Przewodnik po cięciu, rdzeniowaniu i przetwarzaniu obrazów do wysokoprzepustowego pobierania i analizy próbek kości korowych do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej

Dostępne dane dotyczące pobierania próbek kostnych do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej pozostają nieliczne. Nasz obszerny samouczek zawiera metodologię, która jest prosta, minimalnie destrukcyjna i opłacalna. Pozyskiwanie próbek kości o stałych wymiarach i cylindrycznym kształcie ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że wynikowe zestawy danych są najwyższej jakości, a wyniki mają zastosowanie.

Techniki opisane w tym manuskrypcie mają zastosowanie do rdzeniowania skał, skamieniałości lub dowolnego twardego materiału. Użyliśmy ich do zebrania jednorodnych rozmiarów rdzeni skał i monokryształów do eksperymentów wysokociśnieniowych w celu zbadania reologii skorupy ziemskiej i górnego płaszcza. Początkujący rdzeniarze mogą stwierdzić, że próbka kości tworzy stożkowate kształty.

Można temu zaradzić, dając odpowiednią ilość czasu na wypłukanie pyłu kostnego z wiertła i spowalniając prędkość rdzeniowania. Brakuje tekstów instruktażowych i filmów instruktażowych, które demonstrują pobieranie próbek kości do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej i są analizą logiczną. Nasz samouczek krok po kroku dotyczący przygotowania kości pomaga wypełnić tę lukę.

Umieść szklane szkiełko mikroskopowe o wymiarach 75 na 25 milimetrów na płytach grzejnych o temperaturze do 140 stopni Celsjusza i rozpuść dużą ilość termicznej żywicy epoksydowej na środku szkiełka. Wciśnij dolną część bloku kostnego w termiczną żywicę epoksydową na szkiełku mikroskopowym tak, aby długość kości była prostopadła do szkiełka. Przesuwaj próbkę do przodu i do tyłu, aby pokryć spód kości i zapewnić bezpieczne przyleganie.

Pozostaw zamontowaną próbkę na płycie grzejnej przez około pięć minut, aby żywica epoksydowa termiczna mogła wniknąć w pory i pęknięcia, upewniając się, że żywica epoksydowa na szkiełku jest wolna od pęcherzyków. Jeśli obecne są pęcherzyki, przesuwaj próbkę do przodu i do tyłu, aby je usunąć. Użyj kleszczyków, aby usunąć szkiełko z zamontowaną próbką z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej przez około 10 minut, a następnie usuń żywicę epoksydową z krawędzi szkiełka za pomocą żyletki, aby upewnić się, że uchwyt odpowiednio chwyta szkiełko.

Przymocuj szkiełko z przylegającą próbką do szklanego uchwytu suwakowego i zamontuj uchwyt na ramieniu obrotowym piły do cięcia wolnoobrotowego, ustawiając go tak, aby można było przeciąć przekrój kości prostopadle do jej długości. Wyreguluj ramię obrotowe, aby upewnić się, że ostrze styka się i przenika próbkę. Dodaj obciążniki po drugiej stronie ramienia tnącego, aby zrównoważyć ciężar ramienia i dodaj wodę destylowaną i płyn chłodząco-smarujący do pojemnika na płyn

Mocno dokręć diamentowe ostrze waflowe i upewnij się, że poziom płynu zanurza część tnącą ostrza. Ustaw prędkość na 200 obr./min i powoli opuść sample na ostrze. Gdy piła zacznie ciąć, upewnij się, że ostrze i uchwyt nie chwieją się ani nie podskakują.

Jeśli tak, natychmiast zatrzymaj pilarkę i dokręć zespół ostrza lub ramienia uchwytu. Jeśli uchwyt agresywnie porusza się w górę iw dół, dodaj więcej przeciwwag. Pierwszy gruby przekrój to cięcie odpadowe, które zapewni dobrze zdefiniowaną powierzchnię równoległą do każdego dodatkowego cięcia.

