Name: Wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metodę syntezy nanocząstek tlenku żelaza i zastosowanie magnetometrii do monitorowania ich w komórkach macierzystych człowieka. Technika ta umożliwia badanie biotransformacji nanocząstek w układach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Unię Europejską (projekt ERC-2014-CoG MaTissE #648779). Autorzy pragną podziękować za platformę charakterystyk fizykochemicznych CNanoMat Uniwersytetu Paris 13.

1. Synteza nanocząstek magnetycznych
<ol>
	<li>Synteza rdzenia – wspomagana mikrofalami
	<ol>
		<li>Rozpuścić 400 mg acetyloacetonianu żelaza(III) (>99,9%) w 10 ml alkoholu benzylowego (BA, 99,8%) w szklanej fiolce o pojemności 30 ml.</li>
		<li>Zwiększyć temperaturę zawiesiny z 25 do 250 °C w ciągu 20 minut (z szybkością 11,25 °C/min) i utrzymywać ją na poziomie 250 °C przez 30 minut za pomocą reaktora mikrofalowego.</li>
		<li>Powstałe nanocząstki zawieszone w alkoholu benzylowym przenieść do szklanej fiolki i oddzielić nanocząstki za pomocą magnesu neodymowego na 30 minut.</li>
		<li>Przemyć osad w poprzedniej szklanej fiolce o pojemności 100 ml 10 ml 10 ml dichlorometanu, 1 M wodorotlenku sodu, etanolu, wody o pH 7 (trzy razy) za pomocą magnesu neodymowego przez 5 minut każdego kroku w celu granulacji nanocząstek i usunięcia supernatantu.</li>
		<li>Doprowadzić zawiesinę nanocząstek w wodzie do pH 2 za pomocą 1 M kwasu solnego, a następnie odwirować w ultraodśrodkowych filtrach o mocy 100 kDa przy 2 200 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Usunąć filtrat, dodać 12 ml 10-2 M kwasu solnego do roztworu nanocząstek i odwirować w ultraodśrodkowych filtrach 100 kDa przy 2 200 x g przez 10 minut (trzy razy). Następnie rozcieńczyć roztwór nanocząstek w 10 ml 10-2 M kwasu solnego przed powlekaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>powłoka
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 175 mg kwasu cytrynowego i kwasu poliakrylowego w wodzie o pH 2 w szklanej fiolce o pojemności 100 ml i dostosować pH do 2 za pomocą 1 M roztworu kwasu solnego.</li>
		<li>Dodać 10 ml wodnych nanocząstek dyspersji do roztworu cząsteczki powlekającej, co odpowiada stosunkowi masowemu 5 między cząsteczką powłoki a nanocząstkami. Mieszać przez 2 godziny przy mieszaniu magnetycznym w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po reakcji dostosować pH do 7 za pomocą 1 M wodorotlenku sodu.</li>
		<li>Odwirować roztwór nanocząstek 3 razy wodą dejonizowaną (DI) w ultrafiltrach ultraodśrodkowych o stężeniu 100 kDa przy 2 200 x g przez 10 minut; usunąć filtrat i rozcieńczyć roztwór nanocząstek w 12 ml wody demineralizowanej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla i magnetyczne znakowanie komórek macierzystych
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w kompletnym pożywce do wzrostu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCGM) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Gdy komórki osiągną 90% zbieżności, dodaj 10 ml trypsyny-EDTA wstępnie podgrzanej w temperaturze 37°C na kolbę 150 cm² i pozostaw na 2-3 minuty w celu odłączenia komórek.
	<ol>
		<li>Aby wiedzieć, kiedy komórki są odłączone, obserwuj je pod mikroskopem jasnego pola. Ponownie zawiesić oderwane komórki w MSCGM i podzielić je na cztery kolby o powierzchni 150 cm². Amplifikuj komórki w ten sposób, aż do przejścia od 4 do 5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór nanocząstek magnetycznych do znakowania komórek: zdysperguj wybrane stężenie nanocząstek tlenku żelaza w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RMPI-1640) bez glutaminy. RPMI jest używany do inkubacji nanocząstek (i powiązanych etapów płukania), ponieważ ma niższą siłę jonową niż DMEM i lepiej zapobiega agregacji nanocząstek.</li>
	<li>Gdy komórki znajdują się w pasażu 4 lub 5 i 90% zlewają się, usuń pożywkę MSCGM, przepłucz komórki surowicą wolną od surowicy RPMI (bez glutaminy) i dodaj 10 ml roztworu nanocząstek tlenku żelaza na 150 cm2 kolbę hodowlaną, co jest minimalną objętością wymaganą do pokrycia wszystkich komórek.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut, a następnie wyrzucić roztwór nanocząstek. Przemyć raz surowicą wolną od surowicy RPMI-1640 (bez glutaminy) i inkubować ze zmodyfikowanym podłożem Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (25 ml na 150 cm2 kolba) przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby umożliwić pełną internalizację nanocząstek.</li>
