Trójwymiarowe obrazowanie układu naczyniowego i drenażu limfatycznego kręgów przy użyciu iDISCO⁺ i mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych

Nasz protokół zapewnia trójwymiarowe i wielkoskalowe widoki naczyń limfatycznych kręgów i ich drenujących węzłów chłonnych, ułatwiając badanie drenażu limfatycznego i ruchu limfatycznego komórek odpornościowych. Protokół clearing iDISCO+ zachowuje integralność tkanek, umożliwiając lokalizację komórek nerwowych, naczyniowych i odpornościowych kręgosłupa, w tym rdzenia kręgowego, opon mózgowych, przestrzeni zewnątrzoponowej i drenujących węzłów chłonnych. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania u znieczulonej myszy w wieku od 8 do 12 tygodni, umieść mysz w ramce stereotaktycznej.

I za pomocą skalpela należy wykonać nacięcie skóry w odpowiednim miejscu do planowanego wstrzyknięcia. Użyj adaptera kręgosłupa, aby unieruchomić rdzeń kręgowy na poziomie kręgów Th12-L1 i tępo wypreparuj mięśnie przyszyjkowe lub przykręgosłupowe pokrywające szyję i kolumnę, aby uwidocznić powierzchnię opony twardej. Następnie użyj igły o rozmiarze 26, aby ostrożnie nakłuć centralny obszar opony twardej i leżącą pod nią pajęczynówkę.

Następnie odetnij dwa milimetry od szklanej końcówki kapilary i połącz kapilę z kaniulą połączoną ze strzykawką o pojemności 10 mikrolitrów. Załaduj mikrokapilę dwoma do ośmiu mikrolitrów wybranego znacznika fluorescencyjnego. I wprowadzić mikrokapilę do przyśrodkowej części opony twardej pod odpowiednim kątem do planowanego wstrzyknięcia.

Popychając kapilarnę 1,5 milimetra poniżej opony twardej, zamknij nacięcie wokół naczynia włosowatego za pomocą 10 mikrolitrów kleju chirurgicznego. Gdy klej wyschnie, powoli wstrzyknij znacznik fluorescencyjny z szybkością jednego mikrolitra na minutę. Po dostarczeniu całej objętości pozostaw kapilarnę na miejscu na jedną minutę przed wycofaniem mikrokapilary.

I zamknij otwór iniekcyjny dodatkowym klejem. W odpowiednim momencie po wstrzyknięciu należy użyć nożyczek preparacyjnych, aby wykonać nacięcia skóry i otrzewnej od dolnej części brzucha do klatki piersiowej. Otwórz klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca i włóż igłę o rozmiarze 26 do lewej komory serca.

Perfuzja z 20 mililitrami lodowatego 4% paraformaldehydu w PBS, w tempie dwóch mililitrów na minutę. I użyj nożyczek, aby szybko przeciąć prawe przedsionek, uwalniając strumień płynu perfuzyjnego. Użyj kleszczy, aby całkowicie usunąć skórę i usuń kończyny nożyczkami.

Usuń wszystkie narządy wewnętrzne, uważając, aby węzły chłonne pozostały nienaruszone i przeciąć żebra. Zanurz wypreparowane tkanki w lodowatym 4% paraformaldehydzie w PBS w pojedynczych 50-mililitrowych probówkach przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie umyj utrwalone tkanki trzy razy w 50 mililitrach świeżego PBS, przez pięć minut na pranie. W przypadku znakowania iDISCO+ próbek w całości, najpierw należy odwodnić tkanki, zanurzając je w rosnących stężeniach metanolu w PBS przez jedną godzinę na zanurzenie z mieszaniem w temperaturze pokojowej.

Po ostatnim zanurzeniu inkubować próbki w roztworze 33% metanolu i 66% dichlorometanu przez noc z mieszaniem. Następnego ranka umyj próbki dwa razy 100% metanolem przez jedną godzinę na mycie w temperaturze pokojowej. Następnie następuje całonocna inkubacja w 5% nadtlenku wodoru w metanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego ranka próbki należy stopniowo nawadniać w sekwencyjnym zanurzeniu w malejących stężeniach metanolu w PBS przez jedną godzinę na stężenie z mieszaniem w temperaturze pokojowej. Aby odwapnić kręgi, należy inkubować próbki w roztworze Morse'a przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dwa płukania w PBS i dwie jednogodzinne inkubacje w 0,2% Triton X-100 w PBS, z mieszaniem w temperaturze pokojowej.

