Name: Trójwymiarowe obrazowanie układu naczyniowego i drenażu limfatycznego kręgów przy użyciu iDISCO+ i mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę iDISCO+ i mikroskopię arkuszy świetlnych do trójwymiarowego obrazowania naczyń limfatycznych kręgosłupa i węzłów chłonnych. Technika ta umożliwia badanie drenażu limfatycznego i ruchu komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), Federation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Maturation (do L.J.), Universidade Federal de Rio de Janiero (UFRJ dla J.B.), NIH (R01EB016629-01) i Yale School of Medicine. Uznajemy platformy ICM: ICM-QUANT do obrazowania komórkowego i ICM-histomics do immunohistochemii. Wszystkie prace na zwierzętach przeprowadzono w zakładzie PHENO-ICMice. Rdzeń jest wspierany przez 2 "Investissements d'avenir" (ANR-10- IAIHU-06 i ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) oraz "Fondation pour la Recherche Médicale". Dziękujemy Nicolasowi Renierowi za porady metodyczne i lekturę manuskryptów.

Wszystkie procedury in vivo użyte w tym badaniu były zgodne ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi dotyczącymi testów i badań na zwierzętach, zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej dotyczącymi eksperymentalnego wykorzystania zwierząt (L358-86/609EEC). Badanie uzyskało aprobatę etyczną Komitetu Etycznego INSERM (nr 2016110111126651) oraz Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj następujące narzędzia preparacyjne do operacji: skalpel (1), mikrokleszcze (2), kleszcze (1), nożyczki do preparacji i klipsy do szwów Michela. Przygotuj igły 26 g (0,45 mm x 13 mm), strzykawkę 1 ml i mikrostrzykawkę 10 μl.</li>
	<li>Pobrać mikrokapilary za pomocą jednoetapowego protokołu w temperaturze 67,5 °C za pomocą szklanego ściągacza do mikropipet. Przygotować dwie mikrokapilary na wstrzyknięcie.</li>
	<li>Przygotuj odczynniki do obrazowania drenażu limfatycznego (Tabela 1): koniugat albuminy jaja kurzego Alexa Fluor 555 (OVA-A555, 2 mg/ml w 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem [PBS]) i przeciwciało anty-LYVE1 (1 mg / ml w 1x PBS).</li>
	<li>Przygotować przeciwciała (Tabela 1) dla iDISCO+. W przypadku przeciwciał pierwszorzędowych należy użyć poliklonalnego przeciwciała anty-LYVE1 królika (1:1,600) i koziego przeciwciała poliklonalnego IgG anty-PROX1 (1:2,000). W przypadku przeciwciał drugorzędowych użyj Alexa Fluor donkey anti-rabbit-568, donkey anti-rabbit-647 i donkey anti-goat-647 (1:2,000).</li>
</ol>
2. Zabiegi chirurgiczne dla iniekcji wewnątrzcisterna magna (ICM) i piersiowo-lędźwiowych (ThLb)
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierzęcia do zabiegu
	<ol>
		<li>Użyj dorosłych samców i samic myszy C57BL6/J w wieku 8–12 tygodni.</li>
		<li>Wstrzyknąć myszy dootrzewnowo (IP) 0,015 mg/ml roztworu buprenorfiny rozcieńczonego w 0,9% chlorku sodu w stężeniu 0,1 mg/kg, 15 minut przed zabiegiem.</li>
		<li>Znieczulij mysz w pudełku indukcyjnym z 2-3% gazem izofluranowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie znieczulonego zwierzęcia do wstrzyknięcia znacznika
	<ol>
		<li>Umieść znieczuloną mysz i jej poduszkę grzewczą na aparacie stereotaktycznym. Użyj pasków usznych, aby przytrzymać głowę myszy i połóż ciało pod kątem ~135° do głowy lub unieruchomij rdzeń kręgowy na poziomie kręgów ThLb (Th12-L1) za pomocą adaptera rdzeniowego. Uszczypnij ogon lub łapę kleszczem, aby sprawdzić skuteczność znieczulenia.</li>
		<li>Wstrzyknij IP 200 μl 0,9% chlorku sodu w celu nawodnienia myszy.</li>
		<li>Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie skóry, albo w okolicy potylicznej w kierunku odcinka szyjnego w przypadku wstrzyknięcia ICM, albo na poziomie kręgów ThLb (Th10-L3) w celu wstrzyknięcia do miąższu rdzeniowego ThLb.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknięcie znacznika
	<ol>
		<li>Odrzuć mięśnie przyszyjkowe i przykręgosłupowe pokrywające szyję i kolumnę, aby uwidocznić powierzchnię opony twardej, najbardziej zewnętrznej warstwy opon</li> mózgowych.
		<li>Ostrożnie nakłuć centralny obszar opony twardej i leżącą pod nią pajęczynówkę za pomocą igły 26 G.</li>
		<li>Implantacja mikrokapilarna
		<ol>
			<li>Odciąć 2 mm szklaną końcówkę kapilary (patrz krok 1.2), a następnie użyć mikrokapilary połączonej z kaniulą połączoną ze strzykawką o pojemności 10 μl, aby odessać 2−8 μl przeciwciała OVA-A555 lub LYVE1.</li>
			<li>Wprowadzić mikrokapilarnę w przyśrodkowej okolicy opony twardej pod kątem 30° w przypadku iniekcji ICM lub pod kątem 10° w przypadku iniekcji rdzeniowych ThLb i wepchnąć ją do 1,5 mm poniżej opony twardej. 
			UWAGA: Więzadło jest przebite, ale nie wykonuje się laminektomii.</li>
			<li>Dodaj 10 μl kleju chirurgicznego, aby zamknąć nacięcie wokół szklanej kapilary i poczekaj, aż wyschnie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powoli wstrzykiwać znacznik fluorescencyjny w tempie 1 μl/min. Po dostarczeniu objętości wstrzyknięcia należy utrzymać kapilar na miejscu przez 1 minutę. Cofnij mikrokapilę i dodaj klej chirurgiczny, aby zamknąć otwór iniekcyjny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wstrzyknięciu zamknij nacięcia skóry klipsami do szwów. Wyjąć mysz z aparatu stereotaktycznego i umieścić ją w pooperacyjnej komorze rozgrzewającej w temperaturze 37 °C, aż wyzdrowieje.</li>
</ol>
3. Perfuzja i rozwarstwienie tkanek
<ol>
	<li>Po 15 minutach lub 45 minutach od wstrzyknięcia znacznika płynu mózgowo-rdzeniowego należy wstrzyknąć IP śmiertelną dawkę (100 μl) pentobarbitalu sodu. Uszczypnij ogon lub łapę, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu.</li>
	<li>Nożyczkami preparacyjnymi przeciąć skórę i otworzyć warstwę otrzewnej od dolnej części brzucha w kierunku klatki piersiowej. Otwórz klatkę piersiową nożyczkami, aby mieć dostęp do serca.</li>
	<li>Włóż igłę 26 G do lewej komory serca i zacznij perfuzję z 20 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS przy 2 ml / min. Użyj nożyczek, aby szybko przeciąć prawy przedsionek i uwolnić strumień płynu perfuzyjnego.</li>
	<li>Całkowicie usuń skórę kleszczami i odetnij cztery nogi nożyczkami. Usuń wszystkie narządy wewnętrzne, ale uważaj, aby zachować LN w stanie nienaruszonym. 
	UWAGA: LN żuchwy są powierzchowne, dlatego należy uważać, aby ich nie usunąć podczas odcinania skóry. LN głębokiej szyjki macicy (dcLNs) znajdują się po obu stronach tchawicy, w kontakcie z boczną powierzchnią wewnętrznych żył szyjnych i blisko mięśni stereomastoidowych.</li>
	<li>Przetnij żebra, aby usunąć kręgosłup z rdzeniem kręgowym w środku od odcinka szyjnego do odcinka lędźwiowego.</li>
	<li>Zanurz wypreparowane tkanki w lodowatym 4% PFA w 1x PBS w probówce 50 ml na noc (~18 h) w temperaturze 4 °C. Umyj utrwalone chusteczki 3x w 50 ml 1x PBS przez 5 min.</li>
</ol>
4. Makroskopia fluorescencyjna segmentu kręgowego
<ol>
	<li>Umieścić próbkę pod fluorescencyjnym mikroskopem stereozoomowym za pomocą kamery (Tabela materiałów). Zapoznaj się z omówieniem próbki lub powiększ określony region.</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbki do barwienia immunologicznego całego wierzchowca
<ol>
	<li>Za pomocą ostrza mikrotomowego przeciąć poprzecznie głowę i kręgosłup na poziomie potylicznym i szyjnym szyjki macicy. 
	UWAGA: Ta sekcja umożliwia odizolowanie głowy i okolicy kręgu szyjnego od reszty kręgosłupa.</li>
	<li>Za pomocą ostrza mikrotomowego przetnij odcinek szyjny, piersiowo-lędźwiowy i krzyżowy kręgosłupa poprzecznie na segmenty po 2−4 kręgi o wielkości około 0,5 cm każdy.</li>
	<li>Wyizoluj każdy segment w kolejności, w jakiej został oddzielony od osi kręgu, na całej długości odcinka szyjnego i piersiowego kręgosłupa. Każdą próbkę należy przechowywać w probówce o pojemności 2 ml 1x PBS.</li>
</ol>
6. iDISCO+ barwienie immunologiczne całego odcinka kręgu
UWAGA: Szczegółowy opis protokołu iDISCO+ jest dostępny na stronie http://www.idisco.info.
<ol>
	<li>Dzień 1: Odwodnienie tkanek
	<ol>
		<li>Odwodnić próbki tkanki kręgowej (tj. Segment kręgu) przez kolejne zanurzenie w 20%, 40%, 60%, 80% i 100% metanolu w 1x PBS przez 1 godzinę z mieszaniem.</li>
		<li>Próbki inkubować przez noc w roztworze 33% metanolu/66% dichlorometanu (DCM) w temperaturze pokojowej (RT) z mieszaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2: Wybielanie tkanek
	<ol>
		<li>Przemywać próbki 2x 100% metanolem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Próbki inkubować w 5% H2O2 w metanolu (30% H2O2 i metanolu 1:5 v/v) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3: Etap odwapnienia i przepuszczalności
	<ol>
		<li>Próbki należy stopniowo hydratenować w 80%, 60%, 40%, 20% metanolu, a następnie w 1x PBS (1 h w każdym roztworze) w temperaturze pokojowej z mieszaniem.</li>
		<li>Odwapnić kręgi, inkubując próbki w roztworze Morse'a (10% cytrynian trisodowy i 45% kwas mrówkowy 1:1 v/v) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zachowania struktury kości.</li>
		<li>Przepłukać próbki 2x 1x PBS i inkubować 2x przez 1 godzinę w roztworze PTx2 (0,2% Triton X-100 w 1x PBS, odnowić do drugiej inkubacji) w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Następnie inkubować próbki poddane wstępnej obróbce w roztworze permeabilizacyjnym (PTx2 z 20% dimetylosulfotlenku [DMSO] i 2,3% w/v glicyny) w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 4: Etap blokowania
	<ol>
		<li>Próbki inkubować w roztworze blokującym (PTx2 z 6% surowicą osła i 10% DMSO) w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dni 5−16: Znakowanie immunologiczne całej góry
	<ol>
		<li>Inkubować próbki w pierwotnym przeciwciałie rozcieńczonym w PTwH (1x PBS zawierający 0,2% Tween-20 i 0,1% heparyny w stężeniu 10 mg / ml w 1x PBS) z 5% DMSO / 3% surowicy osła w temperaturze 37 °C przez 6 dni. Umyj próbki 4−5x w PTwH w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez noc.</li>
		<li>Próbki inkubować w drugorzędowych rozcieńczeniach przeciwciał w PTwH z 3% surowicą osła w temperaturze 37 °C przez 4 dni. Próbki należy umyć w PTwH 4−5x w temperaturze pokojowej pod mieszaniem przez noc przed opróżnieniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 17 i 18: Oczyszczanie tkanek iDISCO+
	<ol>
		<li>Próbki odwadniać stopniowo, kolejno zanurzając je w 1 x PBS, następnie 20%, 40%, 60%, 80% i 2x w 100% metanolu (1 h w każdym roztworze). Każdą próbkę inkubować przez noc w roztworze 33% metanolu/66% DCM.</li>
		<li>Myć 2x w 100% DCM przez 15 minut, aby usunąć metanol. Inkubować w eterze dibenzylowym (DBE) bez wstrząsania aż do oczyszczenia (4 h), a następnie przechowywać w DBE w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Obrazowanie LSFM
<ol>
	<li>Próbkowanie oczyszczonych z obrazu w płaszczyźnie poprzecznej za pomocą LSFM wyposażonego w obiektyw 4x/0,3.
	<ol>
		<li>Użyj jednostronnej konfiguracji z trzema arkuszami, stała pozycja x (bez dynamicznego ustawiania ostrości). Używaj laserów LED dostrojonych do 561 nm, 100 mW; i 639 nm, 70 mW. Ustaw przysłonę numeryczną arkusza świetlnego na 30%.</li>
		<li>Używaj różnych filtrów emisji: 595/40 dla Alexa Fluor-568 lub -555 i -680/30 dla Alexa Fluor-647.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij komorę mikroskopu DBE.</li>
	<li>Kupuj stosy z krokami 2,5 μm z i czasem naświetlania 30 ms na krok z aparatem (tabela materiałów). Użyj zoomu optycznego x2, aby uzyskać efektywne powiększenie (x8), 0,8 μm/piksel i wykonuj akwizycje mozaiki z 10% nałożeniem na całą klatkę.</li>
	<li>Pobieraj obrazy w formacie .tif za pomocą oprogramowania do akwizycji i konwertuj je do formatu 3D za pomocą oprogramowania do konwersji plików.</li>
	<li>Rekonstrukcja akwizycji mozaik za pomocą oprogramowania do zszywania (tabela materiałów). Otwórz obrazy i przesuń je ręcznie, aby odtworzyć cały obraz mozaiki, używając 10% nakładania się obrazów jako wskazówki.</li>
