Name: Model inokulacji opuszki stopy myszy do badania reakcji neurozapalnych wywołanych wirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj model inokulacji opuszki stopy myszy do badania neurozapalnych reakcji wywołanych wirusem w układzie nerwowym. Ta metoda umożliwia ocenę kinetyki zakażenia i procesów immunopatologicznych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują laboratoriom Charles River za doskonałe wsparcie techniczne przy przeprowadzaniu analiz histopatologicznych. Praca ta została sfinansowana przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 i RO1 NS060699). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem (numery 2083-16 i 2083-19) sprawdzonym i zatwierdzonym przez Instytucję Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Princeton. Praca ta została wykonana przy ścisłym przestrzeganiu wymagań poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), do których mamy w pełni wyposażone laboratorium zatwierdzone przez komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego Uniwersytetu Princeton. Procedury, w tym ścieranie opuszki myszy opuszki podeszwy, inokulacja wirusa, sekcja myszy i pobieranie tkanek, zostały przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) w pomieszczeniu dla zwierząt na Uniwersytecie Princeton. Osoby wykonujące zabieg miały na sobie jednorazowe fartuchy, nakrycie głowy, ochronę oczu, sterylne rękawiczki, maski chirurgiczne i ochraniacze na buty.
1. Ścieranie podkładki pod nóżki myszy
<ol>
	<li>Znieczulij mysz C57BL/6 (w wieku 5–7 tygodni) znieczuleniem gazowym izofluranem, podawanym w dawce 3% przez mały system (komorę) znieczulający.
	<ol>
		<li>Umieść mysz w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia na plecach, przed zaszczepieniem, w tylnej opuszki stopy. Przymocuj stożek nosowy z membraną (szczelina wystarczająco duża, aby pasowała do pyska zwierzęcia) do myszy i podawaj znieczulenie izofluranem w stałej dawce 1,5%-2,0%.</li>
		<li>Uważnie monitoruj mysz pod kątem reakcji na bolesny bodziec wywołany silnym szczypnięciem palca u nogi kleszczami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lekko chwyć jedną tylną poduszkę stopy płaskimi kleszczami.
	<ol>
		<li>Delikatnie zetrzyj nagą skórę tylnej poduszki stopy około 20 razy, między piętą a poduszkami do chodzenia, za pomocą szmergla (ziarnistość 100–180). Nie wywoływać krwawienia poprzez zbyt częste ścieranie lub wywieranie zbyt dużego nacisku.</li>
		<li>Za pomocą cienkich kleszczyków powoli oderwij warstwę rogową naskórka oderwaną przez ścieranie, aby odsłonić warstwę podstawną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Szczepienie opuszki PRV
<ol>
	<li>Przygotować inokulum wirusa rozcieńczone do pożądanego miana w pożywce DMEM zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Określ ilościowo liczbę jednostek tworzących blaszki (PFU) w zapasie wirusa na komórkach PK15, aby obliczyć i ustandaryzować dawkę wirusa i odpowiednio rozcieńczyć inokulum wirusa. 
		UWAGA: W tym badaniu zastosowano zjadliwy szczep PRV (PRV-Becker) w dawce 8 x 106 PFU. Dawka ta została zoptymalizowana w poprzednim wstępnym eksperymencie, aby upewnić się, że wszystkie zaszczepione zwierzęta wykazywały objawy kliniczne po 82 godzinach od inokulacji (hpi).</li>
		<li>Utrzymuj inokulum wirusa na lodzie i delikatnie wymieszaj przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 20 μl kropli inokulum wirusa (8 x 106 PFU) na startą opuszkę stopy (podanie miejscowe). Przeprowadzać szczepienia próbne (tylko pożywka) równolegle.</li>
	<li>Delikatnie przetrzyj 10x trzonkiem igły, aby ułatwić adsorpcję wirusa. Unikać drapania czubkiem igły. Powtarzaj ten krok co 10 minut.</li>
	<li>Trzymaj mysz w znieczuleniu przez 30 minut, aż starta podkładka wyschnie.</li>
	<li>Po przerwaniu znieczulenia monitoruj mysz, aż będzie w stanie utrzymać leżącą mostek i umieść ją w indywidualnej klatce w celu obserwacji klinicznej i pobrania próbek.</li>
</ol>
3. Sekcja myszy i pobieranie tkanek
<ol>
	<li>W odpowiednim czasie po zakażeniu należy poddać mysz eutanazji metodą uduszenia (CO2 ). 
	UWAGA: W tym badaniu humanitarny punkt końcowy (kiedy zwierzęta zaczynają wykazywać objawy terminalne) dla myszy zakażonych PRV-Becker wynosi 82 hpi. Eutanazja zwierząt kontrolnych równolegle.</li>
