Name: Odkrycie genów sterujących w guzach przypominających łodygi raka jelita grubego pochodzących z HT29 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Odkryj metodę RNA-Seq i bioinformatyki do identyfikacji nadekspresyjnych genów sterujących w komórkach macierzystych raka jelita grubego pochodzących z linii HT29. Ta technika umożliwia badanie molekularnych mechanizmów rakowej macierzystości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Laboratorium Biologii Radiacyjnej Instytutu Badań Radiologicznych, Chang Gung Memorial Hospital, za wsparcie techniczne. Badanie to było wspierane przez granty ze szpitala Chang Gung Memorial (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06) i Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 i MMH-106-61). Instytucje finansujące nie miały żadnego wpływu na opracowanie i gromadzenie danych, analizę i interpretację danych, ani na napisanie manuskryptu.

1. Hodowla komórkowa i tworzenie nowotworów
<ol>
	<li>Hodowla komórek HT29 w 10-centymetrowym naczyniu zawierającym zmodyfikowaną pożywkę orła (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykiem penicylinowo-streptomycynowym (P/S).</li>
	<li>Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% w warunkach aseptycznych, aż osiągną 80% zgrywki.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki HT29 1 ml 0,25% trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie neutralizuj trypsynę, dodając 2 ml DMEM z 10% FBS i 1% P / S.</li>
	<li>Policz komórki HT29 za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Dodaj 2,000 komórek / basenik do nisko dołączonych 6-dołkowych płytek z 2 ml DMEM bez surowicy z 1% P / S i uzupełniony 0,2% B27, 20 ng / ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 20 ng / ml czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), 20 ng / ml czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) i 20 ng / ml interleukiny 6 (IL6).</li>
	<li>Hoduj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 95% wilgotnością w warunkach aseptycznych.</li>
	<li>Dodawaj 0,5 ml pożywki z rakowych komórek macierzystych co 2 dni, aż guzy osiągną średnicę >100 μm przez co najmniej 7 dni.</li>
	<li>Obserwuj i mierz średnicę guza za pomocą odwróconego mikroskopu z cyfrowym systemem obrazowania komórek.</li>
	<li>Gdy guzy osiągną średnicę >100 μm, trypsynizuj guzy 0,25% trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C i zneutralizuj trypsynę, dodając 2x objętość pożywki wzrostowej. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Wirować z prędkością 1 200 obr./min przez 10 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Inkubować 5 x 104 komórki z 2 μl anty-LGR5-PE i 2 μl anty-CD133-PE w 100 μl DMEM indywidualnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wytrząsając z prędkością 200 obr./min. 
	UWAGA: CD133 jest ogólnym biomarkerem nowotworowych komórek macierzystych, który ulega silnej ekspresji w komórkach HT29.</li>
	<li>Dodać 900 μl PBS i przeanalizować ekspresję LGR5 i CD133 za pomocą cytometrii przepływowej. Zmiana fluorescencji w kanale FL2-H wskazuje na ekspresję genu.</li>
</ol>
2. Izolacja RNA
UWAGA: Użyj komercyjnego zestawu (zobacz Tabelę Materiałów) z szybką kolumną do izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
<ol>
	<li>Dodać 50 μl PBS do pobranych komórek (2 x 105 komórek) i ponownie je zawiesić za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu do lizy zawierającego 2 μl beta-merkaptoetanolu (β-ME). Szybko odwirować i odstawić na 5 minut.</li>
	<li>Odwirować roztwór o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut. Zebrać supernatant i wymieszać z 200 μl 70% etanolu.</li>
	<li>Za pomocą dołączonej kolumny usunąć rozpuszczalnik przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Przemyć roztworem myjącym 1 i 2 w celu całkowitego usunięcia substancji niebędących RNA przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Ponownie odwirować przy 14 000 x g przez 2 minuty w celu usunięcia pozostałości etanolu.</li>
