Name: Przewodnik po cięciu, rdzeniowaniu i przetwarzaniu obrazów do wysokoprzepustowego pobierania i analizy próbek kości korowych do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę minimalnie inwazyjnego pobierania próbek kości korowej z kości udowej człowieka do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej. Technika rdzeniowania zmniejsza artefakty obrazowania i poprawia wizualizację mikroarchitektury kostnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tym artykule zostały przeprowadzone w ośrodku BMIT w Kanadyjskim Źródle Światła, które jest wspierane przez Kanadyjską Fundację Innowacji, Nauk Przyrodniczych i Inżynierii Research Council of Canada, University of Saskatchewan, Rząd Saskatchewan, Western Economic Diversification Canada, National Research Council Canada oraz Canadian Institutes of Health Research. Autorzy chcieliby podziękować naukowcom z Canadian Light Source, w szczególności Adamowi Webbowi, Denise Miller, Sergeyowi Gasilovowi i Ning Zu za pomoc w konfiguracji i rozwiązywaniu problemów z systemami SkyScan SRμCT i mikroskopu białej wiązki. Pragniemy również podziękować Beth Dalzell z University of Toledo College of Medicine and Life Sciences oraz dr Jeffreyowi Wenstrupowi z Northeast Ohio Medical University za dostęp do próbek zwłok do tego badania. JM Andronowski jest wspierany przez fundusze badawcze na rozpoczęcie działalności zapewniane przez Uniwersytet w Akron oraz grant National Institute of Justice Research and Development in Forensic Science for Criminal Justice Purposes (2018-DU-BX-0188). RA Davis jest wspierany przez asystenturę dla absolwentów zapewnianą przez Uniwersytet w Akron. Sprzęt i materiały używane do rdzeniowania i piłowania zostały zakupione dzięki funduszom startowym zapewnionym przez Uniwersytet w Akron i grantowi NSF EAR-1624242 dla CW Holyoke.

