Rekonstrukcja wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej
27 maja 2020
Tutaj prezentowany jest protokół do optycznego wyodrębniania i katalogowania wrodzonych sygnatur fluorescencji komórkowej (tj. autofluorescencji komórkowej) z każdej pojedynczej żywej komórki rozmieszczonej w przestrzeni trójwymiarowej. Metoda ta jest odpowiednia do badania wrodzonej sygnatury fluorescencyjnej różnych układów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki, w tym komórek bakterii, grzybów, drożdży, roślin i zwierząt.
Technika ta oferuje unikalne badania mające na celu udowodnienie tożsamości lub cech fizjologicznych komórki na poziomie pojedynczej komórki bez konieczności inwazyjnego znakowania. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że ułatwia ona rozdzielczość przestrzenną na poziomie pojedynczej komórki na potrzeby analizy oraz umożliwia rozróżnienie między procesem a procesem w tle. Tak więc ta technika może potencjalnie przyczynić się do identyfikacji i analizy fenotypowej drobnoustrojów chorobotwórczych.
Technika ta może być również stosowana do badania niejednorodności fenotypowej lub monitorowania stanu fizjologicznego populacji drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowania. Procedurę zademonstruje Kyosuke Takabe, adiunkt z mojego laboratorium. Konfokalna mikroskopia refleksyjna i wielokanałowa mikroskopia konfokalna.
Podłącz mikroskop konfokalny z zarysowanymi kanałami widmowymi do lampy fotopowielacza. Wyposaż mikroskop w obiektyw o dużej aperturze numerycznej, o odpowiednim powiększeniu. Wyposaż mikroskop w lustro półrefleksyjne, aby pomieścić konfokalną mikroskopię refleksyjną, która opiera się na rozproszeniu komórkowym padającego światła w celu wizualizacji morfologii komórek.
W przypadku wielokanałowej mikrospektroskopii konfokalnej należy wyposażyć mikroskop w zwierciadła dichroiczne i użyć miernika mocy lasera, aby dostosować intensywność oświetlenia dla każdej długości fali wzbudzenia. Następnie ustaw moc wyjściową pod mikroskopem tak, aby była stała na wszystkich długościach fal wzbudzenia. Aby zobrazować bakterie za pomocą mikroskopu, ustaw rozmiar otworu na 1,0 jednostki powierzchni w oprogramowaniu mikroskopu i ustaw czas przebywania piksela dla każdej długości fali wzbudzenia.
Ustaw rozdzielczość skanowania. W przypadku małych komórek, takich jak bakterie, użyj obszaru skanowania o wymiarach 1024 na 1024. Ustaw zakres Z-Scanning tak, aby obszar zainteresowania był pokryty.
Korzystając z okna spektralnego od 8 do 10 nanometrów, ustaw detektor D-Scan tak, aby rejestrował zakres widzialnych długości fal. Następnie uzyskaj wielokanałowe obrazy spektroskopii konfokalnej w sekwencji od najdłuższej do najkrótszej długości fali wzbudzenia, aby utworzyć stosy Z obrazów fluorescencyjnych i obrazy z konfokalnej mikroskopii refleksyjnej i zapisz obrazy w 16-bitowym formacie tiff. Aby przeprowadzić segmentację komórek i rekonstrukcję wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczej komórki, otwórz odpowiedni program do analizy obrazu i kliknij dwukrotnie, aby otworzyć jeden z dostarczonych skryptów.
Na karcie edytora kliknij przycisk Uruchom. Pojawi się okno wyboru folderu. Wybierz katalog, w którym zostały zapisane obrazy Z-Stack i kliknij przycisk Otwórz.
Automatycznie pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie parametru segmentacji. Ustaw próg binaryzacji obrazu na 0-1, binaryzację obrazu na 0,45, górny próg dla regionu komórki na 200, dolny próg dla obszaru komórki na 10, a liczbę detektorów na 32. Pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie liczby długości fal wzbudzenia.
Wprowadź liczbę długości fal używanych do akwizycji obrazu i kliknij przycisk OK. Pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie długości fal wzbudzenia. Wprowadź długości fal wzbudzenia w kolejności od najkrótszej do najdłuższej i kliknij OK.