	<li>Dodać 50 μl wody destylowanej, odwirować przy 14 000 x g przez 1 minutę i zebrać roztwór.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie RNA za pomocą OD260 za pomocą spektrofotometru. 
	Stężenie RNA (μg/mL) = (OD260) x (40 μg RNA/mL) i OD260/OD280 > 2. Próbki RNA powinny mieć numer integralności RNA (RIN) > 7.</li>
</ol>
3. Profilowanie RNAseq i analiza bioinformatyczna
UWAGA: Analiza RNAseq została przeprowadzona komercyjnie (patrz Tabela materiałów) w celu zbadania różnic genów w nowotworach pochodzących z HT29 w porównaniu z macierzystymi komórkami HT29.
<ol>
	<li>Korzystaj z usług komercyjnych dla etapów RNAseq, w tym budowy biblioteki, kontroli jakości biblioteki i sekwencjonowania DNA.</li>
	<li>Raport danych powinien zawierać ważne informacje, w tym liczbę odczytów, zmianę log2krotności i wartość p. Wybierz geny różnicowe zgodnie z następującymi parametrami: geny z > 1 log2-krotną zmianą z liczbą odczytów >100 w grupie nowotworów HT29 oraz geny <-1 log2-krotną zmianą z liczbą odczytów >100 w grupie rodzicielskiej HT29. W tym przypadku wartość p < 0,05 została uznana za akceptowalną i wykorzystano dane (Tabela 1). 
	UWAGA: W tym przypadku liczba genów >100 została użyta jako próg do kontynuowania badania określonego genu i walidacji jego ekspresji.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do analizy statystycznej (patrz tabela materiałów), aby wyświetlić mapę cieplną i zidentyfikować geny z nadekspresją >1 i geny o obniżonej ekspresji < 1 w log2-krotnej zmianie.</li>
	<li>Użyj oprogramowania R, aby narysować wykres wulkanu ze zmianą krotności x: log2; y: -log10 (wartość p), aby pokazać geny różnicowe.
	<ol>
		<li>Zainstaluj bibliotekę języka R 
		install.packages(biblioteka(kalibrować)) </li>
		<li>Odczytaj dane w RStudio za pomocą następującego programu: 
		res <-read.csv("/Użytkownicy/xxx.csv", nagłówek=T) 
		Głowica(res) 
		with(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0"))) 
		with(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="red")) 
		with(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="blue")) 
		with(subset(res, pvalue>.05), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444")) 
		abline(h=1.3, lty=2) 
		abline(v=1, lty=2) 
		abline(v=(-1), lty=2)</li>
		<li>Wykonaj bieg, aby uzyskać działkę wulkaniczną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wybór genu sterującego
<ol>
	<li>Wybierz opcję Wejście pojedynczego genu w programie NetworkAnalyst.</li>
	<li>Skopiuj i wklej wybrane geny o nadekspresji z Tabeli 1 z "człowiekiem" określonym jako organizm i typem ID Oficjalny symbol genu. 
	UWAGA: Alternatywnie użyj Ensembl Gene ID do kopiowania i wklejania.</li>
	<li>Wstaw dane, klikając przycisk Prześlij i kontynuuj, aby przeanalizować je za pomocą interakcji białko-białko (PPI) po genetycznym PPI.</li>
	<li>Użyj bazy danych interaktomicznych STRING z punktem odcięcia ufności wynoszącym 900, aby pokazać geny nasienne sieciujące przekazane geny. Geny nasienne łączące się z większą liczbą pojedynczych genów zostały wybrane jako geny sterujące, które mogą być zaangażowane w utrzymanie tworzenia nowotworów pochodzących z HT29. 
	UWAGA: Istnieją trzy zestawy danych interaktome do użycia: IMEx, STRING i Rolland. STRING zawiera dowody eksperymentalne o wyższym poziomie pewności. Przy mniejszej liczbie przesyłanych genów, IMEx może być wybrany do przewidywania i wychwytywania genów sterujących w sieciach międzyaktomowych.</li>
	<li>Wybierz opcję Kontynuuj w przeglądzie mapowania.</li>
	<li>Wybierz opcję White (Biały) w tle (Background (Tło) i Force Atlas (Wymuś atlas) w pokrętle Layout (Układ).</li>
	<li>Wybierz PANTHER BP, aby przeanalizować grupę genów regulacji w górę. 
	UWAGA: To pokazuje, że HSPA5 był odpowiedzialny za antyapoptozę w guzach pochodzących z HT29 w tym badaniu (<silna klasa = "xfig" >Figura 3A). Aby zawęzić określone pole funkcjonalne, klasyfikacja KEGG, GO lub PANTHER może być alternatywnie użyta do wyboru określonych genów sterujących.</li>
</ol>

