Rekonstrukcja wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej

Tutaj prezentowany jest protokół do optycznego wyodrębniania i katalogowania wrodzonych sygnatur fluorescencji komórkowej (tj. autofluorescencji komórkowej) z każdej pojedynczej żywej komórki rozmieszczonej w przestrzeni trójwymiarowej. Metoda ta jest odpowiednia do badania wrodzonej sygnatury fluorescencyjnej różnych układów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki, w tym komórek bakterii, grzybów, drożdży, roślin i zwierząt.

Technika ta oferuje unikalne badania mające na celu udowodnienie tożsamości lub cech fizjologicznych komórki na poziomie pojedynczej komórki bez konieczności inwazyjnego znakowania. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że ułatwia ona rozdzielczość przestrzenną na poziomie pojedynczej komórki na potrzeby analizy oraz umożliwia rozróżnienie między procesem a procesem w tle. Tak więc ta technika może potencjalnie przyczynić się do identyfikacji i analizy fenotypowej drobnoustrojów chorobotwórczych.

Technika ta może być również stosowana do badania niejednorodności fenotypowej lub monitorowania stanu fizjologicznego populacji drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowania. Procedurę zademonstruje Kyosuke Takabe, adiunkt z mojego laboratorium. Konfokalna mikroskopia refleksyjna i wielokanałowa mikroskopia konfokalna.

Podłącz mikroskop konfokalny z zarysowanymi kanałami widmowymi do lampy fotopowielacza. Wyposaż mikroskop w obiektyw o dużej aperturze numerycznej, o odpowiednim powiększeniu. Wyposaż mikroskop w lustro półrefleksyjne, aby pomieścić konfokalną mikroskopię refleksyjną, która opiera się na rozproszeniu komórkowym padającego światła w celu wizualizacji morfologii komórek.

W przypadku wielokanałowej mikrospektroskopii konfokalnej należy wyposażyć mikroskop w zwierciadła dichroiczne i użyć miernika mocy lasera, aby dostosować intensywność oświetlenia dla każdej długości fali wzbudzenia. Następnie ustaw moc wyjściową pod mikroskopem tak, aby była stała na wszystkich długościach fal wzbudzenia. Aby zobrazować bakterie za pomocą mikroskopu, ustaw rozmiar otworu na 1,0 jednostki powierzchni w oprogramowaniu mikroskopu i ustaw czas przebywania piksela dla każdej długości fali wzbudzenia.

Ustaw rozdzielczość skanowania. W przypadku małych komórek, takich jak bakterie, użyj obszaru skanowania o wymiarach 1024 na 1024. Ustaw zakres Z-Scanning tak, aby obszar zainteresowania był pokryty.

Korzystając z okna spektralnego od 8 do 10 nanometrów, ustaw detektor D-Scan tak, aby rejestrował zakres widzialnych długości fal. Następnie uzyskaj wielokanałowe obrazy spektroskopii konfokalnej w sekwencji od najdłuższej do najkrótszej długości fali wzbudzenia, aby utworzyć stosy Z obrazów fluorescencyjnych i obrazy z konfokalnej mikroskopii refleksyjnej i zapisz obrazy w 16-bitowym formacie tiff. Aby przeprowadzić segmentację komórek i rekonstrukcję wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczej komórki, otwórz odpowiedni program do analizy obrazu i kliknij dwukrotnie, aby otworzyć jeden z dostarczonych skryptów.

Na karcie edytora kliknij przycisk Uruchom. Pojawi się okno wyboru folderu. Wybierz katalog, w którym zostały zapisane obrazy Z-Stack i kliknij przycisk Otwórz.

Automatycznie pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie parametru segmentacji. Ustaw próg binaryzacji obrazu na 0-1, binaryzację obrazu na 0,45, górny próg dla regionu komórki na 200, dolny próg dla obszaru komórki na 10, a liczbę detektorów na 32. Pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie liczby długości fal wzbudzenia.

Wprowadź liczbę długości fal używanych do akwizycji obrazu i kliknij przycisk OK. Pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie długości fal wzbudzenia. Wprowadź długości fal wzbudzenia w kolejności od najkrótszej do najdłuższej i kliknij OK.

Pojawi się nowe okno obrazu przedstawiające obraz z konfokalnej mikroskopii refleksyjnej. Wybierz dowolny obszar tła, który ma zostać użyty do odejmowania tła i narysuj prostokąt na obrazie mikroskopii konfokalnej odbicia. Kliknij dwukrotnie w wybranym regionie, aby potwierdzić wybór i zlokalizować nowy katalog o nazwie signature.

Aby wykonać techniki redukcji wymiarów, utwórz pusty katalog i nazwij go parent_directory. Zapisz sygnatury fluorescencyjne każdej z dwóch populacji komórek w dwóch oddzielnych katalogach i otwórz interfejs wiersza poleceń stacji roboczej. Wprowadź polecenie.

Po wyświetleniu opcji wybierz katalog docelowy wybierz parent_directory. Następnie w folderze parent_directory zlokalizuj PCA. png, który będzie zawierał wynikowy wykres analizy składowych głównych.

W tym miejscu pokazano typową jednokomórkową sygnaturę fluorescencyjną komórki bakteryjnej przedstawioną jako tradycyjny wykres widma i jako mapę cieplną. Na tym rysunku można zaobserwować niedokładną segmentację komórek 2D nałożoną na oryginalny obraz z mikroskopii konfokalnej odbiciowej populacji bakterii glebowych. Z uzyskanymi wrodzonymi sygnaturami fluorescencyjnymi dla populacji przedstawionymi jako mapa cieplna.

Należy zauważyć, że zmienność wewnątrz populacji była stosunkowo niewielka po udanej segmentacji komórek. Tutaj przykład niedokładnej segmentacji komórek jest pokazany super nałożony na tę samą populację P. putida, jak pokazano wcześniej. Wpływ niedokładnej segmentacji komórek na wrodzone sygnatury fluorescencyjne populacji jest łatwo widoczny na podstawie znacznej liczby wartości odstających zaobserwowanych na odpowiedniej mapie cieplnej.

Niedokładna segmentacja komórek skutkuje luźniejszym klastrem po analizie głównych składników w porównaniu z typem klastra uzyskanym po dokładnej segmentacji komórek. Pomimo niewielkich zmienności wrodzonej sygnatury fluorescencyjnej obserwowanych w poszczególnych szczepach bakterii, każda populacja tworzy odrębny klaster na wykresie analizy głównych składników. Na tym rysunku można zaobserwować niedokładną segmentację komórek 3D nałożoną na oryginalny obraz z mikroskopii konfokalnej odbiciowej populacji pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae YM4271.

Należy zwrócić uwagę na brak wartości odstających i wynikające z tego wrodzone sygnatury fluorescencyjne dla populacji. Istotne jest, aby uzyskać jak najbardziej czysty obraz za pomocą mikroskopii konfokalnej i uniknąć nasycenia intensywności sygnału, ponieważ szum może zepsuć dokładność późniejszej analizy. Modele uczenia maszynowego można trenować za pomocą wrodzonego zestawu danych podpisu zachodniego do użycia w zadaniach klasyfikacji lub przewidywania, oferując analizę populacji bez tagów i przewidywanie fenotypowe.