	<li>Użyj oprogramowania 3D (Tabela materiałów), aby wygenerować ortogonalne rzuty danych, jak pokazano w Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4, a następnie dodaj atrybut kodu koloru do naczyń limfatycznych i innych struktur anatomicznych na wyświetlaczu. Ustaw poprawkę gamma 1,47 do surowych danych uzyskanych z LSFM zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Plog, B. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Glymphatic+System+in+Central+Nervous+System+Health+and+Disease%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Glymphatic System in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future.</a> Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).</li>
<li>Iliff, J. J., Goldman, S. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+discovery+of+brain+lymphatic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Implications of the discovery of brain lymphatic pathways.</a> The Lancet Neurology. 14 (10), 977(2015).</li>
<li>Engelhardt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular%2C+glial%2C+and+lymphatic+immune+gateways+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Vascular, glial, and lymphatic immune gateways of the central nervous system.</a> Acta Neuropathologica. 132, 317-338 (2016).</li>
<li>Benveniste, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Glymphatic+System+and+Waste+Clearance+with+Brain+Aging%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review.</a> Gerontology. , 1-14 (2018).</li>
<li>Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+in+Neurological+Disorders%3A+A+Neuro-Lympho-Vascular+Component+of+Multiple+Sclerosis+and+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Lymphatics in Neurological Disorders: A Neuro-Lympho-Vascular Component of Multiple Sclerosis and Alzheimer's Disease.</a> Neuron. 91 (5), 957-973 (2016).</li>
<li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434(2017).</li>
<li>Ma, Q., Decker, Y., Müller, A., Ineichen, B. V., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+cerebrospinal+fluid+from+the+sacral+spine+through+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of cerebrospinal fluid from the sacral spine through lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 216 (11), 2492-2502 (2019).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+functions+and+relationships+of+the+glymphatic+system+and+meningeal+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3210-3219 (2017).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li>
<li>Aspelund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dural+lymphatic+vascular+system+that+drains+brain+interstitial+fluid+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules.</a> The Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).</li>
<li>Antila, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+meningeal+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of meningeal lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3645-3667 (2017).</li>
<li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+lymphatic+vessels+at+the+skull+base+drain+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid.</a> Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).</li>
<li>Pollay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+and+structure+of+the+cerebrospinal+fluid+outflow+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebrospinal+Fluid+Research%22%5BJournal%5D)">The function and structure of the cerebrospinal fluid outflow system.</a> Cerebrospinal Fluid Research. 7, 9(2010).</li>
<li>Jacob, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+function+of+the+vertebral+column+lymphatic+network+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-16 (2019).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+lymphatic+drainage+and+neuroinflammation+are+regulated+by+meningeal+lymphatic+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).</li>
<li>Da Mesquita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li>
<li>Song, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C-driven+lymphatic+drainage+enables+immunosurveillance+of+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours.</a> Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).</li>
<li>Absinta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+nonhuman+primate+meninges+harbor+lymphatic+vessels+that+can+be+visualized+noninvasively+by+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human and nonhuman primate meninges harbor lymphatic vessels that can be visualized noninvasively by MRI.</a> eLife. 6, 29738(2017).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Jackson, D. G., Prevo, R., Clasper, S., Banerji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+the+lymphatic+system+and+tumor+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis.</a> Trends in Immunology. 22 (6), 317-321 (2001).</li>
<li>Wigle, J. T., Oliver, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prox1+function+is+required+for+the+development+of+the+murine+lymphatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system.</a> Cell. 98 (6), 769-778 (1999).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: a tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół iDISCO+/LSFM zapewnia bezprecedensowe widoki 3D sieci limfatycznej związanej z OUN w otaczających ją tkankach na poziomie rozdzielczości komórkowej. Protokół ten jest dobrze przystosowany do próbek średniej wielkości, nieprzekraczających 1,5cm3, ze względu na ograniczenia układu optycznego LSFM, zmniejszoną odległość roboczą i duży rozmiar komercyjnych soczewek obiektywowych do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości23. To ograniczenie uniemożliwia uchwycenie całego układu limfatycznego związanego z mózgiem. Ważne jest, aby pamiętać, że obszar badania musi być ostrożnie wyznaczony, a tkanki otaczające OUN muszą być dokładnie wypreparowane, aby uwzględnić zewnątrzczaszkowe naczynia limfatyczne i LN, które przyczyniają się do całego obwodu limfatycznego (Tabela 2).
Oprócz wielkości i względów anatomicznych, złożoność otaczających tkanek mezenchymalnych zmienia się wzdłuż czaszki i kręgosłupa, co wymaga dostosowania zabiegu odwapniania i wstępnego oczyszczania w celu uzyskania jednorodnego klarowania próbki i umożliwienia propagacji wiązki światła w miękkiej izotropowej tkance biologicznej. W przypadku braku kości, obrazowanie LFSM tkanek mózgu lub rdzenia kręgowego nie wymaga etapu odwapnienia, a ostateczna rozdzielczość zarejestrowanych obrazów jest optymalna19. Opisany powyżej protokół, który obejmuje łagodny etap odwapnienia roztworem Morse'a, jest dobrze przystosowany do obrazowania LSFM kręgosłupa, jak pokazano na rycinie 1 i rycinie 4. W przeciwieństwie do tego, obszar szyi wykazuje szczególnie złożoną anatomię kości oprócz wielu warstw mięśni, tłuszczu i tkanek gruczołowych, co obniża jakość przechwytywanych obrazów LSFM, jak pokazano na rycinie 3B. Obrazowanie LSFM szyi i szyjki macicy może zatem zostać poprawione dzięki bardziej rygorystycznemu leczeniu tkanek; na przykład z EDTA, jak wcześniej informowano24. Etap odwapnienia jest zatem krytyczny, a warunki odwapnienia muszą być wcześniej przetestowane dla każdego zastosowanego przeciwciała przed rozpoczęciem pełnego protokołu iDISCO+ (Tabela 2).
Podczas gdy protokół iDISCO+/LSFM umożliwia generowanie widoku 3D obwodów łączących między przestrzeniami oponowo-rdzeniowymi i zewnątrzoponowymi oraz związanymi z nimi LN, bezpośrednia analiza ilościowa układu naczyniowego limfatycznego na podstawie obrazów przechwyconych przez LSFM nie jest możliwa z następujących powodów: 1) wyznaczenie obwodów naczyń limfatycznych jest niewiarygodne ze względu na nieciągły wzorzec ekspresji markerów limfatycznych, ponieważ błonowy LYVE1 jest hereterogennie rozmieszczony21, a PROX1 ma wzorzec ekspresji jądrowej22; 2) niejednorodna penetracja przeciwciał, a także anizotropia, która może utrzymywać się w tkance biologicznej z powodu niepełnego i niejednorodnego odwapnienia i wstępnego oczyszczania. Obrazowanie LSFM musi zatem zostać rozszerzone o narzędzia rzeczywistości wirtualnej, które umożliwiają interaktywną wizualizację, a tym samym ułatwiają ilościowe określanie naczyń limfatycznych (www.syglass.io). Warto również zauważyć, że dokładny opis obwodów związanych z OUN wymaga poparcia informacji o LSFM danymi konfokalnymi o wysokiej rozdzielczości uzyskanymi przez konwencjonalne znakowanie immunologiczne na cienkich (5–10 μm) skriostatach lub skrawkach tkanek zatopionych w parafinie, zwłaszcza w celu precyzyjnego zlokalizowania położenia naczyń limfatycznych w stosunku do opony twardej i płynu mózgowo-rdzeniowego, jak opisano wcześniej11, Rozdział 14,18.
Protokół iDISCO+/LSFM umożliwia trójwymiarową wizualizację drenażu makromolekularnego w układzie limfatycznym związanym z OUN, jak pokazano na rysunku 3 i rysunku 4. Jednak ocena funkcjonalna drenażu limfatycznego wymaga, oprócz zaleceń zawartych w protokole iDISCO+/LSFM opisanych powyżej, przestrzegania rygorystycznej procedury, ponieważ ostateczny wynik zależy od jakości operacji iniekcyjnej, wyboru miejsca porodu, rodzaju i objętości wstrzykniętego markera makrocząsteczkowego oraz czasu uśmiercenia po podaniu znacznika (Tabela 2). Ze względu na różnice w schemacie znacznika między zwierzętami, którym wstrzyknięto zastrzyk, charakterystyka obwodów drenażu limfatycznego wymaga dużych grup doświadczalnych (>10 w zależności od warunków wstrzyknięcia). W przedstawionym protokole 1) opona twarda musi zostać nakłuta przed wstrzyknięciem, aby zapobiec niepożądanym zmianom i przenikaniu do tkanek OUN; 2) objętość wstrzykniętego środka musi być mniejsza niż 2 μl, aby ograniczyć niepożądaną dyfuzję przez otwór iniekcyjne, wzdłuż naczynia włosowatego iniekcji, do przestrzeni zewnątrzoponowej lub tkanek zewnątrzkręgowych; 3) głębokość wprowadzenia kapilary iniekcyjnej musi być ograniczona do 2 mm poniżej opony twardej, aby uniknąć uszkodzenia OUN lub nieprawidłowego ukierunkowania odpowiednio w ICM i iniekcjach dordzeniowych. Należy również zauważyć, że należy przeprowadzić uzupełniającą analizę konfokalną w wysokiej rozdzielczości sąsiednich segmentów kręgów, jak wskazano powyżej, w celu oceny obecności wstrzykniętego znacznika wewnątrz naczyń limfatycznych. Analiza ta wymaga wyznaczenia wykresów profilu intensywności dla znacznika i markera limfatycznego na przekrojach poprzecznych naczyń limfatycznych znakowanych markerem. Podejście to było wcześniej stosowane do wykazania wychwytu OVA555 przez limfatyczne ThLb po 15 minutach od wstrzyknięcia (rysunek uzupełniający 5F w Jacob i wsp.14). Jednak w niniejszym badaniu nie zostało to zilustrowane dla znacznika anty-LYVE1 (Figura 4).
Wśród możliwych znaczników płynu mózgowo-rdzeniowego, OVA-A555 jest doskonałą opcją, ponieważ jest odporny na zabiegi protokołem iDISCO+ i utrzymuje wysoką fluorescencję do obrazowania LSFM. Należy jednak pamiętać, że typ znacznika musi być wybrany zgodnie z punktem czasowym analizy (tabela 1 i tabela 2). Jak podano powyżej, znakowanie OVA-A555 miejscowych naczyń limfatycznych kręgów obserwuje się po 15 minutach od wstrzyknięcia14. Jednak OVA-A555 nie jest już wykrywany w tych lokalnych obwodach limfatycznych po 45 minutach od wstrzyknięcia (Figura 3) w przeciwieństwie do przeciwciała anty-LYVE1 (Figura 4).
Podsumowując, protokół iDISCO+/LSFM jest dobrze przystosowany do badania struktury 3D i drenażu układu limfatycznego związanego z OUN w stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak rak OUN i kręgosłupa lub choroby kości i stawów kręgowych. Chociaż cała procedura jest długa i wymaga rygoru metodologicznego, dostarcza cennych, unikalnych informacji, gdy jest używana z uzupełniającą analizą z wykorzystaniem narzędzi rzeczywistości wirtualnej i obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości.