<ol><li>Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+colorectal+cancer%3A+incidence%2C+mortality%2C+survival%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Przegl%C4%85d+Gastroenterologiczny%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors.</a> Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).</li>
<li>Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+risk+factors+of+colorectal+cancer+in+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Intestinal+Research%22%5BJournal%5D)">Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia.</a> Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+expression+of+basic+transcription+factor+3+predicts+poor+survival+of+colorectal+cancer+patients%3A+possible+mechanisms+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved.</a> Cell Death & Disease. 10 (7), 509(2019).</li>
<li>Slattery, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+genes+and+miRNAs+in+the+apoptosis+pathway+in+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients.</a> Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).</li>
<li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERBB+receptors%3A+from+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).</li>
<li>Yarden, Y., Pines, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERBB+network%3A+at+last%2C+cancer+therapy+meets+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YM155+as+an+inhibitor+of+cancer+stemness+simultaneously+inhibits+autophosphorylation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+G9a-mediated+stemness+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells.</a> PLoS One. 12 (8), 0182149(2017).</li>
<li>Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tumor+heterogeneity+from+a+cancer+stem+cell+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 41(2017).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+expression+may+be+useful+as+a+prognostic+indicator+in+colorectal+cancer%2C+a+tool+for+optimizing+therapy+and+supportive+evidence+for+the+cancer+stem+cell+hypothesis%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).</li>
<li>Choi, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+markers+in+colorectal+adenocarcinoma%3A+Clinicopathological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance.</a> Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).</li>
<li>Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cell-targeted+treatment%3A+elimination+or+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation.</a> Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).</li>
<li>Grillet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+from+patients+with+colorectal+cancer+have+cancer+stem+cell+hallmarks+in+ex+vivo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture.</a> Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).</li>
<li>Dallas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).</li>
<li>Chang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+induces+G9a+to+exacerbate+HER3+expression+for+the+survival+of+epidermal+growth+factor+receptor-tyrosine+kinase+inhibitors+in+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers.</a> BMC Cancer. 19 (1), 959(2019).</li>
<li>Catalano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+stem+cells+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer stem cells and cell death.</a> Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).</li>
<li>Piggott, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+apoptosis+inhibitor+c-FLIP+selectively+eliminates+breast+cancer+stem+cell+activity+in+response+to+the+anti-cancer+agent%2C+TRAIL%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL.</a> Breast Cancer Research. 13 (5), 88(2011).</li>
<li>Chung, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+novel+SHP-1+agonists%2C+SC-43+and+SC-78%2C+are+more+potent+than+regorafenib+in+suppressing+the+in+vitro+stemness+of+human+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells.</a> Cell Death Discovery. 4, 25(2018).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+exacerbates+survival+of+cancer+stem-like+tumorspheres+in+EGFR-positive+colorectal+cancers%3A+RNAseq+analysis+and+therapeutic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60(2018).</li>
<li>Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+adult+intestinal+stem+cell+marker+Lgr5+in+the+metastatic+cascade+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).</li>
<li>Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Colorectal+Cancer+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell.</a> New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).</li>
<li>Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cancer+stem+cell+markers+CD133%2C+CD44%2C+CD24%3A+association+with+AKT+isoforms+and+radiation+resistance+in+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells.</a> PLoS One. 9 (4), 94621(2014).</li>
<li>Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetworkAnalyst+for+statistical%2C+visual+and+network-based+meta-analysis+of+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data.</a> Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).</li>
<li>Gagan, J., Van Allen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+to+guide+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing to guide cancer therapy.</a> Genome Medicine. 7 (1), 80(2015).</li>
<li>Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+as+a+Tool+to+Study+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment.</a> Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).</li>
<li>Kanehisa, M., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+Mapper+for+inferring+cellular+functions+from+protein+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences.</a> Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+ontology%3A+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), (2000).</li>
<li>The Gene Ontology Collective. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gene+Ontology+Resource%3A+20+years+and+still+GOing+strong%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong.</a> Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).</li>
<li>Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER+in+2013%3A+modeling+the+evolution+of+gene+function%2C+and+other+gene+attributes%2C+in+the+context+of+phylogenetic+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).</li>
<li>Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+genetic+variations+assisted+by+Ingenuity+Pathway+Analysis+to+comprehensively+investigate+potential+genetic+targets+associated+with+the+progression+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).</li>
<li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetworkAnalyst+3.0%3A+a+visual+analytics+platform+for+comprehensive+gene+expression+profiling+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+induces+STAT1+expression+to+exacerbate+the+IFNr-mediated+PD-L1+axis+in+epidermal+growth+factor+receptor-positive+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers.</a> Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).</li>
<li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie posiadają żadnych istotnych informacji finansowych.

