Name: Rekonstrukcja wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Odkryj metodę nieinwazyjnej analizy fluorescencji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia identyfikację mikroorganizmów bez znakowania i badanie ich różnorodności fenotypowej w zastosowaniach medycznych oraz ekologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez dotację na badania naukowe od Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu i Technologii Japonii (18K04843) dla Y. Yawata, JST ERATO (JPMJER1502) dla N. Nomury.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Umieścić szklaną lamellkę z nałożoną uszczelką silikonową o grubości 1 mm z wgłębieniami.</li>
	<li>W wgłębieniu uszczelki silikonowej umieścić plaster agarozy 0,8% (w/v) o grubości 1 mm.</li>
	<li>Rozcieńczyć gęstość komórek dowolnej hodowli mikroorganizmów do gęstości optycznej przy 60 nm (OD660) = 1,0.</li>
	<li>Nanieść 5 µL zawiesiny komórkowej na plaster agarozy.</li>
	<li>Ostrożnie przykryć szkiełkiem nakrywką.</li>
</ol>
2. Konfiguracja mikroskopu
UWAGA: Technika CRIF łączy konfokalną mikroskopię odbiciową (CRM) z wielokanałową konfokalną mikrospektroskopią. CRM służy jako źródło informacji o morfologii komórkowej i lokalizacji przestrzennej, niezależnie od naturalnej fluorescencji komórek. Wielokanałowa konfokalna mikrospektroskopia dostarcza informacji widmowych dotyczących naturalnej fluorescencji komórkowej. W poniższym protokole każdy obraz uzyskany za pomocą CRM lub konfokalnej mikrospektroskopii fluorescencyjnej określany jest odpowiednio jako obraz CRM lub obraz z wielokanałowej konfokalnej mikrospektroskopii.
<ol>
	<li>Podłącz mikroskop konfokalny z odfiltrowanymi kanałami widmowymi do fotopowielacza (PMT) lub detektora GaAsP. 
	UWAGA: Takie konfiguracje są dostępne u kilku producentów.</li>
	<li>Wyposaż mikroskop w obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej (NA) i odpowiednim powiększeniu. 
	UWAGA: Do analizy komórek bakteryjnych zaleca się obiektyw 63x z NA &gt; 1.4.</li>
	<li>Wyposaż mikroskop w lustro półprzepuszczalne (np. NT 80/20), aby umożliwić stosowanie CRM, która opiera się na rozproszeniu światła padającego przez komórki w celu wizualizacji morfologii komórek.</li>
	<li>W przypadku wielokanałowej mikrospektroskopii konfokalnej wyposaż mikroskop w lustra dichroiczne. Na przykład użyj dzielników wiązki MBS InVis405, MBS458, MBS48, MBS458/514, MBS48/543 lub MBS 48/543/63 odpowiednio dla wzbudzenia przy 405, 458, 48, 514, 543 lub 63 nm.</li>
	<li>Dostosuj intensywność oświetlenia dla każdej długości fali wzbudzenia za pomocą miernika mocy lasera. Utrzymuj stałą moc wyjściową pod mikroskopem dla wszystkich długości fal wzbudzenia (np. stosując 50 µW przy obiektywie 63x).</li>
</ol>
3. Pozyskiwanie obrazów
<ol>
	<li>Ustaw rozmiar otworu (pinhole) na 1 AU za pomocą oprogramowania mikroskopu.</li>
	<li>Ustaw czas przebywania piksela (tj. prędkość skanowania) dla każdej długości fali wzbudzenia. 
	UWAGA: Nadmiernie długi czas przebywania piksela może uszkodzić komórki. Należy unikać zbyt długiego czasu przebywania piksela, aby zminimalizować fotouszkodzenia komórek. Dla próbek bakteryjnych czas przebywania piksela &lt;55,6 µs/µm2 (przy natężeniu promieniowania pod mikroskopem ok. 17 µW/cm2) jest zazwyczaj odpowiedni, aby uniknąć zahamowania wzrostu. Parametr ten może się różnić w zależności od organizmów i konfiguracji doświadczalnej.</li>
	<li>Ustaw rozdzielczość skanowania. W przypadku małych komórek, takich jak bakterie, należy zastosować obszar skanowania 1 024 x 1 024.</li>
	<li>Ustaw zakres skanowania w osi Z tak, aby objął obszar zainteresowania. 