	<li>Połóż mysz brzuszną stroną skierowaną do góry na macie chirurgicznej za pomocą igieł/szpilek. Przymocuj kończyny myszy za pomocą szpilek do chirurgicznej płyty piankowej. Zwilż brzuszną stronę myszy 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierści.</li>
	<li>Uszczypnij zewnętrzną warstwę futra i skóry za pomocą kleszczy i wykonaj małe początkowe nacięcie cienkimi nożyczkami w pobliżu ujścia cewki moczowej.
	<ol>
		<li>Od tego otworu kontynuuj nacięcie po środkowej stronie brzusznej aż do podbródka.</li>
		<li>Przedłuż dwa boczne nacięcia w kierunku kończyn przednich i tylnych.</li>
		<li>Oddziel skórę od leżącej pod spodem warstwy mięśniowej i przypnij z boku.</li>
		<li>Otwórz jamę brzuszną i naciąć do podstawy klatki piersiowej. Zakończ otwarcie jamy brzusznej, wykonując dwa nacięcia poprzeczne.</li>
		<li>Otwórz klatkę piersiową, przecinając przeponę i żebra po obu bocznych stronach. 
		UWAGA: Przecięcie boków klatki piersiowej zapobiega ryzyku skaleczenia serca.</li>
		<li>Zbierz odsłonięte narządy, w tym serce, płuca, śledzionę, trzustkę, wątrobę, nerki i pęcherz moczowy w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml. Trzymaj probówki na lodzie.</li>
		<li>Przeciąć startą podkładkę pod stopę między piętą a podkładkami do chodzenia i umieścić kawałek tkanki w tubie, jak opisano w kroku 3.3.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mysz grzbietem do góry i zwilż futro 70% etanolem. Wytnij warstwę skóry, aby odsłonić kręgosłup.
	<ol>
		<li>Wykonaj małe nacięcie w okolicy miednicy. Zdejmij skórę z tylnych kończyn w kierunku głowy.</li>
		<li>Usuń nogi i ramiona, tnąc nożyczkami równolegle do kręgosłupa i blisko niego po obu stronach.</li>
		<li>Odetnij głowę u podstawy czaszki (poziom C1–C2).</li>
		<li>Rozetnij czaszkę nożyczkami od otworu wielkiego do kości czołowej.</li>
		<li>Otwórz czaszkę w kierunkach bocznych za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Delikatnie zgarnij mózg za pomocą kleszczy i postępuj zgodnie z opisem w kroku 3.3.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść kręgosłup, przecinając mięśnie, tłuszcz i tkanki miękkie za pomocą zakrzywionych nożyczek. Odetnij ogon. Umieść nienaruszony kręgosłup w probówce o pojemności 15 ml zawierającej sterylny, lodowaty roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS). Trzymaj rurki na lodzie do czasu dalszej sekcji rdzenia kręgowego i DRG.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja rdzenia kręgowego i DRG
UWAGA: Wyodrębnij rdzeń kręgowy i DRG z kolumny kręgów bezpośrednio po sekcji myszy. Protokół ekstrakcji rdzenia kręgowego i DRG został zaadaptowany z poprzedniej publikacji7.
<ol>
	<li>Wyjmij kręgosłup z lodowatej rurki PBS i usuń pozostałe tkanki miękkie, co staje się łatwiejsze po schłodzeniu.</li>
	<li>Wykonaj trzy poprzeczne nacięcia w kolumnie przez kręgi (poziomy T1, L1 i S2) za pomocą żyletki. Umieść trzy części na szalce Petriego o średnicy 15 mm zawierającej sterylny, lodowaty PBS. Śledź i oznaczaj początek segmentów do późniejszej analizy.</li>
	<li>Weź jeden segment i zabezpiecz go między kleszczami, grzbietową stroną skierowaną do góry. Wykonaj pojedyncze, podłużne cięcie przez linię środkową za pomocą żyletki, dzieląc kolumnę na dwie równe połowy.</li>
	<li>Umieść obie połówki na nowej szalce Petriego zawierającej nowy, sterylny, lodowaty PBS. Upewnij się, że segment jest prawidłowo zorientowany, aby móc odróżnić lewą i prawą stronę.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie oderwij rdzeń kręgowy z kolumny kręgów z każdej połowy w kierunku rostralnym do ogonowego za pomocą cienkich kleszczy.</li>
	<li>Zbierz obie połówki rdzenia kręgowego do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml zawierających 500 μl sterylnego, lodowatego PBS. Trzymaj probówki na lodzie.</li>
	<li>Delikatnie usuń opony mózgowe z jednej strony kręgosłupa na drugą, aby odsłonić DRG.</li>
	<li>Usuń każdy DRG indywidualnie, chwytając odsłonięty nerw rdzeniowy i delikatnie wyciągnij go z kręgosłupa. Umieść zebrany DRG na szalce Petriego o średnicy 15 mm zawierającej lodowaty PBS. Pobrać wszystkie ipsilateralne i przeciwległe DRG oddzielnie od segmentu kręgosłupa i postępować zgodnie z opisem w kroku 4.5. 
	UWAGA: DRG jest widoczny jako okrągła przezroczysta struktura wzdłuż białego nerwu rdzeniowego.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.3–4.7, używając dwóch pozostałych segmentów kręgosłupa w ciągu 30–45 minut.</li>