OUN jest otoczony przez płyn mózgowo-rdzeniowy i nakładające się warstwy opon mózgowych, tkanki zewnątrzoponowej i kości. Ogólnie rzecz biorąc, płyn mózgowo-rdzeniowy zapewnia fizyczną ochronę miękkiego mózgu i rdzenia kręgowego. Jest wydzielany głównie przez splot naczyniówkowy i błony oponowe (tj. pia mater, pajęczynówkę i oponę twardą). Kompleks płynu mózgowo-rdzeniowego tworzy również funkcjonalny interfejs między tkankami OUN a resztą ciała, przyczyniając się w ten sposób do homeostazy OUN. Po pierwsze, płyn mózgowo-rdzeniowy przenika do miąższu OUN przez przestrzenie przytętnicze OUN i dynamicznie oddziałuje z płynem śródmiąższowym (ISF)1 za pośrednictwem układu glimfatycznego (glejowo-limfatycznego), który składa się z przestrzeni przynaczyniowych i błon astrocytów końcowo-stopowych wokół naczyń OUN2,3,4. Odpady przemiany materii i nadmiar płynów są następnie ostatecznie usuwane przez śródścienny drenaż okołonaczyniowy bezpośrednio z miąższu mózgu w kierunku krążenia ogólnoustrojowego3, a także przestrzeni przyżylnych w kierunku płynu mózgowo-rdzeniowego i przez drenujące mózg naczynia limfatyczne, zgodnie z modelem glimfatycznym2,4. Odpływ płynu mózgowo-rdzeniowego odbywa się głównie przez układ limfatyczny, przez płytkę cribriform i związane z nią pozaczaszkowe naczynia limfatyczne5,6,7, a także przez naczynia limfatyczne opon mózgowych, które zbiegają się w drenującym mózg LNs8,9,10,11,12 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ważną, choć drugorzędną, rolę w odpływie płynu mózgowo-rdzeniowego odgrywają kosmki pajęczynówkowe czaszki, które przenikają przez lukę w zatokach żylnych opon mózgowych13.
Obwody drenażowe CFS zostały gruntownie zbadane za pomocą eksperymentalnych podejść opartych na wstrzyknięciu kolorowych/fluorescencyjnych znaczników do OUN lub płynu mózgowo-rdzeniowego, a następnie na obrazowaniu wzoru znaczników wewnątrz OUN oraz w narządach i tkankach ciała w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu13. Przez długi czas uważano, że odpływ płynu mózgowo-rdzeniowego jest wyłącznie i bezpośrednio odpowiedzialny za krążenie krwi, poprzez kosmki pajęczynówki wystające do zatok żylnych opony twardej13. Jednak odpływ płynu mózgowo-rdzeniowego jest wykonywany głównie przez naczynia limfatyczne, jak ostatnio wykazano w dynamicznej podczerwieni (NIR) obrazowaniu transportu znacznika wstrzykniętym płynem mózgowo-rdzeniowym u myszy9,10. Naczynia limfatyczne drenujące płyn mózgowo-rdzeniowy następnie zawracają limfę do krwiobiegu przez prawą żyłę podobojczykową. Komplementarne aplikacje wykryły zarówno pozaczaszkowe6,7,13, jak i wewnątrzczaszkowe9,10,11,12 wyjść limfatycznych znaczników wstrzykniętych płynem mózgowo-rdzeniowym i sugerują, że płyn mózgowo-rdzeniowy jest wchłaniany przez dwie drogi limfatyczne, jedną zewnętrzną, a drugą wewnętrzną do czaszki i kręgu kolumna. Główna część drenażu płynu mózgowo-rdzeniowego szybko zachodzi przez naczynia limfatyczne zlokalizowane rostralnie, na zewnątrz czaszki w błonie śluzowej nosa, przez kanały płytki krzyżowej kości sitowej3,6,13 oraz, doogonowo, poza kośćmi kręgów lędźwiowo-krzyżowych przez drogi grzbietowo-boczne, które nie są jeszcze w pełni scharakteryzowane7,14. Ponadto w oponach mózgowych czaszki naczynia włosowate limfatyczne opony twardej bezpośrednio absorbują płyn mózgowo-rdzeniowy i komórki odpornościowe opony mózgowej w kierunku kolektorów limfatycznych opony twardej, które przecinają kości czaszki i łączą się z drenującymi OUN LNs12,14. Te naczynia limfatyczne opon mózgowych odgrywają ważną rolę w patofizjologii OUN, ponieważ limfy opon mózgowych zmieniają się wraz z wiekiem, a także wpływają na wyniki neurologicznych chorób mózgu, w tym neurodegeneracji, zapalenia nerwów i raka mózgu15,16,17. Dlatego unaczynienie limfatyczne związane z OUN (tj. Opona twarda i obwodowe naczynia limfatyczne drenujące płyn mózgowo-rdzeniowy) może być obiecującym nowym celem w zwalczaniu chorób OUN u ludzi.
Zbieżne badania przeprowadzone za pomocą immunohistologii i rezonansu magnetycznego o wysokiej rozdzielczości wykazały, że układ limfatyczny opon mózgowych występuje również u naczelnych, w tym u małp marmozet i ludzi7,11,13. Co więcej, naczynia limfatyczne opony mózgowej nie są ograniczone do czaszki, ale rozciągają się w obrębie kręgosłupa do powierzchni zwojów kręgowych i rami13,18. Niedawno przeprowadzono trójwymiarowe (3D) obrazowanie układu limfatycznego kręgosłupa z zachowaniem ogólnej anatomii znakowanych próbek kręgów i kręgosłupa, w tym leżących nad nimi kości, mięśni, więzadeł, a także sąsiednich tkanek trzewnych14. Protokół iDISCO+19,20 został użyty do immunoznakowania odwapnionych i oczyszczonych preparatów całej kolumny kręgowej przeciwciałami specyficznymi dla układu limfatycznego przeciwko receptorowi błonowemu LYVE121 lub czynnikowi transkrypcyjnemu PROX122. Akwizycję i analizę obrazu przeprowadzono następnie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) i oprogramowania Imaris. LSFM pozwala na szybkie i minimalnie inwazyjne obrazowanie 3D dużych próbek poprzez osiowe ograniczenie oświetlenia, co skutkuje zmniejszonym fotowybielaniem i fototoksycznością23.
Podejście iDISCO+/LSFM pozwala na scharakteryzowanie odrębnych warstw naczyń limfatycznych opony twardej i zewnątrzoponowej, a także połączenia tego układu naczyniowego z zewnątrzkręgowymi obwodami limfatycznymi i LN sąsiadującymi z kręgosłupem. Protokół zastosowano do tkanek, którym wcześniej wstrzyknięto znaczniki fluorescencyjne w celu wykazania drenażu kanału kręgowego. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat metodologii iDISCO+/LSFM do obrazowania unaczynienia limfatycznego kręgów i ilustruje jej znaczenie dla badania płynu mózgowo-rdzeniowego i płynu zewnątrzoponowego.