	UWAGA: Dla próbek komórek bakteryjnych i drożdżowych rozmieszczonych na płytce agarowej zakres skanowania Z rzędu ~15 µm jest zazwyczaj wystarczający.</li>
	<li>Ustaw detektor deskanowany tak, aby rejestrował widzialny zakres fal (np. 416−691 nm). Zastosuj okno spektralne 8−10 nm.</li>
	<li>Pozyskaj wielokanałowe obrazy mikrospektroskopii konfokalnej w sekwencji od najdłuższych do najkrótszych długości fal wzbudzenia, aby stworzyć stosy Z (Z-stacks) obrazów fluorescencyjnych.</li>
	<li>Pozyskaj obrazy CRM.</li>
	<li>Zapisz pozyskane obrazy jako 16-bitowe pliki tiff w katalogu. Nazwij pliki zgodnie z konwencją XXXcYYzZZ.tif, gdzie XXX to długość fali wzbudzenia, YY to numer kanału detektora, ZZ to numer przekroju Z, a „c” i „z” to prefiksy odpowiednio dla numeru detektora i numeru przekroju Z.
	<ol>
		<li>Na przykład, jeśli wielokanałowy obraz mikrospektroskopii konfokalnej zostanie wykonany przy długości fali wzbudzenia 405 nm, przy użyciu 1.szego kanału macierzy detektorów i jest to 5.ty przekrój stosu Z, nazwij go „405c01z05.tif”. W przypadku obrazów CRM użyj ciągu „CRM” zamiast XXX (np. „CRMc01z05.tif”). 
		UWAGA: Zdecyduj, czy segmentacja 2D czy 3D jest bardziej odpowiednia dla danych obrazowych. Metody segmentacji 2D stosuj w sytuacjach, gdy małe komórki są ograniczone do płaszczyzny 2D (np. populacja bakterii przylegająca do powierzchni szkła). Metody segmentacji 3D stosuj w sytuacjach, gdy populacja komórek jest rozmieszczona w przestrzeni trójwymiarowej (np. biofilmy i próbki tkanek) lub gdy rozmiary komórek są większe niż grubość przekroju optycznego (np. komórki drożdży, komórki ssaków). W celu wykonania segmentacji 2D przejdź do sekcji 4; w celu wykonania segmentacji 3D przejdź do sekcji 5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazów 2D
<ol>
	<li>Wyposażyć stanowisko pracy w oprogramowanie do analizy obrazu (np. MATLAB).</li>
	<li>Przeprowadzić segmentację komórek i rekonstrukcję sygnatur fluorescencji wrodzonej dla pojedynczych komórek.
	<ol>
		<li>Uruchomić oprogramowanie do analizy obrazu.</li>
		<li>Dwukrotnie kliknąć i otworzyć jeden z dostarczonych skryptów „Script2D.m”.</li>
		<li>Przejść do karty Editor, a następnie kliknąć Run. Powinno pojawić się okno wyboru folderu.</li>
		<li>Wybrać katalog utworzony w kroku 3.8, a następnie kliknąć Open, aby kontynuować. Automatycznie pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie parametru segmentacji. 
		UWAGA: W celach testowych należy wybrać dostarczony zestaw danych („Sample_2D”). Przykładowy zestaw danych jest dostarczony jako plik skompresowany i powinien zostać wcześniej rozpakowany.</li>
		<li>Wprowadzić parametry segmentacji: Threshold of Image Binarization (0−1) dla binaryzacji obrazu = 0.45, Upper Threshold For A Cell Region (in pixels) = 200, Lower Threshold for a Cell Region (in pixels) = 10 oraz The Number of Detectors = 32. Kliknąć OK, aby kontynuować. 
