłonka (Rycina 3). Co więcej, zastosowanie różnych źródeł komórek doprowadziło do powstania różnych wzorów zakrzepów na śródbłonce. HUVEC są komórkami śródbłonka żylnego i wykazywały ograniczoną adhezję płytek krwi oraz depozycję fibryny, podczas gdy chorobowe pierwotne PAEC od pacjentów z CTEPH wykazywały obfitą adhezję płytek krwi i większą depozycję fibryny po stymulacji histaminą w porównaniu do zdrowych PAEC. Sugeruje to, że śródbłonek pacjentów z CTEPH wykazuje większą reaktywność na wazoaktywację, co skutkuje zwiększonym tworzeniem zakrzepów.
<img alt="Schemat hodowli komórek endotelialnych; diagram mikroskopowy; projekt kanału przepływowego; układ do rekalkulacji krwi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd protokołu. (A) Różne źródła i typy komórek endotelialnych zostały wyizolowane i hodowane do wykorzystania w mikroprzepływowym kanale przepływowym w eksperymentach perfuzyjnych. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu dla różnych typów komórek endotelialnych. Pasek skali = 50 µm. (B) Izolowane komórki scharakteryzowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego w celu potwierdzenia fenotypu endotelialnego. Pasek skali = 50 µm. (C) Komórki mogą być wysiewane do komercyjnych płytek przepływowych lub niestandardowych kanałów mikroprzepływowych. (D) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu komórek HUVEC hodowanych w różnych geometriach kanałów. Pasek skali = 50 µm. (E) Układ eksperymentalny doświadczeń z perfuzją krwi. Krew z cytrynianem została pobrana, rozcieńczona buforem solnym i przeprowadzona przez komórki endotelialne za pomocą pompy strzykawkowej. Płuca i żyła pępkowa na tym rysunku zostały zmodyfikowane z Servier Medical Art, na podstawie licencji Creative Common Attribution 3.0 Generic Licence. http://smart.servier.com/ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Test tworzenia zakrzepu; adhezja płytek; depozycja fibryny; histamina; dabigatran; wykresy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Akwizycja obrazu i kwantyfikacja tworzenia zakrzepu. (A) Reprezentatywne obrazy time-lapse przywierających płytek znakowanych Calcein AM-Red oraz zdeponowanej fibryny sprzężonej z Alexa488 w 1., 3. i 5. minucie po perfuzji krwi pełnej nad niestymulowanymi PAECs (B) oraz nad PAECs stymulowanymi histaminą. (C) Reprezentatywne obrazy time-lapse adhezji płytek i depozycji fibryny w 1., 3. i 5. minucie perfuzji krwi pełnej inkubowanej z dabigatranem nad PAECs stymulowanymi histaminą. Pasek skali = 50 µm. (D) Schematyczny przegląd kwantyfikacji obrazów w programie ImageJ. (E) Kwantyfikacja adhezji płytek i depozycji fibryny co 30 s na śródbłonku niestymulowanym i stymulowanym histaminą. (F) Kwantyfikacja wpływu dabigatranu na tworzenie zakrzepu, określona poprzez adhezję płytek i depozycję fibryny. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Reakcja komórek śródbłonka na histaminę w mikroskopii immunofluorescencyjnej; porównanie PAEC i HUVEC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy konfokalne z eksperymentów przepływowych służących do charakterystyki tworzenia zakrzepów w adhezji płytek krwi i depozycji fibryny na komórkach śródbłonka. Kontakty międzykomórkowe komórek śródbłonka zostały scharakteryzowane za pomocą VE-cadherin i zmierzone w kontrolnych PAEC, PAEC pochodzących od pacjentów z CTEPH oraz HUVEC. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Ten model choroby in vitro może być wykorzystany do badania interakcji krwi pełnej i komórek pochodzących od pacjenta, w szczególności śródbłonka, w celu oceny trombogenności i skuteczności leków przeciwzakrzepowych. Jest to, że komórki śródbłonka mogą być używane w różnych okolicznościach i mogą być modyfikowane poprzez wprowadzenie niestandardowych mikrofluidów lub dostosowanie parametrów przepływu krwi. Ponadto model ten może być wykorzystany do badania dynamiki skrzepliny w stanach zapalnych lub do oceny efektów terapii przeciwzakrzepowej i przeciwpłytkowej.Ostatecznie podejścia te mogą być stosowane w metodzie medycyny spersonalizowanej. Po uzyskaniu chirurgicznej próbki ludzkiej tkanki tętnicy płucnej, pokryj 60-mililitrową miskę do hodowli komórek wiążących komórki o wysokim powinowactwie dwoma mililitrami po pięć mikrogramów na mililitr fiboronektyny i inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut. Pod koniec inkubacji użyj sterylnych kleszczy w komorze z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach, aby przenieść tkankę na szalkę Petriego PBS.Jeśli tkanka nadal znajduje się w pierścieniu, przetnij tętnicę nożyczkami, uważając, aby nie dotknąć najbardziej wewnętrznej warstwy naczynia, ponieważ śródbłonek łatwo ulega uszkodzeniu i usunięciu. Po usunięciu fibronektyny dodaj cztery mililitry kompletnej pożywki z komórek śródbłonka do naczynia i za pomocą kleszczy przenieś próbkę tkanki do pożywki, użyj skalpela, aby ostrożnie zeskrobać wewnętrzną warstwę naczynia do pożywki, uważając, aby uniknąć nagromadzenia lipidów, które obserwuje się w ścianie naczynia. Po pobraniu komórek umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.Jeśli fibroblasty zanieczyszczą hodowlę, należy zastosować separację komórek o powinowactwie magnetycznym dla CD144, zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi oczyszczania komórek. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla jest definiowana jako czysta, gdy cytometria przepływowa wykrywa 10% lub mniej komórek zanieczyszczających. Po uzyskaniu wystarczającej liczby komórek śródbłonka do użytku doświadczalnego, pierwotne komórki śródbłonka można scharakteryzować pod kątem obecności markerów specyficznych dla komórek śródbłonka oraz braku markerów komórek mięśni gładkich i komórek nabłonka.W celu przygotowania komory przepływowej należy zakodować jeden kanał szkiełka przepływowego z sześcioma dołkami za pomocą 30 mikrolitrów 0,1% żelatyny i inkubować tę szkiełko przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oprócz komercyjnych komór przepływowych, do badania wpływu geometrii naczyń krwionośnych na dynamikę skrzepu można wykorzystać wykonane na zamówienie komory przepływowe o określonych wymiarach. Podczas inkubacji szkiełka zebrać komórki z konfluentnej hodowli komórek śródbłonka tętnicy płucnej z EDTA i trypsyną i osadzać się na komórkach przez wirowanie, ponownie zawiesić osad w 600 mikrolitrach kompletnej pożywki z komórek śródbłonka i mocno, ale delikatnie, dodać 100 mikrolitrów komórek do każdego kanału, dodać dodatkowe 50 mikrolitrów kompletnej pożywki z komórek śródbłonka do kanału, aby zapewnić wystarczającą ilość podłoża do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zmień pożywkę następnego dnia, aby zmyć niezwiązane komórki.Po sześciu dniach w hodowli komórki powinny utworzyć stabilną, zlewającą się monowarstwę. W siódmym dniu hodowli komórek śródbłonka tętnicy płucnej należy pobrać próbki krwi żylnej od osób, które nie otrzymują leczenia przeciwzakrzepowego, do 109 probówek antyzakrzepowych z cytrynianu sodu i przenieść krew do probówki o pojemności 50 mililitrów. Krew może zawierać wirusy i inne czynniki zakaźne.Dlatego ważne jest, aby zawsze nosić rękawice i postępować zgodnie ze wskazówkami dotyczącymi bezpieczeństwa podczas pracy z materiałem ludzkim. Fluorescencyjnie znakowano komórki krwi stężeniem od 1 do 10 000 Calcein AM Red i 50 mikrogramami na mililitr i dodano fibrynogen Alexa 488, a następnie inkubować krew w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby umożliwić całkowite