</ol>
3. Powstawanie sferoid komórek macierzystych
<ol>
	<li>Świeżo przygotowana pożywka do hodowli sferoidów komórkowych składająca się z DMEM o wysokiej zawartości glukozy z L-glutaminą uzupełnioną 50 μM 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego, 0,1 μM deksametazonu, 1 mM pirogronianu sodu, 0,35 mM L-proliny i 1% uniwersalnego suplementu hodowlanego zawierającego insulinę, ludzką transferynę i kwas selenowy (ITS-Premix).</li>
	<li>Odłączyć magnetyczne MSC, dodając 10 ml 0,05% trypsyny-EDTA wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C na 150 cm2 kolbę przez 2-3 minuty. Po odłączeniu komórek natychmiast dezaktywuj trypsynę, dodając 1/3 objętości DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować zdysocjowane komórki przy 260 x g przez 5 minut, odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w małej objętości (mniej niż 1 ml na kolbę 150 cm²) pożywki do hodowli sferoidalnej, takiej jak 200 000 komórek w około 50 μl pożywki. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i w razie potrzeby dostosuj głośność.</li>
	<li>Dodać 1 ml świeżo przygotowanej pożywki do hodowli sferoidalnych komórek do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać objętość ponownie zawieszonego roztworu odpowiadającą 200 000 komórek.</li>
	<li>Odwiruj te magnetycznie znakowane komórki przy 180 x g przez 3 minuty, tworząc osad komórkowy na dnie probówki i zachowaj supernatant, który jest pożywką do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Lekko otworzyć probówki, aby umożliwić wymianę powietrza i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez okres do 21 dni, czas hodowli, wzdłuż którego komórki tworzą spójną strukturę 3D, w wyniku której powstaje w pełni uformowana sferoida. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu.</li>
	<li>W wyznaczonych dniach należy dwukrotnie przepłukać sferoidy buforem kakodylowym złożonym z 0,2 M kakodylanu rozcieńczonego w wodzie zdemineralizowanej i utrwalić je za pomocą 2% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylowym rozcieńczonym w wodzie destylowanej przez 30 min w temperaturze pokojowej. Przechowuj stałe sferoidy w PBS do czasu użycia do pomiaru VSM lub obrazowania TEM. Ten etap fiksacji zatrzymuje wszystkie procesy biologiczne i pozwala na długotrwałą ochronę.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja nanocząstek magnetycznych w roztworze i w celulonie za pomocą magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM)
<ol>
	<li>Umieścić określoną objętość roztworu nanocząstek magnetycznych (maksymalnie 10 μl) lub sferoidę pojedynczej komórki w uchwycie na próbkę specjalnie zaprojektowanym tak, aby pasował do VSM.</li>
	<li>Włóż próbkę do VSM i zeskanuj w poszukiwaniu przesunięcia próbki. Umieścić próbkę w pozycji odpowiadającej maksimum namagnesowania.</li>
	<li>Wykonaj pierwszy pomiar przy niskim polu magnetycznym (od -1500 Oe do +1500 Oe) z szybkością 20 Oe/s.</li>
	<li>Wykonaj drugi pomiar przy silnym polu magnetycznym (od -30 000 Oe do +30 000 Oe) z szybkością 200 Oe/s.</li>
</ol>
5. Analiza transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)
<ol>
	<li>W przypadku roztworów nanocząstek należy umieścić 10 μl roztworu wodnego na siatce miedzianej pokrytej węglem i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W przypadku nanocząstek zinternalizowanych w komórkach należy skontrastować utrwalone sferoidy komórkowe z ekstraktem z herbaty Oolong (OTE) w stężeniu 0,5% rozcieńczonym w 0,1 M buforze kakodylowym, po utrwaleniu 1% tetratlenkiem osmu zawierającym 1,5% cyjanożelazianu potasu, a następnie odwodnić w stopniowanych kąpielach etanolowych, zawartych w Eponie. Pokrój ultrasekcje o długości fali 70 nm i umieść je na siatkach miedzianych.</li>
	<li>Wykonuj zdjęcia za pomocą mikroskopu elektronowego o napięciu 80 kV z powiększeniem od 1k do obserwacji całych komórek do 40k do obserwacji kompartmentów endosomalnych.</li>
</ol>