		UWAGA: Parametry te mogą wymagać dostrojenia w zależności od jakości obrazu.</li>
		<li>Powinno pojawić się nowe okno obrazu prezentujące obraz CRM. Wybrać dowolny obszar tła (tj. obszar, w którym nie ma komórek), aby użyć go do odejmowania tła. Narysować prostokąt w obrazie CRM, przeciągając myszą. Dwukrotnie kliknąć w wybranym obszarze, aby zatwierdzić wybór.</li>
		<li>Znaleźć nowy katalog o nazwie Signature w tym samym katalogu, który wybrano w kroku 4.2.4. 
		UWAGA: Dostarczony kod automatycznie tworzy ten katalog. Katalog „Signature” przechowuje sygnatury fluorescencji wrodzonej każdej komórki drobnoustrojowej w populacji jako pliki .png, które są ponumerowane szeregowo po wspólnym prefiksie „Signature”.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza obrazu 3D
<ol>
	<li>Wyposażyć stanowisko pracy w oprogramowanie do analizy obrazu (Tabela materiałów).</li>
	<li>Przeprowadzić segmentację komórek i rekonstrukcję sygnatur fluorescencji wrodzonej pojedynczych komórek.
	<ol>
		<li>Uruchomić oprogramowanie do analizy obrazu.</li>
		<li>Dwukrotnie kliknąć i otworzyć dostarczony skrypt „Script3D.m”.</li>
		<li>Przejść do karty Editor, a następnie kliknąć Run. Powinno pojawić się okno wyboru folderu.</li>
		<li>Wybrać katalog utworzony w kroku 3.8, a następnie kliknąć Open, aby kontynuować. Automatycznie pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie parametrów segmentacji. 
		UWAGA: W celach testowych należy wybrać dostarczony zestaw danych („Sample_3D”). Przykładowy zestaw danych jest dostarczony jako plik skompresowany i powinien zostać wcześniej rozpakowany.</li>
		<li>Wprowadzić parametry segmentacji: Threshold of Image Binarization (0–1) dla binaryzacji obrazu = 0.01, Upper Threshold for a Cell Volume (in pixels) = 1,0, Lower Threshold for a Cell Region (in pixels) = 20, X Pixel Size [μm/pixel] = 0.26, Y Pixel Size [μm/pixel] = 0.26, Z pixel Size [μm/pixel] = 0.42 oraz The Number of Detectors = 32. Kliknąć OK, aby kontynuować; pojawi się okno dialogowe z prośbą o podanie liczby długości fal wzbudzenia. 
		UWAGA: Parametry te mogą wymagać dostosowania w zależności od jakości obrazu.</li>
		<li>Wprowadzić liczbę długości fal użytych do akwizycji obrazu (np. jeśli użyto 405, 48, 561, 630, wpisać 4 w oknie dialogowym). Kliknąć OK.</li>
		<li>Wprowadzić długości fal wzbudzenia w kolejności od najkrótszej (tj. nazwa pola: Excitation No. 1) do najdłuższej do okien dialogowych. Kliknąć OK, aby kontynuować; powinno wyskoczyć nowe okno obrazu prezentujące obraz CRM.</li>
		<li>Wybrać dowolny obszar tła (tj. obszar pozbawiony komórek), który zostanie użyty do odjęcia tła. Przeciągnąć myszą prostokąt w obrębie obrazu CRM. Dwukrotnie kliknąć wewnątrz wybranego obszaru, aby potwierdzić wybór.</li>
		<li>Znaleźć katalog o nazwie Signature w katalogu wybranym w kroku 5.2.4. 
