Model inokulacji opuszki stopy myszy do badania reakcji neurozapalnych wywołanych wirusem
14 czerwca 2020
Model inokulacji opuszki stopy jest cennym narzędziem do charakteryzowania indukowanych przez wirusy reakcji neurozapalnych in vivo. W szczególności zapewnia jasną ocenę kinetyki wirusa i związanych z nią procesów immunopatologicznych inicjowanych w obwodowym układzie nerwowym.
Protokół ten pozwala na badanie inicjacji i rozwoju reakcji neurozapalnych w obwodowym układzie nerwowym myszy podczas infekcji wirusowej. Dzięki temu modelowi infekcje pokonują większą odległość od obwodu do obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego, co pozwala na maksymalną ocenę kinetyki odpowiedzi neurozapalnej. Po umieszczeniu pięcio- do siedmiotygodniowej znieczulonej myszy C57BL/6 w pozycji leżącej na podkładce chirurgicznej, potwierdź brak reakcji na odruch pedałowania.
I użyj szmergla o ziarnistości od 100 do 180, aby delikatnie zetrzeć nagą skórę jednego tylnego podnóżka między piętą a poduszkami do chodzenia z około 20 przejściami deski. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków powoli odklej warstwę rogową naskórka oderwaną przez ścieranie, aby odsłonić warstwę podstawną. Po delikatnym wymieszaniu nanieść miejscowo 20 mikrolitrów odpowiedniego miana inokulum wirusa na przetartą opuszkę stopy.
Przeprowadzać próbne szczepienia pożywką tylko w startych opuszkach stóp zwierząt kontrolnych równolegle. Po każdej aplikacji delikatnie przetrzyj opuszkę stopy 10 razy trzonkiem igły, aby ułatwić adsorpcję wirusa co 10 minut przez 30 minut. Po wysuszeniu startej opuszki stopy należy pozwolić myszom wyzdrowieć z monitorowaniem do momentu opadnięcia mostka przed umieszczeniem zwierząt w indywidualnych klatkach w celu obserwacji klinicznej i pobrania próbek.
W odpowiednich punktach czasowych eksperymentu zbierz narządy narażone na działanie wirusa, w tym serce, płuca, śledzionę, trzustkę, wątrobę, nerki i pęcherz moczowy, do pojedynczych mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra na lodzie. Następnie zbierz starte opuszki stóp między piętą a poduszkami do chodzenia i umieść próbki w pojedynczych mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra na lodzie. Następnie umieść mysz w pozycji leżącej i zwilż futro 70% etanolem.
Aby odsłonić kręgosłup, wykonaj małe nacięcie w okolicy miednicy i zdejmij skórę z tylnych kończyn w kierunku głowy. Aby usunąć kończyny przednie i tylne, użyj nożyczek, aby ciąć równolegle do kręgosłupa i blisko niego po obu stronach. I usuń głowę u podstawy czaszki.
Użyj nożyczek, aby otworzyć czaszkę od otworu wielkiego do kości czołowej. I użyj kleszczy, aby otworzyć czaszkę w kierunku bocznym. Następnie użyj kleszczy, aby delikatnie zgarnąć mózg i umieścić go w 1,5 mililitrowej mikroprobówce na lodzie.
Użyj zakrzywionych nożyczek, aby oczyścić kręgosłup z mięśni, tłuszczu i tkanek miękkich oraz usunąć ogon. Następnie umieść nienaruszony kręgosłup w 15-mililitrowej probówce sterylnego, lodowatego PBS na lodzie na nie dłużej niż trzy godziny. Po rozbiorze należy przenieść rdzeń kręgowy do naczynia do hodowli tkankowej, aby umożliwić usunięcie pozostałych tkanek miękkich.
Użyj żyletki, aby wykonać trzy poprzeczne nacięcia przez kręgosłup na kręgach S2, L1 i T1. Przenieś kawałki do pojedynczych 15-milimetrowych naczyń zawierających sterylny, lodowaty PBS. Śledzenie i oznaczanie początków segmentów do późniejszej analizy.