wchłonięcie. Na 30 minut przed perfuzją należy potraktować komórki śródbłonka tętnicy płucnej 100 mikrolitrami jednej histaminy mikromolowej w podłożu komórek śródbłonka i 1% płodowej surowicy bydlęcej bez żadnych innych dodatków.I użyj 20-mililitrowej strzykawki wypełnionej buforem do płukania rurek systemu przepływowego, załaduj trzecią do 20 mililitrową strzykawkę z dwoma mililitrami buforu do płukania i załaduj strzykawkę do pompy strzykawkowej. Użyj drugiej 20-mililitrowej strzykawki, aby napełnić probówki przepływowe hipisami plus bufor zawierający 1% albuminy surowicy bydlęcej i użyj łącznika Laura w kształcie łokcia, aby ostrożnie połączyć rurki z mikroszkiełkiem, podłącz wylot szkiełka do strzykawki, napraw z mikroskopii, umieszczając komórkę zawierającą szkiełko na stoliku i montując zestaw do eksperymentu, Wyreguluj mikroskop i ustaw parametry obrazowania. Ponowne zwapnienie krwi emfatycznej.I jest to szczęśliwy współsponsor krzepnięcia, ponadto staraj się unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza, ponieważ uszkodzi to warstwę komórek śródbłonka i wpłynie na twoje wyniki. Bezpośrednio przed perfuzją należy dwukrotnie rozcieńczyć krew buforem do ponownego zwapnienia i umieścić rurkę wlotową mikroszkiełka w probówce z krwią, nacisnąć start na pompie strzykawkowej. Gdy tylko krew zacznie przepływać przez śródbłonek, naciśnij start na mikroskopie, aby uzyskać obrazy przy użyciu wstępnie wybranych kanałów aktywnych i pozycji obszaru zainteresowania, co 15 sekund przez pięć minut.Po zakończeniu analizy zatrzymaj nagrywanie i pompę strzykawkową i odpowiednio posprzątaj. Znakowanie płytek krwi za pomocą Calcein AM Red i dodatku sprzężonego fibrynogenu Alexa 488 pozwala na badanie powstawania skrzeplin przez adhezję płytek krwi i włókna oraz osadzanie. W warunkach niestymulowanych nie dochodzi do wiązania płytek krwi ani fibryny ze śródbłonkiem.Stymulacja histaminą powoduje natychmiastowy wzrost adhezji płytek krwi, która osiąga plateau po 2,5 minuty, w tym momencie płytki krwi zaczynają wydzielać czynniki autokrynne, które indukują agregację płytek krwi i rozszczepienie fibrynogenu do fibryny, co skutkuje powstawaniem błonnika i odkładania się po trzech minutach oraz tworzeniem stabilnego agregatu z płytkami krwi po czterech minutach. Leczenie bezpośrednim antykoagulantem hamuje zarówno tworzenie się skrzepów, jak i adhezję płytek krwi w porównaniu z krwią nieleczoną. Analiza immunofluorescencyjna interakcji między komórkami płytek krwi w śródbłonku tętnicy płucnej po pięciu minutach perfuzji ujawnia utrzymanie komórki śródbłonka, kontakty komórkowe, co potwierdza barwienie kadheryny śródbłonka naczyniowego, co wskazuje, że skrzepy krwi tworzą się na warstwach modelu śródbłonka, a nie na leżącej poniżej macierzy między szczelinami śródbłonka.Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej wykazują mniejszą adhezję płytek krwi i odkładanie fibryny w porównaniu ze śródbłonkiem tętnicy płucnej. Warto zauważyć, że chore pierwotne komórki śródbłonka tętnicy płucnej u pacjentów z przewlekłym zakrzepowo-zatorowym nadciśnieniem płucnym wykazują zwiększoną adhezję płytek krwi i większe odkładanie fibryny w porównaniu ze zdrowymi komórkami. Trombogenność śródbłonka zależy od wielu czynników, takich jak pochodzenie łożyska naczyniowego lub części tła biologicznego.Za pomocą tego protokołu można badać wewnętrzne dysfunkcje składników naczyniowych i krwi, a także skuteczność terapii przeciwzakrzepowej podczas różnych faz hemostazy zakrzepicy. Protokół ten może być wykorzystany do zrozumienia interakcji między krwią a Theo w różnych chorobach zakrzepowo-zatorowych z ostatecznym potencjałem przewidywania specyficznych dla pacjenta odpowiedzi na terapię przeciwzakrzepową.