		UWAGA: Dostarczony kod automatycznie tworzy ten katalog. Katalog „Signature” przechowuje sygnaturę fluorescencji wrodzonej każdej pojedynczej komórki mikrobiologicznej w populacji w formie plików .png, które są numerowane szeregowo po wspólnym prefiksie „Signature”.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
UWAGA: Należy zastosować techniki redukcji wymiarowości (np. analizę głównych składowych [PCA]), aby zwizualizować rozkład hiperspektrów populacji komórkowych. Dostarczony skrypt (PCA.py) wykonuje PCA dla dwóch populacji komórek (tj. dwóch klas).
<ol>
	<li>Wyposażyć stanowisko robocze w język programowania oraz towarzyszące mu biblioteki i moduły (Tabela materiałów).</li>
	<li>Utwórz pusty katalog na dysku C (lub równoważnym) i nazwij go „Katalog nadrzędny” (tj. C:/ katalog nadrzędny).</li>
	<li>Zapisz sygnatury fluorescencyjne (np. pliki .png wygenerowane w kroku 4.2.7) dla każdej z dwóch populacji komórek w dwóch osobnych katalogach. 
	UWAGA: Oba katalogi powinny znajdować się w „Katalog nadrzędny”. 
	 
	C:/Katalog_nadrzędny/ 
	<img alt="Konsekwencja logiczna, symbol turnstile, notacja matematyczna stosowana w formalnych dowodach logicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="rycina 12">putidaKT240/ 
	<img alt="Równanie równowagi statycznej, ΣFx=0, schemat, koncepcja sił zrównoważonych w mechanice." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="rycina 13"> <img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; schemat; równania, analiza bilansu sił, rozkład wektorowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="rycina 9"> Podpis01.png 
	<img alt="Równanie równowagi statycznej, ΣFx=0, schemat, koncepcja sił zrównoważonych w mechanice." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="rysunek 14"> <img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; schemat; równania, analiza bilansu sił, rozkład wektorowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="rysunek 10"> Podpis02.png 
	<img alt="Równanie stanu równowagi statycznej, ΣFx=0, schemat, koncepcja sił zrównoważonych w mechanice." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="obraz 4"> <img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; schemat; równania, analiza bilansu sił, rozkład wektorowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="rysunek 1"> : 
	<img alt="Konsekwencja logiczna, symbol turnstile, notacja matematyczna stosowana w formalnych dowodach logicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="rycina 5">putidaKT242/ 
	 <img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; diagram; równania, analiza bilansu sił, rozkład wektorowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="rycina 6"> Podpis01.png 
	 <img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; schemat; równania, analiza bilansu sił, rozkład wektorów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="obraz 7"> Podpis02.png 
	 <img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; diagram; równania, analiza bilansu sił, rozkład wektorowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="rycina 8"> :</li>
	<li>Pobierz PCA.py do „Katalog nadrzędny”.</li>
	<li>Otwórz wiersz poleceń stacji roboczej.</li>
	<li>Wpisz „python C:/Parent_directory/PCA.py„ w interfejsie wiersza poleceń.</li>
	<li>Wybierz „Katalog nadrzędnypo komunikacie „Wybierz katalog docelowyjest wyświetlane.</li>
	<li>W sekcji „C:/Katalog_nadrzędny”, znajdź “Analiza głównych składowych (PCA).png”, w którym znajduje się wynikowy wykres PCA. </li>
</ol>

<ol><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microbial metabolomics.</a> Current Genomics. 12, 391-403 (2011).</li>
<li>Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Then+and+now%3A+use+of+16S+rDNA+gene+sequencing+for+bacterial+identification+and+discovery+of+novel+bacteria+in+clinical+microbiology+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories.</a> Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).</li>
<li>Amman, R., Fuchs, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+identification+in+microbial+communities+by+improved+fluorescence+in+situ+hybridization+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques.</a> Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).</li>
<li>Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacterial+species+by+fluorescence+spectroscopy+and+classification+through+principal+components+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis.</a> Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).</li>
<li>Leblanc, L., Dufour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+identity+of+bacteria+using+their+intrinsic+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence.</a> FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).</li>