<ol><li>Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+the+analysis+of+bone+microstructure%3A+New+dimensions+in+forensic+anthropology%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sciences+Research%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology.</a> Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).</li>
<li>Wysokinski, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beamlines+of+the+biomedical+imaging+and+therapy+facility+at+the+Canadian+light+source+-+part+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Instruments+and+Methods+in+Physics+Research+Section+A%3A+Accelerators%2C+Spectrometers%2C+Detectors+and+Associated+Equipment%22%5BJournal%5D)">Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).</li>
<li>Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+variation+in+cortical+osteocyte+lacunar+parameters+in+healthy+young+males%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males.</a> Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).</li>
<li>Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femoral+osteocyte+lacunar+density%2C+volume+and+morphology+in+women+across+the+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan.</a> Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).</li>
<li>Langer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Ray+Phase+Nanotomography+Resolves+the+3D+Human+Bone+Ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure.</a> PLoS ONE. 7 (8), 35691(2012).</li>
<li>Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+Nano-CT+for+the+Study+of+Bone+Ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure.</a> Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).</li>
<li>Dong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+osteocyte+lacunar+morphometric+properties+and+distributions+in+human+femoral+cortical+bone+using+synchrotron+radiation+micro-CT+images%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images.</a> Bone. 60, 172-185 (2014).</li>
<li>Gauthier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+micro+structural+analysis+of+human+cortical+bone+in+paired+femoral+diaphysis%2C+femoral+neck+and+radial+diaphysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).</li>
<li>Giuliani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphosphonate-related+osteonecrosis+of+the+human+jaw%3A+A+combined+3D+assessment+of+bone+descriptors+by+histology+and+synchrotron+radiation-based+microtomography%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography.</a> Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).</li>
<li>Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+osteon+banding+in+adult+human+cortical+bone%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Anthropology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone.</a> American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).</li>
<li>Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+differential+nuclear+DNA+yield+rates+and+osteocyte+numbers+among+human+bone+tissue+types%3A+A+synchrotron+radiation+micro-CT+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach.</a> Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).</li>
<li>Britz, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+unloading+in+growing+rats+reduces+cortical+osteocyte+lacunar+density+and+volume+in+the+distal+tibia%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia.</a> Bone. 51 (5), 913-919 (2012).</li>
<li>Maggiano, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+Haversian+systems+in+human+cortical+bone+using+synchrotron+radiation-based+micro-CT%3A+morphology+and+quantification+of+branching+and+transverse+connections+across+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age.</a> Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).</li>
<li>Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microcomputed+tomography+imaging+of+basic+multicellular+unit-related+resorption+spaces+in+human+cortical+bone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record+Part+A%3A+Discoveries+in+Molecular%2C+Cellular%2C+and+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone.</a> The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).</li>
<li>Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+magnesite%3A+Rheology+of+Magnesite%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Geophysical+Research%3A+Solid+Earth%22%5BJournal%5D)">Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite.</a> Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).</li>
<li>Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+water+weakening+of+quartz%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+and+Planetary+Science+Letters%22%5BJournal%5D)">Reversible water weakening of quartz.</a> Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).</li>
<li>Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dislocation+creep+of+polycrystalline+dolomite%5BTitle%5D)+AND+%22Tectonophysics%22%5BJournal%5D)">Dislocation creep of polycrystalline dolomite.</a> Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).</li>
<li>Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+orthoenstatite+single+crystals+at+mantle+pressure+and+temperature+and+comparison+with+olivine%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+and+Planetary+Science+Letters%22%5BJournal%5D)">Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine.</a> Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).</li>
<li>Millard, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+Dependence+of+Magnesite+Creep%5BTitle%5D)+AND+%22Geosciences%22%5BJournal%5D)">Pressure Dependence of Magnesite Creep.</a> Geosciences. 9 (10), 420(2019).</li>
<li>Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+of+intracortical+porosity+in+the+midshaft+of+the+human+femur%3A+age+and+sex+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences.</a> Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).</li>
<li>Jowsey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+Changes+in+Human+Bone%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Age Changes in Human Bone.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210(1960).</li>
<li>Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+skeletal+remodeling+in+aging+men%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Studies of skeletal remodeling in aging men.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).</li>
<li>Martin, R. B., Burr, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+implications+of+porosity+distribution+in+bone+of+the+appendicular+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopedic+Transactions%22%5BJournal%5D)">Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton.</a> Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).</li>
<li>Bousson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+Intracortical+Porosity+in+Human+Midfemoral+Cortex+by+Age+and+Gender%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).</li>
<li>Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+microstructural+properties+of+bone+at+the+human+midshaft+femur%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur.</a> Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).</li>
<li>De Micheli, P. O., Witzel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+mechanical+study+of+a+transverse+osteon+under+compressive+loading%3A+The+role+of+fiber+reinforcement+and+explanation+of+some+geometrical+and+mechanical+microscopic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties.</a> Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).</li>
<li>Martin, R. B., Boardman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+collagen+fiber+orientation%2C+porosity%2C+density%2C+and+mineralization+on+bovine+cortical+bone+bending+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties.</a> Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).</li>
<li>Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+analysis+of+the+canal+network+in+cortical+bone+by+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record+Part+B%3A+The+New+Anatomist%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography.</a> The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).</li>
<li>Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rib+histomorphometry+for+adult+age+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Microscopy+for+Skeletal+Tissues%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Rib histomorphometry for adult age estimation.</a> Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).</li>
<li>Pfeiffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paleohistology%3A+Health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Anthropology+of+the+Human+Skeleton%22%5BJournal%5D)">Paleohistology: Health and disease.</a> Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).</li>
<li>Bone Hedges, R. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((diagenesis%3A+an+overview+of+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Archaeometry%22%5BJournal%5D)">diagenesis: an overview of processes.</a> Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).</li>
<li>Friedlander, H. The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf">https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf</a> (2017).</li>
<li>Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+formaldehyde+fixation+on+some+mechanical+properties+of+bovine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone.</a> Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).</li>
<li>Asaka, T., Kikugawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+formaldehyde+solution+on+fracture+characteristics+of+bovine+femoral+compact+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Japan+Institute+of+Metals%22%5BJournal%5D)">Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone.</a> Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nie istnieje kompleksowy, ustandaryzowany protokół pozyskiwania jednolitych i cylindrycznych próbek rdzenia kostnego kory mózgowej do obrazowania SRμCT o wysokiej rozdzielczości z ograniczonymi ustawieniami pola widzenia. Opisany tutaj protokół wypełnia tę lukę, zapewniając obszerny samouczek dotyczący sposobu pozyskiwania próbek rdzenia kostnego o stałej wielkości do obrazowania SRμCT oraz późniejszej dokładnej wizualizacji i ekstrakcji danych mikroarchitektonicznych. Wykazaliśmy, że nasz protokół zapewnia bardziej usta...