<ol><li>Azevedo-Pereira, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+as+a+tool+to+track+mouse+neural+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo.</a> Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).</li>
<li>Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+forces+to+promote+stem+cell+aggregation+during+differentiation%2C+and+cartilage+tissue+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling.</a> Advanced Materials. 25 (18), Deerfield Beach, Fla. 2611-2616 (2013).</li>
<li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+spheroids+using+magnetic+nanoparticles+for+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture.</a> Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+artificial+skeletal+muscle+tissues+by+a+magnetic+force-based+tissue+engineering+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).</li>
<li>Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+magnetic+cell+sheet+patches+for+advanced+strategies+in+tendon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).</li>
<li>Du, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+magnetic+tissue+stretcher+for+remote+mechanical+control+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation.</a> Nature Communications. 8 (1), 400(2017).</li>
<li>Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine%3A+A+novel+green+precursor+for+synthesis+of+magnetic+CoFe2O4+nanoparticles+and+pH-sensitive+magnetic+alginate+beads+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery.</a> Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).</li>
<li>Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+iron+oxide+nanoparticles+for+drug+delivery%3A+applications+and+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).</li>
<li>Cazares-Cortes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+in+magnetic+hyperthermia%3A+From+the+%22hot-spot%22+effect+for+local+delivery+to+combined+magneto-photo-thermia+using+magneto-plasmonic+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).</li>
<li>Espinosa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+%28Hyper%29Thermia+or+Photothermia%3F+Progressive+Comparison+of+Iron+Oxide+and+Gold+Nanoparticles+Heating+in+Water%2C+in+Cells%2C+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo.</a> Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660(2018).</li>
<li>Plan Sangnier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+thermal+therapy+with+genetically+engineered+magnetite+magnetosomes%40RGD%3A+Photothermia+is+far+more+efficient+than+magnetic+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia.</a> Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).</li>
<li>Pham, B. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+and+Clearance+of+Stable+Superparamagnetic+Maghemite+Iron+Oxide+Nanoparticles+in+Mice+Following+Intraperitoneal+Administration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).</li>
<li>Kolosnjaj-Tabi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotransformations+of+magnetic+nanoparticles+in+the+body%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Biotransformations of magnetic nanoparticles in the body.</a> Nano Today. 11 (3), 280-284 (2016).</li>
<li>Bargheer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+degradation+of+radiolabeled+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+and+quantum+dots+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Beilstein+Journal+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice.</a> Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).</li>
<li>Freund, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+widely+applicable+method+to+59Fe-radiolabel+monodisperse+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+for+in+vivo+quantification+studies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies.</a> ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).</li>
<li>Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+genotoxicity+and+tissue+distribution+of+nano+and+micron+sized+iron+oxide+in+rats+after+acute+oral+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).</li>
<li>Levy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+in+vivo+biotransformation+of+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles.</a> Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).</li>
<li>Briley-Saebo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+cellular+distribution+and+degradation+of+iron+oxide+nanoparticles+following+single+intravenous+injection+in+rats%3A+implications+for+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging.</a> Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).</li>
<li>Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Clearance+and+Toxicity+of+Monodisperse+Iron+Oxide+Nanocrystals%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals.</a> ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).</li>
<li>Sangnier, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+magnetic+nanoparticle+surface+coating+on+their+long-term+intracellular+biodegradation+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells.</a> Nanoscale. , (2019).</li>
<li>Mazuel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magneto-Thermal+Metrics+Can+Mirror+the+Long-Term+Intracellular+Fate+of+Magneto-Plasmonic+Nanohybrids+and+Reveal+the+Remarkable+Shielding+Effect+of+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold.</a> Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997(2017).</li>
<li>Van de Walle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+magnetic+nanoparticles+from+nano-degradation+products+revealed+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).</li>
<li>Mazuel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+Intracellular+Biodegradation+of+Iron+Oxide+Nanoparticles+Evidenced+Magnetically+at+Single-Endosome+and+Tissue+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels.</a> ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).</li>
<li>Bee, A., Massart, R., Neveu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+very+fine+maghemite+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetism+and+Magnetic+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthesis of very fine maghemite particles.</a> Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).</li>
<li>Feldmann, C., Jungk, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyol-Mediated+Preparation+of+Nanoscale+Oxide+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).</li>
<li>Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Highly+Crystalline+and+Monodisperse+Maghemite+Nanocrystallites+without+a+Size-Selection+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).</li>
<li>Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetite+Nanocrystals%3A+Nonaqueous+Synthesis%2C+Characterization%2C+and+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility.</a> Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).</li>
<li>Richard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USPIO+size+control+through+microwave+nonaqueous+sol-gel+method+for+neoangiogenesis+T2+MRI+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent.</a> Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).</li>
<li>Ngo, A. T., Pileni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblies+of+Ferrite+Nanocrystals%3A+Partial+Orientation+of+the+Easy+Magnetic+Axes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+synthesis+conditions+on+the+properties+of+citric-acid+coated+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Microelectronic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles.</a> Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+stem+cells+and+macrophages+with+gold+and+iron+oxide+nanoparticles+-+The+choice+of+the+best+suited+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles - The choice of the best suited particles.</a> Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).</li>
<li>Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Basic+principles%2C+limits+of+detection%2C+and+pitfalls+of+highly+sensitive+SQUID+magnetometry+for+nanomagnetism+and+spintronics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics.</a> Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101(2018).</li>
<li>Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetophoresis+and+ferromagnetic+resonance+of+magnetically+labeled+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells.</a> European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).</li>
<li>Jing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+intracellular+magnetic+nanoparticle+uptake+measured+by+live+cell+magnetophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis.</a> The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).</li>
<li>Van de Walle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+situ+magnetic+measurement+of+the+intracellular+biodegradation+of+iron+oxide+nanoparticles+in+a+stem+cell-spheroid+tissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model.</a> Nano Research. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z szybkiej i wydajnej syntezy mikrofalowej, nanocząstki magnetyczne mogą być łatwo syntetyzowane, o kontrolowanym rozmiarze, a następnie powlekane danymi cząsteczkami. Krytycznym krokiem jest przechowywanie soli żelaza i alkoholu benzylowego w próżni, aby zachować niewielką dyspersję. Alkohol benzylowy działa jednocześnie jako rozpuszczalnik i ligand, umożliwiając bezpośrednie otrzymanie skalibrowanego gołego tlenku żelaza bez konieczności stosowania dodatkowych ligandów. Po przeniesieniu nanocząstek do wody,...