<table><tbody><tr><td><mocne>Materiały eksploatacyjne</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe: 0,2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30124359</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe: 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe: 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe: 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Microtome ostrze 80mm</td><td>Microm Microtech France</td><td>F/MM35P</td><td></td></tr><tr><td>Igły 26G (0,45x13 mm)</td><td>Terumo</td><td>AN*2613R1</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1ml</td><td>Terumo</td><td>SS+01H1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy i oprogramowanie do obrazowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioZoom.V16 fluorescencyjny mikroskop stereo zmiennoogniskowy, wyposażony w cyfrową kamerę sCMOS ORCA-Flash 4.0 (Hamamatsu Photonics) lub Kamera OptiMOS sCMOS</td><td>Oprogramowanie sterownika mikroskopu Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imspector, wersja v144 (oprogramowanie do przejęcia)</td> <td>Instrumenty</td><td></td><td></td>Abberior</tr><tr><td>Imaris File Converter x64 9.2.0 (oprogramowanie do konwersji plików), Oprogramowanie do zszywania Imaris 9.2.0 (oprogramowanie do zszywania), Imaris x64 9.2.0 (oprogramowanie 3D)</td> <td>Instrumenty</td><td></td><td></td>OXFORD</tr><tr><td>Lasery LED (OBIS) LVBT Moduł laserowy 2. generacji</td><td>KOHERENT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramikroskop II wyposażony w kamerę sCMOS (Andor Neo) oraz 4&thinsp; &czasy; &thinsp;/0,3 soczewka obiektywowa (LVMI-Fluor WD6)</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey anti goat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne anty-LYVE1</td><td>Angiobio#</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne IgG kozy anty-PROX1</td><td>R& Systemy D</td><td>#AF2727</td><td></td></tr><tr><td>Ampułki do wstrzykiwań buprenorfiny (roztwór buprepielęgnacji, 0,3 mg / ml)</td> Ampułka do <td>pielęgnacji zwierząt</td><td>1 ml</td><td></td></tr><tr><td>Eter dibenzylowy 100% (DBE)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan 100% (DCM)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy 99%</td> <td>CARLO ERBA</td><td>405793</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G.7126</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny ze świń</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru roztwór (H2O2 30%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (Iso-Vet 100%)</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-10</td><td></td></tr><tr><td>Metanol 100%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Albumina jaja kurzego Alexa Fluor 555 Sprzężony</td> roztwór buforu fosforanowego <td>Invitrogen</td><td>11549176</td><td></td></tr><tr><td>PBS (roztwór podstawowy 10X)</td><td>Euromedex</td><td>ET330-A</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu (Euthasol 400 mg / ml)</td><td>Dechra</td><td>08718469445110</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodu</td><td>VWR</td><td>6132-04-3</td><td></td></tr><tr><td><silny>Narzędzia i sprzęt chirurgiczny</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System anestezjologiczny</td><td>Univentor</td><td>Univentor 410 Jednostka</td><td></td>anestezjologiczna</tr><tr><td>Szklany ściągacz do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>CMA Microdialysis AB</td><td>CMA 450 Regulator</td><td></td>temperatury</tr><tr><td>Mikrokapilary (kapilary szklane)</td><td>Aparat harwardzki</td><td>GC120-15</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszcze, kleszcze, nożyczki preparacyjne i klipsy do szwów Michel (7,5 i cienkie; &czasy; &cienkie; 1,75 mm)</td> <td>Fine Science Tool</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel (sterylny skalpel jednorazowy 23)</td> <td>Swann-Norton</td><td>0510</td><td></td></tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny</td><td>KOPF</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 10&micro; l 701N</td><td>Hamilton</td><td>28618-U</td><td></td></tr><tr><td>System ciepłego powietrza</td><td>Vet-Tech LTD</td><td>HE011</td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowe obrazowanie układu naczyniowego i drenażu limfatycznego kręgów przy użyciu idisco+ i mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych

Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy

Układ limfatyczny związany z ośrodkowym układem nerwowym (OUN) obejmuje układ limfatyczny, który krąży wokół mózgu, rdzeń kręgowy i powiązane z nim LN. Układ limfatyczny związany z OUN bierze udział w drenażu makrocząsteczek płynu mózgowo-rdzeniowego i komórek odpornościowych opon mózgowych w kierunku LN drenujących OUN, regulując w ten sposób usuwanie odpadów i nadzór immunologiczny w tkankach OUN. Zaprezentowano nowatorskie podejście do uzyskiwania trójwymiarowych (3D) i komórkowych obrazów węzłów chłonnych związanych z OUN przy jednoczesnym zachowaniu integralności ich obwodów w otaczających tkankach. Protokół iDISCO+ służy do znakowania immunologicznego naczyń limfatycznych w odwapnionych i oczyszczonych preparatach całego mocowania kręgosłupa, które są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego (LSFM). Technika ta ujawnia trójwymiarową strukturę sieci limfatycznej łączącej przestrzenie oponowe i zewnątrzoponowe wokół rdzenia kręgowego z zewnątrzkręgowymi naczyniami limfatycznymi. Dostarczono obrazy 3D obwodów drenażowych znaczników molekularnych wcześniej wstrzykniętych do płynu mózgowo-rdzeniowego przez cisterna magna lub miąższ rdzenia piersiowo-lędźwiowego. Podejście iDISCO+/LSFM daje bezprecedensowe możliwości zbadania struktury i funkcji układu limfatycznego związanego z OUN w biologii nerwowo-naczyniowej, neuroimmunologii, raku mózgu i kręgów lub biologii kości i stawów kręgów.