Dzięki najnowszym postępom w technologii obrazowania, możliwe jest teraz pozyskiwanie danych z obrazowania rentgenowskiego o bardzo wysokiej rozdzielczości. Stacjonarne systemy mikrotomografii komputerowej (μCT) są obecnie standardem w obrazowaniu kości gąbczastej ze względu na ich nieniszczący charakter1. Jednak podczas obrazowania cech mikrostrukturalnych kości korowej zastosowanie μCT jest bardziej ograniczone. Ze względu na ograniczenia rozdzielczości systemy stacjonarne nie mogą osiągnąć rozdzielczości wymaganej do obrazowania cech mikrostrukturalnych mniejszych niż pory korowe, takich jak luki w osteocytach. Do tego zastosowania SRμCT jest idealny ze względu na większą rozdzielczość tych systemów1. Na przykład eksperymenty przeprowadzone w Canadian Light Source (CLS) na liniach badawczych BioMedical Imaging and Therapy (BMIT) 2 dały obrazy z wokselami o wielkości zaledwie 0,9 μm. Poprzednie badania1,3,4,5 używały tej rozdzielczości do pozyskiwania projekcji i kolejnych trójwymiarowych (3D) renderingów z próbek kości korowych z ludzkich kości długich (Rysunek 1) w celu ilościowego określenia gęstości lakunarnej osteocytów4,6,7,8,9 oraz różnice w kształcie i rozmiarze lakunarnym3 w zależności od długości życia człowieka i płci. Dalsze badania wykazały obecność pasm osteonowych u ludzi10, zjawisko wcześniej uznane za związane tylko ze ssakami innymi niż ludzie w literaturze sądowej antropologicznej.
Aby osiągnąć wyjątkową rozdzielczość, wiązka promieniowania rentgenowskiego musi być precyzyjnie skupiona w polu widzenia (FOV), co często ogranicza maksymalny rozmiar próbki do kilku milimetrów średnicy. Obecnie nie ma kompleksowych, ustandaryzowanych procedur opisanych w literaturze opisującej pobieranie próbek kości, które spełniałyby te ograniczenia. Wyśrodkowanie próbek w polu widzenia ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że 1) próbka pozostaje wyśrodkowana, gdy obraca się o 180° podczas obrazowania, oraz 2) artefakty skanowania są ograniczone, ponieważ nie ma obcięcia obrazu. Innymi słowy, żadne części próbki poza polem widzenia nie zakłócają wiązki wchodzącej w jej ognisko wewnątrz pola widzenia. W takim przypadku algorytm rekonstrukcji zostaje pozbawiony części danych tłumienia potrzebnych do w pełni poprawnej rekonstrukcji. Warto również zauważyć, że skany 360° (pełny obrót) minimalizują skutki utwardzania wiązki, ale zwiększają artefakty spowodowane niewspółosiowością i ruchem próbki podczas obrazowania. W związku z tym, podczas gdy skanowanie 360° zazwyczaj generuje czystsze dane, czas obrazowania jest podwojony, dlatego należy zająć się kompromisem między kosztami eksperymentu a jakością danych.
Ważnym i często pomijanym aspektem eksperymentów z obrazowaniem kości jest dokładna i powtarzalna technika przygotowania próbki wykonywana przed skanowaniem. Badania, które włączają metody SRμCT do swoich eksperymentów, krótko wspominają o protokole pobierania próbek, ale autorzy podają niewiele lub nie podają żadnych szczegółów na temat konkretnej metodologii użytej do zebrania próbek. Wiele takich badań wspomina o cięciu prostoliniowych bloków kostnych o dowolnych wymiarach, ale generalnie nie dostarczają żadnych dalszych informacji na temat użytych narzędzi lub materiałów do osadzania3,4,10,11,12,13,14. Niektórzy badacze często używają ręcznych narzędzi obrotowych (np. Dremel) do usuwania prostoliniowych bloków kości z obszaru zainteresowania (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Ta metoda skutkuje próbkami o niejednolitych rozmiarach, które mogą być większe niż pole widzenia, co zwiększa prawdopodobieństwo artefaktów skanowania i obcięcia obrazu. Takie próbki często wymagają dalszej rafinacji przy użyciu precyzyjnej piły diamentowej (np. Buehler Isomet). Pozyskiwanie próbek o stałych wymiarach (z dokładnością do dwóch setnych/mm) ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że pozyskane zestawy danych są najwyższej jakości, a późniejsze wyniki są powtarzalne.
Ograniczone raportowanie metodologii pobierania próbek dodatkowo utrudnia próbę zastosowania i/lub walidacji metod przeprowadzonych w poprzednim badaniu. Obecnie badacze muszą kontaktować się bezpośrednio z autorami w celu uzyskania dalszych informacji na temat procedur pobierania próbek. Szczegółowo opisany tutaj protokół zapewnia badaczom biomedycznym dokładnie udokumentowaną, powtarzalną i opłacalną technikę pobierania próbek. Głównym celem tego artykułu jest przedstawienie kompleksowego samouczka dotyczącego sposobu pozyskiwania próbek rdzenia kostnego kory kostnej o stałej wielkości za pomocą frezarki-wiertarki i diamentowego wiertła rdzeniowego w celu dokładnej wizualizacji i ekstrakcji danych mikroarchitektonicznych. Metoda ta jest zmodyfikowana w stosunku do procedur stosowanych do rutynowego zbierania jednolitych cylindrów o małej średnicy (1-5 mm) z bloków twardych materiałów w mechanice skał wysokociśnieniowych 15,16,17,18,19.