Pojawi się nowe okno obrazu przedstawiające obraz z konfokalnej mikroskopii refleksyjnej. Wybierz dowolny obszar tła, który ma zostać użyty do odejmowania tła i narysuj prostokąt na obrazie mikroskopii konfokalnej odbicia. Kliknij dwukrotnie w wybranym regionie, aby potwierdzić wybór i zlokalizować nowy katalog o nazwie signature.
Aby wykonać techniki redukcji wymiarów, utwórz pusty katalog i nazwij go parent_directory. Zapisz sygnatury fluorescencyjne każdej z dwóch populacji komórek w dwóch oddzielnych katalogach i otwórz interfejs wiersza poleceń stacji roboczej. Wprowadź polecenie.
Po wyświetleniu opcji wybierz katalog docelowy wybierz parent_directory. Następnie w folderze parent_directory zlokalizuj PCA. png, który będzie zawierał wynikowy wykres analizy składowych głównych.
W tym miejscu pokazano typową jednokomórkową sygnaturę fluorescencyjną komórki bakteryjnej przedstawioną jako tradycyjny wykres widma i jako mapę cieplną. Na tym rysunku można zaobserwować niedokładną segmentację komórek 2D nałożoną na oryginalny obraz z mikroskopii konfokalnej odbiciowej populacji bakterii glebowych. Z uzyskanymi wrodzonymi sygnaturami fluorescencyjnymi dla populacji przedstawionymi jako mapa cieplna.
Należy zauważyć, że zmienność wewnątrz populacji była stosunkowo niewielka po udanej segmentacji komórek. Tutaj przykład niedokładnej segmentacji komórek jest pokazany super nałożony na tę samą populację P. putida, jak pokazano wcześniej. Wpływ niedokładnej segmentacji komórek na wrodzone sygnatury fluorescencyjne populacji jest łatwo widoczny na podstawie znacznej liczby wartości odstających zaobserwowanych na odpowiedniej mapie cieplnej.
Niedokładna segmentacja komórek skutkuje luźniejszym klastrem po analizie głównych składników w porównaniu z typem klastra uzyskanym po dokładnej segmentacji komórek. Pomimo niewielkich zmienności wrodzonej sygnatury fluorescencyjnej obserwowanych w poszczególnych szczepach bakterii, każda populacja tworzy odrębny klaster na wykresie analizy głównych składników. Na tym rysunku można zaobserwować niedokładną segmentację komórek 3D nałożoną na oryginalny obraz z mikroskopii konfokalnej odbiciowej populacji pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae YM4271.
Należy zwrócić uwagę na brak wartości odstających i wynikające z tego wrodzone sygnatury fluorescencyjne dla populacji. Istotne jest, aby uzyskać jak najbardziej czysty obraz za pomocą mikroskopii konfokalnej i uniknąć nasycenia intensywności sygnału, ponieważ szum może zepsuć dokładność późniejszej analizy. Modele uczenia maszynowego można trenować za pomocą wrodzonego zestawu danych podpisu zachodniego do użycia w zadaniach klasyfikacji lub przewidywania, oferując analizę populacji bez tagów i przewidywanie fenotypowe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół optycznego wyodrębniania i katalogowania wrodzonych sygnatur fluorescencji komórkowej z pojedynczych żywych komórek. Metoda ta kładzie nacisk na nieinwazyjność, co czyni ją odpowiednią do analizy różnych systemów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki, w tym komórek bakteryjnych, grzybowych, drożdżowych, roślinnych oraz zwierzęcych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Analiza fluorescencji komórkowej
- Techniki o rozdzielczości pojedynczej komórki
- Charakterystyka fenotypowa mikroorganizmów
Wprowadzenie
- Znaczenie nieinwazyjnych metod znakowania
- Wyzwania w analizie heterogeniczności komórkowej
- Potencjalne zastosowania w mikrobiologii
Zastosowane metody
- Konfokalna mikroskopia refleksyjna
- Wielokanałowa konfokalna mikrospektroskopia
- Analiza obrazu w celu segmentacji komórek i redukcji wymiarowości
Główne wyniki
- Skuteczna ekstrakcja wrodzonych sygnatur fluorescencji komórkowej
- Identyfikacja zmienności fenotypowej w populacjach drobnoustrojów
- Wykazanie wpływu dokładnej segmentacji komórek na analizę
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia technikę wysokorozdzielczej analizy sygnatur fluorescencyjnych.