Obrazowanie 3D naczyniowości limfatycznej kręgów 
Rycina 1 przedstawia etapy procedury iDISCO+/LSFM oraz obraz LSFM obwodów limfatycznych wewnątrz kanału kręgowego kręgów ThLb poddanych obróbce iDISCO+. Połączenie metody iDISCO+ z LSFM pozwoliło zachować anatomię kręgów i uchwycić widok sieci naczyniowej limfatycznej (tj. naczyń śródkręgowych połączonych z naczyniami zewnątrzkręgowymi wychodzącymi grzbietowo i bocznie z trzonu kręgu) w obrębie otaczających kości, więzadeł, mięśni i zwojów nerwowych.
Obrazowanie makroskopowe fluorescencyjne drenażu dcLN 
Aby obrazować drenaż makrocząsteczek w układzie limfatycznym powiązanym z OUN, znaczniki makrocząsteczkowe podano in vivo poprzez wstrzyknięcie ich do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) lub do miąższu rdzenia kręgowego. Znacznik makrocząsteczkowy można łatwo wprowadzić do CSF w obrębie cysterny wielkiej. Cysterna wielka znajduje się pomiędzy móżdżkiem a grzbietową powierzchnią rdzeni przedłużonego, powyżej otworu wielkiego. Znacznik makrocząsteczkowy można również wstrzyknąć do miąższu rdzenia kręgowego za pomocą chirurgii stereotaktycznej na różnych poziomach wzdłuż kolumny kręgosłupa.
Wykorzystane znaczniki makromolekularne były albo bezpośrednio znakowane fluorophorem, albo wykrywane po śmierci za pomocą immunohistochemii ze specyficznymi przeciwciałami. Rysunek 2A przedstawia plan eksperymentalny śledzenia OVA-A5, czerwonego fluorescencyjnego znacznika o niskiej masie cząsteczkowej (około 45 kDa), który był wstrzykiwany albo do płynu mózgowo-rdzeniowego (Rysunek 2B), albo do obszaru ThLb rdzenia kręgowego (Rysunek 2C).
W 45. minucie po wstrzyknięciu makromolekularnego znacznika myszy zostały uśmiercone, poddane perfuzji 4% PFA, a następnie przetworzone w celu wyizolowania wyciętych fragmentów regionu pnia mózgu oraz kręgosłupa, które zostały odwapnione i przejrzystone. Drenaż makromolekuł oceniono następnie za pomocą fluorescencyjnej makroskopii obrazującej węzły chłonne (LNs) zbierające płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) oraz płyny znadtwardówkowe. Jak pokazano na Rysunku 2, wstrzyknięcie OVA-A55 do płynu mózgowo-rdzeniowego (Rysunek 2B) lub do regionu ThLb (Rysunek 2C) rdzenia kręgowego doprowadziło do akumulacji OVA-A5 w głębokich węzłach chłonnych szyjnych (dcLNs) 45 min po wstrzyknięciu. Obserwacja ta wskazuje na wychwyt i drenaż fluorescencyjnego znacznika przez układ limfatyczny; jest to warunek konieczny przed przeprowadzeniem procedury iDISCO+/LSFM w celu obrazowania drenażu limfatycznego kręgosłupa.
Obrazowanie 3D drenażu makrocząsteczek w układzie limfatycznym kręgosłupa 
W oparciu o detekcję znakowania OVA-A5 w dcLNs, procedurę iDISCO+/LSFM zastosowano do odwapnionych i wstępnie klarowanych próbek kręgosłupa wyizolowanych od myszy po wstrzyknięciu OVA-A5. Podejście to pozwoliło na stworzenie mapy 3D drenażu limfatycznego płynu mózgowo-rdzeniowego oraz płynu znadtwardówkowego rdzenia kręgowego w określonym punkcie czasowym po podaniu znacznika. Mapowanie 3D można było przeprowadzić poprzez obrazowanie kolejnych segmentów OUN, na każdym poziomie kręgosłupa, począwszy od miejsca wstrzyknięcia.
Rysunek 3A przedstawia schemat doświadczalny wstrzyknięcia OVA-A5 do miąższu rdzenia kręgowego w odcinku ThLb oraz wynikowy trójwymiarowy wzorzec dystrybucji OVA-A5 w szyjnym i piersiowym segmencie kręgosłupa wraz z naczyniami limfatycznymi. W 45 min po wstrzyknięciu OVA-A5 wykryto akumulację OVA-A55 w tkankach rdzenia kręgowego i dcLNs (białe strzałki na Rysunku 3B), co jest zgodne z obserwacjami mikroskopowymi przedstawionymi na Rysunku 2. Nie wykryto jej jednak w szyjnych i piersiowych naczyniach limfatycznych znakowanych przeciwciałami anty-LYVE1. Brak wstrzykniętego do CSF znacznika w kręgowych naczyniach limfatycznych może wynikać albo z krótkiego czasu utrzymywania się znacznika wewnątrz naczyń limfatycznych, albo z braku pobierania znacznika przez naczynia limfatyczne (Rysunek 3C).
Aby przetestować pierwszą hipotezę, wykorzystano królicze przeciwciało anty-LYVE1 jako znacznik komórek śródbłonka limfatycznego do związania naczyń limfatycznych związanych z OUN. Wstrzyknięte przeciwciało królicze anty-LYVE1 wykryto następnie metodą immunohistochemiczną za pomocą wtórnego przeciwciała anty-króliczego, natomiast komórki śródbłonka limfatycznego oznakowano immunologicznie przeciwciałami anty-PROX1. Rycina 4 przedstawia schemat eksperymentalny wstrzykiwania anty-LYVE1 do miąższu rdzeniowego na poziomie ThLb (Rycina 4A) oraz wynikowy 3D wzorzec rozkładu przeciwciał LYVE1 w segmencie ThLb blisko miejsca wstrzyknięcia w odniesieniu do naczyń limfatycznych PROX1+ (Rycina 4B). Zarówno naczynia limfatyczne kręgosłupa, jak i ich pozakręgowe połączenia limfatyczne zostały oznakowane wstrzykniętymi przeciwciałami anty-LYVE1, co potwierdziło pobranie znacznika przez kręgowe naczynia limfatyczne oraz drenaż limfatyczny w kierunku pozakręgowego układu limfatycznego. W regionie ThLb brakowało węzłów chłonnych, w związku z czym nie można było ich zwizualizować w obrazowanym segmencie. Co więcej, zaobserwowany wzdłuż naczyń limfatycznych nieciągły wzorzec znacznika LYVE1 prawdopodobnie odzwierciedlał przerywaną ekspresję LYVE1 w naczyniach limfatycznych, o czym raportowano w poprzednich badaniach14,21. Podsumowując, wyniki niniejszego badania wykazały, że 45 min po wstrzyknięciu znacznika przeciwciało LYVE1, a nie OVA-A5, pozwoliło na wykrycie lokalnego pobrania przez kręgowe naczynia limfatyczne i było preferowane nad OVA-A55 jako trwały marker lokalnego drenażu limfatycznego kręgosłupa.
<img alt="Schemat protokołu iDISCO+ dla kręgów myszy; obrazowanie LSFM, rekonstrukcja 3D i segmentacja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61099/61099fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Trójwymiarowy widok układu naczyń limfatycznych kręgosłupa. (A) Schematyczna reprezentacja protokołu. (B) Projekcja planarna obrazu 3D naczyń limfatycznych kręgosłupa ThLb z perspektywy grzbietowo-czołowej. Naczynia limfatyczne zostały oznakowane immunologicznymi przeciwciałami przeciwko PROX1 (kolor zielony) z wykorzystaniem metody iDISCO+ protokół, a następnie obrazowane za pomocą LSFM. Należy zwrócić uwagę na wzór naczyń krwionośnych w kanale kręgowym trzech kolejnych kręgów, przypominający segmentację (białe groty strzałek). Oprócz półkolistych naczyń grzbietowych (białe groty strzałek), każda sieć kręgowa zawierała gałęzie brzuszne (żółte strzałki), obustronne boczne drogi wyjścia wzdłuż gałęzi kręgowych i zwojów (białe strzałki), a także grzbietową drogę wyjścia w linii środkowej (biała podwójna strzałka). Sieci kręgowe były połączone naczyniem podłużnym (fioletowe strzałki). Pełny opis znajduje się w pracy Jacob L. i wsp.18 SC = rdzeń kręgowy; gwiazdka = brzuszna część trzonu kręgu; D = grzbietowy; L = boczny; V = brzuszny; paski skali = 300 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61099/61099fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ilustracji, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Proces przejrzystości tkanek iDISCO z użyciem OVA-A5; obrazowanie fluorescencyjne rdzenia kręgowego, schemat i wyniki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61099/61099fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: dcLN pobrane po podaniu OVA-A555płyny CSF znakowane za pomocą - . (A) Schemat planu eksperymentalnego. OVA-A555 wstrzyknięto do ICM lub do miąższu rdzenia kręgowego w odcinku ThLb, a następnie myszy uśpiono 45 min po iniekcji. Próbki poddano procesowi klarowania i poddano obserwacji przy użyciu obrazowania makroskopowego z wykorzystaniem fluorescencji (B,C). Obrazy z makroskopu fluorescencyjnego kręgów szyjnych z ICM- (B) i ThLb- (C) wstrzyknięte myszy. Należy zauważyć, że OVA-A555 nagromadzone w dCLN (B,C, białe groty strzałek), przestrzenie oponowe i naczyniowe rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym (B,C) oraz po wstrzyknięciu do ICM, w brzuszno-bocznych drogach wyjścia, prawdopodobnie wzdłuż nerwów szyjnych (B, białe strzałki). SC = rdzeń kręgowy. Gwiazdka = brzuszna część trzonu kręgu; D = grzbietowo; L = bocznie; V = brzusznie; Paski skali w B i C = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61099/61099fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="klarowanie