	<li>Odwirować wszystkie probówki z dużą prędkością (17 900 x g) przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Probówki do zasysania supernatantu i błyskawicznego zamrażania w ciekłym azocie. Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C w celu dalszej homogenizacji tkanek.</li>
	<li>Alternatywnie, utrwalić i podzielić oczyszczone DRG i inne tkanki myszy do analiz histopatologicznych i/lub barwienia immunofluorescencyjnego po kroku 4.9.</li>
</ol>
5. Homogenizacja tkanek
<ol>
	<li>Rozmrozić probówki zawierające zamrożone próbki tkanek na lodzie.</li>
	<li>Zważyć 100 mg tkanki i umieścić ją w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml zawierającej sterylny stalowy koralik i 500 μl buforu RIPA zawierającego 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS i tabletki inhibitora koktajlu proteazy.</li>
	<li>Rozbić tkanki w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą homogenizatora przy 20 cyklach/s przez 2 minuty, następnie 1 minutę oczekiwania, a następnie 20 cykli/s przez 2 minuty.</li>
	<li>Odwirować probówkę z dużą prędkością (17 900 x g) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zebrać supernatant (500 μl) w nowej probówce i przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu wykonania testów ELISA i qPCR w celu ilościowego określenia odpowiednio markerów stanu zapalnego i miana wirusa. 
	UWAGA: W przypadku qPCR należy zebrać wszystkie próbki z materiałem wolnym od RNaz (tj. kulkami, probówkami itp.) i rozbić tkanki za pomocą buforu do lizy RNA zawierającego 1% betamerkaptoetanolu (tabela materiałów).</li>
</ol>
6. Przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne zamrożonych skrawków DRG
<ol>
	<li>Przetwarzanie tkanek
	<ol>
		<li>Utrwalić wypreparowany i oczyszczony DRG w 1% paraformaldehydzie (PFA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przenieś tkankę do probówki o pojemności 15 ml z 10% sacharozą w PBS. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieś tkankę do probówki o pojemności 15 ml z 20% sacharozą w PBS. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieś tkankę do probówki o pojemności 15 ml z 30% sacharozą w PBS. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Osadź tkanki w OCT za pomocą kriomoldu i umieść bloki w suchym lodzie w celu szybkiego zamrożenia.</li>
		<li>Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do kriosekcji
	<ol>
		<li>Wyjąć zamrożony blok z temperatury -80 °C i pozostawić do wyrównania temperatury w komorze kriostatu przez 30 minut.</li>
		<li>Przeprowadzić kriosekcję DRG o grubości 15 μm i zamontować sekcje na szkiełkach.</li>
		<li>Za pomocą pisaka narysuj hydrofobowy okrąg wokół chusteczki zamontowanej na szkiełku.</li>
		<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C aż do zabarwienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne
	<ol>
		<li>Umyj sekcje DRG 3x w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować skrawki ze 100 μl pożądanego przeciwciała pierwszorzędowego (np. mysiego przeciwciała przeciwko glikoproteinie B PRV) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w PBS zawierającym 10% ujemnej surowicy koziej.</li>
		<li>Powtórz krok 6.3.1.</li>
		<li>Inkubować skrawki ze 100 μl pożądanego przeciwciała drugorzędowego (koziego przeciwciała anty-mysiego Alexa Fluor 488) przez 50 minut w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe tylko w PBS.</li>
		<li>Dodać 100 μl barwnika DAPI (4′,6-diamidyn-2-fenyloindolowego) rozcieńczonego w PBS na sekcję. Dalsze próbki inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Powtórz krok 6.3.1.</li>
		<li>Umieścić próbki za pomocą fluorescencyjnego podłoża mocującego na szkiełkach podstawowych, zabezpieczyć i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Przygotowanie i barwienie H&E skrawków tkanek zatopionych w parafinie
<ol>
	<li>Utrwalić tkankę w 10% formalinie przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wykonaj standardowy harmonogram przetwarzania dla zatapiania parafiny i cięcia utrwalonych tkanek. Przenieś utrwalone tkanki do 70% etanolu i przeprowadź przez ulepszone alkohole na ksylen, a następnie parafinę, jak opisano wcześniej8. 
	UWAGA: Użyj gąbek poliestrowych do przechowywania małych próbek tkanek, takich jak DRG, w kasetach.</li>
	<li>Wykonaj standardową deparafinowanie, a następnie barwienie H&E skrawków tkanek, jak opisano wcześniej9.</li>
</ol>