<li>Hou, X., Liu, S., Feng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autofluorescence+characteristics+of+bacterial+intracellular+and+extracellular+substances+during+the+operation+of+anammox+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor.</a> Scientific Reports. 7, 39289(2017).</li>
<li>Ramanujam, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diagnosis+of+cervical+intraepithelial+neoplasia+using+337-nm-excited+laser-induced+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence.</a> Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).</li>
<li>Zhang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+cellular+fluorescence+reflects+alterations+in+cellular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).</li>
<li>Gosnell, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+non-invasive+cell+characterisation+and+discrimination+based+on+multispectral+autofluorescence+features%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features.</a> Scientific Reports. 6, 23453(2016).</li>
<li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interspecies+variability+of+single-cell+innate+fluorescence+signature+of+microbial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).</li>
<li>Nelson, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+and+comparative+analysis+of+the+metabolically+versatile+Pseudomonas+putida+KT2440%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).</li>
<li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range%2C+high+copy+number%2C+RSF1010-derived+vectors%2C+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li>
<li>Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+analysis+of+DNA-binding+proteins+by+yeast+one-hybrid+and+one-two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems.</a> Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).</li>
<li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+biofilm+development+in+a+microfluidic+device+using+modified+confocal+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy.+Third+edition%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition</a>. , Springer. Germany. (2006).</li>
<li>Blacker, T. S., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+state+using+NADH+and+NADPH+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence.</a> Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).</li>
<li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+spectroscopy+and+imaging%3A+A+tool+for+biomedical+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tej metodzie istnieją dwa krytyczne punkty, których należy ściśle przestrzegać, aby uzyskać powtarzalne wyniki: 1) utrzymanie stałej mocy wyjściowej lasera pod obiektywem mikroskopu poprzez długości fal wzbudzenia i eksperymenty oraz 2) przeprowadzenie dokładnej segmentacji komórek.
Pierwszy punkt jest szczególnie ważny przy porównywaniu wrodzonej sygnatury fluorescencji w różnych eksperymentach. Unikaj po prostu stosowania tych samych ustawień "procentu mocy" do długości fal wzbudzenia (tj....

Różnorodne biomolekuły w komórce1 emitują sygnały autofluorescencji, a wrodzona sygnatura fluorescencji komórki składa się z połączenia tych sygnałów. Ta charakterystyczna fluorescencja odzwierciedla różne właściwości komórkowe, a także różnice w stanie fizjologicznym. Analiza fluorescencji wrodzonej jest minimalnie inwazyjna i może uzupełniać tradycyjne, bardziej inwazyjne sondy mikrobiologiczne, które pozostawiają szereg śladów od łagodnej modyfikacji metabolicznej do całkowitego zniszczenia komórek. Podczas gdy tradycyjne techniki, takie jak ekstrakcja DNA lub zawartości komórki2,3, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ4 oraz wprowadzenie fluorescencyjnych genów reporterowych do genomu są skuteczne w określaniu typu komórki lub stanu fizjologicznego, zwykle wymagają one albo manipulacji komórkami, albo inwazyjnego znakowania.
Badania wrodzonej fluorescencji różnych żywych i nienaruszonych kolonii drobnoustrojów, w tym zawiesin masowych kultur drobnoustrojów5,6, aktywne szlamy7, ssaki tkanki8,9 i komórki ssaków1,10wykazały, że analiza fluorescencji wrodzonej ułatwia analizę typów komórek i stanu fizjologicznego bez znaczników. Wrodzone sygnatury fluorescencji były tradycyjnie analizowane na poziomie populacji, a nie na poziomie pojedynczej komórki, a zatem wymagają hodowli klonalnej. W przeciwieństwie do tego, opisana tutaj technika analizy pojedynczej komórki wspomaganejmikroskopią reflekcyjną (CRIF)11 rekonstruuje i kataloguje wrodzoną sygnaturę fluorescencji komórkowej każdej pojedynczej żywej komórki drobnoustroju. Co więcej, CRIF może systematycznie zestawiać wrodzoną sygnaturę fluorescencyjną pojedynczej komórki drobnoustroju w populacji, która jest rozmieszczona w przestrzeni trójwymiarowej (3D).