W tym badaniu wyhodowane guzy przypominające łodygi raka wykorzystano jako model do analizy danych RNAseq z dostępnymi danymi bioinformatycznymi. Do stworzenia modelu choroby wykorzystano guzy pochodzące z HT29. Ponieważ guzy mają lekooporność na terapie przeciwnowotworowe, ustalony model może być wykorzystany do zbadania szczegółowych mechanizmów oporności poprzez badanie różnic w ekspresji genów. Co więcej, technologia genomiczna wykorzystująca RNAseq w połączeniu z dostępnymi technologiami bioinformatycznymi zapewnia ...

Rak jelita grubego (CRC) jest główną przyczyną zgonów o wysokiej częstości występowania i śmiertelności na całym świecie1,2. Ze względu na mutacje i amplifikacje genów, komórki nowotworowe rosną bez kontroli proliferacyjnej, co przyczynia się do przeżycia komórek3, anti-apoptosis4, and cancer stemness5,6,7. W tkance nowotworowej heterogeniczność guza pozwala komórkom nowotworowym na adaptację i przetrwanie podczas leczenia terapeutycznego8. Nowotworowe komórki macierzyste (CSC), o wyższym wskaźniku samoodnawiania i pluripotencji niż zróżnicowane typy raka, są głównie odpowiedzialne za nawroty nowotworu9,10 i przerzutowe CRC11. CSC wykazują większą oporność na leki12,13,14 i właściwości antyapoptozowe15,16, dzięki czemu przeżywają chemioterapię nowotworową.
Tutaj, w celu zbadania potencjalnego mechanizmu macierzystego w wybranych komórkach macierzystych CRC, przeprowadzono sekwencję RNAseq w celu zbadania genów o zróżnicowanej ekspresji w sferoidach guza. Komórki rakowe mogą tworzyć sferoidy (zwane również guzami), gdy są hodowane w warunkach niskiej adherencji i stymulowane przez czynniki wzrostu dodane do hodowanej pożywki, w tym EGF, bFGF, HGF i IL6. Dlatego wybraliśmy komórki nowotworowe CRC HT29, które są odporne na chemioterapię ze wzrostem fosforylowanego STAT3 podczas leczenia oksaliplatyną i irynotekonem17. Ponadto HT29 wykazywał ekspresję wyższych markerów pnia podczas hodowli w opisanych warunkach hodowli. Model CSC oparty na HT29 wyrażał większe ilości receptora 5 sprzężonego z białkiem G bogatego w leucynę (LGR5) zawierającego powtórzenia18, specyficzny marker komórek macierzystych CRC19,20. Co więcej, CD133, uważany za ogólny biomarker nowotworowych komórek macierzystych, jest również wysoce eksprymowany w linii komórkowej HT29 21. Celem tego protokołu jest odkrycie grup genów sterujących w ustalonych nowotworach przypominających łodygi raka w oparciu o zestawy danych bioinformatycznych, w przeciwieństwie do badania pojedynczych onkogenów22. Bada potencjalne mechanizmy molekularne poprzez analizę RNAseq, a następnie dostępne analizy bioinformatyczne.