tkanki OVA-A55, schemat protokołu iDISCO+, obrazowanie LSFM; immunoznakowanie, rekonstrukcja obrazu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61099/61099fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Wykrywanie OVA-A555oznaczone płyny mózgowo-rdzeniowe w krążeniu limfatycznym kręgosłupa. (A) Schemat projektu doświadczalnego. OVA-A555 wstrzyknięto do miąższu rdzenia kręgowego na poziomie ThLb, a następnie myszy uśmiercono 45 min po wstrzyknięciu. Próbki poddano procesowi iDISCO+ protokół i obrazowanie za pomocą LSFM. (B,C) Projekcje płaskie trójwymiarowych widoków frontalnych odcinka szyjnego uchwyconych za pomocą LSFM (B) i klatki piersiowej (C) segmenty kręgosłupa. OVA-A555 wykryto akumulację (czerwona) w tkankach rdzenia kręgowego i dcLNs (B, biała strzałka), co przedstawiono w Rysunek 2, ale nie w naczyniach limfatycznych szyjnych i piersiowych, wyznakowanych immunochemicznie przeciwciałami anty-LYVE1 (kolor zielony). SC = rdzeń kręgowy; gwiazdka = brzuszna część trzonu kręgu; D = grzbietowo; L = bocznie; V = brzusznie; paski skali = 1 mm (B), 300 µm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61099/61099fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Przezrocznienie tkanek metodą iDISCO+, przeciwciała przeciwko LYVE-1, obrazowanie LSFM, schemat immunoznakowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61099/61099fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Wykrycie drenażu limfatycznego kręgów po dokanałowym wstrzyknięciu przeciwciał anty-LYVE1. (A) Schemat projektu eksperymentalnego. Przeciwciała anty-LYVE1 wstrzyknięto do miąższu rdzenia kręgowego na poziomie ThLb, następnie myszy uśpiono 45 min po wstrzyknięciu. Próbki poddano procesowi iDISCO+ protokół i obrazowanie za pomocą LSFM. (B). Projekcje płaskie czołowych widoków 3D ThLb (B) segment kręgosłupa, zarejestrowany za pomocą LSFM. Przeciwciała anty-LYVE1 wykryto za pomocą przeciwciał antykróliczych (kolor fioletowy), a naczynia limfatyczne za pomocą przeciwciał anty-PROX1 (kolor zielony). Białe naczynia to PROX1+ naczynia limfatyczne współbarwione przeciwciałami anty-LYVE1 (B); obejmują one naczynia limfatyczne kręgowe (żółte strzałki) i pozakręgowe (podwójne żółte strzałki). SC = rdzeń kręgowy; Gwiazdka = brzuszna część trzonu kręgu; D = grzbietowo; L = bocznie; V = brzusznie; Paski skali = 300 µm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61099/61099fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynniki</td>
			<td>Cel</td>
			<td>Rysunek</td>
			<td>Krok protokołu</td>
			<td>Komentarz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA-A555</td>
			<td>marker płynu mózgowo-rdzeniowego</td>
			<td>Rysunek 2 i Rysunek 3</td>
			<td>2. Iniekcja do ICM lub ThLb 
			7. Obrazowanie LSFM.</td>
			<td>Rozpuszczalny w wodzie, łatwy do wstrzyknięcia i o wysokiej intensywności fluorescencji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">przeciwciało anty-Lyve1</td>
			<td>Marker błonowy komórek LV</td>
			<td>Rysunek 3</td>
			<td>6. Immunobarwienie całych preparatów metodą iDISCO+. 
			7. Obrazowanie LSFM.</td>
			<td rowspan="2">Efektywne przeciwciała do immunobarwienia całych preparatów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drenaż znacznika z naczyń limfatycznych opon twardych i przestrzeni nadoponowej</td>
			<td>Rycina 4</td>
			<td>2. Iniekcja do masy komórkowej (ICM) lub do jamniowej błony trofoblastycznej (ThLb) 
			6. Immunobarwienie całych preparatów metodą iDISCO+ 
			7. Obrazowanie LSFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało przeciwko Prox1</td>
			<td>Marker jądrowy komórek LV</td>
			<td>Rysunek 1 i Rysunek 4</td>
			<td>6. Immunobarwienie całych preparatów metodą iDISCO+ 
			7. Obrazowanie LSFM</td>
			<td>Efektywne barwienie immunocytochemiczne całych preparatów przeciwciałami</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przeciwciała i znaczniki użyte w badaniu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Problem</td>
			<td>Możliwa przyczyna</td>
			<td>Roztwór</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Zabieg chirurgiczny w celu podania znacznika</td>
			<td>Niepożądana zmiana w tkance OUN</td>
			<td>1. Brak kontroli nad wrowadzaniem kapilary szklanej 
			2. Nieprawidłowa głębokość wprowadzenia kapilary szklanej</td>
			<td>1. Przed wprowadzeniem szklanej kapilary należy z należytą starannością, lecz kompleksowo, naciąć oponę twardą igłą 26 G. 
			2. Zmniejsz głębokość wprowadzenia kapilary szklanej (&lt;1,5 mm od opony twardej). 
			3. Zmniejsz średnicę kapilary szklanej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Niepożądane przedostanie się wstrzykniętego znacznika do przestrzeni zewnątrzoponowej lub pozakręgowej</td>
			<td>Nieprawidłowa iniekcja znacznika</td>
			<td>1. Sprawdź, czy szklana mikrokapilara została prawidłowo wprowadzona w celu nakłucia opony twardej. 
			2. Przed wstrzyknięciem znacznika należy nanieść klej chirurgiczny pomiędzy szklaną mikrokapilarę a otaczającą ją tkankę.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zbyt duża objętość wstrzykniętego znacznika</td>
			<td>Zmniejszyć objętość wstrzykniętego znacznika (&lt;2 µL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">immunobarwienie metodą iDISCO+</td>
			<td rowspan="2">Brak, niejednorodność lub nadmierne tło znakowania w tkance</td>
			<td>1. Problemy z koncentracją przeciwciała pierwszorzędowego 
			2. Niewystarczająca permeabilizacja 
			3. Niewystarczające płukanie 
			4. Niewystarczające przejrzyszczanie</td>
			<td>Zwiększyć liczbę i/lub czas trwania etapów inkubacji: permeabilizacji, przemywania, inkubacji z przeciwciałem pierwotnym oraz klarowania. Patrz http://www.idisco.info (FAQ AND TROUBLESHOOTING).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niedostateczna dekalcyfikacja</td>
			<td>Zastosować bardziej rygorystyczną procedurę dekalcyfikacji próbki z użyciem EDTA21 lub roztwór Morse'a, szczególnie dla tkanek głowy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">prześwietlanie iDISCO+</td>
			<td rowspan="3">Próbki są mętne lub mają brązowy kolor</td>
			<td>Niedostateczne wybielanie</td>
			<td>Użyj świeżego H2O2 roztwór, zwiększyć objętość i/lub czas inkubacji.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obecność utleniania</td>
			<td>Wypełnij probówkę całkowicie, aby uniknąć obecności powietrza.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niewystarczające przejaśnianie</td>
			<td>Zwiększyć objętość i/lub czas inkubacji. Patrz http://www.idisco.info (FAQ I ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Detekcja znacznika</td>
			<td rowspan="2">Niewykrywalny znacznik</td>
			<td>Nieprawidłowa kombinacja wybranego znacznika</td>
			<td>Fluorochromy Alexa 5, 594 i 647 są odporne na protokół iDISCO+5,6,7,8,9,10Jednak nie dotyczy to fluorochromów FITC, GFP i RFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moment uśmiercenia po wstrzyknięciu</td>
			<td>Preferuj OVA-A555 do krótkoterminowej (15 min) analizy drenażu w miejscowych naczyniach limfatycznych kręgosłupa. Do analizy drenażu węzłów chłonnych, OVA-A555 a przeciwciało Lyve1 można stosować przez dłuższy czas (&gt;45 min) analiza.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Obrazowanie: akwizycja i analiza</td>
			<td rowspan="2">Uzyskane obrazy układu limfatycznego są niesatysfakcjonujące</td>
			<td>Problem z sekcją (brak węzłów chłonnych)</td>
			<td>W próbce preparowanej należy starannie uwzględnić tkanki sąsiadujące z kręgosłupem lub czaszką, w zależności od obwodu limfatycznego, który jest obrazowany.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Problem z obrazowaniem</td>
			<td>1. Zmodyfikuj parametry akwizycji LSFM: intensywność lasera, aperturę numeryczną arkusza światła, grubość arkusza światła, czas ekspozycji. 
			2. Umieść próbkę w uchwycie, aby skrócić drogę światła przechodzącego przez tkankę do obiektywu. 
			3. Należy upewnić się, że podczas akwizycji wewnątrz próbki tkanki nie znajdują się pęcherzyki powietrza.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Porady dotyczące rozwiązywania problemów dla każdego etapu protokołu, obejmujące możliwe problemy i rozwiązania.