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Wako Chemicals</td><td>312-01193</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacze wiązki</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 lub MBS 488/543/633 rozdzielacze wiązki (Carl Zeiss)</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Matsunami Glass</td><td>C024601</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>szklane Matsunami Szkło</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>Lustro półrefleksyjne</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>NT80/20</td></tr><tr><td>Laserowy miernik mocy</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>PM400 (konsola miernika mocy) i S175C (czujnik)</td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Nacalai tesque</td><td>20066-95</td><td>Do hodowli bakterii</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>The MathWorks</td><td></td><td>MATLAB wersja 2019a lub nowsza, wymagany jest Image Processing Toolbox</td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopu</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td>440762-9904</td><td>np. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie mikroskopowe</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako Chemicals</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Język</td><td></td><td></td> <td>programowaniaPython i biblioteki, moduły (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) są wymagane do uruchomienia dostarczonego skryptu PCA.</td></tr><tr><td>Uszczelka silikonowa</td><td>Stacja</td><td></td> robocza ThermoFisher Scientific P24744 <td></td></tr><tr><td>Zalecana jest stacja robocza o wysokiej wydajności z dyskretnymi procesorami graficznymi.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza (YPD) pożywka agarowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1500-250G</td><td>Do hodowli drożdży</td></tr><tr><td>YPD podłoże</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375-250G</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstrukcja wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Opisana tutaj jest analiza wrodzonej fluorescencji pojedynczej komórki wspomagana mikroskopią refleksyjną (CRIF), minimalnie inwazyjna metoda rekonstrukcji wrodzonej sygnatury fluorescencji komórkowej z każdej pojedynczej żywej komórki w populacji rozmieszczonej w przestrzeni trójwymiarowej (3D). Wrodzona sygnatura fluorescencyjna komórki to zbiór sygnałów fluorescencyjnych emitowanych przez różne biomolekuły w komórce. Wcześniejsze badania wykazały, że wrodzone sygnatury fluorescencyjne odzwierciedlają różne właściwości komórkowe i różnice w stanie fizjologicznym oraz są bogatym źródłem informacji do charakterystyki i identyfikacji komórek. Wrodzone sygnatury fluorescencji były tradycyjnie analizowane na poziomie populacji, co wymagało hodowli klonalnej, ale nie na poziomie pojedynczej komórki. CRIF jest szczególnie przydatny do badań, które wymagają rozdzielczości 3D i/lub selektywnej ekstrakcji sygnałów fluorescencyjnych z pojedynczych komórek. Ponieważ sygnatura fluorescencyjna jest wrodzoną właściwością komórki, CRIF nadaje się również do bezznacznikowego przewidywania typu i/lub stanu fizjologicznego nienaruszonych i pojedynczych komórek. Metoda ta może być potężnym narzędziem do usprawnionej analizy komórek, w której fenotyp każdej pojedynczej komórki w heterogenicznej populacji może być bezpośrednio oceniany na podstawie jej sygnatury autofluorescencyjnej pod mikroskopem bez znakowania komórek.

Rysunek 1A przedstawia typową sygnaturę fluorescencji pojedynczej komórki bakteryjnej w formie tradycyjnego wykresu widma (góra) oraz mapy ciepła (środek). Rysunek 1B pokazuje wynik dokładnej segmentacji komórek 2D nałożonej na oryginalny obraz CRM populacji bakterii glebowych (Pseudomonas putida KT2440)12. Uzyskane wrodzone sygnatury fluorescencji dla tej populacji przedstawiono jako mapę ciepła na Rysunku 1...

Tutaj prezentowany jest protokół do optycznego wyodrębniania i katalogowania wrodzonych sygnatur fluorescencji komórkowej (tj. autofluorescencji komórkowej) z każdej pojedynczej żywej komórki rozmieszczonej w przestrzeni trójwymiarowej. Metoda ta jest odpowiednia do badania wrodzonej sygnatury fluorescencyjnej różnych układów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki, w tym komórek bakterii, grzybów, drożdży, roślin i zwierząt.