Wzrasta zainteresowanie magnetycznymi cechami nanocząsteczek tlenku żelaza dla szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych. Ich reakcja na rezonans magnetyczny sprawia, że są niezawodnymi środkami kontrastowymi do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI), co jest zaletą w medycynie regeneracyjnej, gdzie komórki znakowane nanocząstkami magnetycznymi mogą być śledzone in vivo po implantacji1. Za pomocą pól magnetycznych komórki mogą być również kierowane na odległość; W ten sposób sferoidy komórkowe2,3, rings4, lub sheets5 mogą być konstruowane magnetycznie, a także zdalnie stymulowane6, co jest atutem w rozwoju tkanek wolnych od rusztowań. Zakres możliwości dla tych nanocząstek obejmuje również systemy dostarczania leków7,8 oraz magnetyczne i fotoindukowane leczenie hipertermiczne w celu zabijania komórek rakowych9,10,11. We wszystkich tych zastosowaniach nanocząstki są integrowane ze środowiskiem biologicznym albo przez wstrzyknięcie dożylne, albo poprzez bezpośrednią internalizację w komórkach, a następnie pozostają w środku, co stawia pod znakiem zapytania ich los wewnątrzkomórkowy.
Analizy in vivo dostarczyły ogólnego zrozumienia losu nanocząsteczek w organizmie: po wstrzyknięciu do krwiobiegu, są one najpierw wychwytywane głównie przez makrofagi wątroby (komórki Kupffera), śledziony i szpiku kostnego, ulegają postępującej degradacji i dołączają do puli żelaza w organizmie12,13,14,15,16,17,18,19. Obserwacje jakościowe są możliwe tylko dzięki cyrkulacji nanocząstek w całym organizmie. Zazwyczaj transmisyjna mikroskopia elektroniczna (TEM) może być używana do bezpośredniej obserwacji nanocząstek, a obecność żelaza w narządach można określić za pomocą dawkowania. Ostatnio ich los został oceniony bezpośrednio na puli komórek, co oznacza, że znajdują się w zamkniętym obwodzie bez ucieczki żelaza, co pozwala na ilościowy pomiar ich biotransformacji na poziomie komórki20,21,22. Takie pomiary są możliwe dzięki analizie właściwości magnetycznych nanocząstek, które są ściśle związane z ich integralnością strukturalną. Magnetometria próbek wibracyjnych (VSM) to technika, w której próbka jest okresowo wibrowana, tak że pomiar cewki indukowanego strumienia zapewnia moment magnetyczny próbki przy przyłożonym polu magnetycznym. Taka detekcja synchroniczna pozwala na szybki pomiar, co jest atutem w określaniu momentów magnetycznych dużej liczby próbek20,21,22,23. Makroskopowa sygnatura magnetyczna uzyskana przez VSM daje następnie ilościowy przegląd całej próbki biologicznej bezpośrednio skorelowanej z rozmiarem i strukturą nanocząstek. W szczególności zapewnia moment magnetyczny przy nasyceniu (wyrażony w emu) próbek, który jest bezpośrednim określeniem ilościowym liczby nanocząstek magnetycznych obecnych w próbce, odpowiednio do ich określonych właściwości magnetycznych.
Wykazano, że wewnątrzkomórkowe przetwarzanie nanocząstek magnetycznych jest ściśle związane z ich cechami strukturalnymi20. Cechy te mogą być kontrolowane za pomocą optymalnych protokołów syntezy. Każdy protokół ma swoje zalety i ograniczenia. Nanocząstki tlenku żelaza są powszechnie syntetyzowane w roztworach wodnych poprzez współstrącanie jonów żelaza24. Aby przezwyciężyć ograniczenia polidyspersyjności wielkości nanocząstek, opracowano inne metody syntezy, takie jak metody zol-żel za pośrednictwem polioli25. Niewodne podejścia do rozkładu termicznego prowadzą do produkcji bardzo dobrze skalibrowanych nanocząstek tlenku żelaza26. Jednak stosowanie ogromnych ilości środków powierzchniowo czynnych, takich jak oleiloamina czy kwas oleinowy, komplikuje ich funkcjonalizację i transfer wody do zastosowań biomedycznych. Z tego powodu syntetyzujemy takie magnetyczne nanocząstki za pomocą niewodnego szlaku zol-żel, co prowadzi do wysokiej krystaliczności, czystości i odtwarzalności27. Protokół ten wytwarza nanocząstki o dobrze kontrolowanym rozmiarze, które można dostroić poprzez zmiany temperatury28. Niemniej jednak wspomagana mikrofalami niewodna droga zol-żel ma górną granicę wielkości otrzymanych nanocząstek wynoszącą około 12 nm. Procedura ta nie byłaby dostosowana do zastosowań wykorzystujących cząstki ferromagnetyczne w temperaturze pokojowej. Oprócz syntezy rdzenia, kolejną główną cechą, którą należy wziąć pod uwagę, jest powłoka. Leżąc na powierzchni nanocząstki, powłoka działa jak cząsteczka kotwicząca, pomagając w ukierunkowanej internalizacji nanocząstek lub może chronić nanocząstkę przed degradacją. Ponieważ alkohol benzylowy działa jednocześnie jako źródło tlenu i ligand, gołe nanocząstki są wytwarzane bez potrzeby stosowania dodatkowych środków powierzchniowo czynnych lub ligandów. Nanocząstki są następnie łatwo funkcjonalizowane powierzchniowo po syntezie bez procesu wymiany środków powierzchniowo czynnych.
