Name: Platforma lab-on-a-chip do stymulacji mechanotransdukcji osteocytów i analizy funkcjonalnych wyników przebudowy kości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj platformę lab-on-a-chip do badania mechanotransdukcji osteocytów i analizy przebudowy kości. Technika umożliwia długoterminową hodowlę komórek kostnych oraz ilościowe określenie tworzenia i resorpcji kości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation w ramach grantów nr (CBET 1060990 i EBMS 1700299). Ponadto materiał ten opiera się na pracach wspieranych przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program w ramach grantu nr. (2018250692). Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

1. Przygotowanie maski chipowej
UWAGA: Kroki 1.1 - 1.3 muszą być wykonane tylko raz po pierwszym otrzymaniu maski chipowej. Dbają o to, aby maska nie wygięła się podczas użytkowania. Konstrukcja masek mikroprzepływowych została wcześniej opisana11,14. Maski zostały zaprojektowane wewnętrznie i wyprodukowane komercyjnie przy użyciu stereolitografii o wysokiej rozdzielczości (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
<ol>
	<li>Przykryj górną powierzchnię maski plastikową folią, aby chronić tę powierzchnię przed klejem. Przymocuj maskę wiórową do arkusza akrylowego o równej wielkości za pomocą kleju w sprayu. Zaciśnij kawałki razem przez noc, aby klej mógł się w pełni utwardzić. Po wyschnięciu kleju usuń plastikową folię z górnej części maski.</li>
	<li>Przymocuj dolną część arkusza akrylowego do wydrukowanego w 3D pudełka poziomującego (rysunek uzupełniający 1, pliki uzupełniające 1-4) za pomocą taśmy dwustronnej. Mocno dociśnij, aby zapewnić ścisłe połączenie.</li>
	<li>Uszczelnij wszelkie małe otwory w pobliżu zdejmowanej ścianki skrzynki wyrównującej wodoodpornym uszczelniaczem. Pozostaw szczeliwo do utwardzenia przez 24 godziny.</li>
	<li>Oczyść powierzchnię maski 70% etanolem (EtOH). Umieść pudełko wyrównujące z żądaną maską na wióry w piekarniku. Użyj kątomierza cyfrowego, aby upewnić się, że górna część maski jest wypoziomowana. W razie potrzeby wyreguluj poziomujące.</li>
</ol>
2. Produkcja PDMS
UWAGA: Układ chipowy płytkiej studni (1 mm) jest używany do testów aktywności funkcjonalnej (tworzenie i resorpcja), a układ chipowy z głęboką studnią (10 mm) jest używany do badań obciążenia mechanicznego. Dno studni głębinowej jest formowane przez przymocowanie oddzielnej cienkiej membrany PDMS (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).
<ol>
	<li>Warstwa pokrywy (warstwa 1)
	<ol>
		<li>Połącz 63 g prepolimeru PDMS i 6,3 g utwardzacza (w stosunku 10:1) w plastikowym kubku. Dokładnie wymieszać jednorazową szpatułką do komórek i odgazować w eksykatorze próżniowym przez 30 minut.</li>
		<li>Powoli wlej mieszaninę do przygotowanego pudełka wyrównującego. Pozostaw PDMS na 30 minut, a następnie piecz w temperaturze 45 °C przez 18 godzin.</li>
		<li>Poluzuj krawędzie PDMS za pomocą stożkowej szpatułki laboratoryjnej i wyjmij arkusz polimerowy z pudełka wyrównującego.</li>
		<li>Przytnij poszczególne pokrywki na wymiar (70 mm x 34 mm) za pomocą skalpela i szablonu wydrukowanego w 3D.</li>
		<li>Przebić otwory dostępowe przez każdą pokrywę za pomocą dziurkacza do biopsji (średnica 1 mm).</li>
		<li>Oczyść powierzchnię pokrywek taśmą pakową. 
		UWAGA: Jeśli pokrywki nie są używane od razu, owiń je taśmą pakową i przechowuj w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Studnia i warstwa mikrokanalików (warstwa 2)
	<ol>
		<li>Połącz prepolimer PDMS i utwardzacz (w stosunku 10:1) w plastikowym kubku. Konstrukcja z płytką studnią wymaga 43 g prepolimeru i 4,3 g utwardzacza, a konstrukcja z głęboką studnią wymaga 227 g prepolimeru i 22,7 g utwardzacza. Energicznie wymieszać polimer i odgazować przez 30 min. 
		UWAGA: Przyjmuje się, że wymiar maski wynosi 152,4 mm x 152,4 mm.</li>
		<li>Powoli wylej mieszaninę na odpowiednią, wstępnie wyrównaną maskę. Pozostaw PDMS na 30 minut, a następnie piecz w temperaturze 45 °C przez 18 godzin.</li>
		<li>Poluzuj krawędzie PDMS za pomocą stożkowej szpatułki laboratoryjnej i ostrożnie oderwij polimer od maski. Użyj skalpela i szablonu wydrukowanego w 3D, aby wyciąć pojedyncze wióry. 
		UWAGA: W przypadku badań załadunku ważne jest, aby wymiary wióra (70 x 34 mm) były precyzyjne i aby studzienka znajdowała się pośrodku chipa.</li>
		<li>Powierzchnię PDMS należy oczyścić taśmą pakową. 
		UWAGA: Jeśli chipy nie są używane od razu, owiń każdy chip w taśmę pakową i przechowuj w RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cienka membrana PDMS (warstwa 3) 
	UWAGA: Ta warstwa jest używana tylko do projektowania studni głębinowych.
	<ol>
		<li>Do plastikowego kubka dodać 12,7 g prepolimeru PDMS i 1,3 g utwardzacza (w stosunku 10:1). Mieszać energicznie i odgazowywać przez 30 minut.</li>
		<li>Powoli wlej polimer do przygotowanego pudełka wyrównującego i dokładnie zeskrob plastikowy kubek, aby usunąć jak najwięcej PDMS.</li>
		<li>Użyj szpatułki do komórek, aby rozprowadzić PDMS na całej powierzchni. 
		UWAGA: Jeśli polimer nie zostanie ręcznie rozłożony, napięcie powierzchniowe będzie wystarczające, aby zapobiec tworzeniu się jednolitego arkusza polimeru.</li>
		<li>Pozostaw PDMS na 30 minut, a następnie piecz w temperaturze 45 °C przez 18 godzin.</li>
		<li>Poluzuj krawędzie PDMS za pomocą stożkowej szpatułki i ostrożnie wyjmij arkusz PDMS z pudełka wyrównującego. Wytnij pojedyncze membrany, które pasują do wymiarów warstwy 2.</li>
		<li>Zmierz grubość membrany w środku membrany za pomocą suwmiarki. Wyrzuć wszystkie membrany, które znajdują się poza pożądaną grubością (0,5 mm ± 0,1 mm).</li>
		<li>Ostrożnie oczyść membrany taśmą pakową i ułóż na kawałku folii parafinowej. 
		UWAGA: Jeśli membrany nie są używane od razu, przykryj górną część membrany taśmą pakową i przechowuj w temperaturze RT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Substraty aktywności funkcjonalnej
UWAGA: Krążki polistyrenowe i płytki kostne muszą być przymocowane do dna studzienek, które będą używane odpowiednio do hodowli osteoblastów i osteoklastów.
<ol>
	<li>Krążki z polistyrenu (<klasa mocna="xfig">Rysunek 1C)
	<ol>
		<li>Umieść taśmę maskującą na tylnej stronie polistyrenowego szkiełka nakrywkowego poddanego działaniu kultur tkankowych. Wyciąć okrągłe krążki ze szkiełka nakrywkowego za pomocą zaostrzonego świdra korkowego (średnica 5,4 mm). Zanurz krążki w 70% EtOH i pozostaw na noc.</li>
		<li>Delikatnie wyszoruj górną powierzchnię krążka aplikatorem z bawełnianą końcówką nasączonym 70% EtOH. Upewnij się, że zewnętrzna krawędź dysku jest dokładnie oczyszczona.</li>
		<li>Za pomocą dwóch par kleszczy przytrzymaj dysk i usuń podkład z taśmy maskującej. Umieść krążek stroną potraktowaną do dołu i wyczyść tylną stronę za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.</li>
		<li>Zanurz drewnianą końcówkę aplikatora z bawełnianą końcówką w odgazowanej mieszaninie nieutwardzonego PDMS i umieść niewielką ilość polimeru na dnie żądanego dołka. 