Sekwencjonowanie nowej generacji to wysokoprzepustowa, łatwo dostępna i niezawodna metoda sekwencjonowania DNA oparta na pomocy obliczeniowej, używana do kompleksowego badania genów sterujących terapiami nowotworów23. Technologia ta jest również wykorzystywana do wykrywania ekspresji genów z odwrotnej transkrypcji wyizolowanej próbki RNA24. Jednak podczas badań przesiewowych za pomocą RNAseq najważniejsze geny, które mają być celem terapii, mogą nie mieć największej różnicy ekspresji między próbkami eksperymentalnymi i kontrolnymi. W związku z tym opracowano pewne bioinformatyki do klasyfikowania i identyfikacji genów na podstawie aktualnych zestawów danych, takich jak KEGG25, GO26,27 lub PANTHER28, w tym Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 i NetworkAnalyst30. Protokół ten pokazuje integrację RNAseq i NetworkAnalyst w celu szybkiego odkrycia grupy genów w wybranych sferoidach pochodzących z HT29 w porównaniu z rodzicielskimi komórkami HT29. Sugeruje się również zastosowanie tej metody do innych modeli chorób w celu odkrycia różnic w ważnych genach.
W porównaniu do badania ekspresji pojedynczych genów, technika wysokoprzepustowa zapewnia korzyści w łatwym znajdowaniu potencjalnych genów sterujących dla medycyny precyzyjnej nowotworów. Dzięki przydatnym zestawom danych, takim jak KEGG, GO lub PANTHER, można zidentyfikować określone geny na podstawie modeli choroby, szlaków sygnałowych lub określonych funkcji, co pozwala szybko skupić się na konkretnych, ważnych genach, oszczędzając czas i koszty badań. Podobna aplikacja jest używana w poprzednich badaniach14,18,31. W szczególności guz jest bardziej skomplikowany, ponieważ różne typy nowotworów wyrażają wyróżniające się geny i szlaki przetrwania i proliferacji. Dlatego protokół ten może wychwycić geny rozróżniające różne typy nowotworów w różnych okolicznościach. Istnieje potencjał znalezienia skutecznych strategii walki z nowotworami poprzez zrozumienie mechanizmu ekspresji określonych genów.

<table><tbody><tr><td>iRiS Cyfrowy system obrazowania komórek</td><td>Logos Biosystems, Inc</td><td>I10999</td><td>do obserwacji powstawania nowotworów</td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa</td><td>BD biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>do wykrywania LGR5 i CD133 w guzach</td></tr><tr><td>anty-LGR5-PE</td><td>Biolegend</td><td>373803</td><td>odczynnik do wykrywania LGR5</td></tr><tr><td>anty-CD133-PE</td><td>Biolegend</td><td>372803</td><td>wykrywanie CD133 odczynnik</td></tr><tr><td>EGF</td><td>GenScript</td><td>Z00333</td><td>do hodowli nowotworów</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>GenScript</td><td>Z03116</td><td>do hodowli guzów</td></tr><tr><td>HGF</td><td>GenScript</td><td>Z03229</td><td>do hodowli nowotworów</td></tr><tr><td>IL6</td><td>GenScript</td><td>Z03034</td><td>do hodowli nowotworów</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji RNA PureLink</td><td>Invitrogen</td><td>12183025</td><td>izolat całkowity RNA do analizy RNAseq</td></tr><tr><td>Wydajność RNAseq</td><td>Biotools, Tajwan</td><td></td><td>Analiza RNAseq jest wykonywana komercyjnie przez Biotools, Ttaiwan</td></tr><tr><td>NetworkAnalyst</td><td>Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Kanada</td><td></td><td>http://www.networkanalyst.ca/Prism</td></tr> <tr><td></td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>oprogramowanie do analizy statystycznej</td></tr></tbody></table>

odkrycie genów sterujących w guzach przypominających łodygi raka jelita grubego pochodzących z ht29