<table><tbody><tr><td>1-1/8" węglik spiekany do kompozytów</td><td>Warrior</td><td>61812</td><td>28,6 mm wgłębny</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP8201500</td><td>3,8 litra</td></tr><tr><td>Kleszcze z końcówką</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-300</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>ThermoFisher</td><td>55398</td><td></td></tr><tr><td>Crystalbond 509-3 Żywica epoksydowa</td><td>Ted Pella</td><td>821-3</td><td></td></tr><tr><td>CTAnalyser</td><td>Bruker microCT</td><td>v.1.15.4.0</td><td>Pobierz i zainstaluj w https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html</td></tr><tr><td>Zestaw narzędzi dentystycznych</td><td>Amazon</td><td>787269885110</td><td></td></tr><tr><td>Diamentowy brzeszczot do wafli do materiałów kompozytowych</td><td>Buehler</td><td>#11-4247</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka</td><td>Jet Mill / Wiertarka</td><td>350017</td><td>Model: JMD-15, wiertarki stołowe są odpowiednimi substytutami, ale zazwyczaj brakuje im przekładalnego stołu maszynowego do umieszczania próbek pod trzpieniem wiertła</td></tr><tr><td>Kleszcze z cienką końcówką</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski mocujące do stołu maszyny XY do frezarki/wiertarki</td><td>MSC Industrial Supply</td><td>#04804571</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>szklane Ted Pella</td><td>26005</td><td>Szkiełka 75x50mm, grubość 1mm</td></tr><tr><td>Uchwyt do prowadnic szklanych</td><td>Buehler</td><td>#112488</td><td>Wystarczająco duży, aby pomieścić szkiełka o wymiarach 75x50mm</td></tr><tr><td>Płyta grzejna o prędkości 140 stopni C</td><td>Inkubator</td><td>HP88850105</td><td></td>ThermoScientific</tr><tr><td></td><td>NAPCO</td><td>Model 4200</td><td></td></tr><tr><td>Isocut Płyn</td> do <td>napełniania</td><td>111193032</td><td>smarem; 30mL</td></tr><tr><td>Wiertło diamentowe jubilera</td><td>Otto Frei</td><td>#119.050</td><td>Wiertło rdzeniowe z pustym trzpieniem o średnicy wewnętrznej 2 mm</td></tr><tr><td>NRecon</td><td>Bruker microCT</td><td>v.1.6.10.2</td><td>Pobierz i zainstaluj pod adresem https://www.bruker.com/products/microtomography.html</td></tr><tr><td>Piła oscylacyjna</td><td>Harbor Freight</td><td>62866</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia szklane nadające się do pieczenia w piekarniku</td><td>Pyrex</td><td>1117715</td><td>Szklany pojemnik do przechowywania żywności</td></tr><tr><td>Precyzyjna piła wolnoobrotowa (Isomet 1000)</td><td>Buehler</td><td>111280160</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Amazon</td><td>25181</td><td></td></tr><tr><td>Płytkie puszki aluminiowe</td><td>Amazonka</td><td>Kubki</td> na próbki o <td>średnicy B01MRWLD0R ~ 8 cm</td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>616784425436 885334344729</td><td></td></tr><tr><td>Tergazyme detergent</td><td>Alconox</td><td>1304-1</td><td>Pudełko 1,8 kg</td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>MTI Corporation</td><td>KJ201508006</td><td></td></tr></tbody></table>