Po drugiej inkubacji Triton X-100 próbki należy traktować roztworem przepuszczalnym przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie 24-godzinna inkubacja w roztworze blokującym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji roztworu blokującego znakować próbki pierwszorzędowym przeciwciałem, rozcieńczonym w 0,2% Tween-20 i 0,1% heparynie w PBS uzupełnionym 5% dimetylosulfotlenkiem i 3% roztworem surowicy osła w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć dni.

Pod koniec inkubacji przemyć próbki czterema do pięciu inkubacjami przez noc w świeżych 2% Tween-20 i 0,1% heparynie w PBS na przemycie w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Następnie inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Po ostatnim przemyciu odwodnić próbki, zanurzając je w rosnących stężeniach metanolu w PBS na jedną godzinę na każde stężenie.

Następnie następuje nocna inkubacja w 33% roztworze metanolu i 66% dichlorometanu. Następnego ranka umyj próbki dwoma 15-minutowymi płuczkami dichlorometanu. I oczyść próbki w eterze dibenzylowym bez wstrząsania przez cztery godziny.

W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkuszy świetlnych należy umieścić oczyszczone próbki w płaszczyźnie poprzecznej w stoliku mikroskopu pod obiektywem 4X, 0,3. I wybierz jednostronną konfigurację eliminacji trzech arkuszy ze stałą pozycją X bez dynamicznego ustawiania ostrości. Używaj laserów LED dostrojonych do 561 nanometrów i 100 miliwatów oraz 639 nanometrów i 70 miliwatów.

I ustaw aperturę numeryczną arkusza światła na 0,03. Ustaw odpowiednie filtry emisyjne i napełnij komorę mikroskopu eterem dibenzylowym. Następnie użyj aparatu, aby uzyskać stosy ze stosami Z o wielkości 2,5 mikrometra i czasem ekspozycji wynoszącym 30 milisekund na krok, korzystając z dwóch zoomów optycznych X i 0,8 mikrometra na piksel.

I wykonuj akwizycje mozaiki z 10% nałożeniem na pełną klatkę. Pobieraj obrazy w formacie TIF i konwertuj je do formatu 3D za pomocą odpowiedniego oprogramowania do pełnej konwersji. Aby zrekonstruować akwizycję mozaik za pomocą oprogramowania Stitcher, otwórz obrazy i ręcznie ułóż obrazy, aby odtworzyć cały obraz mozaiki, wykorzystując 10% nakładanie się obrazów jako wskazówkę.

Następnie użyj oprogramowania 3D, aby wygenerować ortogonalne rzuty danych. Dodanie atrybutu kodu kolorystycznego do naczyń limfatycznych i innych struktur anatomicznych na wystawie. I ustaw poprawkę gamma 1,47 na surowe dane uzyskane z mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego.

zgodnie z instrukcjami producenta. Połączenie iDISCO+ z mikroskopią fluorescencyjną za pomocą arkusza świetlnego pozwala zachować anatomię kręgów i umożliwia uchwycenie układu limfatycznego w obrębie otaczających kości, więzadeł, mięśni i zwojów nerwowych. Wstrzyknięcie małego czerwonego znacznika fluorescencyjnego do płynu mózgowo-rdzeniowego, cisterna magna lub odcinka piersiowo-lędźwiowego rdzenia kręgowego powoduje nagromadzenie znacznika w głębokich węzłach chłonnych szyjnych 45 minut po wstrzyknięciu, co wskazuje na wychwyt i drenaż znacznika przez układ limfatyczny.

Wstrzyknięcie znacznika do miąższu rdzeniowego piersiowo-lędźwiowego powoduje akumulację znacznika w tkankach rdzenia kręgowego i głębokich węzłach chłonnych drenujących szyjkę macicy, ale nie w unaczynieniu limfatycznym szyjki macicy i piersi znakowanym przeciwciałami anty-LYVE-1. Iniekcja anty-LYVE do miąższu rdzeniowego piersiowo-lędźwiowego powoduje znakowanie zarówno węzłów chłonnych kręgów, jak i ich pozakręgowych połączeń limfatycznych. Uzasadnienie wychwytu znacznika przez naczynia limfatyczne kręgów i drenaż limfatyczny w kierunku zewnątrzkręgowego układu limfatycznego.

Wykonaj wstrzyknięcie śladu bardzo ostrożnie, aby nie zakłócić krążenia płynu mózgowo-rdzeniowego. Protokół iDISCO+ jest bardzo oficjalny, ale musisz dostosować się do wielkości swoich próbek. Po wstrzyknięciu śladowym do ośrodkowego układu nerwowego można przeprowadzić eksperyment z barwieniem immunologicznym lub obrazowaniem na żywo.

Protokół iDISCO+ może być używany do badania różnych komórek, populacji i tkanek.