<ol><li>Field, H. J., Hill, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+pseudorabies+in+mice+following+peripheral+inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation.</a> Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).</li>
<li>Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transneuronal+spread+phenotype+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+mouse+hind+footpad%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad.</a> Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).</li>
<li>Guedon, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+changes+induced+by+Varicella+Zoster+Virus+in+a+rat+model+of+postherpetic+neuralgia%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia.</a> Virology. 482, 167-180 (2015).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li>
<li>Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittmann%2C+G+%22Herpesvirus+diseases+of+cattle%2C+horses+and+pigs%22">Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diseases+of+swine%2C+6th+ed%22">Diseases of swine, 6th ed</a>. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Histochemical+Detection+of+Iron+in+Paraffin+Sections+of+Mouse+Central+Nervous+System+Tissue%3A+Application+in+the+APP%2FPS1+Mouse+Model+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22ASN+Neuro%22%5BJournal%5D)">Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease.</a> ASN Neuro. 8 (5), (2016).</li>
<li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li>
<li>Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmented+neuronal+cultures+reveal+two+distinct+mechanisms+for+alpha+herpesvirus+escape+from+genome+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing.</a> PLoS pathogens. 13 (10), 1006608(2017).</li>
<li>Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+Pseudorabies+Virus+Infection+Induces+a+Specific+and+Lethal+Systemic+Inflammatory+Response+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice.</a> Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).</li>
<li>Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphaherpesvirus+infection+of+mice+primes+PNS+neurons+to+an+inflammatory+state+regulated+by+TLR2+and+type+I+IFN+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling.</a> PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087(2019).</li>
<li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li>
<li>Mancini, M., Vidal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+pathogenesis+of+herpes+simplex+encephalitis+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%3A+Official+Journal+of+the+International+Mammalian+Genome+Society%22%5BJournal%5D)">Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models.</a> Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).</li>
<li>Kopp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+neurons+and+encephalitis+after+intracranial+inoculation+of+herpes+simplex+virus+requires+the+entry+receptor+nectin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).</li>
<li>Wang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+specific+innate+immune+responses+in+herpes+simplex+virus+infection+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system.</a> Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).</li>
<li>Haberthur, K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+varicella+zoster+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Animal models of varicella zoster virus infection.</a> Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).</li>
<li>Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+neuropathy+in+multiple+sclerosis%3A+a+clinical+and+electrophysiologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurologica+Scandinavia%22%5BJournal%5D)">Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study.</a> Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).</li>
<li>MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+axonal+transport+of+rabies+virus+is+unaffected+by+interferon+treatment+but+blocked+by+emetine+locally+in+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188(2018).</li>
<li>Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+analyses+of+the+neuropathogenesis+of+a+West+Nile+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurovirology%22%5BJournal%5D)">Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice.</a> Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).</li>
<li>Swartwout, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Persistently+and+Productively+Infects+Primary+Adult+Sensory+Neurons+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro.</a> Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49(2017).</li>
<li>Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+hundred+years+of+poliovirus+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">One hundred years of poliovirus pathogenesis.</a> Virology. 344 (1), 9-16 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj model inokulacji opuszki stopy jest przydatny do badania inicjacji i rozwoju odpowiedzi neurozapalnych podczas infekcji wirusem alfaherpeswirusa. Co więcej, ten model in vivo jest wykorzystywany do ustalenia kinetyki replikacji i rozprzestrzeniania się alfaherpeswirusa z PNS do OUN. Jest to alternatywa dla innych modeli inokulacji, takich jak model inokulacji skóry na boku, który opiera się na głębokim drapaniu skóry13, lub droga wewnątrzczaszkowa, która bezpośrednio wprowadza wirusa...