		UWAGA: Pozostały nieutwardzony PDMS można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Umieść krążek polistyrenowy stroną podniesioną do góry w studzience i delikatnie dociśnij krążek bawełnianym wacikiem. Upewnij się, że żaden nieutwardzony PDMS nie styka się z obrabianą stroną dysku. 
		UWAGA: Jeśli PDMS wejdzie w kontakt z obrabianą powierzchnią dysku, wyjmij dysk z dołka i powtórz kroki 3.1.4 i 3.1.5 z nowym dyskiem.</li>
		<li>Pozostaw frytki na równej powierzchni na 30 minut, a następnie piecz w temperaturze 65 °C przez 4 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wafle kostne
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy umieść wafel kostny (o średnicy 6 mm, grubości 0,4 mm) na dnie naczynia o średnicy 100 mm. Przytrzymaj wafel stabilnie kleszczami i delikatnie wytraw literę "X" z tyłu wafla za pomocą skalpela. 
		UWAGA: Podczas procesu obrazowania "X" służy do rozróżnienia tylnej części płytki od powierzchni, na której zostały wysiane komórki.</li>
		<li>Użyj drewnianego końca aplikatora z bawełnianą końcówką, aby dodać niewielką ilość nieutwardzonego PDMS na dno żądanego dołka. Umieść wafel kostny, oznaczoną stroną do dołu, w studzience i użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby docisnąć wafel.</li>
		<li>Pozostaw frytki na równej powierzchni na 30 minut, a następnie piecz w temperaturze 65 °C przez 4 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Montaż i sterylizacja chipów
<ol>
	<li>Aktywuj powierzchnie warstwy 1 i warstwy 2 za pomocą myjki plazmowej przez 30 sekund, używając ustawienia mocy średniej częstotliwości radiowej (RF) (co odpowiada około 10.2 W).</li>
	<li>Dopasuj otwory dostępowe w warstwie 1 do mikrokanalików w warstwie 2 i mocno dociśnij obie warstwy do siebie.</li>
	<li>W przypadku projektu ze studnią głębinową powtórz krok 4.1 z warstwą 2 i warstwą 3. Podczas obróbki plazmowej za pomocą taśmy dwustronnej przymocuj folię parafinową warstwy 3 do płaskiej powierzchni.</li>
	<li>Użyj skalpela, aby odciąć nadmiar materiału z membrany PDMS. Ostrożnie oderwij arkusz folii parafinowej od spodu chipa</li>
	<li>Piecz frytki w temperaturze 65 °C przez 10 minut, aby zwiększyć siłę wiązania między warstwami PDMS.</li>
	<li>Włóż kątowe końcówki dozujące (rozmiar 18, 0.5 cala, 90°) do otworów dostępowych w pokrywie. Przymocuj końcówki dozujące do pokrywki za pomocą dwuskładnikowej żywicy epoksydowej. Użyj końcówki do mikropipet, aby nałożyć żywicę epoksydową wokół każdej końcówki dozującej.</li>
	<li>Po całkowitym utwardzeniu żywicy epoksydowej wyczyść powierzchnię chipa 70% EtOH i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wykonaj wszystkie kolejne kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Podłącz strzykawkę o pojemności 5 ml do końcówek dozujących ze sterylną silikonową rurką (1/32'' ID, ~10 cm długości) i napełnij cały chip 70% EtOH przez co najmniej 30 s. W przypadku konstrukcji z płytką studnią wszystkie płyny należy podawać za pomocą pompy strzykawkowej ustawionej na natężenie przepływu 4 ml/h. W przypadku konstrukcji z głęboką studnią należy podawać wszystkie płyny, powoli dozując strzykawkę ręcznie.</li>
	<li>Usuń EtOH z chipa i wysterylizuj chip światłem UV przez noc.</li>
	<li>Umyj frytki 3 razy za pomocą dH2O. Napełnij wiór dH2O, wyjmij rurkę z końcówek dozujących i inkubuj przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Zespół mechanicznego urządzenia ładującego
UWAGA: Procesy projektowania i produkcji dla drukowanego w 3D mechanicznego urządzenia ładującego (Rysunek 2A-C) zostały wcześniej opisane i wszystkie pliki projektowe dla drukowanych komponentów zostały wcześniej dostarczone13.
<ol>
	<li>Autoklawować wszystkie elementy urządzenia ładującego przez 30 minut w temperaturze 121 °C. 
	UWAGA: Aby uniknąć wypaczania drukowanych elementów, owiń każdy element osobno folią i umieść na twardej, płaskiej powierzchni podczas procesu autoklawowania. Metalowy sprzęt można owinąć razem. Wykonaj wszystkie kolejne kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Umieść sprężynę naciskową wokół wału płyty dociskowej i włóż płytę do środkowego otworu w dolnej części podstawy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	<li>Przymocuj blok wybierania do dolnej części podstawy za pomocą czterech wkrętów samogwintujących.</li>
	<li>Umieść drugą sprężynę naciskową wokół centralnej. Włóż do sześciokątnego otworu w dolnej części tarczy i wkręć zespół w gwintowany otwór pośrodku bloku wybierania.</li>
	<li>Przykręć cztery wsporniki męsko-żeńskie w dolnej części podstawy.</li>
	<li>Usuń luz z urządzenia, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż górna część płyty znajdzie się poniżej górnej części podstawy. Następnie powoli obracaj tarczę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż górna część płyty zrówna się z górną częścią podstawy.</li>
</ol>
6. Eksperymentowanie
UWAGA: Protokoły eksperymentów z aktywnością funkcjonalną były wcześniej dostarczane11,12.
<ol>
	<li>Badania obciążenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
	<ol>
		<li>Wykonując krok 4.9, użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby usunąć dH2O z chipa studni głębinowej. Pokryj dno studzienki 200 μl 0,15 mg/ml kolagenu typu I (CTI) w 0,02 M kwasie octowym przez 1 godzinę.</li>
		<li>Trzykrotnie przepłukać frytki solą fizjologiczną z wapniem i magnezem buforowanym fosforanami firmy Dulbecco (DPBS++).</li>
		<li>Umieść chip w uchwycie na chipsy i wysiew z osteocytami MLO-Y4 o gęstości 2 x 104 komórek/ml w minimalnej niezbędnej pożywce alfa (MEMα) uzupełnionej 5% surowicą cielęcą, 5% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną.</li>
		<li>Wyjmij rurkę z końcówek dozujących i umieść chip w głębokim naczyniu hodowlanym (150 mm x 25 mm). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 72 godziny.</li>
		<li>Podłącz sterylne rurki do końcówek dozujących i użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby usunąć zużytą pożywkę hodowlaną z chipa. Powoli dozuj świeżą pożywkę hodowlaną, aby ponownie napełnić chip.</li>
		<li>Umieść uchwyt na wióry w prostokątnej wstawce na górze podstawy urządzenia ładującego. Przeprowadź rurkę przez szczeliny znajdujące się na pokrywie urządzenia ładującego i przymocuj pokrywę do podstawy za pomocą czterech z stożkowym płaskim i nakrętek sześciokątnych. 
		UWAGA: Aby upewnić się, że pokrywa pozostaje wypoziomowana, najpierw dokręć dwie, które znajdują się po przekątnej od siebie, zanim dokręcisz pozostałe dwie.</li>
		<li>Przyłóż obciążenie do ogniw, obracając pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż do osiągnięcia żądanego przemieszczenia płyty. 
		UWAGA: Urządzenie zostało zaprojektowane w taki sposób, że jeden obrót tarczy jest równy przemieszczeniu płyty o 1 mm. Pole odkształcenia generowane na górze membrany PDMS było wcześniej modelowane jako funkcja przemieszczenia płyty za pomocą analizy elementów skończonych (MES)13.</li>
		<li>Umieść urządzenie ładujące w pustym pudełku na końcówki do mikropipet P1000. Inkubować komórki z przyłożonym ładunkiem przez 15 min. 
		UWAGA: Użyty tutaj okres czasu ładowania służy jako przykład. Można zastosować alternatywne czasy ładowania.</li>
		<li>Po inkubacji usuń ładunek z komórek, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż płyta powróci do pierwotnej pozycji wyjściowej. Zdejmij pokrywę z urządzenia i umieść uchwyt na wióry w płytce do hodowli głębinowej. Inkubuj komórki przez 90-minutowy okres regeneracji po obciążeniu. 
		UWAGA: Ponownie, okres odzyskiwania użyty tutaj służy jako przykład. Można zastosować alternatywne czasy odzyskiwania. W przypadku badań długoterminowych należy karmić komórki co 72 godziny.</li>
		<li>Użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby usunąć kondycjonowane podłoże z chipa. 
		UWAGA: To medium można zapisać i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Wyjmij chip z uchwytu na wióry i użyj stożkowej szpatułki, aby zerwać połączenie między pokrywą PDMS a warstwą studzienki. 
		UWAGA: Testy komórkowe można teraz wykonywać zgodnie z dowolnym protokołem ustalonym dla płytki do hodowli komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+Osteocytes%2C+and+Mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction.</a> Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amazing+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li>
<li>Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+platform+for+investigating+osteocyte-osteoclast+signalling+during+fluid+shear+stress+mechanostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation.</a> Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).</li>
<li>Kou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multishear+microfluidic+device+for+quantitative+analysis+of+calcium+dynamics+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).</li>
<li>Ma, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chip-based+co-culture+of+fibroblast-like+synoviocytes+with+osteoblasts+and+osteoclasts+to+test+bone+erosion+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation.</a> Royal Society Open Science. 5 (9), 180528(2018).</li>
<li>Jang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+osteoblast-based+3D+continuous-perfusion+microfluidic+system+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PLOS ONE. 9 (2), e89966(2014).</li>
<li>Hwang, P. W., Horton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+osteogenic+performance+of+MC3T3-E1+subclones+impacts+their+utility+as+models+of+osteoblast+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 8299(2019).</li>
<li>Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+lifetime+lead+exposure+impedes+osteoclast+activity+and+produces+an+increase+in+bone+mass+in+adolescent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice.</a> Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).</li>
<li>Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+growth+factor+control+of+bone+formation+through+osteoprogenitor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation.</a> Bone. 34 (3), 402-411 (2004).</li>
<li>George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-chip+platforms+for+quantification+of+multicellular+interactions+in+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling.</a> Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).</li>
<li>Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+considerations+for+optimizing+bone+cell+culture+and+remodeling+in+a+lab-on-a-chip+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform.</a> Biotechniques. , In review (2019).</li>
<li>Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+loading+device+for+inducing+cellular+mechanotransduction+via+matrix+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation.</a> Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).</li>
<li>George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanically+loaded+osteocytes+and+inflammation+on+bone+remodeling+in+a+bisphosphonate-induced+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment.</a> Bone. 127, 460-473 (2019).</li>
<li>George, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quantifying+the+roles+of+stimulated+osteocytes+and+inflammation+in+bone+remodeling+Doctor+of+Philosophy%22">Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy</a>. , University of Akron. (2019).</li>
<li>York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+osteocytic+microdamage+and+viability+quantification+using+a+microloading+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Engineering+%26+Physics%22%5BJournal%5D)">In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform.</a> Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).</li>
<li>Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+plasma+treatment+of+polymer+surface+for+irreversible+sealing+of+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices.</a> Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).</li>
<li>Millare, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+the+quality+of+adhesion+between+poly%28dimethylsiloxane%29+and+glass+surfaces+on+the+conditions+of+treatment+with+oxygen+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma.</a> Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+compatibility+of+poly%28dimethylsiloxane%29-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices.</a> Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li>
<li>Regehr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncured+PDMS+inhibits+myosin+in+vitro+motility+in+a+microfluidic+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell.</a> Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).</li>
<li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li>
<li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li>
<li>Van Scoy, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+automata+model+of+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mathematical+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A cellular automata model of bone formation.</a> Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).</li>
<li>Truesdell, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+remodeling+platforms%3A+Understanding+the+need+for+multicellular+lab-on-a-chip+systems+and+predictive+agent-based+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mathematical+Biosciences+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models.</a> Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano podstawy wytwarzania platformy LOC do przebudowy kości do hodowli osteocytów, osteoklastów i osteoblastów. Zmieniając głębokość i rozmiar studzienki w chipie, opracowano wiele konfiguracji do stymulacji osteocytów obciążeniem mechanicznym i ilościowego określenia funkcjonalnych wyników przebudowy kości (ryc. 1B).
Podczas montażu chipów optymalizacja protokołu utleniania plazmowego miała kluczowe znaczenie dla wyeliminowania ...

Kość to bardzo dynamiczna tkanka, która wymaga skomplikowanej koordynacji między trzema głównymi typami komórek: osteocytami, osteoblastami i osteoklastami. Interakcje wielokomórkowe między tymi komórkami są odpowiedzialne za utratę masy kostnej, która występuje podczas paraliżu i długotrwałego unieruchomienia oraz za tworzenie kości, które następuje w odpowiedzi na wzrost i ćwiczenia. Osteocyty, najliczniejszy typ komórek kostnych, są bardzo wrażliwe na bodźce mechaniczne wywierane na kość. Stymulacja mechaniczna zmienia aktywność metaboliczną osteocytów i prowadzi do wzrostu kluczowych cząsteczek sygnałowych1,2. Dzięki temu procesowi, znanemu jako mechanotransdukcja, osteocyty mogą bezpośrednio koordynować działania osteoblastów (komórek tworzących kość) i osteoklastów (komórek resorpcyjnych kości). Utrzymanie homeostazy kości wymaga ścisłej regulacji między tworzeniem kości a szybkością resorpcji kości; Jednak zakłócenia w tym procesie mogą skutkować stanami chorobowymi, takimi jak osteoporoza czy osteopetroza.
Złożoność interakcji między tymi trzema typami komórek dobrze nadaje się do badań z wykorzystaniem technologii mikroprzepływowych i lab-on-a-chip (LOC). W tym celu nasze laboratorium niedawno opracowało dowód słuszności koncepcji platformy LOC do analizy resorpcji i tworzenia kości (wyników funkcjonalnych) w procesie przebudowy kości. Platforma może być wykorzystywana do badania interakcji komórkowych, zmienionych środowisk ładowania i badań przesiewowych leków. W ostatnich latach opracowano różne urządzenia mikroprzepływowe do badania molekularnych szlaków sygnałowych, które regulują przebudowę kości; Jednak wiele z tych systemów określa ilościowo przemodelowanie za pomocą pośrednich markerów, które wskazują na aktywność funkcjonalną3,4,5,6,7. Zaletą naszego systemu jest to, że można go wykorzystać do bezpośredniej kwantyfikacji wyników funkcjonalnych. Przebudowa kości to proces długotrwały. W związku z tym bezpośrednia kwantyfikacja resorpcji i tworzenia kości wymaga systemu hodowli, który może być utrzymywany przez co najmniej kilka tygodni do miesięcy8,9,10,11. W związku z tym, opracowując platformę LOC, ustaliliśmy długoterminowe protokoły hodowli niezbędne do tworzenia i resorpcji oraz utrzymywaliśmy komórki w systemie przez okres do siedmiu tygodni11. Dodatkowo do platformy włączyliśmy odpowiednie substraty do hodowli dla obu typów komórek; Osteoklasty hodowano bezpośrednio na kościach, a osteoblasty, o których wiadomo, że przylegają do tworzyw sztucznych, hodowano na krążkach polistyrenowych. Ponadto poruszyliśmy kwestie związane ze sterylnością, długoterminową cytotoksycznością i demontażem chipów na potrzeby analizy przebudowy11,12.
Platforma LOC może być również używana do indukcji mechanotransdukcji osteocytów poprzez deformację matrycy. Wydrukowane w 3D mechaniczne urządzenie ładujące zostało opracowane w celu sparowania z LOC i zastosowania statycznego rozdęcia poza płaszczyzną w celu rozciągnięcia komórek13. Aby skompensować to obciążenie mechaniczne, głębokość studni w obrębie LOC została zwiększona. To proste, mechaniczne urządzenie ładujące na małą skalę może być łatwo wyprodukowane przez laboratoria z ograniczonym doświadczeniem inżynierskim, a wcześniej udostępniliśmy rysunki komponentów drukowanych w 3D13. W obecnej pracy demonstrujemy niektóre z nowatorskich technik niezbędnych do pomyślnego wykorzystania LOC. W szczególności demonstrujemy wytwarzanie chipów, wysiewanie komórek na podłożach funkcjonalnych, mechaniczne ładowanie i demontaż chipów w celu ilościowego modelowania. Uważamy, że wyjaśnienie tych technik korzysta z formatu wizualnego.