Tutaj oceniane są dwa rodzaje nanocząstek, które mają ten sam rdzeń i różnią się powłoką. Rdzeń jest syntetyzowany przy użyciu szybkiej i bardzo wydajnej techniki opartej na mikrofalach. Dwie porównywane powłoki składają się z kwasu cytrynowego, jednego z najczęściej używanych jako środek powlekający w zastosowaniach biomedycznych29,30, oraz kwasu poliakrylowego (PAA), powłoki polimerowej o dużej liczbie funkcji chelatujących. Pomiary magnetometryczne VSM są następnie wykorzystywane najpierw do ilościowego określenia wychwytu nanocząstek przez komórki, a następnie jako bezpośrednia ocena integralności strukturalnej nanocząstek po internalizacji w komórkach macierzystych. Wyniki pokazują, że stężenie w inkubacji wpływa na absorpcję nanocząstek, a powłoka wpływa na ich degradację, przy czym duża liczba cząsteczek zakotwiczających PAA chroni rdzeń przed degradacją.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy do syntezy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.22259</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Przygotować 1 mM roztwór podstawowy rozcieńczony w etanolu 100% i przechowywać w temperaturze -20&deg; C</td></tr><tr><td>Dichlorometan &ge; Stabilizowany w 99%, GPR RECTAPUR</td><td>VWR Chemicals</td><td>23367</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z Glutamax I</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>Bez pirogronianu sodu, bez HEPES</td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu Life <td>Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny 10% neutralny buforowany</td><td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny, 1,0N Roztwór standaryzowany</td><td>Alfa Aesar</td><td>35640</td><td></td></tr><tr><td>acetyloacetonian żelaza(III) (> 99,9%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517003</td><td></td></tr><tr><td>ITS Premix Uniwersalny suplement do hodowli (20x)</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy 2-fosforan</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Przygotować świeży stężony roztwór (25 mM) rozcieńczony w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td>Przygotować 175 mM roztwór podstawowy rozcieńczony w wodzie destylowanej i przechowywać w temperaturze 4&deg; C</td></tr><tr><td>Mezenchymalna komórka macierzysta (MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka ze szkła monofalowego</td><td>Anton Paar</td><td>82723_us</td><td></td></tr><tr><td>Reaktor mikrofalowy</td><td>Anton Paar</td><td>Monowave 300</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit medium</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Aby uzyskać kompletną pożywkę, dodaj dostarczony zestaw BulletKit (zawierający surowicę, glutaminę i antybiotyki) do pożywki MSCGM</td></tr><tr><td>PBS bez CaCl2 w/ o MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina (10.000U/ml)/Streptomycyna (10.000&mikro; g / mL)</td> <td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poli(kwas akrylowy, sól sodowa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>416010</td><td>MW = 1200 g/mol</td></tr><tr><td>RPMI medium 1640, bez glutaminy</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>Bez pirogronianu sodu, bez HEPES</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, 1,0N Standaryzowany roztwór</td><td>Alfa Aesar</td><td>35629</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu 100mM</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>probówki Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>Przygotować 1 M roztwór podstawowy rozcieńczony w wodzie destylowanej i przechowywać w temperaturze 4&deg; C</td></tr><tr><td>Cytrynian trójsodowy dwuwodny, certyfikowany AR do analizy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10396430</td><td></td></tr><tr><td>Ultra filtr odśrodkowy</td><td>Amicon</td><td>AC S510024</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetyczne nanocząstki, zbudowane z tlenku żelaza, są szczególnie interesujące dla szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych, do których często są internalizowane w komórkach, a następnie pozostawiane w nich. Jednym z wyzwań jest ocena ich losu w środowisku wewnątrzkomórkowym za pomocą wiarygodnych i precyzyjnych metodologii. W niniejszym artykule przedstawiamy zastosowanie magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM) do precyzyjnego ilościowego określenia integralności nanocząstek magnetycznych w komórkach poprzez pomiar ich momentu magnetycznego. Komórki macierzyste są najpierw znakowane dwoma rodzajami nanocząstek magnetycznych; Nanocząstki mają ten sam rdzeń wytwarzany w wyniku szybkiej i wydajnej syntezy żelu niewodnego na bazie mikrofal i różnią się powłoką: powszechnie stosowana cząsteczka kwasu cytrynowego jest porównywana do kwasu poliakrylowego. Tworzenie sferoid komórkowych 3D odbywa się następnie poprzez wirowanie, a moment magnetyczny tych sferoid jest mierzony w różnych momentach za pomocą VSM. Uzyskany moment jest bezpośrednim odciskiem palca integralności nanocząstek, przy czym malejące wartości wskazują na degradację nanocząstek. W przypadku obu nanocząstek moment magnetyczny zmniejsza się w czasie hodowli, ujawniając ich biodegradację. Wykazano również działanie ochronne powłoki z kwasu poliakrylowego w porównaniu z kwasem cytrynowym.