To badanie opisuje model inokulacji opuszki stopy w celu zbadania replikacji i rozprzestrzeniania się wirusów z PNS do OUN oraz związanych z tym reakcji neurozapalnych. Model inokulacji opuszki stopy był intensywnie wykorzystywany do badania infekcji wirusem alfaherpeswirusa w neuronach1,2,3. Głównym celem tego modelu jest umożliwienie wirusom neurotropowym pokonania maksymalnej odległości przez PNS przed dotarciem do OUN. W tym przypadku model ten służy do uzyskania nowych informacji na temat rozwoju określonej neuropatii (świądu neuropatycznego) u myszy zakażonych wirusem wścieklizny rzekomej (PRV).
PRV to alfaherpeswirus związany z kilkoma dobrze znanymi patogenami (np. wirusem opryszczki pospolitej typu 1 i 2 [HSV1 i HSV2] oraz wirusem ospy wietrznej i półpaśca [VZV]), które powodują odpowiednio opryszczkę, zmiany w narządach płciowych i ospę wietrzną4. Wszystkie te wirusy są pantropiczne i mogą infekować wiele różnych typów komórek, nie wykazując powinowactwa do określonego typu tkanki. Jednak wszystkie wykazują charakterystyczny neurotropizm poprzez inwazję na PNS (a czasami na OUN) gatunków gospodarzy. Naturalnym żywicielem jest świnia, ale PRV może zarazić większość ssaków. U tych nienaturalnych gospodarzy PRV infekuje PNS i wywołuje silny świąd zwany "szalonym swędzeniem", po którym następuje śmierć okołoostrą5,6. Rola odpowiedzi neuroimmunologicznej w wynikach klinicznych i patogenezie zakażenia PRV jest słabo poznana.
Model inokulacji opuszki stopy pozwala PRV zainicjować infekcję w komórkach naskórka opuszki. Następnie infekcja rozprzestrzenia się na czuciowe i współczulne włókna nerwowe, które unerwiają naskórek, gruczoły potowe i skórę właściwą. Infekcja rozprzestrzenia się przez cząsteczki wirusa przemieszczające się przez nerw kulszowy do DRG w ciągu około 60 godzin. Infekcja rozprzestrzenia się przez rdzeń kręgowy, ostatecznie docierając do tyłomózgowia, gdy zwierzęta stają się w stanie agonalnym (82 godziny po zakażeniu). W tym oknie czasowym próbki tkanek mogą być pobierane, przetwarzane i analizowane pod kątem replikacji wirusa i markerów odpowiedzi immunologicznej. Na przykład badanie histologiczne i kwantyfikacja wiremii mogą być przeprowadzone w różnych tkankach w celu ustalenia korelacji między inicjacją a rozwojem procesów klinicznych, wirusologicznych i neurozapalnych w patogenezie PRV.
Korzystając z modelu inokulacji opuszki stopy, można badać komórkowe i molekularne mechanizmy świądu wywołanego PRV u myszy. Co więcej, model ten może dostarczyć nowych informacji na temat inicjacji i rozwoju zapalenia nerwów wywołanego przez wirusa podczas infekcji wirusem opryszczki. Lepsze zrozumienie procesów leżących u podstaw neuropatii wywołanych przez alfaherpeswirus może doprowadzić do opracowania innowacyjnych strategii terapeutycznych. Na przykład model ten jest przydatny do badania mechanizmów swędzenia neuropatycznego u pacjentów ze zmianami popółpaścowymi (np. półpaścem, półpaścem) i testowaniem nowych celów terapeutycznych u myszy w przypadku odpowiednich chorób ludzkich.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-PRV gB</td><td>Wykonane przez laboratorium</td><td></td> 1<td>/500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Aqua-hold2 pap pen czerwony</td><td>Fisher scientific</td><td>2886909</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowe tablice ścierne - 24 sztuki (pilniki do paznokci o ziarnistości 100/180)</td> <td>Revlon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complete Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 myszy (5-7 tygodni)</td><td>The Jackson Laboratoria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór DAPI (1 mg / ml)</td><td>Fisher scientific</td><td>62248</td><td>Rozcieńczenie 1/1000</td></tr><tr><td>Jednorazowa sterylna polistyrenowa szalka Petriego 100 x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30022</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phophate Buffer Sol (PBS)</td><td>Hyklon, GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30028</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyklon, GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30088</td><td></td></tr><tr><td>Drobno zakrzywione nożyczki ze stali nierdzewnej</td><td>FST</td><td>14095-11</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Media montażowe</td><td>Fisher scientific</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, neutralny buforowany 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isofluran</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 2ml</td><td>Denville Scientific 1000945</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtube 1,5 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72692005</td><td></td></tr><tr><td>Ujemna surowica kozia</td><td>Wektor</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>154022</td><td></td></tr><tr><td>Igła Precision Glide 18G</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki stalowy tył</td><td>Personna</td><td>9412071</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RNA (RLT)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej, 5 mm</td> Szkiełka mikroskopowe <td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/plus Fisher</td><td>scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Lizer tkanek LT</td><td>Qiagen</td><td>69980</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>488 (koza anty-mysz)</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>1/2000 rozcieńczenie</td></tr></tbody></table>

