Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Protokół ten ma na celu uproszczenie przygotowania bibliotek sekwencjonowania małych RNA o niskim nakładzie pracy z wczesnych zarodków w celu dokładnego profilowania mikroRNA, które regulują rozwój embrionalny. Zaletą tej techniki jest to, że pozwala uniknąć gromadzenia się próbek o niskiej wartości wejściowej i może być łatwo stosowana zarówno do komórek niesortowanych, jak i sortowanych. Wykazujemy również staranną ocenę zarodka, aby uniknąć wariantów między powtórzeniami.

Metoda ta może być stosowana do badań czasowych, genetycznych i rozwojowych lub innych zastosowań, w których wejściowe stężenia RNA są niskie. W przyszłości metoda ta może być potencjalnie wykorzystana do diagnozowania zaburzeń rozwojowych, w których mikroRNA są rozregulowane. Najtrudniejszą technicznie częścią tego protokołu jest sekcja zarodków.

Ponieważ każdy zarodek musi zostać wypreparowany, poddany etapowi, obrazowi, a następnie szybko zdysocjowany, aby zapewnić żywotność komórki. Aby wypreparować zarodki, przepłucz macicę ciężarnej samicy myszy PBS i umieść ją w sterylnym plastikowym naczyniu o długości 10 centymetrów. Użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby oddzielić obszar zawierający decidua i oderwij mięsień macicy, aby odsłonić wszystkie decidua.

Aby wypreparować zarodki, przepłucz macicę ciężarnej samicy myszy PBS i umieść ją w sterylnym plastikowym naczyniu o długości 10 centymetrów. Użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby oddzielić obszar zawierający decidua. Przenieś wszystkie zarodki do nowego naczynia z czystym PBS i zrób zdjęcie całego miotu.

Następnie wyobraź sobie każdy zarodek z osobna i policz liczbę somitów, utrzymując stałe powiększenie i ekspozycję między eksperymentami. W przypadku zarodków starszych niż E8.0 należy odciąć głowę tuż nad tabliczką otic i przenieść głowę do czystego dołka na 48-dołkowej płytce. Dodaj 250 mikrolitrów papainy do dołka i delikatnie pipetuj w górę iw dół.

Za pomocą mikroskopu sprawdzić, czy nie ma grudek i kontynuować pipetowanie w górę i w dół, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Następnie dodaj 250 mikrolitrów FBS do komórek i przefiltruj 500 mikrolitrów zawiesiny przez nylonowy filtr siatkowy o grubości 35 mikrometrów. Przenieś filtrat do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra i wiruj go do 200 x g przez pięć minut.

Przenieść supernatant do nowej probówki i ponownie zawiesić osad komórek w 300 mikrolitrach PBS z BSA. Gdy będziesz gotowy do sortowania, przefiltruj komórki ponownie przez rurkę z nasadką filtrującą i dodaj DAPI, aby zabarwić żywe komórki. Użyj sortownika komórek z dyszą o średnicy 70 mikrometrów, aby posortować każdą próbkę do 500 mikrolitrów roztworu do lizy ekstrakcji RNA, a następnie wymieszaj i przechowuj próbkę w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza.

Do każdej próbki dodać pięć mikrolitrów barwnika o 6-krotnym obciążeniu i wymieszać przez pipetowanie. Załaduj próbki do żelu poliakrylamidowego 6% TBE, zaczynając od tego ostatniego w pierwszym dołku i pozostawiając jeden pas między każdą próbką. Uruchom żel pod napięciem 150 V przez 30 do 40 minut w buforze roboczym 0,5X TBE.

Gdy żel skończy płynąć, ostrożnie wyjmij go ze szklanych płytek i umieść na tacy z oryginalnego opakowania, zwracając uwagę na orientację. Usuń bufor do biegania i zabarwiaj żel przez 15 minut. A następnie zobrazuj to na oświetlaczu UV trans.