Następnie za pomocą kleszczy zabezpiecz jeden segment grzbietową stroną do góry i użyj żyletki, aby wykonać pojedyncze, podłużne cięcie w dół przez linię środkową, aby podzielić kolumnę na dwie równe połowy. Umieść obie połówki na nowej szalce Petriego zawierającej świeży, sterylny, lodowaty PBS w oryginalnej orientacji, aby móc odróżnić lewą i prawą stronę kręgosłupa. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie oderwać rdzeń kręgowy z każdej połowy kręgosłupa w kierunku rostralnym do ogonowego.
Następnie umieść obie połówki rdzenia kręgowego w pojedynczych 1,5-mililitrowych mikroprobówkach zawierających 500 mikrolitrów sterylnego, lodowatego PBS na lodzie. Aby odsłonić zwój korzenia grzbietowego, delikatnie usuń opony mózgowe z jednej strony kręgosłupa na drugą. I wyciągnij odsłonięty biały nerw rdzeniowy z kręgosłupa.
Zbierz okrągły, przezroczysty zwój korzenia grzbietowego z segmentu kręgosłupa na 15-milimetrową szalkę Petriego z lodowatym PBS. I zbierz ipsilateralny i przeciwległy zwój korzenia grzbietowego, jak właśnie pokazano. Po pobraniu nerwu rdzeniowego i zwoju korzenia grzbietowego z pozostałych dwóch segmentów kręgosłupa, jak właśnie pokazano, odwiruj wszystkie rurki tkanki z dużą prędkością.
Następnie odessać supernatanty i błyskawicznie zamrozić próbki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu homogenizacji. W celu homogenizacji tkanek należy rozmrozić probówki z zamrożoną tkanką na lodzie przed odważeniem 100 miligramów każdej próbki. Przenieść do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej sterylne kulki i 500 mikrolitrów buforu do oznaczania radioimmunoprecypitacji.
Następnie rozdrabniaj tkanki w temperaturze pokojowej na homogenizatorze z prędkością 20 cykli na sekundę przez dwie minuty, po czym następuje jednominutowy okres oczekiwania i 20 cykli na sekundę przez dodatkowe dwie minuty. Po drugiej rundzie homogenizacji odwirować tkanki z dużą prędkością przed przeniesieniem 500 mikrolitrów każdego supernatantu do nowej, odpowiednio oznakowanej probówki. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy.
Miejsce otarcia jest widoczne w podnóżku sterowniczym. Typowe jest, że w miejscu ścierania tworzy się skorupa w ramach procesu gojenia. Natomiast myszy zaszczepione wścieklizną rzekomą wykazują ciężkie zapalenie opuszki stopy w humanitarnym punkcie końcowym, które charakteryzuje się obrzękiem i zaczerwienieniem.
W badaniu histopatologicznym zaszczepionej opuszki stopy i zwoju korzenia grzbietowego stwierdza się martwicę naskórka i ciężkie zapalenie skóry w obrębie odcinków stopy zakażonych rzekomą wścieklizną. Naciek neutrofili obserwuje się również w skrawkach DRG zakażonych wścieklizną rzekomą. Znaczny wzrost ekspresji białka G-CSF mierzy się w opuszki stopy i zwoju korzenia grzbietowego myszy zakażonych wścieklizną rzekomą w porównaniu z grupą kontrolną zarówno po siedmiu, jak i 82 godzinach po zakażeniu.
Znaczne poziomy G-CSF obserwuje się również po 82 godzinach od zakażenia w tkankach rdzenia kręgowego, mózgu, serca i wątroby myszy zakażonych wścieklizną rzekomą w porównaniu z grupą kontrolną. Co więcej, znaczne poziomy IL-6 są wykrywane we wszystkich badanych tkankach myszy zakażonych wścieklizną rzekomą, począwszy od 24 godzin po zakażeniu. W stanie agonalnym wściekliznę rzekomą wykryto w opuszki stopy, zwoju korzenia grzbietowego, rdzeniu kręgowym i mózgu.
