Model choroby niedokrwiennej serca i porównanie wideo skurczu kardiomiocytów przy użyciu kardiomiocytów pochodzących z hiPSC
5 maja 2020
Prezentujemy model choroby niedokrwiennej serca za pomocą kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, wraz z metodą ilościowej oceny uszkodzeń tkanek spowodowanych niedokrwieniem. Model ten może stanowić użyteczną platformę do badań przesiewowych leków i dalszych badań nad chorobą niedokrwienną serca.
Badania nad chorobami serca są często przeprowadzane u małych i ssaków, takich jak gryzonie. Jednak fizjologia ludzkiego serca znacznie różni się od fizjologii serca gryzonia. Nasz protokół wykorzystuje kardiomiocyty zróżnicowane z ludzkich komórek iPS do modelowania choroby niedokrwiennej serca oraz do ilościowego określenia uszkodzeń i upośledzenia funkcjonalnego kardiomiocytów niedokrwiennych.
Protokół ten może stanowić wygodną metodę spersonalizowanych badań przesiewowych leków przy użyciu komórek iPS pochodzących od indywidualnych pacjentów, odpowiednie obchodzenie się z komórkami iPS, takie jak stosowanie świeżej pożywki, oraz powolna i punktowa zmiana pożywki ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia pomyślnego różnicowania w funkcjonalne kardiomiocyty. Procedurę zademonstruje wraz z Yun Liu, Yin Liang i Mengxue Wang Chen Wang, doktorant z laboratorium. Aby indukować indukowane przez człowieka różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórkach serca, najpierw pokryj studzienki 96-dołkowej płytki hodowlanej 100 mikrolitrami 1,675 mikrograma na mililitr lamininy w PBS.
Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zobacz trzy razy od 10 do czwartego komórek macierzystych w 200 mikrolitrach pożywki podtrzymującej IPS uzupełnionej 10 mikromolowym Y27632 do każdej studzienki i włóż płytkę do inkubatora kultur komórkowych. Po 24 godzinach zastąp super środki 200 mikrolitrami pożywki wzrostowej IPS na dołek i włóż płytkę do inkubatora kultur komórkowych na dodatkowe dwa do trzech dni. Gdy komórki osiągną 70 do 80% zbiegalności.
Zastąp pożywkę w każdym dołku 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej A i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na kolejne 48 godzin. Pod koniec inkubacji powoli zastępuj supernatant w każdym dołku 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanego podłoża różnicującego B i włóż płytkę z powrotem do inkubatora kultur komórkowych. Po dwóch dniach zastąp supernatanty 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanej pożywki podtrzymującej kardiomiocyty na dołek i zwróć płytkę do inkubatora kultur komórkowych na okres do 30 dni.
Aby ocenić kurczliwość kardiomiocytów, zainstaluj wtyczkę do pomiaru prędkości obrazu cząstek i użyj mikroskopu z kontrastem fazowym oraz obiektywu wideł, aby rejestrować obrazy wideo komórek z prędkością około 20 klatek na sekundę przez około 10 sekund. Następnie zapisz plik wideo zgodnie z analizą naszego API i utwórz strukturę folderów zgodnie ze wskazaniami. Aby przeanalizować dyskretne dwuwymiarowe pola wektorowe przemieszczenia komórkowego, uruchom VG i wybierz wtyczki, makra i edytuj, aby otworzyć analizę wektorową.
ijm, a następnie kliknij przycisk Uruchom Analiza zostanie wykonana automatycznie. W przypadku leczenia niedokrwiennego zastąp supernatant w każdej studzience 200 mikrolitrami dmem bez glukozy i surowicy, a następnie umieść płytkę w komorze hipoksyjnej, a następnie wlej gazowy azot do komory, utrzymując wewnętrzne stężenie tlenu na poziomie 2% i stężenie dwutlenku węgla na poziomie 5% przez 24 godziny. Pomyślnie różnicujące się komórki, wykazują spontaniczny skurcz, jak zaobserwowano pod mikroskopem, przy czym 50% dołków hodowlanych zwykle wykazuje spontaniczny skurcz w czasie krótszym niż 20 dni.