<table><tbody><tr><td>Arkusz akrylowy</td><td>Optix</td> <td>-</td> <td>grubość 3,175 mm</td></tr><tr><td>Kątowe końcówki dozujące</td><td>Jensen Global</td><td>JG18-0,5X-90</td><td>Usuń plastikowe złącze przed użyciem</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP-10</td><td>o średnicy 1 mm</td></tr><tr><td>Wafle kostne</td><td>o</td><td>grubości Boneslices.com 0,4 mm</td><td>Kość korowa bydlęca</td></tr><tr><td>Surowica cielęca Bydlęca surowica</td><td></td><td></td><td></td>SH30072</tr><tr><td>Calipers</td><td>Global Industrial T9F534164</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Szpatułka</td><td>TPP</td><td>99010</td><td></td></tr><tr><td>Maska chipowa</td><td>ProtoLabs</td><td>Specjalnie zaprojektowana</td><td>Materiał do druku: Accura SL 5530</td></tr><tr><td>Świdr korkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-865-10B</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan</td><td>806-WCL</td><td></td></tr><tr><td>Kultura naczynie (100 mm)</td><td>Corning</td><td>430591</td><td>Sterylne, Niepoddawane hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane (150 mm)</td><td>Corning</td><td>430597</td><td>Sterylne, Hodowla nietkankowa</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>3M Company</td><td>Scotch 237</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Kleszcze</td><td>SH30910</td><td></td>Hyklon</tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko niwelacyjne</td><td>Wykonane na zamówienie</td> <td>-</td> <td>drukowana w 3D</td></tr><tr><td>taśma maskująca</td><td>3M Company Scoth</td><td>2600</td><td></td></tr><tr><td>MC3T3-E1 preosteoblasty</td><td>ATCC</td><td>CRL-2593</td><td>Subclone 4</td></tr><tr><td>Mechaniczne urządzenie ładujące</td><td>Wykonane na zamówienie</td> <td>-</td> <td>wydrukowane w 3D</td></tr><tr><td>Minimalne niezbędne podłoże alfa</td><td>Gibco</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>Osteocyty MLO-Y4</td> <td>--</td><td>--</td><td>Prezent od dr Lyndy Bonewald</td></tr><tr><td>Taśma pakowa</td><td>Marka</td> <td>kaczki -</td> <td>standardowa taśma pakowa</td></tr><tr><td>Folia parafinowa</td><td>Bemis Parafilm</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>p4333</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>Ekspandowany środek do czyszczenia plazmy</td></tr><tr><td>Zestaw polidimetylosiloksanu</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe szkiełka nakrywkowe</td><td>Nunc Thermanox</td><td>174942</td><td>Sterylne, poddane hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>Piekarnik Quincy</td><td>Lab</td><td>12-180</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 preosteoklasty</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>BD Medical</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td>Saint-Gobain Tygon</td><td></td><td>ABW00001 ID: 1/32" (0,79 mm), OD: 3/32" (2,38 mm)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie SolidWorks</td><td>Dassault Syst&egrave; mes</td> <td>-</td> <td>Służy do generowania modeli drukowanych w 3D i wykonywania MES</td></tr><tr><td>Klej w sprayu</td><td>Loctite</td><td>2323879</td><td>Uniwersalny klej</td></tr><tr><td>Strzykawka (5 ml)</td><td>BD Medical</td><td>309646</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvarda</td><td>70-2213</td><td>Pompa 11 Pico Plus</td></tr><tr><td>Stożkowa szpatułka laboratoryjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>Dwuczęściowa expoxy</td><td>Loctite</td><td>1395391</td><td>5-minutowy szybki zestaw</td></tr><tr><td>kolagenu typu I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Kolagen z ogona szczura</td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td><td></td></tr><tr><td>Wodoodporny uszczelniacz</td><td>Gorilla</td><td>8090001</td><td>100% uszczelniacz silikonowy</td></tr></tbody></table>

platforma lab-on-a-chip do stymulacji mechanotransdukcji osteocytów i analizy funkcjonalnych wyników przebudowy kości

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Przebudowa kości to ściśle regulowany proces, który jest niezbędny do wzrostu i naprawy szkieletu, a także adaptacji do zmian w środowisku mechanicznym. Podczas tego procesu mechanowrażliwe osteocyty regulują przeciwstawne odpowiedzi między osteoklastami katabolicznymi a osteoblastami anabolicznymi. Aby lepiej zrozumieć bardzo skomplikowane szlaki sygnałowe, które regulują ten proces, nasze laboratorium opracowało podstawową platformę lab-on-a-chip (LOC) do analizy funkcjonalnych wyników (tworzenia i resorpcji) przebudowy kości w systemie na małą skalę. Ponieważ przebudowa kości jest długotrwałym procesem, który trwa od tygodni do miesięcy, opracowaliśmy długoterminowe protokoły hodowli komórek w systemie. Osteoblasty i osteoklasty hodowano na substratach aktywności funkcjonalnej w obrębie LOC i utrzymywano przez okres do siedmiu tygodni. Następnie wióry zostały zdemontowane, aby umożliwić ilościowe określenie tworzenia i resorpcji kości. Dodatkowo zaprojektowaliśmy wydrukowane w 3D mechaniczne urządzenie ładujące, które łączy się z platformą LOC i może być używane do indukcji mechanotransdukcji osteocytów poprzez deformację macierzy komórkowej. Zoptymalizowaliśmy protokoły hodowli komórek dla osteocytów, osteoblastów i osteoklastów w ramach platformy LOC i rozwiązaliśmy problemy związane ze sterylnością i cytotoksycznością. W tym miejscu przedstawiamy protokoły wytwarzania i sterylizacji LOC, wysiewania komórek na funkcjonalnych podłożach, indukowania obciążenia mechanicznego i demontażu LOC w celu ilościowego określenia wyników końcowych. Wierzymy, że techniki te stanowią podstawę do opracowania prawdziwego narządu na chipie do przebudowy kości.

Konfiguracja z płytkimi wgłębieniami może być wykorzystywana do analizy aktywności funkcjonalnej osteoblastów i osteoklastów. Tworzenie kości przez osteoblasty oraz jej resorpcja przez osteoklasty wymagają czasu hodowli rzędu od kilku tygodni do kilku miesięcy. Tworzenie kości z preosteoblastów MC3T3-E1 ilościowo określono za pomocą barwienia alizaryną czerwoną oraz metodą von Kossa11,15. W 49. dniu średnia powierzchnia zabarwiona...

Tutaj prezentujemy protokoły analizy przebudowy kości w ramach platformy lab-on-a-chip. Wydrukowane w 3D mechaniczne urządzenie ładujące można sparować z platformą w celu wywołania mechanostransdukcji osteocytów poprzez deformację macierzy komórkowej. Platforma może być również wykorzystana do ilościowego określenia funkcjonalnych wyników przebudowy kości na podstawie osteoklastów i osteoblastów (resorpcja/tworzenie).

Platforma lab-on-a-chip do stymulacji mechanotransdukcji osteocytów i analizy funkcjonalnych wyników przebudowy kości

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

W tym miejscu przedstawiamy protokoły hodowli komórek kostnych w ramach adaptowalnej platformy lab-on-a-chip. Techniki te mogą być wykorzystane do pogłębienia naszego zrozumienia mechanizmów, które regulują mechanicznie indukowaną przebudowę kości. Nasz system pozwala na długoterminową hodowlę komórek kostnych, co umożliwia bezpośrednie ilościowe określenie procesu tworzenia i resorpcji kości w odpowiedzi na zmienione środowiska obciążenia mechanicznego.Zastosowanie tych podstawowych technik może prowadzić do odkryć, które obejmują szereg problemów związanych z kośćmi, takich jak osteoporoza, gojenie złamań i osteoliza okołoprotezowa. Aby utworzyć warstwę studzienki i mikrokanałów, połącz prepolimer PDMS i utwardzacz w stosunku 10 do jednego w plastikowym kubku i energicznie wymieszaj, a następnie odgazuj polimer przez 30 minut. Powoli wylej mieszaninę na odpowiednią, wstępnie wypoziomowaną maskę.Odstaw na 30 minut i piecz w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Poluzuj krawędzie PDMS stożkową szpatułką laboratoryjną i ostrożnie oderwij ją od maski, a następnie wytnij pojedyncze wióry skalpelem i szablonem wydrukowanym w 3D i wyczyść je taśmą pakową. Aby wykonać warstwę membrany PDMS, powtórz poprzednie kroki dotyczące mieszania, nalewania i pieczenia PDMS.Wyjmij arkusz PDMS ze skrzynki wyrównującej i przytnij poszczególne membrany, które pasują do wymiarów studni i warstwy mikrokanałów. Użyj suwmiarki, aby zmierzyć grubość membrany pośrodku i wyrzuć wszelkie membrany, które znajdują się poza pożądaną grubością, a następnie ostrożnie wyczyść membrany taśmą pakową i umieść je na kawałku folii parafinowej. Aby wykonać warstwę pokrywy PDMS, powtórz poprzednie kroki dotyczące mieszania, nalewania i pieczenia PDMS.Po przycięciu poszczególnych wieczek na wymiar, przebij otwory dostępowe przez PDMS za pomocą jednomilimetrowego dziurkacza do biopsji, a następnie wyczyść je taśmą pakową. Aktywuj powierzchnie warstwy pierwszej i drugiej za pomocą środka do czyszczenia plazmowego przez 30 sekund przy ustawieniu mocy średniej częstotliwości radiowej, a następnie wyrównaj otwory dostępowe w warstwie pierwszej z mikrokanałami w warstwie drugiej i mocno dociśnij obie warstwy do siebie. W przypadku konstrukcji studni głębinowej powtórz ten proces z warstwami drugą i trzecią za pomocą taśmy dwustronnej, aby przymocować warstwę parafinową warstwy trzeciej do płaskiej powierzchni podczas obróbki plazmowej.Odetnij nadmiar materiału z membrany PDMS i ostrożnie oderwij arkusz folii parafinowej od spodu chipa. Piecz chips w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby zwiększyć siłę wiązania między warstwami PDMS, a następnie włóż kątowe końcówki dozujące do otworów dostępowych w pokrywie i zabezpiecz je dwuczęściową żywicą epoksydową za pomocą końcówki do mikropipet, aby nałożyć żywicę epoksydową wokół każdej końcówki. Po całkowitym utwardzeniu żywicy epoksydowej wyczyść powierzchnię chipa 70% etanolem i przenieś go do szafy bezpieczeństwa biologicznego.Podłącz pięciomililitrową strzykawkę do końcówek dozujących ze sterylną silikonową rurką i napełnij cały chip 70% etanolem przez co najmniej 30 sekund. Usuń etanol z chipa i wysterylizuj go światłem UV przez noc. Następnego dnia umyj frytek trzy razy wodą destylowaną, napełnij go wodą i wyjmij rurkę z końcówek dozujących.Inkubuj chip przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść sprężynę naciskową wokół wału płyty dociskowej i włóż ją do środkowego otworu w dolnej części podstawy, a następnie przymocuj blok wybierania do dolnej części podstawy za pomocą czterech wkrętów samogwintujących. Umieść drugą sprężynę naciskową wokół centralnej.Włóż do sześciokątnego otworu w dolnej części tarczy i wkręć zespół w gwintowany otwór pośrodku bloku wybierania. Przykręć cztery wsporniki męsko-żeńskie w dolnej części podstawy. Usuń luz z urządzenia, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż górna część płyty znajdzie się poniżej górnej części podstawy, a następnie powoli obracaj pokrętłem zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż górna część płyty zrówna się z górną częścią podstawy.Użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby usunąć wodę z wióra studni głębinowej i pokryj dno studzienki 200 mikrolitrami kolagenu typu I w kwasie octowym na godzinę. Opłucz chip trzy razy za pomocą DPBS z wapniem i magnezem i umieść go w uchwycie na wióry. Wysiewaj chip z osteocytami MLO-Y4 w pożywce MEM alfa uzupełnionej surowicą cielęcą, FBS i penicyliną/streptomycyną.Wyjmij rurkę z końcówek dozujących, umieść chip w głębokim naczyniu hodowlanym i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla przez 72 godziny. Po inkubacji przymocuj sterylne rurki do końcówek dozujących i użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby usunąć zużytą pożywkę hodowlaną z chipa, a następnie powoli ponownie napełnij chip świeżą pożywką. Umieść uchwyt na wióry w prostokątnej wstawce na górze podstawy urządzenia ładującego, przeprowadź rurkę przez szczeliny znajdujące się na pokrywie i przymocuj pokrywę do podstawy.Przyłóż ładunek do komórek, obracając pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż do osiągnięcia żądanego przemieszczenia płyty, a następnie umieść urządzenie ładujące w pustym pudełku z końcówkami do mikropipet P1000 i inkubuj komórki z ładunkiem przez 15 minut. Po inkubacji usuń ładunek z komórek, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara do pierwotnej pozycji wyjściowej, a następnie zdejmij pokrywę z urządzenia, umieść uchwyt na chipy na płytce do hodowli głębinowej i inkubuj komórki przez 90-minutowy okres rekonwalescencji po załadowaniu. Użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby usunąć kondycjonowane podłoże z chipa i wyjmij wiór z uchwytu na wióry, a następnie użyj stożkowej szpatułki, aby zerwać wiązanie między pokrywą PDMS a warstwą studzienki.Komórki są teraz gotowe do analizy. Konfiguracja płytkiej studni może być wykorzystana do analizy aktywności funkcjonalnej osteoblastów i osteoklastów. Tworzenie kości z preosteoblastów określono ilościowo za pomocą czerwieni alizarynowej i barwienia von Kossa.Resorpcję kości z osteoklastów określono ilościowo za pomocą barwienia błękitem toluidyny, a do sprawdzenia obecności wgłębień resorpcyjnych użyto skaningowej mikroskopii elektronowej. Konfiguracja chipa z głęboką studnią została wykorzystana do indukcji mechanotransdukcji osteocytów poprzez rozciąganie komórek poprzez statyczne rozdęcie poza płaszczyzną. Obrazy osteocytów osadzonych w chipach pokazują, że 48-godzinna inkubacja chipa z wodą destylowaną ma kluczowe znaczenie dla utrzymania żywotności komórek w typowej morfologii.Podczas napadów obciążenia osteocyty były wystawione na działanie gradientu szczepów indukowanego na błonie PDMS. Określono zależność między średnim odkształceniem zastępczym a przemieszczeniem płyty dla wartości od jednego do dwóch milimetrów i wygenerowano reprezentatywną mapę cieplną indukowanego odkształcenia. Po załadowaniu analizowano żywotność komórek za pomocą barwienia dehydrogenazą mleczanową oraz testu aneksyny V i martwych komórek.Barwienie dehydrogenazą mleczanową rozciągniętych osteocytów wykazało jaśniejsze zabarwienie w pobliżu zewnętrznej krawędzi studzienki, co odpowiada lokalizacji wyższych wartości szczepu. Nasza platforma zapewnia wysoki stopień wszechstronności i może być używana do badania różnych czynników regulujących przebudowę kości, takich jak mechanotransdukcja wywołana obciążeniem, stan zapalny i działanie leków. Przedstawione tutaj techniki stanowią podstawę do opracowania prawdziwego narządu kostnego na chipie, który może znacznie poszerzyć nasze zrozumienie wielokomórkowych zawiłości regulujących zdrowie kości.

a-lab-on-chip-platform-for-stimulating-osteocyte-mechanotransduction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Różnicowanie komórek prekursorowych w osteoklasty jest regulowane przez cytokiny i czynniki wzrostu. W tym artykule opisano nową technikę transferu genów do różnicowania osteoklastów in vivo oraz protokoły hodowli komórkowych do różnicowania komórek prekursorowych w osteoklasty in vitro jako metodę badania wpływu cytokin na osteoklastogenezę.

Nowatorska technika transferu genów in vivo i testy komórkowe in vitro do badania utraty masy kostnej w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego

Przedstawiamy metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych stawów mysich po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób choroba zwyrodnieniowa stawów, czynniki genetyczne i/lub różne schematy obciążenia wpływają na podatność chondrocytów in situ.

Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

Ten artykuł zawiera szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania pneumatycznie uruchamiającego urządzenia mikroprzepływowego do kompresji chondrocytów.

Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

Test przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym mierzy zużycie tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, co odpowiada produkcji mitochondrialnego i glikolitycznego trifosforanu adenozyny, przy użyciu czujników pH i tlenu. W manuskrypcie wyjaśniono metodę pozwalającą zrozumieć stan energetyczny osteoblastów oraz charakterystykę i interpretację statusu bioenergetycznego komórek.

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Udostępniamy szczegółowe metody generowania czterech typów tkanek z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, które są używane do rekapitulacji chrząstki, kości, poduszeczki tłuszczowej i błony maziowej w ludzkim stawie kolanowym. Te cztery tkanki są zintegrowane z dostosowanym bioreaktorem i połączone za pomocą mikrofluidyki, tworząc w ten sposób staw kolanowy na chipie.

Stworzenie stawu kolanowego na chipie do modelowania chorób stawów i testowania leków

Obecny artykuł opisuje wykonywanie metody obrazowania przyżyciowego w celu obserwacji mechanicznie indukowanej sygnalizacji wapniowej osadzonych osteocytów in vivo w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na mechaniczne obciążenie trzeciej kości śródstopia myszy na poziomie tkankowym.

Fluorescencyjne obrazowanie przyżyciowe w celu zbadania dynamiki sygnalizacji wapniowej wywołanej obciążeniem w osteocytach myszy

Tutaj opisujemy łatwy do wdrożenia, ustandaryzowany, mikrofizjologiczny system, który odzwierciedla złożoność struktury ludzkiego szpiku kostnego in vivo, dostarczając odpowiedniego modelu do precyzyjnego badania szerokiego zakresu normalnych i patologicznych zdarzeń.

Model 3D ludzkiego szpiku kostnego do badania dynamiki i interakcji między komórkami rezydentnymi w kontekście fizjologicznym lub nowotworowym

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Poznaj platformę lab-on-a-chip do badania mechanotransdukcji osteocytów i analizy przebudowy kości. Technika umożliwia długoterminową hodowlę komórek kostnych oraz ilościowe określenie tworzenia i resorpcji kości.

Platforma lab-on-a-chip do stymulacji mechanotransdukcji osteocytów i analizy funkcjonalnych wyników przebudowy kości

Przeglądaj więcej filmów