Zidentyfikuj opaskę na 150 parach zasad i użyj czystej żyletki, aby ją wyciąć. Upewnij się, że unikasz produktu dimera adaptera przy 130 parach zasad. Włóż plastry żelu do probówek mikrowirówek i wiruj je z maksymalną prędkością przez 30 sekund.

Następnie użyj końcówki P200, aby zmiażdżyć plasterek żelu na najmniejsze możliwe kawałki i wysunąć końcówkę do tuby. Dodaj 300 mikrolitrów buforu elucyjnego do każdej probówki, myjąc kawałki żelu z boku. Ponownie załóż końcówkę pipety i zmyj ją przed wyjęciem z probówki.

Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min. Następnego dnia wiruj je z maksymalną prędkością przez 10 minut i przenieś supernatant na 96-dołkową płytkę wolną od RNaz. Dodaj 50 mikrolitrów kulek czyszczących do każdej próbki i odpipetuj do wymieszania.

Następnie dodaj 350 mikrolitrów izopropanolu, wymieszaj próbkę i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, kołysząc się. Po inkubacji pociągnij, zakręć płytką i namagnesuj ją przez dwie minuty. Wyrzuć supernatant i myj kulki 950 mikrolitrami 80% etanolu przez 30 sekund.

Suszyć próbkę przez trzy minuty, a następnie usunąć całą pozostałość płynu z dna studzienki. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego. I ponownie zawiesić kulki w 13 mikrolitrach bufora do rezaspensji.

Inkubuj płytkę przez dwie minuty, a następnie przenieś ją z powrotem na stojak magnetyczny na trzy minuty. Przenieść 12 mikrolitrów supernatantu do czystej probówki i przechowywać przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub długotrwale w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Pobrano zarodki o wartościach E7,5, E8,5 i E9,5.

I somit zainscenizowany, aby rozwiązać sześciogodzinne interwały czasowe. Gdy zastosowano analizę głównych składowych do grupowania próbek na podstawie podobieństwa, stwierdzono, że próbki grupują się według wieku. Premigrujące i migrujące komórki grzebienia nerwowego oznaczono jako E8.5 z Wnt1-Cre i E9.5 z Sox10-Cre.

Porównanie dwóch czynników CRE potwierdza, że oznaczają one różne populacje we wczesnych zarodkach myszy. RNA oznaczono ilościowo za pomocą spektrofotometru i elektroforezy kapilarnej. Podczas gdy ślad spektrofotometru ujawnił, że RNA nie zawiera zanieczyszczających białek i ma wysokie stężenie w komórkach, nie był wystarczająco czuły, aby wykryć zmiany stężenia RNA wraz z wiekiem.

Ślad elektroforezy kapilarnej można wykorzystać do oszacowania stężenia i wielkości fragmentów RNA. Piki przy 2 000 i 5 100 nukleotydach to odpowiednio rybosomalne RNA 18S i 28S. Podczas gdy mały region RNA znajduje się na około 150 nukleotydach.

Ekstrakcja żelu może być stosowana do izolowania małych bibliotek sekwencjonowania RNA z dala od starterów adaptera. Przed wycięciem w każdej próbce występuje wiele rozmiarów produktów. Ślady elektroforezy kapilarnej przed i po doborze rozmiaru pokazują poprawę czystości produktu z biblioteki 150 par zasad po oczyszczeniu żelu.

Zaprojektowaliśmy ten protokół, aby podzielić preparat RNA z pojedynczej próbki zarówno na małe biblioteki sekwencjonowania RNA, jak i biblioteki sekwencjonowania mRNA na masowe. Pozwoli to odpowiedzieć na pytania dotyczące nie tylko ekspresji mikroRNA, ale także tego, które cele mRNA mogą być regulowane przez wyrażone mikroRNA. Technika ta umożliwiła nam uzyskanie kompleksowego wglądu w mikroRNA o najwyższej ekspresji i regulację ich celów w komórkach grzebienia nerwowego czaszki między gastrulacją a zamknięciem cewy nerwowej.