Wielokomórkowy model wyrostka zębodołowego człowieka złożony z komórek nabłonka i pierwotnych komórek odpornościowych do oceny zagrożeń

Ten indywidualny ludzki model dźwiękowy wykorzystuje odpowiednie komórki odpornościowe jako potężne narzędzie do przewidywania ostrej odpowiedzi immunologicznej na substancje, w tym nanomateriały i leki oparte na wiedzy. Te medyczne łączą ludzkie komórki nabłonkowe i ludzkie pierwotne komórki odpornościowe w celu oceny tych konkretnych reakcji. Wykorzystanie świeżych i mrożonych monocytów zapewnia elastyczność planu eksperymentu.

Liczne badania wykazały, że model ten może zapewnić wgląd w międzygwiezdną komunikację między zmysłem zachowania a zmysłem immunologicznym. Ponieważ ta demonstracja zawiera wszystkie ważne szczegóły dotyczące badania modelu cechy osobistej w hodowli komórkowej, wizualne instrukcje do replikacji eksperymentów. Kilka etapów w protokole pęcherza moczowego jest złożonych i wymaga specjalnego traktowania.

Dlatego są one demonstrowane ze wszystkimi wymaganymi szczegółami, aby można je było łatwo śledzić. W celu wyizolowania monocytów krwi obwodowej z ludzkich płaszczy Buffy, podziel zawartość torebki na płaszcze Buffy Harvest, równomiernie między 250 mililitrowymi stożkowymi probówkami. Ostrożnie doprowadź całkowitą objętość do każdej probówki 250 mililitrów z PBS i wymieszaj probówki z trzema delikatnymi inwersjami.

Następnie podzielić roztwór PBS Buffy coat równo między cztery nowe 50-mililitrowe probówki, a następnie dodać 10 mikrolitrów dodatnich kulek magnetycznych CD 14 siódmych komórek do probówki i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Po napełnieniu odłącz pipetę od pipety i natychmiast zatkaj kciukiem górny otwór pipety, a następnie umieść napełnioną pipetę na dnie jednej probówki i odłącz otwór pipety, aby umożliwić powolny przepływ medium o gradiencie gęstości pod mieszaniną PBS w kożuchie, aż jeden mililitr pożywki o gradiencie gęstości pozostanie wewnątrz pipety. Po dodaniu pożywki o gradiencie gęstości do każdej probówki w ten sam sposób, należy oddzielić komórki przez wirowanie w gradiencie gęstości i użyć pipety serologicznej do zebrania białej, dwu- lub trzymilimetrowej warstwy komórek jednojądrzastych krwi obwodowej spomiędzy warstwy osocza i pożywki gradientu gęstości.

Najlepszym sposobem na połączenie warstwy jest najpierw usunięcie plazmy, a następnie wyłączenie naszych logicznych pipet w celu zebrania komórek. Wyciągnij komórki jednojądrzaste krwi obwodowej z każdego zestawu dwóch probówek do jednej nowej probówki o pojemności 50 mililitrów i umyj komórki dwa razy z łączną objętością 50 mililitrów świeżego PBS na pranie. Następnie odrzuć supernatant i ponownie zawieś pipetę w każdym z pięciu mililitrów świeżego PBS i połącz zawiesiny komórek w jednej probówce w celu zliczenia.

Po zliczeniu ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś pelette do 80 mililitrów bufora separacji magnetycznej na siódmą komórkę. Następnie dodaj 10 mikrolitrów dodatnich kulek magnetycznych CD 14 na siódmą liczbę komórek do probówki i dobrze wymieszaj przez pipetowanie. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przepłukać kolumnę magnetyczną trzema mililitrami buforu do separacji magnetycznej i dodać komórki do kolumny.

Przemyć kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami buforu na przepłukanie i przenieść kolumnę do 15-mililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr świeżego buforu do separacji magnetycznej. Następnie użyj tłoka i pięciu mililitrów buforu, aby przepłukać dodatnie ogniwa CD 14 do probówki. Indukuj różnicowanie izolowanych komórek CD 14 dodatnich z kulkami magnetycznymi.

