Platforma lab-on-a-chip do stymulacji mechanotransdukcji osteocytów i analizy funkcjonalnych wyników przebudowy kości

W tym miejscu przedstawiamy protokoły hodowli komórek kostnych w ramach adaptowalnej platformy lab-on-a-chip. Techniki te mogą być wykorzystane do pogłębienia naszego zrozumienia mechanizmów, które regulują mechanicznie indukowaną przebudowę kości. Nasz system pozwala na długoterminową hodowlę komórek kostnych, co umożliwia bezpośrednie ilościowe określenie procesu tworzenia i resorpcji kości w odpowiedzi na zmienione środowiska obciążenia mechanicznego.

Zastosowanie tych podstawowych technik może prowadzić do odkryć, które obejmują szereg problemów związanych z kośćmi, takich jak osteoporoza, gojenie złamań i osteoliza okołoprotezowa. Aby utworzyć warstwę studzienki i mikrokanałów, połącz prepolimer PDMS i utwardzacz w stosunku 10 do jednego w plastikowym kubku i energicznie wymieszaj, a następnie odgazuj polimer przez 30 minut. Powoli wylej mieszaninę na odpowiednią, wstępnie wypoziomowaną maskę.

Odstaw na 30 minut i piecz w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Poluzuj krawędzie PDMS stożkową szpatułką laboratoryjną i ostrożnie oderwij ją od maski, a następnie wytnij pojedyncze wióry skalpelem i szablonem wydrukowanym w 3D i wyczyść je taśmą pakową. Aby wykonać warstwę membrany PDMS, powtórz poprzednie kroki dotyczące mieszania, nalewania i pieczenia PDMS.

Wyjmij arkusz PDMS ze skrzynki wyrównującej i przytnij poszczególne membrany, które pasują do wymiarów studni i warstwy mikrokanałów. Użyj suwmiarki, aby zmierzyć grubość membrany pośrodku i wyrzuć wszelkie membrany, które znajdują się poza pożądaną grubością, a następnie ostrożnie wyczyść membrany taśmą pakową i umieść je na kawałku folii parafinowej. Aby wykonać warstwę pokrywy PDMS, powtórz poprzednie kroki dotyczące mieszania, nalewania i pieczenia PDMS.

Po przycięciu poszczególnych wieczek na wymiar, przebij otwory dostępowe przez PDMS za pomocą jednomilimetrowego dziurkacza do biopsji, a następnie wyczyść je taśmą pakową. Aktywuj powierzchnie warstwy pierwszej i drugiej za pomocą środka do czyszczenia plazmowego przez 30 sekund przy ustawieniu mocy średniej częstotliwości radiowej, a następnie wyrównaj otwory dostępowe w warstwie pierwszej z mikrokanałami w warstwie drugiej i mocno dociśnij obie warstwy do siebie. W przypadku konstrukcji studni głębinowej powtórz ten proces z warstwami drugą i trzecią za pomocą taśmy dwustronnej, aby przymocować warstwę parafinową warstwy trzeciej do płaskiej powierzchni podczas obróbki plazmowej.

Odetnij nadmiar materiału z membrany PDMS i ostrożnie oderwij arkusz folii parafinowej od spodu chipa. Piecz chips w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby zwiększyć siłę wiązania między warstwami PDMS, a następnie włóż kątowe końcówki dozujące do otworów dostępowych w pokrywie i zabezpiecz je dwuczęściową żywicą epoksydową za pomocą końcówki do mikropipet, aby nałożyć żywicę epoksydową wokół każdej końcówki. Po całkowitym utwardzeniu żywicy epoksydowej wyczyść powierzchnię chipa 70% etanolem i przenieś go do szafy bezpieczeństwa biologicznego.

Podłącz pięciomililitrową strzykawkę do końcówek dozujących ze sterylną silikonową rurką i napełnij cały chip 70% etanolem przez co najmniej 30 sekund. Usuń etanol z chipa i wysterylizuj go światłem UV przez noc. Następnego dnia umyj frytek trzy razy wodą destylowaną, napełnij go wodą i wyjmij rurkę z końcówek dozujących.

Inkubuj chip przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść sprężynę naciskową wokół wału płyty dociskowej i włóż ją do środkowego otworu w dolnej części podstawy, a następnie przymocuj blok wybierania do dolnej części podstawy za pomocą czterech wkrętów samogwintujących. Umieść drugą sprężynę naciskową wokół centralnej.