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Rakowe komórki macierzyste odgrywają istotną rolę przeciwko terapiom klinicznym, przyczyniając się do nawrotu nowotworu. Istnieje wiele onkogenów biorących udział w nowotworzeniu i inicjacji właściwości pnia raka. Ponieważ ekspresja genów w tworzeniu guzów pochodzących z raka jelita grubego jest niejasna, potrzeba czasu, aby odkryć mechanizmy działające na jeden gen na raz. Badanie to demonstruje metodę szybkiego odkrycia genów odpowiedzialnych za przeżycie komórek macierzystych podobnych do raka jelita grubego in vitro. W tym badaniu wybrano i wykorzystano komórki raka jelita grubego HT29, które wyrażają LGR5, gdy są hodowane jako sferoidy i towarzyszą wzrostowi markerów macierzystych CD133. Przedstawiony protokół służy do wykonywania sekwencji RNAseq z dostępnymi bioinformatykami w celu szybkiego odkrycia nadekspresji genów sterujących w tworzeniu guzów przypominających łodygi jelita grubego HT29. Metodologia ta może szybko przeprowadzić badania przesiewowe i odkryć potencjalne geny sterujące w innych modelach chorób.

Aby opracować model do badania mechanizmu w nowotworowych komórkach macierzystych, wykorzystano komórki jelita grubego HT29 do hodowli in vitro nowotworowych sferopodobnych (tumorspheres) na płytkach o niskim przywieraniu zawierających B27, EGF, bFGF, HGF i IL6. Sferopody o średnicy &gt;100 µm uformowały się w ciągu 7 dni (Rysunek 1A). Sferopody poddano trypsynizacji do pojedynczych komórek i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrycia ekspresji LGR5 oraz CD133. Ekspres...

Prezentowany tutaj jest protokół do odkrycia nadekspresji genów napędzających, które utrzymują ustalone rakopodobne komórki macierzyste pochodzące z komórek HT29 jelita grubego. Przeprowadzono sekwencję RNAseq z dostępnymi danymi bioinformatycznymi w celu zbadania i zbadania sieci ekspresji genów w celu wyjaśnienia potencjalnego mechanizmu związanego z przetrwaniem docelowych komórek nowotworowych.

Odkrycie genów sterujących w guzach przypominających łodygi raka jelita grubego pochodzących z HT29