model inokulacji opuszki stopy myszy do badania reakcji neurozapalnych wywołanych wirusem

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

Ten protokół opisuje model inokulacji opuszki stopy używany do badania inicjacji i rozwoju reakcji neurozapalnych podczas infekcji wirusem alfaherpeswirusa u myszy. Ponieważ alfaherpeswirusy są głównymi najeźdźcami obwodowego układu nerwowego (PNS), model ten jest odpowiedni do scharakteryzowania kinetyki replikacji wirusa, jego rozprzestrzeniania się z PNS do OUN i związanych z tym reakcji neurozapalnych. Model inokulacji opuszki stopy umożliwia rozprzestrzenianie się cząsteczek wirusa z pierwotnego miejsca infekcji w naskórku opuszki stopy do czuciowych i współczulnych włókien nerwowych, które unerwiają naskórek, gruczoły potowe i skórę właściwą. Infekcja rozprzestrzenia się przez nerw kulszowy do zwojów korzenia grzbietowego (DRG) i ostatecznie przez rdzeń kręgowy do mózgu. W tym przypadku opuszka myszy jest zaszczepiana wirusem rzekomej wścieklizny (PRV), alfaherpeswirusem blisko spokrewnionym z wirusem opryszczki pospolitej (HSV) i wirusem ospy wietrznej i półpaśca (VZV). Model ten pokazuje, że zakażenie PRV wywołuje ciężki stan zapalny, charakteryzujący się naciekiem neutrofili w opuszkach stopy i DRG. Wysokie stężenia cytokin zapalnych są następnie wykrywane w homogenizowanych tkankach za pomocą testu ELISA. Ponadto obserwuje się silną korelację między ekspresją genu PRV i białka (poprzez barwienie qPCR i IF) w DRG a wytwarzaniem cytokin prozapalnych. W związku z tym model inokulacji opuszki stopy pozwala lepiej zrozumieć procesy leżące u podstaw neuropatii wywołanych przez alfaherpeswirusa i może prowadzić do opracowania innowacyjnych strategii terapeutycznych. Ponadto model może stanowić podstawę badań nad neuropatiami obwodowymi, takimi jak stwardnienie rozsiane i związane z nim uszkodzenia PNS wywołane przez wirusy. W ostatecznym rozrachunku może służyć jako opłacalne narzędzie in vivo do opracowywania leków.

Model inokulacji w stopę myszy pozwala na charakteryzację immunopatogenezy infekcji alphaherpeswirusem in vivo, w tym replikację i rozprzestrzenianie się infekcji z inokulowanej stopy do układu nerwowego oraz indukcję specyficznych odpowiedzi neurozapalnych.
W niniejszym badaniu najpierw dokonaliśmy ścierania skóry podeszwy tylnej łapy myszy, a następnie przeprowadziliśmy inokulację pozorowaną lub inokulację obszaru ścieranego wirulentnym szczepem PRV (PRV-Becker). Miejsce ścierania było widoc...

Model inokulacji opuszki stopy jest cennym narzędziem do charakteryzowania indukowanych przez wirusy reakcji neurozapalnych in vivo. W szczególności zapewnia jasną ocenę kinetyki wirusa i związanych z nią procesów immunopatologicznych inicjowanych w obwodowym układzie nerwowym.

Model inokulacji opuszki stopy myszy do badania reakcji neurozapalnych wywołanych wirusem