przewodnik po cięciu, rdzeniowaniu i przetwarzaniu obrazów do wysokoprzepustowego pobierania i analizy próbek kości korowych do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Kość to dynamiczna i mechanicznie aktywna tkanka, której struktura zmienia się w ciągu życia człowieka. Produkty procesu przebudowy kości zostały dokładnie przebadane przy użyciu tradycyjnych technik dwuwymiarowych. Ostatnie postępy w technologii obrazowania rentgenowskiego za pomocą stacjonarnej mikrotomografii komputerowej (μCT) i mikrotomografii komputerowej promieniowania synchrotronowego (SRμCT) pozwoliły na uzyskanie trójwymiarowych (3D) skanów o wysokiej rozdzielczości o większym polu widzenia (FOV) niż inne techniki obrazowania 3D (np. SEM), zapewniając pełniejszy obraz mikroskopijnych struktur w ludzkiej kości korowej. Próbka powinna być jednak dokładnie wyśrodkowana w obrębie pola widzenia, aby ograniczyć pojawianie się artefaktów smug, o których wiadomo, że wpływają na analizę danych. Wcześniejsze badania donosiły o pozyskiwaniu prostoliniowych bloków kostnych o nieregularnych kształtach, które powodują artefakty obrazowania z powodu nierównych krawędzi lub obcięcia obrazu. Zastosowaliśmy protokół pobierania próbek geologicznych (rdzeniowanie) w celu uzyskania próbek rdzenia kostnego kory kostnej o spójnej wielkości do eksperymentów SRμCT z przedniej części ludzkiej kości udowej. Ta metoda rdzeniowania jest wydajna i minimalnie destrukcyjna dla tkanek. Tworzy jednolite cylindryczne próbki, które zmniejszają artefakty obrazowania ze względu na to, że są izometryczne podczas obrotu i zapewniają jednolitą długość ścieżki dla wiązek promieniowania rentgenowskiego podczas skanowania. Przetwarzanie obrazowe danych tomograficznych rentgenowskich próbek rdzeniowych i o nieregularnych kształtach potwierdza potencjał tej techniki w zakresie poprawy wizualizacji i analizy mikroarchitektury kości korowej. Celem tego protokołu jest dostarczenie niezawodnej i powtarzalnej metody ekstrakcji rdzeni kostnych kory mózgowej, którą można dostosować do różnych typów eksperymentów obrazowania kości w wysokiej rozdzielczości. Nadrzędnym celem prac jest stworzenie ustandaryzowanego procesu pozyskiwania kości korowej do SRμCT, który będzie przystępny cenowo, spójny i prosty. Procedura ta może być dalej adaptowana przez badaczy z pokrewnych dziedzin, którzy zwykle oceniają twarde materiały kompozytowe, takie jak antropologia biologiczna, nauki o Ziemi lub nauki o materiałach.

Opisana metoda pobierania próbek rdzeniowych okazała się wysoce skuteczna i wydajna. Pozyskanie próbek rdzeniowych zgodnie z tym protokołem pozwoliło na zgromadzenie &gt;300 próbek o spójnych wymiarach do eksperymentów na linii wiązki CLS BMIT-BM2, z FOV wynoszącym ~2 mm przy rozmiarze woksela 1,49 µm. Aby zweryfikować spójność średnicy rdzenia, wykonano trzy pomiary wzdłuż jego długości (góra, środek, dół) dla podzbioru rdzeni przedniej części kości udowej człowieka (n=69). Średnia średn...