- Otwiera ono nowe możliwości w zakresie zrozumienia różnorodności fenotypowej mikroorganizmów w badaniach ekologicznych oraz w opiece zdrowotnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
CRIF umożliwia rozdzielczość na poziomie pojedynczych komórek dla sygnatur fluorescencji wrodzonej bez konieczności stosowania znaczników, oferując nieinwazyjne podejście do oceny fenotypu komórkowego i stanu fizjologicznego w populacjach heterogenicznych. Możliwość ta wspiera procesy wczesnego odkrywania, dostarczając ilościowych, rozdzielczo przestrzennych danych do walidacji celów i przesiewu fenotypowego bez znakowania genetycznego lub chemicznego. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących związków poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w systemach komórek ssów oraz drobnoustrojów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośrednią ocenę sygnatur autofluorescencji pojedynczych komórek.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnianie subpopulacji komórkowych na podstawie wrodzonej fluorescencji, bez artefaktów związanych z znakowaniem.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie sygnatur fluorescencyjnych z fenotypem komórkowym i stanem fizjologicznym.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewania poprzez generowanie powtarzalnych, ilościowych odczytów fluorescencji na komórkę.
- Skalowalność: Umożliwia obrazowanie 3D o wysokiej rozdzielczości oraz rozdzielanie widmowe w celu skalowalnej analizy populacji komórek mikrobiologicznych lub ssaczych.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Generuje zestandaryzowane zbiory danych widmowych odpowiednie do trenowania uczenia maszynowego i międzyprojektowej predykcji fenotypowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy charakterystykę pojedynczych komórek na etapie odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez spójne, bezznacznikowe metryki fenotypowe.
- Korelacja z biomarkerami: Wspiera identyfikację translacyjnych biomarkerów opartych na fluorescencji, które korelują ze stanem fizjologicznym lub patogennością.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o dane poprzez kwantyfikację zmienności wewnątrzpopulacyjnej oraz wykrywanie wartości odstających w przestrzeni sygnatur.
Integracja potoku i przepływu pracy
CRIF wpisuje się w kontinuum odkryć – od testowania hipotez we wczesnej fazie badań biologicznych, po przygotowanie testów do przesiewowych oraz rozwój biomarkerów translacyjnych, szczególnie w przypadku badań wymagających rozdzielczości 3D i bezetykietowej oceny fenotypowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez rozdzielanie sygnatur fluorescencji pojedynczych komórek w przestrzeni 3D.
- Przesiewy: Dostarcza ilościowe wyniki gotowe do analizy, charakteryzujące się wysoką powtarzalnością po optymalizacji parametrów segmentacji.
- Analityka: Generuje wielokanałowe dane spektralne oraz wyniki redukcji wymiarowości (np. wykresy PCA), które umożliwiają analizę porównawczą między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy sygnatury pojedynczych komórek ze stanem fizjologicznym, wspierając odkrywanie biomarkerów w systemach mikrobiologicznych i eukariotycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku biblioteki spektralne, które można zastosować w różnych projektach do klasyfikacji, predykcji i przesiewów fenotypowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezetykietowemu fenotypowaniu pojedynczych komórek.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność poprzez segmentację opartą na protokole, odejmowanie tła oraz kalibrację spektralną.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów z wykorzystaniem wrodzonych właściwości komórkowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez ilościowe określenie heterogeniczności fenotypowej i identyfikację interesujących subpopulacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii konfokalnej, obrazowania spektralnego oraz obsługi oprogramowania do analizy obrazu w celu segmentacji i redukcji wymiarowości.
- Zależne od aparatury, w tym od obiektywów o wysokiej aperturze numerycznej (NA), luster dichroicznych, detektorów spektralnych oraz kontroli mocy lasera dla akwizycji wielokanałowej.
- Wymaga standaryzacji długości fal wzbudzenia, ustawień przysłony (pinhole) i progów binaryzacji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu metody w różnych systemach modelowych (np. bakterie vs. drożdże) ze względu na różnice w autofluorescencji i właściwościach rozpraszania.
- Ograniczone przez problemy z poziomem sygnału do szumu; dokładne wyniki zależą od minimalizacji nasycenia i pozyskiwania czystych obrazów, aby uniknąć pozornej zmienności sygnatur.