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Protokół ten pozwala na badanie inicjacji i rozwoju reakcji neurozapalnych w obwodowym układzie nerwowym myszy podczas infekcji wirusowej. Dzięki temu modelowi infekcje pokonują większą odległość od obwodu do obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego, co pozwala na maksymalną ocenę kinetyki odpowiedzi neurozapalnej. Po umieszczeniu pięcio- do siedmiotygodniowej znieczulonej myszy C57BL/6 w pozycji leżącej na podkładce chirurgicznej, potwierdź brak reakcji na odruch pedałowania.I użyj szmergla o ziarnistości od 100 do 180, aby delikatnie zetrzeć nagą skórę jednego tylnego podnóżka między piętą a poduszkami do chodzenia z około 20 przejściami deski. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków powoli odklej warstwę rogową naskórka oderwaną przez ścieranie, aby odsłonić warstwę podstawną. Po delikatnym wymieszaniu nanieść miejscowo 20 mikrolitrów odpowiedniego miana inokulum wirusa na przetartą opuszkę stopy.Przeprowadzać próbne szczepienia pożywką tylko w startych opuszkach stóp zwierząt kontrolnych równolegle. Po każdej aplikacji delikatnie przetrzyj opuszkę stopy 10 razy trzonkiem igły, aby ułatwić adsorpcję wirusa co 10 minut przez 30 minut. Po wysuszeniu startej opuszki stopy należy pozwolić myszom wyzdrowieć z monitorowaniem do momentu opadnięcia mostka przed umieszczeniem zwierząt w indywidualnych klatkach w celu obserwacji klinicznej i pobrania próbek.W odpowiednich punktach czasowych eksperymentu zbierz narządy narażone na działanie wirusa, w tym serce, płuca, śledzionę, trzustkę, wątrobę, nerki i pęcherz moczowy, do pojedynczych mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra na lodzie. Następnie zbierz starte opuszki stóp między piętą a poduszkami do chodzenia i umieść próbki w pojedynczych mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra na lodzie. Następnie umieść mysz w pozycji leżącej i zwilż futro 70% etanolem.Aby odsłonić kręgosłup, wykonaj małe nacięcie w okolicy miednicy i zdejmij skórę z tylnych kończyn w kierunku głowy. Aby usunąć kończyny przednie i tylne, użyj nożyczek, aby ciąć równolegle do kręgosłupa i blisko niego po obu stronach. I usuń głowę u podstawy czaszki.Użyj nożyczek, aby otworzyć czaszkę od otworu wielkiego do kości czołowej. I użyj kleszczy, aby otworzyć czaszkę w kierunku bocznym. Następnie użyj kleszczy, aby delikatnie zgarnąć mózg i umieścić go w 1,5 mililitrowej mikroprobówce na lodzie.Użyj zakrzywionych nożyczek, aby oczyścić kręgosłup z mięśni, tłuszczu i tkanek miękkich oraz usunąć ogon. Następnie umieść nienaruszony kręgosłup w 15-mililitrowej probówce sterylnego, lodowatego PBS na lodzie na nie dłużej niż trzy godziny. Po rozbiorze należy przenieść rdzeń kręgowy do naczynia do hodowli tkankowej, aby umożliwić usunięcie pozostałych tkanek miękkich.Użyj żyletki, aby wykonać trzy poprzeczne nacięcia przez kręgosłup na kręgach S2, L1 i T1. Przenieś kawałki do pojedynczych 15-milimetrowych naczyń zawierających sterylny, lodowaty PBS. Śledzenie i oznaczanie początków segmentów do późniejszej analizy.Następnie za pomocą kleszczy zabezpiecz jeden segment grzbietową stroną do góry i użyj żyletki, aby wykonać pojedyncze, podłużne cięcie w dół przez linię środkową, aby podzielić kolumnę na dwie równe połowy. Umieść obie połówki na nowej szalce Petriego zawierającej świeży, sterylny, lodowaty PBS w oryginalnej orientacji, aby móc odróżnić lewą i prawą stronę kręgosłupa. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie oderwać rdzeń kręgowy z każdej połowy kręgosłupa w kierunku rostralnym do ogonowego.Następnie umieść obie połówki rdzenia kręgowego w pojedynczych 1,5-mililitrowych mikroprobówkach zawierających 500 mikrolitrów sterylnego, lodowatego PBS na lodzie. Aby odsłonić zwój korzenia grzbietowego, delikatnie usuń opony mózgowe z jednej strony kręgosłupa na drugą. I wyciągnij odsłonięty biały nerw rdzeniowy z kręgosłupa.Zbierz okrągły, przezroczysty zwój korzenia grzbietowego z segmentu kręgosłupa na 15-milimetrową szalkę Petriego z lodowatym PBS. I zbierz ipsilateralny i przeciwległy zwój korzenia grzbietowego, jak właśnie pokazano. Po pobraniu nerwu rdzeniowego i zwoju korzenia grzbietowego z pozostałych dwóch segmentów kręgosłupa, jak właśnie pokazano, odwiruj wszystkie rurki tkanki z dużą prędkością.Następnie odessać supernatanty i błyskawicznie zamrozić próbki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu homogenizacji. W celu homogenizacji tkanek należy rozmrozić probówki z zamrożoną tkanką na lodzie przed odważeniem 100 miligramów każdej próbki. Przenieść do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej sterylne kulki i 500 mikrolitrów buforu do oznaczania radioimmunoprecypitacji.Następnie rozdrabniaj tkanki w temperaturze pokojowej na homogenizatorze z prędkością 20 cykli na sekundę przez dwie minuty, po czym następuje jednominutowy okres oczekiwania i 20 cykli na sekundę przez dodatkowe dwie minuty. Po drugiej rundzie homogenizacji odwirować tkanki z dużą prędkością przed przeniesieniem 500 mikrolitrów każdego supernatantu do nowej, odpowiednio oznakowanej probówki. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy.Miejsce otarcia jest widoczne w podnóżku sterowniczym. Typowe jest, że w miejscu ścierania tworzy się skorupa w ramach procesu gojenia. Natomiast myszy zaszczepione wścieklizną rzekomą wykazują ciężkie zapalenie opuszki stopy w humanitarnym punkcie końcowym, które charakteryzuje się obrzękiem i zaczerwienieniem.W badaniu histopatologicznym zaszczepionej opuszki stopy i zwoju korzenia grzbietowego stwierdza się martwicę naskórka i ciężkie zapalenie skóry w obrębie odcinków stopy zakażonych rzekomą wścieklizną. Naciek neutrofili obserwuje się również w skrawkach DRG zakażonych wścieklizną rzekomą. Znaczny wzrost ekspresji białka G-CSF mierzy się w opuszki stopy i zwoju korzenia grzbietowego myszy zakażonych wścieklizną rzekomą w porównaniu z grupą kontrolną zarówno po siedmiu, jak i 82 godzinach po zakażeniu.Znaczne poziomy G-CSF obserwuje się również po 82 godzinach od zakażenia w tkankach rdzenia kręgowego, mózgu, serca i wątroby myszy zakażonych wścieklizną rzekomą w porównaniu z grupą kontrolną. Co więcej, znaczne poziomy IL-6 są wykrywane we wszystkich badanych tkankach myszy zakażonych wścieklizną rzekomą, począwszy od 24 godzin po zakażeniu. W stanie agonalnym wściekliznę rzekomą wykryto w opuszki stopy, zwoju korzenia grzbietowego, rdzeniu kręgowym i mózgu.Z wysoką cytoplazmatyczną ekspresją glikoproteiny gB psuedorabies w neuronach zwoju korzenia grzbietowego u myszy zakażonych wścieklizną rzekomą. Aby zapewnić pomyślną infekcję, ważne jest, aby kropla wirusa w kolumnie nie spadła z uszkodzonej opuszki stopy. Ten model zwierzęcy może służyć jako platforma do testowania skuteczności leków przeciwzapalnych i przeciwwirusowych w celu zapobiegania neuropatiom obwodowym wywołanym przez wirusy.

