Przygotowanie ostrych wycinków ludzkiego hipokampa do zapisów elektrofizjologicznych

Korzystając z naszej techniki, możemy testować potencjalne substancje przeciwpadaczkowe w próbkach ludzkiego mózgu, aby pomóc w opracowaniu leków na padaczkę skroniową. Ludzka tkanka mózgowa ma tę zaletę, że narusza pułapkę translacyjną między badaniami podstawowymi a zastosowaniami klinicznymi. W dniu zabiegu lub jak najpóźniej w dniu poprzedzającym rozmrozić 50 mililitrów 10x roztworu choliny aCSF w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i dodać rozmrożony roztwór i 50 mililitrów 10x roztworu od dwóch do około 300 mililitrów podwójnie destylowanej wody.

Dodać końcowe stężenia glukozy i chlorku wapnia do mieszaniny i mieszać aż do rozpuszczenia. Następnie dodaj podwójnie destylowaną wodę do końcowej objętości 500 mililitrów. Zmierz osmolarność.

I napełnij butelkę około 100 mililitrami 1x cholina aCSF. W dniu zabiegu schłodź 1x cholina aCSF na lodzie i użyj szklanego dozownika gazu podłączonego do gazu karbogenicznego, aby skarbonizować roztwór przez co najmniej 10 do 15 minut. Co najmniej 10 do 15 minut przed zabiegiem należy podgrzać do 35 stopni Celsjusza za pomocą karbonizacji zapasy aCSF, zawartość wysokiego potasu i 4-aminopirydyny aCSF oraz niską zawartość magnezu i bicukuliny.

Aby przygotować komorę interfejsu, wytnij dwa kawałki bibuły filtracyjnej o wymiarach cztery na dwa centymetry dla każdej komory na plasterki i ułóż kawałki jeden na drugim. Następnie umieść cienkie bawełniane sznurki wokół kawałków bibuły filtracyjnej wewnątrz przegródek, aby złamać napięcie roztworu i zapewnić równomierny przepływ. I umieść trzy do czterech kawałków bibuły filtracyjnej o wymiarach 1,5 na jeden centymetr na większym kawałku bibuły filtracyjnej w każdej komorze.

Przed pobraniem plastrów tkanki użyj 70% etanolu, aby przetrzeć obszar preparatu i nałożyć na niego osłonę. Umieść super klej, dwie ostre pęsety, szpatułkę, skalpel z ostrzami i ostrze do zgrubnego cięcia tkanki mózgowej w pobliżu wibratomu. Przetrzyj tackę buforową i płytkę próbki wibratomu 70% etanolem.

Gdy tacka buforowa całkowicie wyschnie, przykryj ją folią aluminiową i umieść tackę w łaźni lodowej. Napełnij łaźnię lodową kruszonym lodem i utrzymuj kąpiel w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do momentu przygotowania. Następnie przetrzyj wibratom i żyletkę 70% etanolem i skalibruj wibratom, aby zminimalizować wszelkie pionowe wibracje i uszkodzenia tkanek podczas procedury krojenia.

Natychmiast po pobraniu próbki tkanki należy usunąć tkankę z transportowej choliny aCSF i odciąć wszelkie spalone fragmenty tkanki. Wytnij równą powierzchnię, aby ułatwić przyklejenie kawałka tkanki do płytki próbki i użyj wibratomu, aby pokroić tkankę mózgową na plastry o grubości 400 mikrometrów, dostosowując amplitudę i prędkość wibratomu w razie potrzeby podczas cięcia. Niektóre części ludzkiego hipokampa mogą być bardziej odporne na przecięcie niż inne.

Zachowanie szczególnej ostrożności i poświęcenie czasu może znacznie poprawić jakość próbki. Użyj skalpela, aby przyciąć plastry mózgu, aby zmieściły się w komorze nagrywania, a następnie użyj szpatułki i małych kleszczyków, aby ostrożnie umieścić plastry na małych kawałkach bibuły filtracyjnej w komorze interfejsu na co najmniej godzinę. W celu rejestracji aktywności padaczkowej należy umieścić półprzepuszczalną membranę przyklejoną do plastikowego pierścienia w komorze i podłączyć rurki doprowadzające i odpływowe komory do pompy perystaltycznej.

Napełnij probówki i komorę wstępnie podgrzanym karbogenicznym aCSF. Aby przygotować elektrody rejestrujące, napełnij jedną lub dwie szklane pipety megaomowe 154-milimolowym roztworem chlorku sodu. Umieść pipety w uchwycie elektrody i za pomocą pęsety i szpatułki przenieś wycinek hipokampa z komory interfejsu na szalkę Petriego wypełnioną karbogennym aCSF.

Wyjmij bibułę filtracyjną bez odwracania plastra i umieść plasterek w komorze nagrywającej. Przytrzymaj plasterek na miejscu za pomocą siatki plastrów i umieść elektrody w obszarze zainteresowania. Rozpocznij nagrywanie.

Aktywność impulsowa wywołana przez wysoki poziom potasu i 4-aminopirydyny powinna być widoczna od dwóch do pięciu minut po umyciu, podczas gdy indukcja zdarzeń podobnych do napadów padaczkowych przez niski poziom magnezu i bicukuliny może trwać do 30 minut. Zastosowanie wysokiej zawartości potasu i 4-aminopirydyny indukuje aktywność padaczkową w postaci wybuchów w ciągu kilku minut. Zdarzenia podobne do napadów trwających ponad 10 sekund mogą być wywołane przez zastosowanie niskiego poziomu magnezu i bicukuliny.

Liczba zdarzeń wybuchowych zmniejsza się zarówno podczas stosowania lakozamidu, jak i stosowania dimetyloetanoloaminy, chociaż amplitudy są w większości nienaruszone. Jakość tkanki mózgowej można również poprawić poprzez zmniejszenie zanieczyszczeń i uszkodzeń podczas przygotowywania. Wycinki ludzkiego mózgu przygotowane naszymi metodami mogą być również wykorzystywane do badania podstawowych funkcji fizjologicznych neuronów za pomocą patch clamp lub badania ekspresji genów za pomocą różnych technik.

Laboratoria na całym świecie zaczęły badać podstawowe mechanizmy zachodzące w ludzkim mózgu, a te spostrzeżenia mogą być wykorzystane do pomocy w opracowywaniu leków i mogą być testowane przy użyciu proponowanych przez nas metod.