Z wysoką cytoplazmatyczną ekspresją glikoproteiny gB psuedorabies w neuronach zwoju korzenia grzbietowego u myszy zakażonych wścieklizną rzekomą. Aby zapewnić pomyślną infekcję, ważne jest, aby kropla wirusa w kolumnie nie spadła z uszkodzonej opuszki stopy. Ten model zwierzęcy może służyć jako platforma do testowania skuteczności leków przeciwzapalnych i przeciwwirusowych w celu zapobiegania neuropatiom obwodowym wywołanym przez wirusy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Model inokulacji w poduszkę stopy jest cennym narzędziem do charakterystyki odpowiedzi neurozapalnych indukowanych przez wirusy in vivo. Niniejszy protokół umożliwia precyzyjną ocenę kinetyki wirusa oraz powiązanych procesów immunopatologicznych inicjowanych w obwodowym układzie nerwowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neurozapalenie
- Infekcje wirusowe
Wstęp
- Badanie koncentruje się na inicjacji i rozwoju odpowiedzi neurozapalnych.
- Wykorzystano w nim model mysi do zbadania infekcji wirusowych.
- Model ten pozwala na maksymalną ocenę kinetyki stanu zapalnego w układzie nerwowym.
- Zrozumienie tych procesów jest kluczowe dla opracowania strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Charakterystyka odpowiedzi neurozapalnej indukowanej przez wirusa.
- Ocena kinetyki wirusa w obwodowym układzie nerwowym.
- Badanie procesów immunopatologicznych związanych z infekcjami wirusowymi.
Zastosowane metody
- Inokulacja podeszwowa myszy C57BL/6.
- Zastosowanie pilnika do paznokci w celu złuszczenia naskórka na poduszce tylnej łapy.
- Miejscowe aplikowanie inokulum wirusa na obszar złuszczony.
- Ocena odpowiedzi neurozapalnych in vivo.
Główne wyniki
- Skuteczne ustanowienie infekcji wirusowej w obwodowym układzie nerwowym.
- Charakterystyka kinetyki odpowiedzi neurozapalnej.
- Identyfikacja zmian immunopatologicznych po infekcji.
- Wykazanie użyteczności modelu w badaniach nad neurozapaleniem.
Wnioski
- Model inokulacji w poduszkę stopy jest skuteczny w badaniu odpowiedzi neurozapalnych.
- Podejście to pogłębia zrozumienie infekcji wirusowych w układzie nerwowym.
- Wyniki mogą być podstawą dla przyszłych strategii terapeutycznych w chorobach neurozapalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model inokulacji w poduszeczkę stopy myszy umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniu szlaków neurozapalnych indukowanych przez alfaherpeswirusy, wspierając walidację punktów uchwytu w badaniach nad neuropatią obwodową. Poprzez kwantyfikację rozprzestrzeniania się wirusa z obwodowego układu nerwowego (PNS) do ośrodkowego układu nerwowego (CNS) oraz korelację ekspresji genów z uwalnianiem cytokin, model ten zapewnia pewność prognostyczną w przesiewowych badaniach leków przeciwwirusowych i przeciwzapalnych. Ten system in vivo wspomaga wstępną selekcję przedkliniczną poprzez identyfikację zależnych od dawki biomarkerów zapalnych istotnych dla HSV, VZV oraz powiązanych z nimi wirusów neurotropowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analiza hipotez terapeutycznych dotyczących wirusowego neurozapalenia poprzez infiltrację neutrofili oraz nadrzędną regulację G-CSF/IL-6 w zwojach korzeni grzbietowych (DRG) i rdzeniu kręgowym.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez korelację ekspresji glikoproteiny gB wirusa PRV z produkcją cytokin prozapalnych w neuronach sensorycznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez modelowanie bólu neuropatycznego zależnego od dawki oraz aktywacji immunologicznej istotnej dla neuropatii indukowanych przez HSV/VZV.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie zestandaryzowanych, mierzalnych homogenatów tkankowych z poduszki stopy, zwojów rdzeniowych (DRG), rdzenia kręgowego i mózgu do profilowania cytokin metodą ELISA.
- Powtarzalność: Zapewnia spójną inokulację wirusową poprzez kontrolowane ścieranie i miareczkowanie, co umożliwia wiarygodną ocenę związków w różnych laboratoriach.