Z wykorzystaniem syntezy wspomaganej mikrofalowo otrzymuje się nanocząstki magnetyczne o monodyspersyjnej wielkości rdzenia 8.8 ± 2.5 nm, które następnie pokrywa się cytratem lub PAA (Rysunek 1A). Komórki macierzyste inkubuje się następnie przez 30 minut z tymi nanocząstkami zdyspergowanymi w pożywce hodowlanej w określonym stężeniu, co prowadzi do ich endocytozy i zamknięcia w endosomach komórkowych (Rysunek 1B). Magnetyczne komórki macierzyste zawiesza się w p...

Nanocząstki tlenku żelaza są syntetyzowane za pomocą niewodnego żelu zolowego i pokrywane anionowymi krótkimi cząsteczkami lub polimerem. Zastosowanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji i biotransformacji nanocząstek magnetycznych wewnątrz ludzkich komórek macierzystych wykazano za pomocą magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM).

Wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Ten film przedstawia szybką i wydajną metodę syntezy nanocząstek magnetycznych oraz wykorzystanie magnetometrii do fotografowania przemian w środowisku biologicznym. Nanocząstki magnetyczne przyciągnęły coraz większą uwagę do zastosowań biomedycznych i ważne jest, aby zrozumieć, że los kiedyś zinternalizował się w komórkach. Osiąga się to poprzez pomiar magnetyzmu komórkowego.Zarówno w przypadku syntezy, jak i pomiarów nanocząstek magnetycznych, na wynik może mieć wpływ zanieczyszczenie. Używaj dobrze oczyszczonych fiolek chemicznych i upewnij się, że magnetometr jest wolny od zanieczyszczeń. Uchwyt na próbki magnetometryczne jest zwykle używany do próbek proszkowych.Pokazujemy, jak dostosować zastosowanie uchwytu do próbek płynnych lub biologicznych. W 30-mililitrowej szklanej fiolce z falą many rozpuść 400 miligramów żelaza trzech acetyloacetonianów w 10 mililitrach alkoholu benzylowego. Za pomocą reaktora mikrofalowego podgrzej zawiesinę od 25 stopni Celsjusza do 250 stopni Celsjusza z szybkością 11,25 stopni Celsjusza na minutę i utrzymuj ją w temperaturze 250 stopni Celsjusza.Aby oddzielić nanocząstki, przyłóż magnes neodymowy na 30 minut. Aby granulować nanocząsteczki, wykonaj serię płukań przy użyciu 10 mililitrów przeznaczonego płynu myjącego i przykładając magnes neodymowy przez pięć minut. Usunąć filtrat i dodać 12 mililitrów 10 do minus dwóch molowych kwasów solnych.Odwirować zawiesinę i filtr o mocy 100 kilodaltonów przy 2 200 razy G przez 10 minut. Następnie ponownie zawieś nanocząstki w 10 mililitrach 10 do minus dwóch molowych kwasów solnych. Przygotować roztwór cząsteczki powlekającej zgodnie z opisem w manuskrypcie.Dodaj 10-mililitrową wodną dyspersję nanocząstek do roztworu cząsteczki powłoki w stosunku masowym pięć do jednego między cząsteczkami powłoki a nanocząstkami. Następnie mieszaj mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej za pomocą mieszadła magnetycznego. Po zakończeniu reakcji dostosować pH mieszaniny do siedmiu za pomocą jednego molowego wodorotlenku sodu.Gdy hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych osiągnie pięć pasaży i 90% zlewa się, usuń pożywkę i przepłucz komórki RPMI bez surowicy bez glutaminy. Do każdej kolby hodowlanej o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych dodaj 10 mililitrów zawiesiny nanocząstek. Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut.Następnie wyrzuć pożywkę zawierającą zawiesinę nanocząstek i przemyj komórki raz niezawierającym surowicy RPMI 1640. Dodaj DMEM uzupełniony 10% FBS i 1% penicyliną streptomycyną. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić pełną internalizację nanocząstek.Dodaj 10 mililitrów 0,05% trypsyny EDTA podgrzanej do 37 stopni Celsjusza do każdej kolby magnetycznie znakowanych MSC. Po dwóch do trzech minutach, gdy komórki zostaną odłączone, natychmiast dezaktywuj trypsynę, dodając jedną trzecią objętości wstępnie ostrzeżonego suplementu DMEM. Odwirować oderwane komórki w temperaturze 260 razy G przez pięć minut.Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w małej objętości pożywki do hodowli sferoidalnej o stężeniu około 200 000 komórek na 50 mikrolitrów. Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanej pożywki do hodowli sferoidalnych komórek do 15-mililitrowej sterylnej stożkowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj objętość zawiesiny komórek odpowiadającą 200 000 komórek.Odwiruj te magnetycznie znakowane komórki pod ciśnieniem 180 razy G przez trzy minuty, aby utworzyć osad komórek na dnie probówki. Następnie umieść probówkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, trzymając lekko uchyloną nasadkę w celu wymiany gazowej. Umieścić określoną objętość nanocząstki magnetycznej lub stałą zawiesinę sferoidalną z pojedynczą komórką w wibracyjnym magnetometrze próbki lub VSM uchwycie na próbkę.W razie potrzeby można użyć taśmy PTFE, aby zapobiec wyciekom. Włóż uchwyt próbki do VSM i zeskanuj w poszukiwaniu przesunięcia próbki. Umieścić próbkę w pozycji odpowiadającej maksimum namagnesowania.Wykonaj pierwszy pomiar przy niskim polu magnetycznym między minus 1 500 Oerstedów a dodatnim 1 500 Oerstedów z szybkością 20 Oerstedów na sekundę. Wykonaj drugi pomiar przy silnym polu magnetycznym między zerem Oerstedów a dodatnimi 30 000 Oerstedów z szybkością 200 Oerstedów na sekundę. W magnetometrze do próbek wibracyjnych zmierzono 10 mikrolitrów nanocząstek zdyspergowanych w roztworze wodnym.Nachylenie drugiej części krzywej jest stałą diamagnetyczną, reprezentującą sygnał diamagnetyczny z wody i uchwytu próbki. Ta stała diamagnetyczna została odjęta od momentu magnetycznego roztworu, aby uzyskać tylko moment magnetyczny nanocząstek. Następnie wyznaczono moment magnetyczny przy nasyceniu.Powlekane nanocząstki zostały zinternalizowane w komórkach macierzystych. Obrazy z mikroskopu elektronowego pokazują nanocząstki pokryte cytrynianem i PAA zamknięte w endosomach. Po granulowaniu komórek przez odwirowanie utworzyły sferoidę komórkową, która może być przechowywana w kulturze przez dłuższy czas.Poszczególne sferoidy komórkowe mierzono również za pomocą VSM, a moment magnetyczny nasycenia wykorzystano do obliczenia ilości nanocząstek w próbce komórkowej. Stwierdzono, że absorpcja nanocząstek zależy od ich stężenia w inkubacji. Spadek magnetyzmu sferoid komórkowych w czasie wskazywał na biodegradację nanocząstek, co zostało potwierdzone za pomocą mikroskopii elektronowej.Degradacja była bardziej znacząca w nanocząstkach pokrytych cytrynianem niż w nanocząstkach pokrytych PAA. Za pomocą magnetometrii można precyzyjnie określić ilościowo degradację nanocząstek magnetycznych w komórkach oraz ocenić wpływ przyszłości nanocząstek na zachowanie zainteresowanych surowcami. W tym protokole pomiary magnetometryczne zostały przeprowadzone na sferoidach komórkowych, ale można je rozszerzyć na komórki w zawiesinie lub na narządy.Dzięki opisanej metodzie jesteś w stanie badać interakcje nowo zaprojektowanych nanocząstek magnetycznych w różnych układach komórkowych będących przedmiotem zainteresowania, ale także możesz śledzić ich biodystrybucję i losy in vivo.

using-magnetometry-to-monitor-cellular-incorporation-subsequent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych przy użyciu zatwierdzonego przez FDA superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), ferumoksytolu (Feraheme). Ta technika obrazowania komórkowego, wykorzystująca obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) do wizualizacji, jest łatwo dostępna w celu długoterminowego monitorowania i diagnozowania pomyślnych lub nieudanych przeszczepów komórek macierzystych u pacjentów.

Znakowanie komórek macierzystych za pomocą ferumoksytolu, zatwierdzonej przez FDA nanocząsteczki tlenku żelaza

Źródło: Arias, S. L. i in. Wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstek tlenku żelaza. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje syntezę nanocząsteczek magnetytu in situ w bakteryjnej nanocelulozowej pelikule produkowanej przez Gluconacetobacter xylinus. Wyjaśnia, jak magnetyczna nanoceluloza bakteryjna powstaje poprzez infuzję jonów żelaza, wytrącanie alkaliczne oraz oczyszczanie.

Generowanie bakterialnych nanocelulozowych pelikuli osadzonych w magnetycie

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia magnetycznej bakteryjnej nanocelulozy (BNC) do zastosowań w rekonstrukcji uszkodzonych naczyń krwionośnych. BNC został zsyntetyzowany przez szczep G. xylinus. Z drugiej strony, namagnesowanie BNC zostało zrealizowane poprzez wytrącanie in situ jonów żelazawychFe2+ i Fe3+ wewnątrz siatki BNC.

Wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstkami tlenku żelaza

Ukierunkowane dostarczanie komórek jest przydatne w różnych zastosowaniach biomedycznych.  Celem tego protokołu jest wykorzystanie superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION) do znakowania komórek, a tym samym umożliwienie podejścia do magnetycznego celowania w komórki w celu uzyskania wysokiego stopnia kontroli nad dostarczaniem i lokalizacją komórek.

Znakowanie i celowanie w komórki za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza

Technologia mikrofalowa umożliwia niezwykle szybką syntezę nanocząsteczek tlenku żelaza w celu scharakteryzowania blaszek miażdżycowych. Zastosowanie aminobisfosfonianu w zewnętrznej stronie nanocząstki zapewnia szybką akumulację w obszarze miażdżycowym.

Synteza nanocząstek tlenku żelaza sterowana mikrofalami w celu szybkiego wykrywania miażdżycy

Przedstawiono protokół syntezy i kationizacji magnetoferytyny domieszkowanej kobaltem, a także metodę szybkiego magnesowania komórek macierzystych za pomocą kationizowanej magnetoferytyny.

Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

Opisujemy procedurę wykrywania pierwiastków chemicznych obecnych in situ w komórkach ludzkich, jak również ich kwantyfikację in vitro. Metoda ta jest odpowiednia dla każdego typu komórek i jest szczególnie przydatna do ilościowych analiz chemicznych w pojedynczych komórkach po ekspozycji na nanocząstki tlenku metalu in vitro.

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Ta praca opisuje protokoły przygotowania nanocząstek magnetycznych, ich powlekania SiO2, następnie funkcjonalizacji aminy (3-aminopropylo)trietoksysilanem (APTES) i jej koniugacji z deferoksaminą przy użyciu ugrupowania sukcynylu jako łącznika. Szczegółowo opisano również szczegółowy opis charakterystyki strukturalnej i test wychwytywania bakterii z użyciem Y. enterocolitica dla wszystkich nanocząstek pośrednich i końcowego koniugatu.

Synteza funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, ich koniugacja z sideroforem feroksaminą i jej ocena pod kątem wykrywania bakterii

W tej pracy dostarczamy protokół do biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów z przeciwciałami do określonego celowania w komórki. Na przykład wykorzystujemy nanodruty żelaza do celowania w komórki rakowe.

Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

Poniższe badanie ocenia profil toksykologiczny wybranego szkieletu metaloorganicznego za pomocą wykrywania impedancji ogniwa elektrycznego i substratu (ECIS), techniki badań przesiewowych w czasie rzeczywistym o wysokiej przepustowości.

Elektryczne wykrywanie podłoża komórkowego do oceny profili toksykologicznych struktury metaloorganicznej w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę syntezy nanocząstek tlenku żelaza i zastosowanie magnetometrii do monitorowania ich w komórkach macierzystych człowieka. Technika ta umożliwia badanie biotransformacji nanocząstek w układach biologicznych.

Wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza

Przeglądaj więcej filmów