mouse-footpad-inoculation-model-to-study-viral-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Ten film pokazuje generowanie modelu myszy z infekcją OUN. Młodemu szczeniakowi ssącemu wstrzykuje się wirusa zarówno wewnątrzczaszkowo, jak i dootrzewnowo. Wirus rozprzestrzenia się, infekując OUN, powodując śmierć komórek neuronalnych i stan zapalny. Szczenię jest oceniane pod kątem objawów infekcji w miarę postępu choroby.

Generacja modelu mysiego z infekcją ośrodkowego układu nerwowego

Ten film pokazuje powstawanie zapalenia nerwów w modelu mysim. Pobiera się znieczuloną mysz z mikroranami, a na rany nakłada się inokulum wirusa wścieklizny rzekomej (PRV). Wirus infekuje nerwy obwodowe, rozprzestrzenia się do zwojów korzenia grzbietowego (DRG), a następnie infekuje rdzeń kręgowy i mózg. Zakażenie neuronów w układzie nerwowym prowadzi do odpowiedzi immunologicznej, która indukuje uszkodzenie neuronów, prowadząc do zapalenia nerwów.

Generowanie zapalenia nerwów wywołanego wirusem w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Ten film pokazuje proces oceny dysfunkcji motorycznej w modelu mysim poprzez podanie toksyny krztuścowej i inokulum zawierającego peptydy naśladujące mielinę i adiuwanty, a następnie testy na bieżni w celu oceny funkcji motorycznych i oceny wynikłego uszkodzenia nerwów w wyniku aktywacji immunologicznej i demielinizacji.

Ocena funkcji motorycznych w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia nerwu

Zoptymalizowany protokół testowy jest przedstawiony w tym artykule dla testu wydajności Rotarod, używanego do pomiaru postępującej niepełnosprawności neurologicznej u myszy zakażonych TMEV.

Pomiar postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu stwardnienia rozsianego

Ten raport przedstawia proste podejście do skutecznego wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu (EAN) przy użyciu peptydu białka mieliny zero (P0)180-199 w połączeniu z kompletnym adiuwantem Freunda i toksyną krztuścową. Przedstawiamy wyrafinowany paradygmat zdolny do dokładnej oceny zakresu deficytów funkcjonalnych i neuropatologii, które występują w tym EAN.

Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej

W tym raporcie, zalety kultur organotypowych i dysocjacji kultur pierwotnych zwojów korzenia grzbietowego pochodzących od myszy są podkreślone w celu zbadania szerokiego zakresu mechanizmów związanych z interakcją neuron-glej, neuroplastycznością, zapaleniem nerwów i reakcją na infekcję wirusową.

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

Opisano podejście do wykrywania w czasie rzeczywistym wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zranienia skórne i zakażenie Staphylococcus aureus u myszy. Porównując myszy LysM-EGFP (które posiadają fluorescencyjne neutrofile) z krzyżówką LysM-EGFP szczepu myszy z niedoborem odporności, pogłębiamy naszą wiedzę na temat infekcji i rozwijamy podejścia do zwalczania infekcji.

Mysi model do oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie Staphylococcus aureus

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia immunokompetentnego mysiego modelu infekcji ośrodkowego układu nerwowego ICR (Institute of Cancer Research), aby pokazać rozwój neuropatii. Monitorowanie ostrych wirusowych zaburzeń encefalitycznych za pomocą identycznych wyników choroby można przeprowadzić w celu wykazania neuropatii wywołanej wirusem dengi in vivo.

Mysi model ostrej choroby podobnej do wirusowego zapalenia mózgu wywołanej wirusem dengi

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

Poznaj model inokulacji opuszki stopy myszy do badania neurozapalnych reakcji wywołanych wirusem w układzie nerwowym. Ta metoda umożliwia ocenę kinetyki zakażenia i procesów immunopatologicznych in vivo.

Model inokulacji opuszki stopy myszy do badania reakcji neurozapalnych wywołanych wirusem

Przeglądaj więcej filmów