Zastosowaliśmy protokół geologicznego (rdzeniowego) pobierania próbek, aby pozyskać próbki kości korowej o jednakowej wielkości do eksperymentów SRμCT z przedniej strony ludzkiej kości udowej. Metoda ta jest minimalnie destrukcyjna, wydajna, daje w wyniku cylindryczne próbki, które minimalizują artefakty obrazowania z nieregularnych kształtów próbek oraz poprawiają wizualizację i analizę mikroarchitektoniczną.

Przewodnik po cięciu, rdzeniowaniu i przetwarzaniu obrazów do wysokoprzepustowego pobierania i analizy próbek kości korowych do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Dostępne dane dotyczące pobierania próbek kostnych do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej pozostają nieliczne. Nasz obszerny samouczek zawiera metodologię, która jest prosta, minimalnie destrukcyjna i opłacalna. Pozyskiwanie próbek kości o stałych wymiarach i cylindrycznym kształcie ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że wynikowe zestawy danych są najwyższej jakości, a wyniki mają zastosowanie.Techniki opisane w tym manuskrypcie mają zastosowanie do rdzeniowania skał, skamieniałości lub dowolnego twardego materiału. Użyliśmy ich do zebrania jednorodnych rozmiarów rdzeni skał i monokryształów do eksperymentów wysokociśnieniowych w celu zbadania reologii skorupy ziemskiej i górnego płaszcza. Początkujący rdzeniarze mogą stwierdzić, że próbka kości tworzy stożkowate kształty.Można temu zaradzić, dając odpowiednią ilość czasu na wypłukanie pyłu kostnego z wiertła i spowalniając prędkość rdzeniowania. Brakuje tekstów instruktażowych i filmów instruktażowych, które demonstrują pobieranie próbek kości do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej i są analizą logiczną. Nasz samouczek krok po kroku dotyczący przygotowania kości pomaga wypełnić tę lukę.Umieść szklane szkiełko mikroskopowe o wymiarach 75 na 25 milimetrów na płytach grzejnych o temperaturze do 140 stopni Celsjusza i rozpuść dużą ilość termicznej żywicy epoksydowej na środku szkiełka. Wciśnij dolną część bloku kostnego w termiczną żywicę epoksydową na szkiełku mikroskopowym tak, aby długość kości była prostopadła do szkiełka. Przesuwaj próbkę do przodu i do tyłu, aby pokryć spód kości i zapewnić bezpieczne przyleganie.Pozostaw zamontowaną próbkę na płycie grzejnej przez około pięć minut, aby żywica epoksydowa termiczna mogła wniknąć w pory i pęknięcia, upewniając się, że żywica epoksydowa na szkiełku jest wolna od pęcherzyków. Jeśli obecne są pęcherzyki, przesuwaj próbkę do przodu i do tyłu, aby je usunąć. Użyj kleszczyków, aby usunąć szkiełko z zamontowaną próbką z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej przez około 10 minut, a następnie usuń żywicę epoksydową z krawędzi szkiełka za pomocą żyletki, aby upewnić się, że uchwyt odpowiednio chwyta szkiełko.Przymocuj szkiełko z przylegającą próbką do szklanego uchwytu suwakowego i zamontuj uchwyt na ramieniu obrotowym piły do cięcia wolnoobrotowego, ustawiając go tak, aby można było przeciąć przekrój kości prostopadle do jej długości. Wyreguluj ramię obrotowe, aby upewnić się, że ostrze styka się i przenika próbkę. Dodaj obciążniki po drugiej stronie ramienia tnącego, aby zrównoważyć ciężar ramienia i dodaj wodę destylowaną i płyn chłodząco-smarujący do pojemnika na płyn.Mocno dokręć diamentowe ostrze waflowe i upewnij się, że poziom płynu zanurza część tnącą ostrza. Ustaw prędkość na 200 obr./min i powoli opuść sample na ostrze. Gdy piła zacznie ciąć, upewnij się, że ostrze i uchwyt nie chwieją się ani nie podskakują.Jeśli tak, natychmiast zatrzymaj pilarkę i dokręć zespół ostrza lub ramienia uchwytu. Jeśli uchwyt agresywnie porusza się w górę iw dół, dodaj więcej przeciwwag. Pierwszy