Po wstępnym cięciu odpadu podnieś ramię obrotowe i przesuń uchwyt o pięć milimetrów w kierunku ostrza za pomocą pokrętła pozycjonującego. Po zakończeniu cięcia umieść szkiełko z zamontowaną próbką na płycie grzejnej, aby stopić termiczną żywicę epoksydową. Zamontuj pięciomilimetrowe odcinki kości na dnie płytkiej aluminiowej cyny, korzystając z opisanej wcześniej techniki termicznego łączenia epoksydowego.

Umieść cynę na stole maszyny XY wiertarki młynowej i ręcznie dokręć mocowanie clamps. Włóż wiertło rdzeniowe o średnicy wewnętrznej o średnicy wewnętrznej o średnicy wewnętrznej z diamentową końcówką jubilera do uchwytu wiertarskiego młyna i wyreguluj ogranicznik głębokości, aby zapobiec przebijaniu się cyny. Wyrównaj środkową przednią część próbki kości pod wiertłem, unikając bliskiego kontaktu z okostną i ostium lub silnie beleczkowanymi obszarami.

Napełnij puszkę wodą destylowaną, aby całkowicie przykryć próbkę, co zapobiega gromadzeniu się ciepła, spaleniu próbki i uszkodzeniu wiertła podczas wiercenia. Wiertarka młynowa może być niebezpieczna, jeśli nie zostaną podjęte odpowiednie środki bezpieczeństwa. Operatorzy powinni upewnić się, że noszą okulary ochronne, że luźna odzież jest zabezpieczona, a długie włosy są ściągnięte do tyłu, aby nie zostały zaplątane we wrzeciono.

W pierwszych kilku przypadkach kontaktu między rdzeniem wiertniczym a kością należy delikatnie docisnąć, aby założyć pierścień na górną powierzchnię kości. Zapobiega to ugięciu wiertła na początku procesu wiercenia i zapewnia prawidłowe umieszczenie wiertła. Podczas wiercenia podnieś wiertło i wyjmij je z próbki, trzymając końcówkę wiertła pod powierzchnią wody.

Rób to co kilka sekund, aby wypłukać uwięziony pył kostny i upewnić się, że zanieczyszczenia nie zasłaniają wiertła. Po zakończeniu rdzeniowania powstały rdzeń kostny może utknąć w wiertle z pustym trzpieniem. Użyj pary kleszczyków z cienką końcówką lub małego klucza imbusowego, aby usunąć rdzeń z wiertła.

Przechowuj wydrążoną próbkę w oznakowanej probówce mikrowirówkowej w chłodnym i suchym miejscu do czasu obrazowania. Opisana metoda pobierania próbek rdzeniowych okazała się wysoce skuteczna i wydajna. Poniżej przedstawiono reprezentatywne dane liczbowe porównujące przebieg przetwarzania obrazu próbki rdzeniowej i próbki pobranej za pomocą narzędzia obrotowego.

Próbka wycięta za pomocą zwykłego narzędzia obrotowego wykazała zwiększoną liczbę kanałów i luk oraz zmniejszoną średnią średnicę kanału, objętość kanału i porowatość kory mózgowej w porównaniu z próbką rdzeniową. Poniższa tabela przedstawia dane dotyczące porowatości dla każdej próbki. Chociaż protokół rdzeniowania zmniejsza artefakty obserwowane w skanach synchrotronowej tomografii mikrokomputerowej, gorszej jakości dane z artefaktami z eksperymentów z prostoliniowymi blokami kostnymi stanowią wieloaspektowy problem.

Późniejsze przetwarzanie obrazu potwierdziło potencjał tej techniki w zakresie poprawy wizualizacji mikroarchitektury kości korowej. Zaobserwowano na przykład różnice w mineralizacji, lepsze wytyczenie granic kostnych i konsekwentną wizualizację tkanek miękkich w kanałach naczyniowych. Powolne postępowanie jest kluczem do uzyskania cylindrycznych próbek o stałej wielkości.

Zbyt szybka jazda może spowodować, że próbki staną się stożkowate, a nie cylindryczne. Zamawiając grube skrawki do rdzeniowania, można zebrać kolejne grube skrawki do mikroskopii Brightfield lub konfokalnej. Pozwala to na wizualizację sieci kanałowej.