Przedstawiono protokół łączący oczyszczanie tkanek z mikroskopią fluorescencyjną (LSFM) w celu uzyskania trójwymiarowych i komórkowych obrazów naczyń limfatycznych i węzłów chłonnych (LN) zbierających płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i płyn zewnątrzoponowy rdzeniowy.

Trójwymiarowe obrazowanie układu naczyniowego i drenażu limfatycznego kręgów przy użyciu iDISCO+ i mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych

The lymphatic system associated with the central nervous system (CNS) includes the lymphatic vasculature that spins around the brain, the spinal cord, and ...

Nasz protokół zapewnia trójwymiarowe i wielkoskalowe widoki naczyń limfatycznych kręgów i ich drenujących węzłów chłonnych, ułatwiając badanie drenażu limfatycznego i ruchu limfatycznego komórek odpornościowych. Protokół clearing iDISCO+ zachowuje integralność tkanek, umożliwiając lokalizację komórek nerwowych, naczyniowych i odpornościowych kręgosłupa, w tym rdzenia kręgowego, opon mózgowych, przestrzeni zewnątrzoponowej i drenujących węzłów chłonnych. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania u znieczulonej myszy w wieku od 8 do 12 tygodni, umieść mysz w ramce stereotaktycznej.I za pomocą skalpela należy wykonać nacięcie skóry w odpowiednim miejscu do planowanego wstrzyknięcia. Użyj adaptera kręgosłupa, aby unieruchomić rdzeń kręgowy na poziomie kręgów Th12-L1 i tępo wypreparuj mięśnie przyszyjkowe lub przykręgosłupowe pokrywające szyję i kolumnę, aby uwidocznić powierzchnię opony twardej. Następnie użyj igły o rozmiarze 26, aby ostrożnie nakłuć centralny obszar opony twardej i leżącą pod nią pajęczynówkę.Następnie odetnij dwa milimetry od szklanej końcówki kapilary i połącz kapilę z kaniulą połączoną ze strzykawką o pojemności 10 mikrolitrów. Załaduj mikrokapilę dwoma do ośmiu mikrolitrów wybranego znacznika fluorescencyjnego. I wprowadzić mikrokapilę do przyśrodkowej części opony twardej pod odpowiednim kątem do planowanego wstrzyknięcia.Popychając kapilarnę 1,5 milimetra poniżej opony twardej, zamknij nacięcie wokół naczynia włosowatego za pomocą 10 mikrolitrów kleju chirurgicznego. Gdy klej wyschnie, powoli wstrzyknij znacznik fluorescencyjny z szybkością jednego mikrolitra na minutę. Po dostarczeniu całej objętości pozostaw kapilarnę na miejscu na jedną minutę przed wycofaniem mikrokapilary.I zamknij otwór iniekcyjny dodatkowym klejem. W odpowiednim momencie po wstrzyknięciu należy użyć nożyczek preparacyjnych, aby wykonać nacięcia skóry i otrzewnej od dolnej części brzucha do klatki piersiowej. Otwórz klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca i włóż igłę o rozmiarze 26 do lewej komory serca.Perfuzja z 20 mililitrami lodowatego 4% paraformaldehydu w PBS, w tempie dwóch mililitrów na minutę. I użyj nożyczek, aby szybko przeciąć prawe przedsionek, uwalniając strumień płynu perfuzyjnego. Użyj kleszczy, aby całkowicie usunąć skórę i usuń kończyny nożyczkami.Usuń wszystkie narządy wewnętrzne, uważając, aby węzły chłonne pozostały nienaruszone i przeciąć żebra. Zanurz wypreparowane tkanki w lodowatym 4% paraformaldehydzie w PBS w pojedynczych 50-mililitrowych probówkach przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie umyj utrwalone tkanki trzy razy w 50 mililitrach świeżego PBS, przez pięć minut na pranie. W przypadku znakowania iDISCO+ próbek w całości, najpierw należy odwodnić tkanki, zanurzając je w rosnących stężeniach metanolu w PBS przez jedną godzinę na zanurzenie z mieszaniem w temperaturze pokojowej.Po ostatnim zanurzeniu inkubować próbki w roztworze 33% metanolu i 66% dichlorometanu przez noc z mieszaniem. Następnego ranka umyj próbki dwa razy 100% metanolem przez jedną godzinę na mycie w temperaturze pokojowej. Następnie następuje całonocna inkubacja w 5% nadtlenku wodoru w metanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego ranka próbki należy stopniowo nawadniać w sekwencyjnym zanurzeniu w malejących stężeniach metanolu w PBS przez jedną godzinę na stężenie z mieszaniem w temperaturze pokojowej. Aby odwapnić kręgi, należy inkubować próbki w roztworze Morse'a przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dwa płukania w PBS i dwie jednogodzinne inkubacje w 0,2% Triton X-100 w PBS, z mieszaniem w temperaturze pokojowej.Po drugiej inkubacji Triton X-100 próbki należy traktować roztworem przepuszczalnym przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie 24-godzinna inkubacja w roztworze blokującym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji roztworu blokującego znakować próbki pierwszorzędowym przeciwciałem, rozcieńczonym w 0,2% Tween-20 i 0,1% heparynie w PBS uzupełnionym 5% dimetylosulfotlenkiem i 3% roztworem surowicy osła w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć dni.Pod koniec inkubacji przemyć próbki czterema do pięciu inkubacjami przez noc w świeżych 2% Tween-20 i 0,1% heparynie w PBS na przemycie w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Następnie inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Po ostatnim przemyciu odwodnić próbki, zanurzając je w rosnących stężeniach metanolu w PBS na jedną godzinę na każde stężenie.Następnie następuje nocna inkubacja w 33% roztworze metanolu i 66% dichlorometanu. Następnego ranka umyj próbki dwoma 15-minutowymi płuczkami dichlorometanu. I oczyść próbki w eterze dibenzylowym bez wstrząsania przez cztery godziny.W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkuszy świetlnych należy umieścić oczyszczone próbki w płaszczyźnie poprzecznej w stoliku mikroskopu pod obiektywem 4X, 0,3. I wybierz jednostronną konfigurację eliminacji trzech arkuszy ze stałą pozycją X bez dynamicznego ustawiania ostrości. Używaj laserów LED dostrojonych do 561 nanometrów i 100 miliwatów oraz 639 nanometrów i 70 miliwatów.I ustaw aperturę numeryczną arkusza światła na 0,03. Ustaw odpowiednie filtry emisyjne i napełnij komorę mikroskopu eterem dibenzylowym. Następnie użyj aparatu, aby uzyskać stosy ze stosami Z o wielkości 2,5 mikrometra i czasem ekspozycji wynoszącym 30 milisekund na krok, korzystając z dwóch zoomów optycznych X i 0,8 mikrometra na piksel.I wykonuj akwizycje mozaiki z 10% nałożeniem na pełną klatkę. Pobieraj obrazy w formacie TIF i konwertuj je do formatu 3D za pomocą odpowiedniego oprogramowania do pełnej konwersji. Aby zrekonstruować akwizycję mozaik za pomocą oprogramowania Stitcher, otwórz obrazy i ręcznie ułóż obrazy, aby odtworzyć cały obraz mozaiki, wykorzystując 10% nakładanie się obrazów jako wskazówkę.Następnie użyj oprogramowania 3D, aby wygenerować ortogonalne rzuty danych. Dodanie atrybutu kodu kolorystycznego do naczyń limfatycznych i innych struktur anatomicznych na wystawie. I ustaw poprawkę gamma 1,47 na surowe dane uzyskane z mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego.zgodnie z instrukcjami producenta. Połączenie iDISCO+ z mikroskopią fluorescencyjną za pomocą arkusza świetlnego pozwala zachować anatomię kręgów i umożliwia uchwycenie układu limfatycznego w obrębie otaczających kości, więzadeł, mięśni i zwojów nerwowych. Wstrzyknięcie małego czerwonego znacznika fluorescencyjnego do płynu mózgowo-rdzeniowego, cisterna magna lub odcinka piersiowo-lędźwiowego rdzenia kręgowego powoduje nagromadzenie znacznika w głębokich węzłach chłonnych szyjnych 45 minut po wstrzyknięciu, co wskazuje na wychwyt i drenaż znacznika przez układ limfatyczny.Wstrzyknięcie znacznika do miąższu rdzeniowego piersiowo-lędźwiowego powoduje akumulację znacznika w tkankach rdzenia kręgowego i głębokich węzłach chłonnych drenujących szyjkę macicy, ale nie w unaczynieniu limfatycznym szyjki macicy i piersi znakowanym przeciwciałami anty-LYVE-1. Iniekcja anty-LYVE do miąższu rdzeniowego piersiowo-lędźwiowego powoduje znakowanie zarówno węzłów chłonnych kręgów, jak i ich pozakręgowych połączeń limfatycznych. Uzasadnienie wychwytu znacznika przez naczynia limfatyczne kręgów i drenaż limfatyczny w kierunku zewnątrzkręgowego układu limfatycznego.Wykonaj wstrzyknięcie śladu bardzo ostrożnie, aby nie zakłócić krążenia płynu mózgowo-rdzeniowego. Protokół iDISCO+ jest bardzo oficjalny, ale musisz dostosować się do wielkości swoich próbek. Po wstrzyknięciu śladowym do ośrodkowego układu nerwowego można przeprowadzić eksperyment z barwieniem immunologicznym lub obrazowaniem na żywo.Protokół iDISCO+ może być używany do badania różnych komórek, populacji i tkanek.

three-dimensional-imaging-vertebral-lymphatic-vasculature-drainage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiono technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego (LN) pachwinowego. Technika ta umożliwia badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego w czasie rzeczywistym, in vivo, zarówno w stanie homeostazy, jak i podczas infekcji. Metoda ta może zostać dostosowana do badań nad migracją komórek oraz do analizy innych lokalizacji węzłów chłonnych.

Mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego

Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Niedawno opracowane techniki obrazowania z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) mogą pomóc w wyjaśnieniu roli, jaką układ limfatyczny odgrywa w przerzutowaniu nowotworów, odpowiedzi immunologicznej, gojeniu ran oraz innych chorobach związanych z układem limfatycznym.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne naczyń limfatycznych myszy

Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości fluorescencyjnie znakowanych komórek w dużych tkankach, najlepiej byłoby, gdyby próbki biologiczne były obrazowane bez dzielenia na sekcje. 3DISCO to prosta procedura oczyszczania tkanek oparta na sekwencyjnej inkubacji z rozpuszczalnikami organicznymi. Po oczyszczeniu narządy stają się przezroczyste, co pozwala na kompleksowe skanowanie laserowe próbki.

Obrazowanie oczyściło nienaruszone systemy biologiczne na poziomie komórkowym za pomocą 3DISCO

Wprowadzamy metodę obrazowania in vivo przy użyciu dwóch różnych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamicznych zmian naczyniowych kręgosłupa po kontuzji rdzenia kręgowego u dorosłych szczurów Sprague-Dawley.

Badanie in vivo Dwukolorowa metoda obrazowania dynamiki naczyń krwionośnych po kontuzyjnym urazie rdzenia kręgowego

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Ten artykuł opisuje protokół immunofluorescencji multipleksowej zoptymalizowany pod kątem charakterystyki trójwymiarowej architektury przerzutów otrzewnowych.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

Ten protokół ocenia drenaż limfatyczny po złamaniu poprzez łączenie obrazowania w bliskiej podczerwieni z użyciem zielonej indokyaninowej (ICG) z ultrasonografią w celu ilościowego określenia usuwania ICG podeszwowego i powiększenia węzłów chłonnych okołokolanowych u myszy.

Ocena drenażu limfatycznego z wykorzystaniem obrazowania ICG w bliskiej podczerwieni i ultradźwięków po złamaniu

Przedstawiono tutaj protokół do oceny naczyń limfatycznych oponowych myszy (MLV), które odgrywają ważną rolę w wielu chorobach neurologicznych. Celem tego protokołu jest zapewnienie zintegrowanej metody, która umożliwia zarówno funkcjonalną ocenę drenażu znacznika, jak i szczegółową charakteryzację morfologiczną sieci grzbietowych MLV.

Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu

Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Poznaj metodę iDISCO+ i mikroskopię arkuszy świetlnych do trójwymiarowego obrazowania naczyń limfatycznych kręgosłupa i węzłów chłonnych. Technika ta umożliwia badanie drenażu limfatycznego i ruchu komórek immunologicznych.

Trójwymiarowe obrazowanie układu naczyniowego i drenażu limfatycznego kręgów przy użyciu iDISCO+ i mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (Wideo) | JoVE Journal

Trójwymiarowe obrazowanie układu naczyniowego i drenażu limfatycznego kręgów przy użyciu iDISCO⁺ i mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych

Przeglądaj więcej filmów