Włóż do sześciokątnego otworu w dolnej części tarczy i wkręć zespół w gwintowany otwór pośrodku bloku wybierania. Przykręć cztery wsporniki męsko-żeńskie w dolnej części podstawy. Usuń luz z urządzenia, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż górna część płyty znajdzie się poniżej górnej części podstawy, a następnie powoli obracaj pokrętłem zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż górna część płyty zrówna się z górną częścią podstawy.

Użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby usunąć wodę z wióra studni głębinowej i pokryj dno studzienki 200 mikrolitrami kolagenu typu I w kwasie octowym na godzinę. Opłucz chip trzy razy za pomocą DPBS z wapniem i magnezem i umieść go w uchwycie na wióry. Wysiewaj chip z osteocytami MLO-Y4 w pożywce MEM alfa uzupełnionej surowicą cielęcą, FBS i penicyliną/streptomycyną.

Wyjmij rurkę z końcówek dozujących, umieść chip w głębokim naczyniu hodowlanym i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla przez 72 godziny. Po inkubacji przymocuj sterylne rurki do końcówek dozujących i użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby usunąć zużytą pożywkę hodowlaną z chipa, a następnie powoli ponownie napełnij chip świeżą pożywką. Umieść uchwyt na wióry w prostokątnej wstawce na górze podstawy urządzenia ładującego, przeprowadź rurkę przez szczeliny znajdujące się na pokrywie i przymocuj pokrywę do podstawy.

Przyłóż ładunek do komórek, obracając pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż do osiągnięcia żądanego przemieszczenia płyty, a następnie umieść urządzenie ładujące w pustym pudełku z końcówkami do mikropipet P1000 i inkubuj komórki z ładunkiem przez 15 minut. Po inkubacji usuń ładunek z komórek, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara do pierwotnej pozycji wyjściowej, a następnie zdejmij pokrywę z urządzenia, umieść uchwyt na chipy na płytce do hodowli głębinowej i inkubuj komórki przez 90-minutowy okres rekonwalescencji po załadowaniu. Użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby usunąć kondycjonowane podłoże z chipa i wyjmij wiór z uchwytu na wióry, a następnie użyj stożkowej szpatułki, aby zerwać wiązanie między pokrywą PDMS a warstwą studzienki.

Komórki są teraz gotowe do analizy. Konfiguracja płytkiej studni może być wykorzystana do analizy aktywności funkcjonalnej osteoblastów i osteoklastów. Tworzenie kości z preosteoblastów określono ilościowo za pomocą czerwieni alizarynowej i barwienia von Kossa.

Resorpcję kości z osteoklastów określono ilościowo za pomocą barwienia błękitem toluidyny, a do sprawdzenia obecności wgłębień resorpcyjnych użyto skaningowej mikroskopii elektronowej. Konfiguracja chipa z głęboką studnią została wykorzystana do indukcji mechanotransdukcji osteocytów poprzez rozciąganie komórek poprzez statyczne rozdęcie poza płaszczyzną. Obrazy osteocytów osadzonych w chipach pokazują, że 48-godzinna inkubacja chipa z wodą destylowaną ma kluczowe znaczenie dla utrzymania żywotności komórek w typowej morfologii.

Podczas napadów obciążenia osteocyty były wystawione na działanie gradientu szczepów indukowanego na błonie PDMS. Określono zależność między średnim odkształceniem zastępczym a przemieszczeniem płyty dla wartości od jednego do dwóch milimetrów i wygenerowano reprezentatywną mapę cieplną indukowanego odkształcenia. Po załadowaniu analizowano żywotność komórek za pomocą barwienia dehydrogenazą mleczanową oraz testu aneksyny V i martwych komórek.

Barwienie dehydrogenazą mleczanową rozciągniętych osteocytów wykazało jaśniejsze zabarwienie w pobliżu zewnętrznej krawędzi studzienki, co odpowiada lokalizacji wyższych wartości szczepu. Nasza platforma zapewnia wysoki stopień wszechstronności i może być używana do badania różnych czynników regulujących przebudowę kości, takich jak mechanotransdukcja wywołana obciążeniem, stan zapalny i działanie leków. Przedstawione tutaj techniki stanowią podstawę do opracowania prawdziwego narządu kostnego na chipie, który może znacznie poszerzyć nasze zrozumienie wielokomórkowych zawiłości regulujących zdrowie kości.