gruby przekrój to cięcie odpadowe, które zapewni dobrze zdefiniowaną powierzchnię równoległą do każdego dodatkowego cięcia.Po wstępnym cięciu odpadu podnieś ramię obrotowe i przesuń uchwyt o pięć milimetrów w kierunku ostrza za pomocą pokrętła pozycjonującego. Po zakończeniu cięcia umieść szkiełko z zamontowaną próbką na płycie grzejnej, aby stopić termiczną żywicę epoksydową. Zamontuj pięciomilimetrowe odcinki kości na dnie płytkiej aluminiowej cyny, korzystając z opisanej wcześniej techniki termicznego łączenia epoksydowego.Umieść cynę na stole maszyny XY wiertarki młynowej i ręcznie dokręć mocowanie clamps. Włóż wiertło rdzeniowe o średnicy wewnętrznej o średnicy wewnętrznej o średnicy wewnętrznej z diamentową końcówką jubilera do uchwytu wiertarskiego młyna i wyreguluj ogranicznik głębokości, aby zapobiec przebijaniu się cyny. Wyrównaj środkową przednią część próbki kości pod wiertłem, unikając bliskiego kontaktu z okostną i ostium lub silnie beleczkowanymi obszarami.Napełnij puszkę wodą destylowaną, aby całkowicie przykryć próbkę, co zapobiega gromadzeniu się ciepła, spaleniu próbki i uszkodzeniu wiertła podczas wiercenia. Wiertarka młynowa może być niebezpieczna, jeśli nie zostaną podjęte odpowiednie środki bezpieczeństwa. Operatorzy powinni upewnić się, że noszą okulary ochronne, że luźna odzież jest zabezpieczona, a długie włosy są ściągnięte do tyłu, aby nie zostały zaplątane we wrzeciono.W pierwszych kilku przypadkach kontaktu między rdzeniem wiertniczym a kością należy delikatnie docisnąć, aby założyć pierścień na górną powierzchnię kości. Zapobiega to ugięciu wiertła na początku procesu wiercenia i zapewnia prawidłowe umieszczenie wiertła. Podczas wiercenia podnieś wiertło i wyjmij je z próbki, trzymając końcówkę wiertła pod powierzchnią wody.Rób to co kilka sekund, aby wypłukać uwięziony pył kostny i upewnić się, że zanieczyszczenia nie zasłaniają wiertła. Po zakończeniu rdzeniowania powstały rdzeń kostny może utknąć w wiertle z pustym trzpieniem. Użyj pary kleszczyków z cienką końcówką lub małego klucza imbusowego, aby usunąć rdzeń z wiertła.Przechowuj wydrążoną próbkę w oznakowanej probówce mikrowirówkowej w chłodnym i suchym miejscu do czasu obrazowania. Opisana metoda pobierania próbek rdzeniowych okazała się wysoce skuteczna i wydajna. Poniżej przedstawiono reprezentatywne dane liczbowe porównujące przebieg przetwarzania obrazu próbki rdzeniowej i próbki pobranej za pomocą narzędzia obrotowego.Próbka wycięta za pomocą zwykłego narzędzia obrotowego wykazała zwiększoną liczbę kanałów i luk oraz zmniejszoną średnią średnicę kanału, objętość kanału i porowatość kory mózgowej w porównaniu z próbką rdzeniową. Poniższa tabela przedstawia dane dotyczące porowatości dla każdej próbki. Chociaż protokół rdzeniowania zmniejsza artefakty obserwowane w skanach synchrotronowej tomografii mikrokomputerowej, gorszej jakości dane z artefaktami z eksperymentów z prostoliniowymi blokami kostnymi stanowią wieloaspektowy problem.Późniejsze przetwarzanie obrazu potwierdziło potencjał tej techniki w zakresie poprawy wizualizacji mikroarchitektury kości korowej. Zaobserwowano na przykład różnice w mineralizacji, lepsze wytyczenie granic kostnych i konsekwentną wizualizację tkanek miękkich w kanałach naczyniowych. Powolne postępowanie jest kluczem do uzyskania cylindrycznych próbek o stałej wielkości.Zbyt szybka jazda może spowodować, że próbki staną się stożkowate, a nie cylindryczne. Zamawiając grube skrawki do rdzeniowania, można zebrać kolejne grube skrawki do mikroskopii Brightfield lub konfokalnej. Pozwala to na wizualizację sieci kanałowej.

a-sectioning-coring-image-processing-guide-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.

Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)

Rentgenowska tomografia komputerowa (HRCT) o wysokiej rozdzielczości to nieniszcząca technika obrazowania diagnostycznego, która może być wykorzystana do badania struktury i funkcji naczyń krwionośnych roślin w 3D. Pokazujemy, w jaki sposób HRCT ułatwia eksplorację sieci ksylemu w szerokim zakresie tkanek i gatunków roślin.

Wykorzystanie tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji trójwymiarowej struktury i funkcji naczyń krwionośnych roślin

W tym manuskrypcie prezentujemy wysokoprzepustową, półautomatyczną platformę kriohistologiczną do tworzenia wyrównanych obrazów kompozytowych pomiarów wielokrotnej odpowiedzi z kilku rund obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych odcinkach zmineralizowanych tkanek.

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

Przedstawiono protokół do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkanek za pomocą metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego, przeznaczonej do rentgenowskiej tomografii komputerowej.

Obrazowanie 3D próbek tkanek miękkich przy użyciu metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego i nanoskopowej tomografii komputerowej

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Mikrotomografia komputerowa (μCT) jest nieniszczącym narzędziem do obrazowania, które jest instrumentalne w ocenie struktury kości w badaniach przedklinicznych, jednak nie ma zgody co do procedur μCT do analizy modzeli gojącej się kości. Badanie to zapewnia krok po kroku protokół μCT, który umożliwia monitorowanie gojenia się złamań.

Ocena gojenia złamań kości za pomocą mikrotomografii komputerowej

To badanie opisuje etapy uzyskiwania obrazów mózgów noworodków myszy w wysokiej rozdzielczości poprzez połączenie mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) i środka kontrastowego w próbkach ex vivo. Opisujemy podstawowe analizy morfometryczne w celu ilościowego określenia wielkości i kształtu mózgu na tych obrazach.

Obrazowanie mikro-CT i analiza morfometryczna mózgów noworodków myszy

Przedstawiamy metodę analizy zdefiniowanego przez użytkownika obszaru zainteresowania (ROI) w podłużnym modelu defektu promieniowego szczura in vivo . Metoda ta umożliwia analizę porównawczą różnych rusztowań, które wcześniej były ograniczone przez różnice w polu widzenia skanowania metodą tomografii komputerowej (μCT), orientacji próbki i wyjściowej obecności rusztowania.

Podłużna analiza obrazu mikrotomografii komputerowej dla zdefiniowanego przez użytkownika obszaru zainteresowania w ubytkach kostnych o krytycznej wielkości

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Jest to protokół wysokoprzepustowej krio konserwacji plemników rybek zebrafish. Plemniki krio konserwowane zgodnie z tym protokołem wykazują średnią płodność na poziomie 25% podczas późniejszego zapłodnienia in vitro i pozostają stabilne przez wiele lat.

Wysokoprzepustowa metoda krio konserwacji plemników i zapłodnienia in vitro ryby danio-ostreokonicznej (zebrafish)

Poznaj metodę minimalnie inwazyjnego pobierania próbek kości korowej z kości udowej człowieka do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej. Technika rdzeniowania zmniejsza artefakty obrazowania i poprawia wizualizację mikroarchitektury kostnej.

Przewodnik po cięciu, rdzeniowaniu i przetwarzaniu obrazów do wysokoprzepustowego pobierania i analizy próbek kości korowych do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej (Wideo) | JoVE Journal

Przewodnik po cięciu, rdzeniowaniu i przetwarzaniu obrazów do wysokoprzepustowego pobierania i analizy próbek kości korowych do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej

Przeglądaj więcej filmów