Ocena stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych za pomocą testu substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego

Tak więc test TBARS najlepiej nadaje się do wewnątrzlaboratoryjnej ogólnej oceny stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych, w której względne poziomy TBARS są bezpośrednio porównywane między próbkami, które były przechowywane i przetwarzane razem. Testy te mają wyjątkowo niski koszt około 3 za przebadanie 96 próbek w porównaniu z dostępnymi na rynku zestawami, które kosztują około 400 i pozwalają na analizę tylko jednej partii próbek. Opisana tutaj metoda może być dalej dostosowywana do konkretnych zastosowań, w tym badań stabilności próbek biologicznych oraz tych, w przypadku których dodanie przeciwutleniaczy lub innych rodzajów środków konserwujących próbki przed analizą jest właściwe lub obowiązkowe.

Aby uniknąć bardzo zmiennych wyników, należy przygotować świeże odczynniki, upewniając się, że pH nie jest większe niż cztery dla odczynników barwiących i usunąć wszelkie pęcherzyki z płytki pęczniejącej nidese przed pomiarem absorbancji. Zacznij od przygotowania 0,8% wodnego roztworu kwasu tiobarbiturowego. Przygotuj pięciomolowy roztwór wodorotlenku sodu, rozpuszczając cztery gramy kulek wodorotlenku sodu w 20 mililitrach wody.

Roztwór należy przechowywać w plastikowym pojemniku. Powinien być świeżo przygotowany do każdej partii. Dodaj cztery gramy kwasu tiobarbiturowego do 450 mililitrów wody dejonizowanej i użyj mieszadła magnetycznego, aby delikatnie go rozpuścić.

Powoli dodawać około czterech mililitrów roztworu wodorotlenku sodu w odstępach co 100 mikrolitrów, sprawdzając pH, gdy cząsteczki kwasu tiobarbiturowego rozpuszczają się. Kontynuuj dodawanie wodorotlenku sodu, aż wszystkie cząstki się rozpuszczą. Sprawdź, czy pH roztworu nie jest wyższe niż cztery za pomocą paska pH, a następnie doprowadzić końcową objętość do 500 mililitrów wodą dejonizowaną i przechowywać wodny roztwór tiobarbiturowego kwasu barbarzyńskiego w temperaturze pokojowej.

Przygotować roztwory wzorcowej MDA bis dimetyloacetalu w dwóch mililitrowych probówkach polipropylenowych z zatrzaskiem. Rozcieńczając 200-mikromolowy roztwór podstawowy w wodzie, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu. Odwiruj próbki.

Oznacz szklane probówki dla próbek, które mają być analizowane, a następnie dodaj 100 mikrolitrów przygotowanej próbki do każdej probówki. Dodaj 200 mikrolitrów 8,1% SDS do każdej próbki i delikatnie obracaj szklaną rurkę okrężnymi ruchami, aby wymieszać. Do każdej próbki dodać 1,5 mililitra 3,5-molowego buforu octanu sodu, a następnie dodać 1,5 mililitra wodnego 0,8% roztworu kwasu tiobarbiturowego.

Doprowadź końcówkę w każdej probówce do czterech mililitrów, dodając 700 mikrolitrów wody dejonizowanej. Szczelnie zakryj szklane rurki i inkubuj je w bloku grzewczym ustawionym na 95 stopni Celsjusza przez godzinę. Przykryj probówki folią aluminiową, aby zapobiec kondensacji, a następnie wyjmij probówki z bloku i inkubuj je na lodzie przez 30 minut.

Po inkubacji odwirować próbki i wzorce w temperaturze 1 500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść 150 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki do studzienki na płytce 96-dołkowej, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety. Zmierzyć absorbancję próbek przy 532 nanometrach, a następnie odjąć średni odczyt absorbentu próbek ślepych od odczytów wszystkich innych absorbentów.

Utwórz krzywą wzorcową i użyj jej do obliczenia nieznanych stężeń próbki. Wygenerowano krzywe wzorcowe MDA bis dimetyloacetolu w celu określenia granic wykrywalności i czułości testu oraz poziomów utlenienia w trzech różnych próbkach biologicznych. Łącznie przeprowadzono 9 testów TBARS na trzech próbkach w różnych dniach.

Aby określić granice wykrywalności, mierzono absorbancję próbek zerowych w trzech różnych dniach. Minimalne stężenie substancji TBARS potrzebne do wytworzenia wykrywalnego sygnału niepochłaniającego szumów wynosi 1,1 mikromola. A czułość testu wynosi około 0,0016 jednostki absorbentów na mikromolowy wzrost stężenia.

Test TBARS może być stosowany do wykrywania zmian w peroksydacji lipidów różnych matryc biologicznych. Aby to zademonstrować, zastosowano chlorek dwóch miedzi do indukcji utleniania in vitro lizatów komórkowych HEPG2 w ludzkiej surowicy i lipoprotein o niskiej gęstości. Test TBARS przeprowadzono na próbkach LDL zawierających EDTA, a poziomy TBARS nie zmieniły się między dwiema próbkami LDL poddanymi działaniu miedzi i niepoddanymi działaniu substancji.

Jednak po usunięciu EDTA przez filtrację spinową, LDL uległ utlenianiu za pośrednictwem miedzi dwóch. Aby zilustrować zakres dynamiczny testu TBARS w surowicy ludzkiej, do próbek dodano stężenie dwóch milimolowych jonów miedzi, co spowodowało sześcio- do siedmiokrotnego wzrostu TBARS. Próbując zastosować ten protokół, nie należy pozostawiać próbek na lodzie dłużej niż 10 minut, a po odwirowaniu pozostawić je w temperaturze pokojowej.

W przypadku partii lub podzbiorów próbek biologicznych, które nie zostały pierwotnie zebrane, przetworzone i przechowywane razem, należy statystycznie ocenić dane pod kątem efektów partii, aby upewnić się, że sztuczne utlenianie nie przyczyniło się do uzyskania wyników. Celowe, mierzalne utlenianie invitro lipoprotein o niskiej gęstości umożliwia zrozumienie, w jaki sposób utlenianie wpływa na biologię funkcjonowania.