- Skalowalność: Wspiera średnioprzepustowe przesiewanie czynników przeciwzapalnych lub przeciwwirusowych z wykorzystaniem pobierania zwojów DRG z obu stron (ipsilateralnie/kontralateralnie) oraz segmentacji rdzenia kręgowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje mechanizmy wirusowej neuropatii obwodowej mające zastosowanie w reaktywacji HSV/VZV oraz w neuralgii popółpaskowej.
- Ciągłość translacyjna: Łączy kinetykę infekcji w OUN z neurozapaleniem w OUN, wspierając decyzje go/no-go oparte na biomarkerach w rozwoju leków przeciwwirusowych.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Umożliwia pomiar progów G-CSF i IL-6 w homogenizatach tkanek w celu oszacowania okna terapeutycznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten integruje się z wczesnymi procesami badawczymi, dostarczając relewantnych dla danej choroby systemów do testowania hipotez, umożliwiając identyfikację związków wiodących poprzez mierzalne odczyty neurozapalne oraz wspierając walidację przedkliniczną za pomocą czasowo-przestrzennego mapowania cytokin.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków poprzez śledzenie rozprzestrzeniania się PRV z naskórka poduszki stopy do zwojów korzeni grzbietowych (DRG) za pośrednictwem nerwu kulszowego, co umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad celami neuroimmunologicznymi.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy próbek tkanek ze zstandaryzowanymi mianami wirusa, co ułatwia powtarzalne przesiewanie związków immunomodulujących za pomocą testów ELISA i qPCR.
- Analityka: Generuje ilościowe zmienne zależne (G-CSF, IL-6, ekspresja genów wirusowych), umożliwiając statystyczne porównanie efektów leczenia w różnych przedziałach tkankowych.
- Badania translacyjne: Łączy obwodową inokulację wirusową z centralnymi skutkami neuropatycznymi, wspierając ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczne testy skuteczności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę in vivo do badań nad neuropatologią alfaherpeswirusa, ograniczając nadmiarowe opracowywanie modeli w programach przeciwwirusowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w neuropatologii wirusowej poprzez korelację ładunku wirusowego z infiltracją neutrofili i burzami cytokinowymi w tkance nerwowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury inokulacji wirusowej i pobierania tkanek, poprawiając odtwarzalność punktów końcowych stanu zapalnego układu nerwowego pomiędzy laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez dostarczanie wczesnych sygnałów skuteczności dla leków przeciwwirusowych przenikających do OUN oraz środków neuroprotekcyjnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie supresji poziomu IL-6 pochodzącej z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) oraz wzrostu poziomu G-CSF w rdzeniu kręgowym.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w zakresie technik chirurgicznych u myszy, dysekcji nerwów oraz sterylnej obsługi tkanek w celu zapewnienia prawidłowego odzyskania zwojów korzeni grzbietowych (DRG) i rdzenia kręgowego.
- Zależne od infrastruktury do homogenizacji (lizy za pomocą kulek, wirowania) oraz przechowywania w łańcuchu chłodniczym w celu przeprowadzenia dalszych analiz qPCR, ELISA i immunofluorescencji.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie głębokości ścierania, miana wirusa oraz punktów czasowych pobierania próbek, aby zachować spójność wyników odczytów neurozapalnych.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie szczepów wirusowych (np. HSV-1, VZV) i szczepów myszy przy jednoczesnym zachowaniu kinetyki infekcji z poduszeczki stopy do OUN.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność kinetyki gojenia poduszeczek stóp oraz potencjalne efekty zakłócające wynikające ze stresu chirurgicznego w odniesieniu do bazowych poziomów cytokin.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:38
Mouse Footpad Abrasion
1:15
Pseudorabies Virus (PRV) Footpad Inoculation
1:58
Tissue Collection
3:32
Spinal Cord and Dorsal Root Ganglion (DRG) Extraction
5:49
Tissue Homogenization
6:51
Results: Representative Viral-Induced Neuroinflammatory Response Evaluation
8:37
Conclusion
