Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

W przypadku ognisk chorób przenoszonych przez arbowirusy, przeciwdziałania ograniczają się głównie do zwalczania komarów. Analizy kompetencji wektora są zatem kluczowymi strategiami zapobiegawczymi, ponieważ pozwalają określić, które populacje i gatunki komarów mogą służyć jako wektory dla danego arbowirusa, a co za tym idzie, powinny stać się celem działań. Jednym z najważniejszych elementów naszego instrumentarium do oceny roli komarów oraz innych wektorów w przenoszeniu chorób zakaźnych jest badanie kompetencji wektora. Są to eksperymenty, w których możemy bardzo precyzyjnie kontrolować nie tylko gatunek komara lub kleszcza, ale także szczepy geograficzne, a także bardzo specyficzne szczepy różnych wirusów lub innych organizmów zakaźnych, aby uzyskać precyzyjne i dobrze kontrolowane dane na temat ryzyka przenoszenia różnych czynników przez poszczególne gatunki w konkretnych częściach świata. Praca z zakażonymi komarami wymaga specjalistycznych pomieszczeń, przeszkolenia, doświadczenia oraz starannego planowania, aby zminimalizować ryzyko dla eksperymentatora, a także ryzyko ucieczki zakażonego komara. Dlatego dla nowych osób w tych placówkach bardzo ważne jest, aby poświęcić czas na pracę z niezakażonymi komarami zasilanymi krwią, aby zapoznać się z technikami i przebiegiem pracy.

W dniu ekspozycji włącz zasilanie w pomieszczeniu do utrzymania stawonogów, aby wstępnie podgrzać jednostki karmiące. Połącz świeżo pobraną ludzką krew z cytratem lub heparyną z zapasem wirusa w stosunku objętości 1:1, a standardową jednostkę zbiornika o pojemności 3 ml przykryj skórą naiwnej, niezakażonej myszy. Umieść przykryty zbiornik na białych ręcznikach papierowych i dodaj do zbiornika około 2 ml zakaźnej krwi, dolewając ją partiami po 1 ml.

Następnie należy sprawdzić za pomocą ręczników papierowych, czy nie ma wycieków. Na 24 godziny przed przeprowadzeniem testu zakaźności należy przygotować 24-dołkowe płytki do hodowli komórek z komórkami Vero oraz opisać każdy dołek, podając tożsamość komara i próbki. W dniu, w którym komary zostaną poddane działaniu zakaźnego posiłku z krwi, należy usunąć nasączone wodą kulki waty i za pomocą przezroczystej plastikowej rękawicy ochronnej przymocować zbiorniki z syntetyczną krwią do przewodów jednostki karmiącej.

Umieścić tekturowe pudełko z zagłodzonymi komarami w komorze rękawicowej pod jednostką do karmienia. Po zakończeniu karmienia wyjąć zbiornik i zanurzyć go w świeżo przygotowanym 10% roztworze wybielacza. Wewnątrz komory rękawicowej przelać zimne, znieczulone komary do szalki Petriego umieszczonej na lodzie, a następnie oddzielić komary nasycone od nienasyconych.

Przenieś nasycone komary z powrotem do kartonowego pudełka, szybko przykrywając je siatką i pokrywą. Odetnij nadmiar siatki z krawędzi pudełka i zabezpiecz pokrywę taśmą. Do siatki dodaj kuleczkę waty nasączoną sterylnym filtrowanym 10% sucrose, a następnie umieść pudełko w dużym, plastikowym pojemniku zewnętrznym z wilgotną gąbką w celu utrzymania wilgotności.

Inkubować drugi pojemnik w temperaturze 27 °C, zapewniając komarom dostęp do sacharozy ad libitum do zakończenia eksperymentów. Użyć aspiratora mechanicznego, aby pobrać z kartonu określoną liczbę inkubowanych komarów, a następnie zamknąć probówkę zbiorczą krążkiem bawełnianym. Pracując w komorze z rękawicami, przelać zimne, znieczulone komary do szalki Petriego umieszczonej na lodzie.

Usuń wszystkie sześć odnóży każdego komara i umieść je w uprzednio oznakowanej probówce do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów, zawierającej sterylną kulkę łożyskową ze stali nierdzewnej oraz 500 µl medium do zbierania wydzieliny komarów, czyli MCM. Delikatnie umieść komara na kropli oleju mineralnego, dbając o to, aby olej nie miał kontaktu z głową ani trąbką owada. Wprowadź trąbkę do końcówki mikropipety wypełnionej 10 µl inaktywowanego termicznie FBS i pozostaw komara na 30 minut w celu pobrania śliny.

Wyrzuć końcówkę pipety z salivary do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 100 µL MCM, a odwłok umieść w osobnej probówce o średnicy 2 mm wraz ze sterylną stalową kulką i 500 µL MCM. Przenieś probówki do urządzenia do homogenizacji tkanek metodą rozcierania kulkowego w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie utrzyj wszystkie próbki ciała i odnóży przy częstotliwości 26 Hz przez pięć minut, aby uwolnić cząsteczki wirusa do nadsączu. Przejrzyść wszystkie próbki poprzez wirowanie przy 200 ×g przez pięć minut w celu osadzenia resztek komórkowych.

Bezpośrednio przed inokulacją próbkami usunąć medium z wcześniej przygotowanych komórek Vero. Ostrożnie odpipetować 100 µL sklarowanych naddatków z tułowi lub odnóży do każdej studni, dbając o to, aby nie zaburzyć osadu z resztek komórek komarów. Następnie inkubować płytki przez jedną godzinę.

Po inkubacji należy dodać jeden mililitr warstwy methylcelulozy do każdej dołki, a następnie umieścić płytki z powrotem w inkubatorze na okres od trzech do siedmiu dni. Wyjmij płytki z warstwą z inkubatora i przenieś je do komory z laminarnym przepływem powietrza. Usuń warstwę methylcelulozy do kuwety zawierającej 10% roztwór wybielacza, a następnie przemyj każdą dołkę dwukrotnie PBS, wylewając każdy z roztworów do kuwety.

Usunąć PBS, dodać jeden mililitr mieszaniny metanolu i acetonu do każdej studzienki i pozostawić komórki do utrwalenia na płytce na 30 minut. Następnie odlać utrwalacz i pozostawić płytki do wyschnięcia. Przemyć każdą studzienkę trzykrotnie niesterylnym PBS na orbitalnym kołysaczu do płytek przez 15 minut na każde płukanie, a następnie dodać jeden mililitr roztworu blokującego do każdej studzienki i kołysać płytką przez kolejne 15 minut.

Do każdej dołki należy dodać 100 µL przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko wirusowi Zika lub przeciwko flawiwirusom, a następnie inkubować płytkę z kołysaniem przez noc. Następnego dnia należy usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i powtórzyć etapy płukania w PBS. Po ostatnim płukaniu należy dodać 100 µL przeciwciał drugorzędowych i inkubować płytkę z kołysaniem przez jedną godzinę.

Powtórz płukanie buforem PBS, następnie dodaj 100 µL odczynnika do wywoływania substratu do każdej studzienki i inkubuj płytkę w pozycji poziomej, delikatnie nią kołysząc przez 15 minut. Po pojawieniu się ognisk lub plak przerwij reakcję, płucząc płytkę wodą z kranu. Odlej wodę z kranu i pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu, a następnie policz ogniska wirusowe, aby określić liczbę jednostek tworzących ogniska obecnych w danej próbce.

Trzy populacje komarów wystawiono na działanie szczepu wywołującego epidemię wirusa Zika w różnych mianach w posiłku krwi. Przez kolejne dwa tygodnie analizowano podgrupy komarów w celu określenia stopnia infekcji, dysseminacji oraz potencjalnego współczynnika transmisji. Przy niższych mianach w posiłku krwi, komary z Salvador w Brazylii zostały zainfekowane po 4, 10 i 14 dniach inkubacji zewnętrznej, przy czym w przebadanych odnóżach nie zaobserwowano oznak dysseminacji infekcji.

Przy najwyższym mianie wirusa wykryto go w odnóżach komarów, ale nie w ślinie. Komary z Dominikany okazały się najbardziej podatne na zakażenie i wykazały największą zdolność do transmisji przy wszystkich testowanych mianach w posiłkach krwi. U komarów karmionych wszystkimi trzema dawkami stwierdzono dysseminację do siódmego dnia oraz zdolność do transmisji w 14. dniu po zakażeniu.

Komary z doliny Rio Grande w Teksasie, narażone na niższe miana w posiłkach krwi, uległy zakażeniu już cztery dni po infekcji, natomiast zakażenia rozsiane stwierdzono po 14 dniach. W grupie narażonej na najwyższe miano zakażenie zaobserwowano począwszy od drugiego dnia po infekcji, a szczyty wystąpiły w 4., 10. i 14. dniu. Zakażenia rozsiane zaobserwowano w siódmym dniu, a jedynie jeden komar był zdolny do transmisji w 10. dniu.

Podczas realizacji tego protokołu kluczowe jest zachowanie zasad bezpieczeństwa, a nie szybkość pracy. Należy zatem zawsze obchodzić się z zarażonymi lub potencjalnie zarażonymi komarami wewnątrz komory rękawicowej lub komory bezpieczeństwa biologicznego, aż do momentu usunięcia im nóg lub skrzydeł. Podstawowy schemat badania kompetencji wektora można dostosować w celu uzyskania zarażonych komarów do dalszych analiz, takich jak badania transmisji, a także do badania interakcji między komarami, wirusem a mikrobiomem.

Kompetencja wektorowa od wielu dziesięcioleci stanowi niezwykle istotne narzędzie w rozumieniu roli komarów w transmisji wirusów podczas epidemii chorób wirusowych. Jest to jednak metoda, która ewoluowała na przestrzeni lat, włączając nowe informacje na temat interakcji między tymi wirusami a komarami pełniącymi rolę wektorów w miarę ich odkrywania. Podając dwa przykłady: genetyczna populacja wirusa oraz złożoność populacji wewnątrz komara okazują się być bardzo istotne dla jego zdolności do transmisji, a dzięki nowym metodom sekwencjonowania populacji wirusowej możemy obecnie uwzględniać te aspekty w badaniach nad kompetencją wektorową.

Wiemy obecnie również, że populacja bakterii i innych organizmów zamieszkujących przewód pokarmowy komara może mieć istotny wpływ na jego zdolność do transmisji, a populację tę możemy teraz oceniać za pomocą nowych metod sekwencjonowania. Zatem ocena kompetencji wektora jest metodą, która ewoluowała i nadal ewoluuje w miarę pogłębiania naszej wiedzy na temat tych złożonych interakcji.