Po pierwsze, ponownie zawiesić komórki za jednym razem, aby zwracać uwagę na stężenie sześciu komórek na mililitr w pożywce do hodowli komórkowych. Lub różnicowanie MDDC, dodaj 10 nanogramów na mililitr i czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów w miejscu ziarnistości do probówki i dodaj trzy mililitry komórek do każdej studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli komórek, lub różnicowanie MDM dodaj 10 nanogramów na mililitr czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów do komórek i płytkuj komórki, jak właśnie pokazano. Aby skonfigurować model potrójnej hodowli komórek nabłonka ludzkich komórek nabłonka pęcherzyków płucnych, najpierw przenieś 1,5 mililitra wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowej do odpowiedniej liczby dołków na 12-dołkowej płytce i umieść wkładkę do hodowli komórkowej w każdym dołku.

Następnie dodać 500 mikrolitrów zawiesiny komórek nabłonkowych o gęstości pięć razy 10 do piątych komórek na mililitr do wierzchołkowej strony każdej wkładki i przykryć płytkę na czterodniową inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Lub wysiewanie MDDC zastępuje supernatant z dołków z sześciodołkowymi płytkami używanymi do różnicowania MDDC, jednym mililitrem świeżej ciepłej pożywki do hodowli komórkowych i użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć przylegające komórki od każdej studzienki. Przemyć każdą studzienkę trzy razy supernatem i w każdym dołku i połączyć wszystkie roztwory komórkowe w jedną probówkę wirówkową.

Pobrany MDDC przez odwirowanie i sterylną pęsetę w celu umieszczenia wkładek z 12 dołków do góry nogami na sterylnej szalce Petriego. Zeskrob wszelkie komórki nabłonkowe z podstawowej strony wkładki i ponownie zawieś MDDC w pożywce do hodowli świeżych komórek, aby uzyskać stężenie 4,2 razy 10 tych komórek na mililitr. Następnie dodaj 150 mikrolitrów komórek do każdej wkładki, tak aby cała podstawowa powierzchnia wkładki była równomiernie pokryta płynem bez pęcherzyków.

W przypadku wysiewu MDDM po zebraniu zróżnicowanych MDDM, jak pokazano dla MDDC, rozcieńczyć komórki do 2,5 razy 10 do czterech komórek na mililitr stężenia pożywki do hodowli świeżych komórek i dodać 500 mikrolitrów komórek w dół ściany każdej komórki nabłonkowej i wkładki do hodowli komórkowej zawierającej MDDC, a następnie umieścić pokrywkę na płytce i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Następnego dnia należy zassać supernatant zarówno z obszaru wierzchołkowego, jak i podstawnego każdej wkładki do hodowli komórkowej i studzienek. Następnie sterylizujesz pęsetę, aby podnieść wkładki z dołków i dodać 600 mikrolitrów świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowej do każdej studzienki.

Po sześciu dniach różnicowania MDM wydają się okrągłe, podczas gdy MDDC tworzą skupiska złożone z komórek o bardziej wydłużonym kształcie i obserwowalnych wypukłościach. Po trzech dniach wzrostu na wstawkach błonowych komórki nabłonkowe tworzą gęsty Obserwuje się znaczny wzrost uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w pożywce hodowli komórkowej przedziału podstawowego po wystawieniu na kontrolę pozytywną pęknięcia błony, co dowodzi reakcji modelu na substancję cytotoksyczną. Brak zwiększenia uwalniania dehydrogenazy mleczanowej mierzonego po stymulacji wierzchołkowej TNF alfa lub LPS.

Statystycznie istotne zwiększenie uwalniania IL6 i IL8 obserwuje się zarówno w próbkach traktowanych LPS, jak i TNF alfa w porównaniu z komórkami kontrolnymi nietraktowanymi. Nie obserwuje się różnic w morfologii komórek między modelami kohodowli z wykorzystaniem MDDM i MDDC ze świeżych monocytów krwi obwodowej w porównaniu z modelami wykorzystującymi rozmrożone komórki w kohodowli narażonej na LPS i TNF alfa, zaobserwowano przerwaną warstwę nabłonkową. Możliwe jest wykorzystanie innych typów komórek ludzkich, takich jak komórki dróg oddechowych lub oskrzelików, można również analizować inne punkty końcowe.

Głównie naukowcy zainspirowali się tą techniką, używając podobnej konfiguracji, ale z różnymi typami komórek.