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

W naszym protokole wykorzystaliśmy RNA-Seq i narzędzia bioinformatyczne, aby szybko odkryć nadekspresję genów sterujących, które przyczyniają się do powstawania guzów jelita grubego przypominających łodygi. Protokół ten służy do badań przesiewowych genów i szlaków sygnałowych o zróżnicowanej ekspresji w celu zbadania molekularnego mechanizmu pnia raka w selektywnym raku jelita grubego. W siódmym dniu hodowli użyj odwróconego mikroskopu z cyfrowym systemem obrazowania komórek, aby obserwować i mierzyć średnicę guzów.Gdy guzy osiągną średnicę większą niż 100 mikrometrów, potraktuj kulturę 0,25% trypsyną. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zneutralizuj trypsynę dwukrotnie większą objętością pożywki i policz komórki za pomocą hemocytometru. Zebrać komórki przez odwirowanie.I ponownie zawiesić osad w ilości pięć razy 10 do czterech komórek na 100 mikrolitrów średniego stężenia. Dodaj dwa mikrolitry podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do każdej probówki i inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej i 200 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji przemyć każdą probówkę 900 mikrolitrami PBS i przeanalizować komórki pod kątem ekspresji interesującego białka za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami.W celu izolacji RNA po pobraniu trypsyny, jak właśnie pokazano, ponownie zawiesić komórki w stężeniu dwa razy od 10 do piątych komórek na 50 mikrolitrów PBS i poddać każdą próbkę lizie z 200 mikrolitrami buforu do lizy uzupełnionego dwoma mikrolitrami beta merkaptoetanolu na probówkę. Po krótkim wirowaniu i pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, zbierz lizaty przez odwirowanie i dodaj 200 mikrolitrów 70% etanolu do każdej probówki. Przenieść próbki do szybkich kolumn i usunąć rozpuszczalnik przez odwirowanie.Przemyć próbki 400 mikrolitrami pierwszego roztworu płuczącego i 600 mikrolitrami drugiego roztworu płuczącego w celu całkowitego usunięcia wszelkich substancji niezawierających RNA przez odwirowanie, a następnie odwirować przez dodatkowe dwie minuty w tych samych warunkach wirówki w celu usunięcia pozostałości etanolu. Następnie ponownie zawiesić granulki w 50 mikrolitrach wody destylowanej na probówkę i odwirować próbkę przez jedną minutę przed pobraniem RNA zawierającego supernatanty. Zbadanie zróżnicowanej ekspresji genów między komórkami nowotworu w porównaniu z macierzystymi komórkami nowotworowymi po analizie sekwencjonowania RNA.Wybierz geny z większą niż jedną do minus jednej log2-krotnej zmiany z liczbą odczytów większą niż 100 w grupie nowotworowej i rodzicielskiej. I użyj poleceń zgodnie ze wskazaniami. Aby uzyskać wykres wulkaniczny danych w celu określenia różnicowej ekspresji genów.W celu selekcji genów sterujących w analityku sieciowym, wybierz wejście pojedynczego genu oraz skopiuj i wklej wybrane geny o nadekspresji z człowiekiem określonym jako organizm i oficjalnym symbolem genu jako typem ID. Kliknij Prześlij i kontynuuj. Aby wstawić i przeanalizować dane przy użyciu interakcji białko-białko, po genetycznej interakcji białko-białko, użyj bazy danych interaktomii STRING z odciętym wynikiem ufności 900, aby pokazać geny nasienne.Sieciowanie przesłanych genów. Geny nasienne kojarzące się z większą liczbą pojedynczych genów mogą być wybrane jako geny sterujące, które mogą być zaangażowane w utrzymanie tworzenia się guza. Wybierz opcję Kontynuuj w przeglądzie mapowania na biało w tle i Force Atlas w pokrętle Layout.Następnie wybierz parę zasad PANTHER, aby przeanalizować grupę genów regulacji w górę. Guzy o średnicy większej niż 100 mikrometrów tworzą się w ciągu siedmiu dni od hodowli. Analiza cytometrii przepływowej ujawnia wzrost ekspresji LGR5 i CD133 w guzach pochodzących z HT29 w porównaniu z macierzystymi komórkami HT29.Po sekwencjonowaniu RNA, geny z większą niż jedną log2-krotną zmianą w ich regulacji w górę lub w dół z wartością P mniejszą niż 0,05, jak określono na mapie cieplnej, można wykreślić w celu rozróżnienia istotnych genów między guzami pochodzącymi z HT29 a rodzicielskimi komórkami HT29. W tym reprezentatywnym eksperymencie analiza genów o podwyższonej regulacji z większą niż 1 log2krotnością zaowocowała 10 genami nasiennymi, sieciującymi sieci genów. Analiza par zasad PANTHER wykazała, że dwa geny były związane z negatywną regulacją apoptozy.Co więcej, wybrane geny zostały następnie zweryfikowane za pomocą ilościowej reakcji PCR, potwierdzając ich zwiększoną ekspresję w guzach pochodzących z HT29. Różnicowa selekcja genów jest najważniejszym etapem procedur. Pamiętaj, aby jako kryterium użyć zmiany log2krotności większej niż jedna z przeliczeniami większymi niż 100.Korzystając z tego protokołu, geny wybrane z guzów pochodzących z jelita grubego mogą zostać powalone lub nadmiernie eksprymowane, aby odkryć ich potencjalną rolę w tworzeniu guza.

discovery-driver-genes-colorectal-ht29-derived-cancer-stem-like

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Testy sferyczne in vitro są powszechnie używane do identyfikacji komórek macierzystych raka. Tutaj porównujemy testy sferyczne pojedyncze i wielokomórkowe. Bardziej pracochłonne testy jednokomórkowe lub suplementacja metylocelulozą dają dokładniejsze wyniki, podczas gdy testy wielokomórkowe wykonywane w płynnym podłożu mogą mieć duży wpływ na gęstość komórek.