in-vitro-microfluidic-disease-model-to-study-whole-blood-endothelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Platforma mikrokanałów na chipie została opracowana przez połączenie techniki fotorezystu fotolitografii rozpływowej, miękkiej litografii i mikrofluidyki. Platforma mikrokanalizacyjna naśladuje trójwymiarową (3D) geometrię mikronaczyń in vivo, działa w kontrolowanym ciągłym przepływie perfuzyjnym, umożliwia wysokiej jakości obrazowanie w czasie rzeczywistym i może być stosowana do badań mikronaczyniowych.

Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Brakuje dostępu do wiarygodnych modeli do badania interakcji naczyniowych krwi u ludzi. Przedstawiamy model in vitro hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka w połączeniu z ludzką krwią pełną w celu zbadania interakcji komórkowych zarówno we krwi (ELISA), jak i w przedziale naczyniowym (mikroskopia).

Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem

Ten protokół replikuje fizjologiczny lub patologiczny przepływ krwi in vitro, aby pomóc w określeniu odpowiedzi komórek w patologiach chorobowych. Wprowadzając komorę tłumiącą ciśnienie za pompą krwi, przepływ krwi przez naczynia krwionośne może zostać ponownie podsumowany i nałożony na monowarstwę śródbłonka naczyniowego lub kokulturę mimetyczną.

In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Prezentujemy model in vitro, który pozwala na badanie i analizę krzepnięcia w pełnej, nieantykoagulowanej krwi. Antykoagulacja w ustroju zależy od naturalnego działania przeciwzakrzepowego zdrowych komórek śródbłonka, a aktywacja komórek śródbłonka spowoduje krzepnięcie.

Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej

Prezentowany tutaj jest protokół dla ustandaryzowanego modelu pętli hemodynamicznej in vitro. Model ten pozwala na przetestowanie hemokompatybilności probówek perfuzyjnych lub stentów naczyniowych zgodnie z normą ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna) 10993-4.

Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych

Testy trombolizy in vitro często miały trudności z odtworzeniem warunków in vivo, czy to w trawionej skrzeplinie, czy w środowisku, w którym tromboliza zachodzi. W tym artykule badamy, w jaki sposób sprzężenie pętli Chandlera i testu fluorometrycznej fibrynolizy przepływowej w czasie rzeczywistym (RT-FluFF) jest wykorzystywane do monitorowania lizy skrzepów ex vivo o wysokiej wierności.

Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli Chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro

Przedstawiamy tutaj protokół do wytworzenia i obsługi układu mikrofluidalnego, który naraża komórki śródbłonka na zsynchronizowany oscylatorny hiperglikemię i pulsujące naprężenia ścinające. Takie podejście zapewnia fizjologicznie istotny in vitro model do badania cukrzycowej dysfunkcji śródbłonka. Ten protokół umożliwia ilościowe pomiary stresu oksydacyjnego i reakcji komórek śródbłonka.

System mikrofluidyczny do modelowania dysfunkcji endotelialnych w warunkach połączonego fizjologicznego pulsującego stresu ścinającego i oscylacyjnej hiperglikemii

Poznaj mikroprzepływowy model in vitro do badania interakcji pełnej krwi z komórkami śródbłonka pacjenta. Ta metoda umożliwia ocenę zakrzepowości i skuteczności terapii przeciwzakrzepowych w czasie rzeczywistym.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów