Podejście laboratoryjne do specyficznego dla lokalizacji otworu bariery krew-mózg przy użyciu zogniskowanych ultradźwięków w modelu szczurzym

Skoncentrowane ultradźwięki z mikropęcherzykami mogą otworzyć barierę krew-mózg punktowo i przejściowo. Technika ta została wykorzystana do dostarczania szerokiej gamy środków przez barierę krew-mózg. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół miejscowego dostarczania do mózgu gryzonia z lub bez wskazówek MRI.

Skoncentrowane ultradźwięki w połączeniu z krążącymi mikropęcherzykami mogą być stosowane w celu zapewnienia tymczasowych milimetrowych otworów w barierze krew-mózg. Umożliwia to nieinwazyjne dostarczanie czynników krążących ogólnoustrojowo do docelowych obszarów mózgu. Na początek napełnij zatyczkę cewnika solą fizjologiczną i ogrzej ogon szczura lampą, uważając, aby nie przegrzać zwierzęcia.

Włóż cewnik do żył ogonowych o rozmiarze 24, który będzie używany do dostarczania mikropęcherzyków, niebieskiego barwnika Evansa, kontrastu MRI gadobutrolu w przypadku korzystania z MRI oraz czynnika eksperymentalnego, który Cię interesuje. Krew wypełni osłonkę, gdy dojdzie do uderzenia w żyłę. Powoli wyjmij igłę wewnętrzną, jednocześnie wpychając osłonkę głębiej do żyły.

Wkręć zatyczkę cewnika w koniec portu cewnika, gdy tylko port wypełni się krwią. Ostrożnie owiń taśmę laboratoryjną wokół cewnika i ogona, aby utrzymać go na miejscu, zaczynając od małego kawałka u góry i pracując w kierunku ogonowym. Pozostaw odsłonięty sam koniec zatyczki cewnika.

Podłącz linię anestezjologiczną do złącza anestezjologicznego na ramie stereotaktycznej. Następnie przymocuj głowę zwierzęcia do ramy, umieszczając pysk na drążku gryzowym, a następnie prowadząc nauszniki do obu kanałów słuchowych i dokręcając dociskowe. Przenieś zwierzę na łóżko do rezonansu magnetycznego.

Korzystając z parametrów opisanych w manuskrypcie tekstowym, zbierz koronalne i osiowe obrazy ważone T2, które obejmują cały mózg, a także odniesienie MRI do pomiarów współrzędnych. Na obrazach koronalnych znajdź obraz, na którym fiducial jest największy, wskazując środek fiducial. Zapisz odległość od szczytu kości odniesienia do obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania w milimetrach, zarówno w kierunku przyśrodkowo-bocznym, jak i grzbietowo-brzusznym.

Na obrazach osiowych znajdź obraz, który pokazuje samą górę powiernika i zapisz współrzędne X i Y dla środka odniesienia oraz współrzędne X i Y obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Oblicz odległość od środka powiernika do docelowego obszaru mózgu zarówno w kierunku rostralno-ogonowym, jak i przyśrodkowo-bocznym. Po zebraniu współrzędnych zbierz obrazy przed skanowaniem.

Trzymając zwierzę w tej stereotaktycznej ramie, szybko przetransportuj je z łóżka do rezonansu magnetycznego na stole FUS. Upewnij się, że zwierzę pozostaje w stanie snu pod wpływem znieczulenia. Wsuń ramkę do uchwytu ramy i mocno zatrzaśnij ją na swoim miejscu.

Użyj maszynki do strzyżenia, aby ogolić głowę zwierzęcia, a następnie zetrzyj nadmiar włosów i nałóż krem do depilacji na skórę głowy. Pozostaw na trzy minuty i wytrzyj wodą i gazą. Jeśli korzystasz z wskazówek MRI, przymocuj wskaźnik i przesuń wskaźnik do miejsca, w którym znajduje się punkt odniesienia MRI.

Umieść wskaźnik na samej górze i na środku odniesienia MRI, czyli punktu, od którego obliczono wszystkie odległości na obrazie MRI. Usuń wskaźnik i przesuń pozycjoner do współrzędnych przyśrodkowo-bocznych i współrzędnych rostralno-ogonowych. Polizaj przycisk pozycji zerowej i podnieś pozycjoner do góry, naciskając przycisk w górę 50, aby umożliwić umieszczenie kąpieli wodnej i żelu ultradźwiękowego.

Nałóż żel ultradźwiękowy na skórę głowy zwierzęcia i umieść kąpiel wodną na zwierzęciu, z okienkiem z taśmy poliimidowej dociśniętym do żelu, upewniając się, że w żelu nie ma pęcherzyków powietrza. Napełnij łaźnię wodną odgazowaną wodą. Jeśli używasz przetwornika dużej mocy, opuść pozycjoner tak, aby magnes znajdował się tuż nad wodą.

Przymocuj przetwornik do pozycjonera, ostrożnie opuszczając przetwornik do wody pod kątem i podłączając magnesy. Opuść pozycjoner do współrzędnej grzbietowo-brzusznej i włącz wzmacniacz mocy RF. Wstrzyknąć jeden mililitr na kilogram 3% niebieskiego barwnika Evans, wbijając końcówkę igły w zatyczkę cewnika i wstrzykując.

Całe zwierzę powinno stać się niebieskie w ciągu kilku sekund, co oznacza, że cewnik jest prawidłowo umieszczony w żyle ogonowej. Pozwól barwnikowi krążyć przez pięć minut, a następnie aktywuj mikropęcherzyki, potrząsając nimi gwałtownie wytrząsarką bąbelkową. Odwróć tę strzykawkę kilka razy, aby uzyskać równomierny rozkład mikropęcherzyków, a następnie podłącz i napełnij skrzydlaty zestaw do infuzji.

Umieść strzykawkę na pompie infuzyjnej i ustaw pompę infuzyjną tak, aby dostarczała 0,2 mililitra z szybkością sześciu mililitrów na godzinę, zapewniając powolny wlew mikropęcherzyków w ciągu dwóch minut ekspozycji na FUS. Wprowadzić igłę ze skrzydełkami do zatyczki cewnika. Najpierw uruchom pompę infuzyjną, odczekaj trzy sekundy, a następnie rozpocznij leczenie FUS, naciskając przycisk włączania i na generatorze funkcyjnym.

Powtórz to dwa razy na region z pięciominutową przerwą, aby mikropęcherzyki mogły się oczyścić. Ponownie nacisnąć przycisk włączania na generatorze funkcyjnym, aby zatrzymać leczenie FUS, gdy pompa infuzyjna zatrzyma się po dwóch minutach. Odczekaj pięć minut, aż mikropęcherzyki znikną, a następnie rozpocznij infuzję i drugi zabieg FUS.

Natychmiast po drugim zabiegu FUS wstrzyknąć kontrast gadobutrolu i interesujący nas środek. Łączna objętość dostarczonych środków nie powinna przekraczać pięciu mililitrów na kilogram. Aby potwierdzić otwarcie BBB, umieść zwierzę z powrotem na łóżku MRI dokładnie w tym samym miejscu i podłącz linię anestezjologiczną.

Zbierz skany końcowe MRI o tych samych parametrach obrazowania, co obrazy przed skanowaniem, aby potwierdzić poprawę MRI gadobutrol w regionie otwarcia BBB. Protokół ten został wykorzystany do wywołania miejscowego otwarcia bariery krew-mózg zarówno za pomocą przetwornika zanurzeniowego o małej mocy, jak i przetwornika ultradźwiękowego o dużej mocy. Po pierwsze, przetwornik zanurzeniowy o małej mocy został skierowany do przedniej lub przyśrodkowej półkuli mózgu.

Zwierzęta zostały uśmiercone z perfuzją lub bez, a otwór BBB uwidoczniono za pomocą autofluorescencji niebieskiego barwnika Evansa. W późniejszych eksperymentach przetwornik FUS był ukierunkowany na hipokamp lub przednią korę zakrętu obręczy. Oprócz niebieskiego barwnika Evansa, do weryfikacji docelowego otwarcia bariery krew-mózg w VIVO użyto środka kontrastowego MRI gadobutrolu.

Po tym, jak zwierzęta zostały złożone w ofierze, autofluorescencja niebieskiego barwnika Evansa potwierdziła miejsce otwarcia. Aby ocenić, czy technika ta może być wykorzystana do celowanego dostarczania genów, AAV 9 wyrażającego zielone białko fluorescencyjne i kontrast gadobutrolu wstrzyknięto natychmiast po otwarciu bariery krew-mózg w hipokampie. Zwierzę zostało zobrazowane w celu zweryfikowania otworu z kontrastem gadobutrolu.

Następnie dostarczenie genu zostało potwierdzone przez ekspresję GFP. Protokół ten oferuje laboratoryjne podejście do otwierania bariery krew-mózg za pośrednictwem MRI Focus Ultrasound, które może być łatwo dostosowane przez inne laboratoria w celu zapewnienia nieinwazyjnej translacyjnej alternatywy dla chirurgii stereotaktycznej.