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Zrozumienie roli nowotworowych komórek macierzystych w nawrotach nowotworów i oporności na terapie stało się tematem wielkiego zainteresowania w ostatniej dekadzie. W artykule opisano izolację i charakterystykę subpopulacji nowotworowych komórek macierzystych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC).

Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Wykorzystanie guzów pochodzących od pacjentów w podskórnym modelu przedklinicznym to doskonały sposób na badanie skuteczności nowych terapii, predykcyjnego odkrywania biomarkerów i ścieżek oporności na leki. Model ten, w procesie opracowywania leków, ma zasadnicze znaczenie dla określenia losu wielu nowatorskich terapii przeciwnowotworowych przed rozpoczęciem badań klinicznych.

Opracowanie i utrzymanie przedklinicznego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pochodzącego od pacjenta w celu zbadania nowych terapii przeciwnowotworowych

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Przedstawiono protokół tworzenia genetycznie modyfikowanego mysiego modelu raka jelita grubego poprzez segmentowe zakażenie adeno-cre i jego nadzorowanie za pomocą kolonoskopii o wysokiej rozdzielczości.

Genetycznie zmodyfikowany mysi model sporadycznego raka jelita grubego

Opisujemy szczegółowy protokół izolacji komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z ludzkim mięsakiem poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, przy użyciu ludzkiego antygenu leukocytów-1 (HLA-1) jako markera ujemnego, oraz dla dalszej walidacji i charakterystyki tych komórek inicjujących HLA-1-ujemny nowotwór.

Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

Aby umożliwić bardzo czułe wykrywanie komórek kolonizujących tkanki ludzkiego raka jelita grubego (CRC), pokazujemy protokół efektywnej transdukcji cząsteczek lentiwirusa z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do komórek organoidowych CRC pochodzących z PDX przed ich wstrzyknięciem myszom biorcy, z obserwacją mikroskopową stereofluorescencji.

Wysoka czułość wykrywania mikroprzerzutów generowanych przez organoidy transdukowane przez GFP lentiwirus hodowane z guza jelita grubego pochodzącego od pacjenta

Celem tej metodologii jest identyfikacja komórek macierzystych raka (CSC) w liniach komórek rakowych i pierwotnych próbkach guzów ludzkich za pomocą protokołu formowania kuli, w solidny sposób, przy użyciu testów funkcjonalnych i charakterystyki fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot.

Pozyskiwanie kulek komórek macierzystych raka z guzów ginekologicznych i raka piersi

W tym protokole prezentujemy eksperymentalny projekt wykorzystujący system warunkowego knockdown i dostosowany test tworzenia kuli w celu zbadania wpływu klastryny na macierzystość GCSC pochodzących od pacjenta. Protokół można łatwo dostosować do badania zarówno in vitro, jak i in vivo funkcji genów związanych z macierzystą naturą w różnych typach CSC.

Połączony test warunkowego knockdownu i dostosowanego tworzenia kuli w celu zbadania genu związanego z łodygą komórek macierzystych raka żołądka pochodzących od pacjenta

Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego

Odkryj metodę RNA-Seq i bioinformatyki do identyfikacji nadekspresyjnych genów sterujących w komórkach macierzystych raka jelita grubego pochodzących z linii HT29. Ta technika umożliwia badanie molekularnych mechanizmów rakowej macierzystości.

Odkrycie genów sterujących w guzach przypominających łodygi raka jelita grubego pochodzących z HT29

Przeglądaj więcej filmów