Rekonstrukcja wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Technika ta oferuje unikalne badania mające na celu udowodnienie tożsamości lub cech fizjologicznych komórki na poziomie pojedynczej komórki bez konieczności inwazyjnego znakowania. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że ułatwia ona rozdzielczość przestrzenną na poziomie pojedynczej komórki na potrzeby analizy oraz umożliwia rozróżnienie między procesem a procesem w tle. Tak więc ta technika może potencjalnie przyczynić się do identyfikacji i analizy fenotypowej drobnoustrojów chorobotwórczych.Technika ta może być również stosowana do badania niejednorodności fenotypowej lub monitorowania stanu fizjologicznego populacji drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowania. Procedurę zademonstruje Kyosuke Takabe, adiunkt z mojego laboratorium. Konfokalna mikroskopia refleksyjna i wielokanałowa mikroskopia konfokalna.Podłącz mikroskop konfokalny z zarysowanymi kanałami widmowymi do lampy fotopowielacza. Wyposaż mikroskop w obiektyw o dużej aperturze numerycznej, o odpowiednim powiększeniu. Wyposaż mikroskop w lustro półrefleksyjne, aby pomieścić konfokalną mikroskopię refleksyjną, która opiera się na rozproszeniu komórkowym padającego światła w celu wizualizacji morfologii komórek.W przypadku wielokanałowej mikrospektroskopii konfokalnej należy wyposażyć mikroskop w zwierciadła dichroiczne i użyć miernika mocy lasera, aby dostosować intensywność oświetlenia dla każdej długości fali wzbudzenia. Następnie ustaw moc wyjściową pod mikroskopem tak, aby była stała na wszystkich długościach fal wzbudzenia. Aby zobrazować bakterie za pomocą mikroskopu, ustaw rozmiar otworu na 1,0 jednostki powierzchni w oprogramowaniu mikroskopu i ustaw czas przebywania piksela dla każdej długości fali wzbudzenia.Ustaw rozdzielczość skanowania. W przypadku małych komórek, takich jak bakterie, użyj obszaru skanowania o wymiarach 1024 na 1024. Ustaw zakres Z-Scanning tak, aby obszar zainteresowania był pokryty.Korzystając z okna spektralnego od 8 do 10 nanometrów, ustaw detektor D-Scan tak, aby rejestrował zakres widzialnych długości fal. Następnie uzyskaj wielokanałowe obrazy spektroskopii konfokalnej w sekwencji od najdłuższej do najkrótszej długości fali wzbudzenia, aby utworzyć stosy Z obrazów fluorescencyjnych i obrazy z konfokalnej mikroskopii refleksyjnej i zapisz obrazy w 16-bitowym formacie tiff. Aby przeprowadzić segmentację komórek i rekonstrukcję wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczej komórki, otwórz odpowiedni program do analizy obrazu i kliknij dwukrotnie, aby otworzyć jeden z dostarczonych skryptów.Na karcie edytora kliknij przycisk Uruchom. Pojawi się okno wyboru folderu. Wybierz katalog, w którym zostały zapisane obrazy Z-Stack i kliknij przycisk Otwórz.Automatycznie pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie parametru segmentacji. Ustaw próg binaryzacji obrazu na 0-1, binaryzację obrazu na 0,45, górny próg dla regionu komórki na 200, dolny próg dla obszaru komórki na 10, a liczbę detektorów na 32. Pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie liczby długości fal wzbudzenia.Wprowadź liczbę długości fal używanych do akwizycji obrazu i kliknij przycisk OK. Pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie długości fal wzbudzenia. Wprowadź długości fal wzbudzenia w kolejności od najkrótszej do najdłuższej i kliknij OK.Pojawi się nowe okno obrazu przedstawiające obraz z konfokalnej mikroskopii refleksyjnej. Wybierz dowolny obszar tła, który ma zostać użyty do odejmowania tła i narysuj prostokąt na obrazie mikroskopii konfokalnej odbicia. Kliknij dwukrotnie w wybranym regionie, aby potwierdzić wybór i zlokalizować