Białko markera sercowego może być również wykorzystane do potwierdzenia pomyślnego różnicowania Komórki z grupy niedokrwiennej zazwyczaj wykazują niższą żywotność w testach MTT i niższą kurczliwość niż te z normoksyjnej grupy kontrolnej. Stosunek komórek dodatnich w jodku propidyny jest również wyższy w grupie niedokrwiennej niż w grupie kontrolnej, co wskazuje na większą częstość występowania uszkodzeń komórek. Ważne jest, aby dokładnie zlokalizować obszary zainteresowania na płytce wychwytującej, aby umożliwić porównanie kurczliwości kardiomiocytów.
Technika ta może być stosowana do badań przesiewowych leków przy użyciu komórek iPS pochodzących od pacjenta. Stanowi również unikalną platformę do dalszego wyjaśniania mechanizmów leżących u podstaw chorób niedokrwiennych serca
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół modelowania niedokrwiennej choroby serca z wykorzystaniem kardiomiocytów zróżnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS-CMs). Metoda ta umożliwia ilościowe określenie uszkodzeń komórkowych oraz upośledzenia funkcji w warunkach niedokrwienia, stanowiąc klinicznie istotną platformę do badań nad chorobami serca i spersonalizowanego przesiewu leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad układem sercowo-naczyniowym
- Biologia komórek macierzystych
- Fizjologia komórkowa
Wstęp
- Choroba niedokrwienna serca jest wiodącą przyczyną śmiertelności na całym świecie.
- Powszechnie stosuje się modele gryzoni, jednak różnią się one znacząco od fizjologii serca człowieka.
- Kardiomiocyty pochodzące z ludzkich iPS oferują bardziej odpowiedni model do badania chorób serca u ludzi.
- Istnieje zapotrzebowanie na platformy ułatwiające zarówno modelowanie chorób, jak i przesiewowe badanie leków w kontekście ludzkim.
Cel badania
- Opracowanie protokołu różnicowania ludzkich komórek iPS w kardiomiocyty.
- Modelowanie choroby niedokrwiennej serca in vitro z wykorzystaniem hiPS-CMs.
- Ilościowe określenie uszkodzeń komórkowych i upośledzenia funkcji w warunkach niedotlenienia.
Zastosowane metody
- Różnicowanie ludzkich komórek iPS w kardiomiocyty przy użyciu sekwencyjnych mediów hodowlanych i płytek pokrytych lamininą.
- Indukcja niedokrwienia poprzez wystawienie hiPS-CM na 2% tlenu i medium wolne od glukozy i surowicy przez 24 godziny w komorze hipoksycznej.
- Ocena żywotności komórek z wykorzystaniem testów MTT i barwienia jodkiem propidialnym.
- Pomiar kurczliwości za pomocą analizy pola wektorów przemieszczenia z wykorzystaniem mikroskopii w kontraście fazowym i oprogramowania do welocymetrii obrazu cząstek.
Główne wyniki
- Warunki niedokrwienne zwiększyły odsetek uszkodzonych komórek, co wskazywało zwiększone barwienie jodkiem propidium.
- Żywotność komórek w grupie z niedokrwieniem była niższa w porównaniu z grupami kontrolnymi.
- Kurczliwość hiPS-CMs była zredukowana w warunkach niedokrwiennych.
- W około 50% studzienek hodowlanych zaobserwowano spontaniczne skurcze w ciągu 20 dni różnicowania.
Wnioski
- Protokół zapewnia stabilny model in vitro choroby niedokrwiennej serca z wykorzystaniem kardiomiocytów pochodzenia ludzkiego.
- System ten umożliwia ilościowe określenie zarówno uszkodzeń komórkowych, jak i zaburzeń czynnościowych.
- Model ten nadaje się do spersonalizowanego przesiewu leków oraz dalszych badań mechanistycznych nad chorobą niedokrwienną serca.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modele kardiomiocytów pochodzących z ludzkich iPSC niwelują lukę translacyjną między badaniami na gryzoniach a ludzkimi chorobami serca, umożliwiając bardziej predykcyjne odkrycia we wczesnych etapach badań nad niedokrwienną chorobą serca. Ilościowa analiza kurczliwości oparta na analizie wideo oraz testy żywotności dostarczają istotnych danych do walidacji celów i ograniczania ryzyka mechanistycznego. Platforma ta wspiera decyzje dotyczące portfela projektów z uwzględnieniem ryzyka oraz spersonalizowane strategie przesiewowe leków w badaniach i rozwoju w obszarze sercowo-naczyniowym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów uszkodzeń niedokrwiennych w systemie odpowiadającym warunkom ludzkim.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe odczyty kurczliwości i żywotności.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie odpowiedzi komórkowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wczesnej selekcji projektów w programach sercowo-naczyniowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowaną platformę kardiomiocytów pochodzących z hiPSC do powtarzalnej oceny związków.
- Dostarcza ilościowe wskaźniki kurczliwości za pomocą analizy pola wektorów przemieszczenia.
- Umożliwia skalowalny screening oparty na wideo w celu wykrycia upośledzenia czynnościowego w warunkach niedokrwienia.
- Wspiera przygotowanie testu do późniejszego screeningu leków oraz badań mechanistycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie wyników in vitro z biologią ludzkich chorób w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Pozwala na wykorzystanie komórek pochodzących od pacjentów do personalizowanego profilowania odpowiedzi na leki.
- Zmniejsza zależność od modeli nie-ludzkich, zwiększając istotność danych przedklinicznych w kontekście choroby.
- Wspiera odkrywanie i walidację biomarkerów w kontekście klinicznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model niedokrwienia kardiomiocytów pochodnych hiPSC łączy wczesną fazę odkryć, identyfikację związków wiodących oraz badania translacyjne, dostarczając swoistych dla ludzi punktów końcowych dotyczących funkcjonalności i żywotności.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie obrażeń niedokrwiennych i dysfunkcji skurczowej na potrzeby testowania hipotez i analizy szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki kurczliwości i żywotności do wstępnej selekcji związków.
- Analityka: Integruje analizę przemieszczenia na podstawie wideo oraz testy żywotności w celu przeprowadzenia rzetelnych porównań statystycznych.
- Badania translacyjne: Umożliwia tworzenie modeli specyficznych dla pacjenta i wspiera dopasowanie biomarkerów do punktów końcowych badania klinicznego.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną i wielokrotnego użytku platformę do odkrywania leków kardyologicznych oraz badań mechanistycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy funkcjonalne i wspiera skalowalne, powtarzalne procesy robocze.
- Wartość strategiczna: Informuje decyzje typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez redukcję biologicznego ryzyka na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów w obszarze sercowo-naczyniowym.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli hiPSC, różnicowania oraz walidacji markerów kardiologicznych.
- Niezbędny jest dostęp do komór hipoksycznych, mikroskopii kontrastowej oraz oprogramowania do analizy wideo.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności analizy i porównywalności danych.
- Można potrzebować adaptacji metody dla różnych linii iPSC pochodzących od pacjentów lub różnych podtypów chorób.
- Staranny wybór obszaru zainteresowania (region-of-interest) ma kluczowe znaczenie dla dokładnego porównania kurczliwości.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Cardiac Differentiation Induction
2:30
Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocyte (iPS-CM) Contractility Assessment
3:15
Ischemia Exposure
3:42
Results: Representative Cardiac Cell Differentiation
4:27
Conclusion