nowy katalog o nazwie signature.Aby wykonać techniki redukcji wymiarów, utwórz pusty katalog i nazwij go parent_directory. Zapisz sygnatury fluorescencyjne każdej z dwóch populacji komórek w dwóch oddzielnych katalogach i otwórz interfejs wiersza poleceń stacji roboczej. Wprowadź polecenie.Po wyświetleniu opcji wybierz katalog docelowy wybierz parent_directory. Następnie w folderze parent_directory zlokalizuj PCA. png, który będzie zawierał wynikowy wykres analizy składowych głównych.W tym miejscu pokazano typową jednokomórkową sygnaturę fluorescencyjną komórki bakteryjnej przedstawioną jako tradycyjny wykres widma i jako mapę cieplną. Na tym rysunku można zaobserwować niedokładną segmentację komórek 2D nałożoną na oryginalny obraz z mikroskopii konfokalnej odbiciowej populacji bakterii glebowych. Z uzyskanymi wrodzonymi sygnaturami fluorescencyjnymi dla populacji przedstawionymi jako mapa cieplna.Należy zauważyć, że zmienność wewnątrz populacji była stosunkowo niewielka po udanej segmentacji komórek. Tutaj przykład niedokładnej segmentacji komórek jest pokazany super nałożony na tę samą populację P. putida, jak pokazano wcześniej. Wpływ niedokładnej segmentacji komórek na wrodzone sygnatury fluorescencyjne populacji jest łatwo widoczny na podstawie znacznej liczby wartości odstających zaobserwowanych na odpowiedniej mapie cieplnej.Niedokładna segmentacja komórek skutkuje luźniejszym klastrem po analizie głównych składników w porównaniu z typem klastra uzyskanym po dokładnej segmentacji komórek. Pomimo niewielkich zmienności wrodzonej sygnatury fluorescencyjnej obserwowanych w poszczególnych szczepach bakterii, każda populacja tworzy odrębny klaster na wykresie analizy głównych składników. Na tym rysunku można zaobserwować niedokładną segmentację komórek 3D nałożoną na oryginalny obraz z mikroskopii konfokalnej odbiciowej populacji pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae YM4271.Należy zwrócić uwagę na brak wartości odstających i wynikające z tego wrodzone sygnatury fluorescencyjne dla populacji. Istotne jest, aby uzyskać jak najbardziej czysty obraz za pomocą mikroskopii konfokalnej i uniknąć nasycenia intensywności sygnału, ponieważ szum może zepsuć dokładność późniejszej analizy. Modele uczenia maszynowego można trenować za pomocą wrodzonego zestawu danych podpisu zachodniego do użycia w zadaniach klasyfikacji lub przewidywania, oferując analizę populacji bez tagów i przewidywanie fenotypowe.

reconstruction-single-cell-innate-fluorescence-signatures-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Przeciwciała, które wiążą się z docelowymi receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany konformacji i grupowania. Te dynamiczne zmiany mają implikacje dla charakterystyki rozwoju leków w komórkach docelowych. Protokół ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną i spektroskopię korelacji obrazów za pomocą ImageJ/FIJI w celu ilościowego określenia zakresu grupowania receptorów na powierzchni komórki.

Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Opisujemy metodę obrazowania w celu określenia średniego stanu oligomerów receptora znakowanego mEGFP, indukowanego przez wiązanie ligandów w błonie komórkowej żywych komórek. Protokół opiera się na mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonej z analizą liczby i jasności (N&amp;B).

Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Odkryj metodę nieinwazyjnej analizy fluorescencji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia identyfikację mikroorganizmów bez znakowania i badanie ich różnorodności fenotypowej w zastosowaniach medycznych oraz ekologicznych.

Rekonstrukcja wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów