Name: Ocena stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych za pomocą testu substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Poznaj metodę TBARS do oceny stresu oksydacyjnego w surowicy i lizatach komórkowych. Ta ekonomiczna technika spektrofotometryczna umożliwia porównanie poziomów peroksydacji lipidów między próbkami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisane tutaj badania były częściowo wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody nr R33 CA217702 oraz programu Initiative for Maximizing Student Development (IMSD). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne stanowisko National Institutes of Health.

Próbki ludzkiej surowicy zostały pobrane od ochotników, którzy wyrazili zgodę na to za zgodą IRB i zgodnie z zasadami wyrażonymi w Deklaracji Helsińskiej. Próbki zostały zakodowane i pozbawione elementów pozwalających na identyfikację przed przekazaniem do laboratorium analitycznego.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Lizaty komórek HepG2
	<ol>
		<li>Wysiewać około 10 x 106 komórek HepG2 na kolbę w 16 kolbach T75 z 14 ml pożywki EMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i rosnąć komórki przez 2 dni.</li>
		<li>Przygotuj bufor RIPA: do probówki o pojemności 50 ml dodaj 1,5 ml 5 M NaCl, 2,5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μl odczynnika NP-40, a następnie doprowadź końcową objętość do 50 ml wodą DI.</li>
		<li>Przygotuj bufor do lizy: podajcie 20 ml buforu RIPA do probówki o pojemności 50 ml i dodajcie 200 μl 100-krotnego roztworu inhibitora proteazy, aby zahamować degradację białek i lipidów. Przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Bufor do lizy jest kompatybilny z odczynnikami TBARS i nie zakłóca absorbancji przy 532 nm. Jeżeli planowane jest użycie innego buforu do lizy lub dodanie dodatkowych składników do buforu do lizy, należy przeprowadzić wstępne badania walidacyjne w celu sprawdzenia, czy składniki buforu do lizy są kompatybilne z testem TBARS.</li>
		<li>Usuń pożywkę zawierającą 10% FBS i umyj komórki 2x 5 ml zimnego, sterylnego 1x PBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu do lizy do kolb T75 zawierających komórki i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) z ciągłym wirowaniem, aby zapewnić dobre rozprowadzenie buforu.</li>
		<li>Zebrać lizaty do odpowiednio oznakowanych probówek polipropylenowych typu snap-cap o pojemności 2 ml i inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
		<li>Wirować lizaty przy 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zebrać resztki komórek, a następnie odessać supernatanty do pojedynczej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Stężyć supernatant lizatu komórkowego czterokrotnie za pomocą Speed Vac w temperaturze 50 °C i ciśnieniu 3 mbar i zrobić porcje po 94 μl każda w probówkach polipropylenowych typu snap-cap o pojemności 2 ml. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ich wykorzystania do utleniania in vitro i/lub testu TBARS. 
		UWAGA: Aby uniknąć zagęszczenia supernatantu lizatu komórkowego, komórki można również odłączyć za pomocą 3 ml 1x trypsyny, zneutralizować 6 ml pożywki i przemyć 2x 5 ml zimnego PBS. Granulki komórkowe można następnie rozpuścić w 250 μl buforu do lizy, a następnie wykonać kroki 1.1.6 i 1.1.7.</li>
		<li>Przygotować 35 mM CuCl2 roztwór podstawowy w kwasie octowym (pH = 4).
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór kwasu octowego (pH = 4): Rozcieńczyć 1 μl lodowatego kwasu octowego w 100 ml wody demineralizowanej (pH powinno wynosić około 4, ale potwierdź to pH-metrem). Dodaj więcej wody lub kwasu octowego, aby dostosować pH do 4.</li>
			<li>Odważyć około 0,1936 g chlorku miedzi II i rozpuścić w 10 ml roztworu kwasu octowego (pH = 4), aby uzyskać 144 mM CuCl2 bulion. Podać 490 μl z tego roztworu i dodać do 1,510 μl kwasu octowego (pH = 4) w celu uzyskania 35 mM roztworu CuCl2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podwielokrotność 6 μl z 35 mM roztworu podstawowego CuCl2 i dodać do sześciu próbek zawierających 94 μl lizatu komórkowego, aby uzyskać końcowe stężenie CuCl2 około 2 mM. Dodać 6 μl roztworu kwasu octowego (pH = 4), który nie ma CuCl2, do sześciu próbek zawierających 94 μl lizatów komórkowych do wykorzystania jako kontrole. Ostateczna objętość lizatu komórkowego powinna wynosić 100 μl, czyli tyle, ile zostanie użyte do testu TBARS. 
		UWAGA: Przygotowanie 35 mM roztworu podstawowego CuCl2 w kwasie octowym (pH = 4) jest konieczne, aby zapobiec wytrącaniu się wodorotlenku miedzi.</li>
		<li>Inkubować próbki w piecu w temperaturze 37 °C przez 24 godziny i przeprowadzić test TBARS na każdej próbce zawierającej końcową objętość 100 μl.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.1.9 i 1.1.11 2 razy w różnych dniach, aby sprawdzić odtwarzalność testu TBARS dla lizatów komórek HepG2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lipoproteiny o niskiej gęstości 
	UWAGA: Zazwyczaj wstępnie oczyszczona lipoproteina o niskiej gęstości (LDL) zawiera pewną ilość EDTA. Użyte tutaj próbki LDL zawierają 0,01% EDTA. EDTA może hamować utlenianie LDL za pośrednictwem Cu(II) in vitro. W związku z tym może być konieczne usunięcie EDTA z próbek LDL przed eksperymentami lub analizą. Kroki 1.2.1–1.2.5 opisują ten proces. 
	UWAGA: Wodorotlenek sodu działa żrąco i powoduje podrażnienia skóry i oczu. Używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
	<ol>
		<li>Podwielokrotność 24 μl z 5,51 mg/ml LDL (stężenie białka określone zmodyfikowaną metodą Lowry'ego przy użyciu BSA jako standardu) do odpowiednio oznakowanych probówek polipropylenowych o pojemności 1 ml typu snap-cap. Przygotować tyle porcji, ile potrzeba i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia w teście utleniania i/lub TBARS.</li>
		<li>Przygotować 10 mM bufor HEPES w 0,15 M NaCl doprowadzonym do pH = 7 za pomocą kulek NaOH: rozpuścić 4,39 g NaCl w 0,49 l wody, następnie dodać 1,19 g HEPES. Dobrze rozpuść za pomocą mieszadła. Dodaj kulki wodorotlenku sodu, aż pH wyniesie 7. Rozcieńczyć do 0,5 l wodą. Przechowywać bufor w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 miesięcy.</li>
		<li>Dodać 476 μl 10 mM buforu HEPES w 0,15 M NaCl (pH = 7) do poddanych próbek LDL, aby uzyskać końcową objętość do 500 μl. Dodać rozcieńczoną próbkę LDL do 0,5 ml odśrodkowego filtra wirowego z odciętą masą cząsteczkową 100K.</li>
		<li>Próbki należy wirować przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, pozostawiając końcową objętość retentatu około 30 μl. Próbki należy rozpuścić w 480 μl buforu 10 mM HEPES w 0,15 M NaCl (pH = 7) i ponownie wirować w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wykonaj ten krok 2 razy, aby uzyskać łącznie cztery odwirowania.</li>
		<li>Umieść urządzenie filtrujące do góry nogami w nowej probówce polipropylenowej o pojemności 2 ml typu snap-cap i odwiruj przy 1000 x g przez 2 minuty, aby pobrać próbkę LDL (objętość końcowa = około 30 μl).</li>
		<li>Podwielokrotną próbkę przelać do odpowiednio oznakowanej probówki o pojemności 1 ml i dodać 20 μl wody do każdej próbki, aby uzyskać końcową objętość 50 μl.</li>
		<li>Przygotowanie 200 μM roztworu podstawowego CuCl2 w kwasie octowym (pH = 4)
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór kwasu octowego (pH = 4): patrz krok 1.1.9.1.</li>
			<li>Przygotować roztwór podstawowy 144 mM CuCl2 (patrz krok 1.1.9.2), następnie podwielokrotność 5,5 μl z 144 mM CuCl2 i rozpuścić w końcowej objętości 4 ml kwasu octowego (pH = 4) w celu uzyskania roztworu 200 μM.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podwielokrotność 2,7 μl z 200 μM roztworu podstawowego CuCl2 i dodać do sześciu próbek zawierających 50 μl LDL, aby uzyskać końcowe stężenie CuCl2 ~10 μM. Dodać 2,7 μl z roztworu kwasu octowego (pH = 4), który nie zawiera CuCl2, do sześciu próbek zawierających 50 μl LDL, które mają być użyte do kontroli.</li>
		<li>Próbki LDL inkubować przez 2 godziny w piecu w temperaturze 37 °C. Po 2 godzinach doprowadzić końcową objętość do 100 μl dla każdej próbki z 10 mM buforem HEPES w 0,15 M NaCl (pH = 7). Natychmiast wykonaj test TBARS.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.2.3–1.2.9 2x w dwóch różnych dniach, aby sprawdzić reprodukcję testu TBARS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Surowica ludzka
	<ol>
		<li>Z próbki surowicy ludzkiej pobrać porcje po 94 μl każda do probówek polipropylenowych typu snap-cap o pojemności 2 ml i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przygotować 35 mM roztwór podstawowy CuCl2 w kwasie octowym (pH = 4): patrz krok 1.1.9.</li>
		<li>Podwielokrotność 6 μl z roztworu podstawowego CuCl2 i dodać do sześciu próbek zawierających 94 μl surowicy ludzkiej, aby uzyskać końcowe stężenie CuCl2 około 2 mM. Dodać 6 μl roztworu kwasu octowego (pH = 4), który nie ma CuCl2, do sześciu próbek zawierających 94 μl surowicy ludzkiej do wykorzystania jako kontrole.</li>
		<li>Próbki surowicy ludzkiej inkubować przez 24 godziny w piecu w temperaturze 37 °C i oznaczać poziomy utlenienia za pomocą testu TBARS (sekcja 4).</li>
		<li>Powtórz kroki 1.3.2–1.3.4 2x w dwóch oddzielnych dniach, aby określić odtwarzalność testu TBARS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynnika
UWAGA: Kwas tiobarbiturowy powoduje podrażnienie skóry i oczu i może być szkodliwy przez wdychanie lub wchłanianie przez skórę. Kwas octowy może uszkodzić narządy wewnętrzne w przypadku wdychania. Przygotuj wszystkie roztwory kwasów w dygestorium.
<ol>
	<li>Przygotowanie 8,1% (w/v) roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS)
	<ol>
		<li>Odważyć 32,4 g SDS i rozpuścić w 350 ml wody demineralizowanej w zlewce. Użyj mieszadła magnetycznego, aby delikatnie rozpuścić SDS i uniknąć tworzenia bąbelków. Doprowadzić końcową objętość do 400 ml za pomocą wody DI i przechowywać roztwór SDS w RT. 
		UWAGA: Tutaj przygotowuje się nadmiar 8,1% roztworu SDS; jednak w przypadku 96 próbek potrzeba tylko około 20 ml 8,1% roztworu SDS. Przygotuj ten roztwór zgodnie z liczbą analizowanych próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 3,5 M buforu octanu sodu (pH = 4)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 100 ml lodowatego kwasu octowego w 350 ml wody demineralizowanej w zlewce. Użyj magnetycznego mieszadła, aby delikatnie go rozpuścić.</li>
		<li>Przygotować 6,5 M roztwór NaOH za pomocą kulek wodorotlenku sodu w wodzie. Rozpuścić 13 g kulek NaOH w 40 ml wody DI i doprowadzić do końcowej objętości 50 ml wodą DI.</li>
		<li>Powoli dodawać około 46 ml 6,5 M roztworu NaOH do roztworu kwasu octowego, mieszając z mieszadłem (powinno to podnieść pH do 4, ale potwierdź, powoli dodając roztwór NaOH podczas odmierzania za pomocą pH-metru).</li>
		<li>Doprowadzić końcową objętość do 500 ml wodą demineralizowaną i przechowywać bufor octanu sodu w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 0,8% wodnego roztworu kwasu tiobarbiturowego (dostosowanego do pH = 4) 
	UWAGA: Na tym etapie przygotowanie kwasu tiobarbiturowego jest zoptymalizowane dla dużych objętości, ponieważ analizowana będzie duża liczba próbek (108 próbek, nie wliczając wzorców). Roztwór ten należy przygotować w zależności od liczby próbek planowanych do analizy.
	<ol>
		<li>Przygotować 5 M roztwór wodorotlenku sodu, używając kulek wodorotlenku sodu i wody: rozpuścić 4 g kulek wodorotlenku sodu w końcowej objętości 20 ml wody. Przechowywać w plastikowym pojemniku. Roztwór ten powinien być świeżo przygotowany dla każdej partii.</li>
		<li>Odważyć 4 g kwasu tiobarbiturowego i dodać 450 ml wody demineralizowanej. Użyj mieszadła magnetycznego, aby delikatnie go rozpuścić. 
		UWAGA: Ten roztwór zostanie ostatecznie doprowadzony do całkowitej objętości 500 ml.</li>
		<li>Rozpuszczając kwas tiobarbiturowy za pomocą mieszadła, dodawać (powoli i kroplami) około 3 ml 5 M roztworu NaOH w odstępach co 100 μl. Po dodaniu roztworu NaOH cząsteczki kwasu tiobarbiturowego zaczną się rozpuszczać.</li>
		<li>Jeżeli cząstki kwasu tiobarbiturowego nadal nie rozpuściły się całkowicie, dodać więcej 5 M roztworu NaOH w odstępach co 100 μl, aż wszystkie cząstki kwasu tiobarbiturowego zostaną całkowicie rozpuszczone. Do tej konkretnej objętości roztworu dodaje się łącznie 4 ml 5 M roztworu NaOH w celu całkowitego rozpuszczenia cząstek kwasu tiobarbiturowego. 
		UWAGA: Przy tym stężeniu kwas tiobarbiturowy nie rozpuści się całkowicie, chyba że pH będzie bliskie 4.</li>
		<li>Przestań dodawać NaOH po całkowitym rozpuszczeniu całego kwasu tiobarbiturowego. Unikaj przekraczania pH 4. Końcowe pH można sprawdzić, pobierając 1 μl z mieszającego roztworu kwasu tiobarbiturowego i umieszczając go na bibułce pH.</li>
		<li>Doprowadzić końcową objętość do 500 ml wodą demineralizowaną i przechowywać wodny roztwór 0,8% kwasu tiobarbiturowego w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie standardowej próbki dialdehydu malonowego bis(acetalu dimetylu)
UWAGA: Dialdehyd malonowy (MDA) jest niestabilny i niedostępny na rynku. Istnieją jednak różne formy chemiczne MDA, które są dostępne na rynku, takie jak sól tetrabutyloamoniowa MDA, bis MDA (octan dimetylu) i bis MDA (acetal dietylowy). Spośród tych trzech form chemicznych stosuje się tutaj MDA bis(octan dimetylu), ponieważ większość badań używa tego samego standardu21,22. W przypadku wyboru pozostałych dwóch form chemicznych MDA należy przeprowadzić uprzednią walidację ich odpowiedniości.
<ol>
	<li>Przygotować 550 μM roztwór podstawowy bis(octanu dimetylu) MDA, rozcieńczając 92 μl czystego bis(octanu dimetylu) MDA w 1 l wody demineralizowanej. Za pomocą mieszadła magnetycznego dokładnie mieszaj roztwór przez 10 minut. Roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 miesiąca.</li>
	<li>Przygotować 200 μM MDA bis(octan dimetylu), rozcieńczając 726 μl z 550 μM bis(octanu dimetylu) MDA w 1274 μl wody demineralizowanej. Ten 200 μM roztwór bis(octanu dimetylu) MDA powinien być przygotowywany na świeżo za każdym razem, gdy przeprowadzany jest test TBRES.</li>
	<li>Przygotowanie krzywej wzorcowej: wziąć osiem probówek polipropylenowych o pojemności 2 ml typu snap-cap i oznaczyć je literami od A do H. Dodać bis(octan dimetylu) MDA z 200 μM i rozcieńczyć w wodzie, jak opisano w tabeli 1.</li>
	<li>Weź osiem szklanych probówek (13 mm x 100 mm) i oznacz je jako A–H, a następnie dodaj 100 μl wzorca do odpowiednich probówek. Wykonać sześć powtórzeń dla wzorca próby ślepej (próbka A) w celu obliczenia granic wykrywalności testu TBARS. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać na nie dłużej niż 1 godzinę.</li>
</ol>
4. Test TBARS
UWAGA: Gdy test TBARS zostanie rozpoczęty, powinien zostać zakończony bez zatrzymywania.
<ol>
	<li>Weź tyle szklanych probówek, ile potrzeba do liczby próbek do analizy i oznacz je nazwami próbek. Następnie dodać 100 μl każdej przygotowanej próbki (jak opisano powyżej) do każdej szklanej probówki.</li>
	<li>Dodać 200 μl 8,1% SDS do każdej próbki i wzorca i delikatnie obracać szklaną probówkę okrężnymi ruchami, aby wymieszać próbkę.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml 3,5 M buforu octanu sodu (pH = 4) do każdej próbki i wzorca.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml wodnego roztworu 0,8% kwasu tiobarbiturowego (pH = 4) do każdej próbki i wzorca.</li>
	<li>Doprowadzić końcową objętość do 4 ml dla każdej próbki i wzorca, dodając 700 μl wody DI.</li>
	<li>Szczelnie zakryj każdą szklaną probówkę i inkubuj w bloku grzewczym ustawionym na 95 °C przez 1 godzinę. Przykryj szklane rurki folią aluminiową, aby zapobiec kondensacji pary wodnej na górze probówek.</li>
	<li>Wyjmij szklane rurki z bloku grzewczego i inkubuj na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki i wzorce przy 1500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu szklane probówki zawierające próbki i wzorce należy przechowywać w temperaturze RT. 
	UWAGA: Trzymanie próbek na lodzie lub w temperaturze 4 °C spowoduje wytrącenie się całej próbki lub wzorca.</li>
	<li>Natychmiast po odwirowaniu podamy 150 μl supernatantu z każdej probówki i umieścimy w oddzielnym dołku na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Usuń wszelkie pęcherzyki z każdej studzienki za pomocą końcówki pipety. 
	UWAGA: Obecność pęcherzyków spowoduje niespójne odczyty absorbancji, co doprowadzi do wysokiej niedokładności testu.</li>
	<li>Odczyt absorbancji przy 532 nm. Odjąć średni odczyt absorbancji próbek ślepych od wszystkich innych odczytów absorbancji.</li>
	<li>Utwórz krzywą wzorcową, wykreślając odczyty absorbancji odjęte od ślepej próby przy 532 nm w porównaniu ze znanym stężeniem każdego wzorca. Dopasuj punkty danych przy użyciu regresji liniowej. Obliczyć nieznane stężenia próbki, korzystając z równania linii regresji liniowej uzyskanej z krzywej standardowej.</li>
</ol>

<ol><li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lipid+peroxidation+by+measuring+malondialdehyde+%28MDA%29+and+relatives+in+biological+samples%3A+Analytical+and+biological+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges.</a> Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).</li>
<li>Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+of+linoleic+acid+hydroperoxide+with+thiobarbituric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid.</a> Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoid+Using+Spectrophotometric+Determination+of+Malondialdehyde+as+a+Biomarker+of+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress.</a> Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).</li>
<li>Morales, M., Munné-Bosch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malondialdehyde%3A+Facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Malondialdehyde: Facts and artifacts.</a> Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).</li>
<li>Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+estimating+lipid+peroxidation%3A+An+analysis+of+merits+and+demerits%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits.</a> Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).</li>
<li>Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDasgupta%2C+A+%22Antioxidants+in+Food%2C+Vitamins+and+Supplements%22">Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements</a>. , 19-40 (2014).</li>
<li>Wade, C. R., van Rij, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+malondialdehyde%2C+lipid+peroxides%2C+and+the+thiobarbituric+acid+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction.</a> Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+malondialdehyde+as+a+biomarker+of+oxidative+stress+in+psychological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BioImpacts%22%5BJournal%5D)">Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders.</a> BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+Concerning+%22Comparison+of+Airway+and+Systemic+Malondialdehyde+Levels+for+Assessment+of+Oxidative+Stress+in+Cystic+Fibrosis%22%5BTitle%5D)+AND+%22Lung%22%5BJournal%5D)">Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis".</a> Lung. 193 (5), 867-868 (2015).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+on+%22Salivary+8-hydroxy-2-deoxyguanosine%2C+malondialdehyde%2C+vitamin+C%2C+and+vitamin+E+in+oral+pre-cancer+and+cancer%3A+diagnostic+value+and+free+radical+mechanism+of+action%22%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Oral+Investigations%22%5BJournal%5D)">Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action".</a> Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+on+%22An+Investigation+into+the+Serum+Thioredoxin+Superoxide+Dismutase%2C+Malondialdehyde%2C+and+Advanced+Oxidation+Protein+Products+in+Patients+with+Breast+Cancer%22%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer".</a> Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).</li>
<li>Azizi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+analytical+procedures+on+the+repeatability+of+malondialdehyde+determinations+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples.</a> Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).</li>
<li>Azizi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+reason+for+the+low+reproducibility+of+malondialdehyde+determinations+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples.</a> Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).</li>
<li>Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+steps+in+fluorometric+determination+of+thiobarbituric+acid-+reactive+substances+in+serum%3A+Importance+of+extraction+pH+and+influence+of+sample+preservation+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage.</a> Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).</li>
<li>Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+analysis+of+malondialdehyde+in+human+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids.</a> Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).</li>
<li>Buege, J. A., Aust, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsomal+lipid+peroxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Microsomal lipid peroxidation.</a> Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).</li>
<li>Gutteridge, J. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-Radical+Damage+to+Lipids%2C+Amino-Acids%2C+Carbohydrates+and+Nucleic-Acids+Determined+by+Thiobarbituric+Acid+Reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity.</a> International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).</li>
<li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+malondialdehyde+as+an+oxidative+stress+biomarker+in+oral+and+systemic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res+Dent+Clin+Dent+Prospects%22%5BJournal%5D)">Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases.</a> J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).</li>
<li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture%3A+How+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li>
<li>Lee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+oxidative+stress+in+human+cardiovascular+disease%3A+methodological+aspects+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations.</a> Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).</li>
<li>Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+lipoprotein+cytotoxicity+induced+by+free+radical+peroxidation+of+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid.</a> Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).</li>
<li>Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-thiobarbituric+acid+test+for+lipid+oxidation+in+food%3A+Synthesis+and+spectroscopic+study+of+2-thiobarbituric+acid-malonaldehyde+adduct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Oil+Chemists+Society%22%5BJournal%5D)">2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct.</a> Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).</li>
<li>Shibata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lipid+peroxidation+product+as+a+potential+trigger+of+the+p53+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).</li>
<li>Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C+DA+%22Fundamentals+of+Analytical+Chemistry.+9th+ed%22">Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed</a>. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).</li>
<li>Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C+DA+%22Principles+of+Instrumental+Analysis.+6th+ed%22">Principles of Instrumental Analysis. 6th ed</a>. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).</li>
<li>Seibig, S., Van Eldik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+%5BFeII%28edta%29%5D+Oxidation+by+Molecular+Oxygen+Revisited.+New+Evidence+for+a+Multistep+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism.</a> Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).</li>
<li>Jeffs, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-S-Cys-Albumin%3A+A+Lab+Test+that+Quantifies+Cumulative+Exposure+of+Archived+Human+Blood+Plasma+and+Serum+Samples+to+Thawed+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).</li>
<li>Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYagi%2C+K+%22Free+Radical+and+Antioxidant+Protocols.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology</a>. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).</li>
<li>Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reaction+between+thiobarbituric+acid+and+the+oxidation+products+of+certain+lipides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides.</a> Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).</li>
<li>Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiobarbituric+acid+reagent+as+a+test+for+the+oxidation+of+unsaturated+fatty+acids+by+various+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents.</a> Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).</li>
<li>Kwon, T. W., Watts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+malonaldehyde+by+ultraviolet+spectrophotometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry.</a> Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).</li>
<li>Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biochemistry+of+4-hydroxynonenal%2C+malonaldehyde+and+related+aldehydes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes.</a> Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).</li>
<li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).</li>
<li>Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+analysis+of+malondialdehyde+in+human+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids.</a> Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).</li>
<li>Jo, C., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorometric+Analysis+of+2-Thiobarbituric+Acid+Reactive+Substances+in+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey.</a> Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).</li>
<li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+validation+and+biomedical+applications+of+stable-isotope+dilution+GC-MS+and+GC-MS%2FMS+techniques+for+circulating+malondialdehyde+%28MDA%29+after+pentafluorobenzyl+bromide+derivatization%3A+MDA+as+a+biomarker+of+oxidative+stress+and+its+relation+to+15%28S%29-8-iso-prostaglandin+F2%CE%B1+and+nitric+oxide+%28NO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO).</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).</li>
<li>Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+artifactual+elevation+of+lipid+peroxidation+products+%28F+2-isoprostanes%29+in+plasma+during+collection+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage.</a> Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).</li>
<li>Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+instability+of+glycated+albumin%3A+A+role+for+autoxidative+glycation%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).</li>
<li>Lee, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malondialdehyde+in+Stored+Plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Malondialdehyde in Stored Plasma.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).</li>
<li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+GC-MS%2FMS+measurement+of+malondialdehyde+and+4-hydroxy-2-nonenal+in+human+plasma%3A+Effects+of+long-term+L-arginine+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration.</a> Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Pomimo swoich ograniczeń 1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 i braku przydatności do porównania między laboratoriami, test TBARS jest jednym z najstarszych <...

Peroksydacja lipidów to proces, w którym wolne rodniki, takie jak reaktywne formy tlenu i reaktywne formy azotu, atakują podwójne wiązania węgiel-węgiel w lipidach, proces, który polega na abstrahowaniu wodoru z węgla i wstawieniu cząsteczki tlenu. Proces ten prowadzi do powstania mieszaniny złożonych produktów, w tym nadtlenków lipidowych i wodoronadtlenków jako produktów pierwotnych, a także dialdehydu malonowego (MDA) i 4-hydroksynonenalu jako dominujących produktów wtórnych<klasa sup="xref">1.
MDA jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych jako marker peroksydacji lipidów ze względu na łatwą reakcję z kwasem tiobarbiturowym (TBA). Reakcja prowadzi do powstania MDA-TBA2, koniugatu, który absorbuje w widmie widzialnym przy 532 nm i wytwarza czerwono-różowy kolor2. Inne cząsteczki pochodzące z peroksydacji lipidów oprócz MDA mogą również reagować z TBA i absorbować światło o długości fali 532 nm, przyczyniając się do ogólnego pomiaru sygnału absorpcji. Podobnie, MDA może reagować z większością innych głównych klas biomolekuł, potencjalnie ograniczając jego dostępność do reakcji z TBA3,4. W związku z tym ten tradycyjny test jest po prostu uważany za mierzący "substancje reagujące z kwasem tiobarbiturowym" lub TBARS5.
Przy prawidłowym zastosowaniu i interpretacji, test TBARS jest ogólnie uważany za dobry wskaźnik ogólnego poziomu stresu oksydacyjnego w próbce biologicznej6. Niestety, jak udokumentowali Khoubnasabjafari i inni, test TBARS jest często przeprowadzany i interpretowany w sposób, który ułatwia wątpliwe wnioski3,4,7,8,9,10,11. Przyczyny tego stanu rzeczy są przede wszystkim zakorzenione w zmiennych przedanalitycznych związanych z próbką oraz braku odporności testu, która uniemożliwia pozornie niewielkie zmiany w protokole testu bez istotnych zmian w wynikach testu1,7,12,13.
Zmienne przedanalityczne związane z obsługą i przechowywaniem próbek biologicznych (np. osocze krwi przechowywane tymczasowo w temperaturze -20 °C)14,15 mogą mieć duży wpływ na wyniki testów TBARS class16,17; do tego stopnia, że wyniki testów TBARS nie powinny być porównywane między różnymi laboratoriami, chyba że jest to uzasadnione wyraźnymi międzylaboratoryjnymi danymi analitycznymi. To zalecenie jest podobne do tego, jak western blot jest powszechnie używany i interpretowany. Porównania gęstości prążków są ważne dla badań wewnątrz-plamowych i być może wewnątrzlaboratoryjnych, ale porównywanie gęstości prążków między laboratoriami jest ogólnie uważane za nieprawidłową praktykę.
Niektórzy badacze sugerowali, że MDA mierzone za pomocą testu TBARS po prostu nie spełnia kryteriów analitycznych lub klinicznych wymaganych od akceptowalnego biomarkera3,9,10,18,19. Rzeczywiście, gdyby test nie został opracowany ponad 50 lat temu, prawdopodobnie nie zyskałby tak powszechnego zastosowania i milczącej akceptacji, jak ma dzisiaj. Chociaż istnieją inne testy o większej czułości analitycznej, swoistości i odporności stosowane do określania stresu oksydacyjnego, test TBARS oparty na absorbancji przy 532 nm pozostaje zdecydowanie jednym z najczęściej stosowanych testów do oznaczania peroksydacji lipidów20, a tym samym oceny stresu oksydacyjnego.
Test TBARS można znaleźć tylko jako drogi zestaw (ponad 400 dolarów amerykańskich), w którym instrukcje nie zawierają szczegółowych informacji na temat większości stężeń używanych odczynników. Dodatkowo dostarczone odczynniki mogą być użyte tylko do jednego eksperymentu, ponieważ w jednym zestawie można wykonać tylko jedną kolorymetryczną krzywą wzorcową. Może to być problematyczne dla badaczy, którzy zamierzają określić poziomy utlenienia w kilku próbkach w różnych punktach czasowych, ponieważ ta sama krzywa standardowa nie może być używana w wielu momentach. W związku z tym należy zakupić wiele zestawów do wielu eksperymentów. Obecnie, o ile nie zostanie zakupiony drogi zestaw, nie ma szczegółowego protokołu dotyczącego wykonywania testu TBARS. Niektórzy badacze w przeszłości niejasno opisywali, jak przeprowadzić test TBARS21,22, ale w literaturze nie jest dostępny ani w pełni szczegółowy protokół, ani obszerny film na temat przeprowadzania testu TBARS bez drogiego zestawu.
Tutaj przedstawiamy szczegółową, analitycznie zweryfikowaną metodologię dotyczącą tego, jak przeprowadzić test TBARS w prosty, powtarzalny i tani sposób. Zmiany w peroksydacji lipidów ludzkiej surowicy, lizatów HepG2 i lipoprotein o niskiej gęstości po leczeniu jonami Cu(II) przedstawiono jako ilustracyjne zastosowania do testu TBAR. Wyniki pokazują, że ten test TBARS jest spójny i powtarzalny na co dzień.

<table><tbody><tr><td>1x Sterylny PBS pH 7,4 1 L</td><td>VWR, PA</td> 101642<td>--262</td><td>odczynnik do lizy komórek</td></tr><tr><td>50 ml samostojąca probówka wirówkowa</td><td>Corning, NY</td><td>CLS430897</td><td>Materiał ogólny</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa, nieobrobiona, przezroczysta, z pokrywką, niesterylna</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA</td><td>280895</td><td>Do pomiaru absorbancji</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0,5 100 kD odśrodkowy filtr wirowy</td><td>Fisher Scientific, NH</td><td>UFC510024</td><td>Oczyszczanie LDL</td></tr><tr><td>Nasadki do probówek szklanych</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA</td><td>14-930-15D</td><td>do testu TBARS</td></tr><tr><td>Chlorek miedzi II</td><td>SIGMA, MO</td><td>222011-250G</td><td>do indukcji utleniania</td></tr><tr><td>Probówki hodowlane, jednorazowe, z nakrętką, szkło borokrzemianowe (13 x 100 mm)</td><td>VWR, PA</td><td>53283-800</td><td>do testu TBARS</td></tr><tr><td>Minimalna niezbędna pożywka Eagle'a (EMEM)</td><td>ATCC, VA</td><td>HB-8065</td><td>Pożywka komórkowa HepG2</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 ml</td><td>eppendorf, Nowy Jork</td><td>22363204</td><td>Materiał ogólny</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf Safe-Lock, 2,0 ml</td><td>Genesee Sceitific, CA</td><td>22363352</td><td>Materiał ogólny</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu USA Źródło</td><td>: Omega Scientific, CA</td><td>FB-11</td><td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>SIGMA, MO</td><td>27225-1L-R</td><td>TBARS Odczynnik</td></tr><tr><td>Halt Inhibitor proteazy Koktajl (100x)</td><td>Thermo Scientific, MA</td><td>87786</td><td>odczynnik do lizy komórek</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA, MO</td><td>H3375-250G</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>LDL Komórki HepG2</td><td>ATCC, VA</td><td>HB-8065</td><td>Prototyp matrycy biologicznej</td></tr><tr><td>Kwas hydrokwarowy (HCl)</td><td>Fisher Scientific, odczynnik</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>do lizy komórek NH A144-212Wirówka Legend Micro 17</td><td>Thermo Scientific, MA</td><td>75002431</td><td>Materiał ogólny</td></tr><tr><td>Lipoproteiny o niskiej gęstości, osocze ludzkie</td><td>Badania i Technologia, GA</td><td>12-16-120412</td><td>Prototyp matrycy biologicznej</td></tr><tr><td>Mieszacze magnetyczne, ośmiokąt 6-Asortyment</td><td>VWR, PA</td><td>58948-025</td><td>Materiał ogólny</td></tr><tr><td>Dialdehyd malonowy bis (octan dimetylu)</td><td>SIGMA, MO</td><td>8207560250</td><td>TBARS Standardowy</td></tr><tr><td>spektrofotometr mikropłytkowy Multiskan Go</td><td>Fisher Scientific, NH</td><td>51119200</td><td>Do pomiaru absorbancji</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>EMD Millipore Corp, MA</td><td>492016-100ML</td><td>odczynnik do lizy komórek</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>SIGMA, MO</td><td>S7653-1KG</td><td>odczynnik do lizy komórek</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>SIGMA, MO</td><td>436143-100G</td><td>Odczynnik TBARS</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>SIGMA, MO</td><td>367176-2.5KG</td><td>Odczynnik TBARS</td></tr><tr><td>Koncentrator SpeedVac</td><td>Thermo Scientific, MA</td><td>SC250EXP</td><td>Do koncentratoryzacja lizatów komórkowych</td></tr><tr><td>Kolba T-75, poddawana działaniu kultur tkankowych, 250 mL, z nasadką filtrującą</td><td>USA Scientific, FL</td><td>658175</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Kwas tiobarbiturowy</td><td>SIGMA, MO</td><td>T5500-100G</td><td>TBARS Odczynnik</td></tr><tr><td>TRIS na bazie</td><td>Fluka, GA</td><td>93362</td><td>odczynnik do lizy komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna (1x)</td><td>VWR, PA</td><td>16777-166</td><td>Do odłączania komórek HepG2</td></tr></tbody></table>

ocena stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych za pomocą testu substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego

Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay

Pomimo ograniczonej specyfiki analitycznej i wytrzymałości, test substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego (TBARS) jest szeroko stosowany jako ogólny wskaźnik peroksydacji lipidów w płynach biologicznych. Często uważa się, że jest dobrym wskaźnikiem poziomu stresu oksydacyjnego w próbce biologicznej, pod warunkiem, że próbka była odpowiednio obsługiwana i przechowywana. Test polega na reakcji produktów peroksydacji lipidów, przede wszystkim dialdehydu malonowego (MDA), z kwasem tiobarbiturowym (TBA), co prowadzi do powstania adduktówMDA-TBA2 zwanych TBARS. TBARS daje czerwono-różowy kolor, który można zmierzyć spektrofotometrycznie przy 532 nm. Test TBARS przeprowadza się w warunkach kwaśnych (pH = 4) i w temperaturze 95 °C. Czysty MDA jest niestabilny, ale warunki te pozwalają na uwolnienie MDA z MDA bis(octan dimetylu), który jest stosowany jako wzorzec analityczny w tej metodzie. Test TBARS jest prostą metodą, którą można wykonać w ciągu około 2 godzin. Przygotowanie odczynników do oznaczania jest szczegółowo opisane tutaj. Badacze dbający o budżet mogą używać tych odczynników do wielu eksperymentów przy niskich kosztach, zamiast kupować drogi zestaw testowy TBARS, który pozwala na skonstruowanie tylko jednej krzywej wzorcowej (a zatem może być użyty tylko w jednym eksperymencie). Zastosowanie tego testu TBARS wykazano w surowicy ludzkiej, lipoproteinach o niskiej gęstości i lizatach komórkowych. Test jest spójny i powtarzalny, a granice wykrywalności mogą zostać osiągnięte na poziomie 1,1 μM. Podano zalecenia dotyczące stosowania i interpretacji spektrofotometrycznego testu TBARS.

W warunkach kwasowych (pH = 4) i w temperaturze 95 °C malonodialdehyd (MDA) bis(dimetyloacetal) tworzy MDA23. MDA oraz blisko spokrewnione związki chemiczne reagują z dwiema cząsteczkami kwasu tiobarbiturowego (TBA), tworząc związki zwane substancjami reagującymi z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), które nadają barwę czerwoną do różowej i wykazują maksimum absorbancji λmax przy 532 nm (Rysunek 1, Rysunek 2). Używając MDA bis(dime...

Celem testu substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego jest ocena stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych poprzez pomiar produkcji produktów peroksydacji lipidów, głównie dialdehydu malonowego, przy użyciu spektrofotometrii o długości fali widzialnej przy długości fali 532 nm. Opisana tutaj metoda może być stosowana do ludzkiej surowicy, lizatów komórkowych i lipoprotein o niskiej gęstości.

Ocena stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych za pomocą testu substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego

Despite its limited analytical specificity and ruggedness, the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay has been widely used as a generic ...

Tak więc test TBARS najlepiej nadaje się do wewnątrzlaboratoryjnej ogólnej oceny stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych, w której względne poziomy TBARS są bezpośrednio porównywane między próbkami, które były przechowywane i przetwarzane razem. Testy te mają wyjątkowo niski koszt około 3 za przebadanie 96 próbek w porównaniu z dostępnymi na rynku zestawami, które kosztują około 400 i pozwalają na analizę tylko jednej partii próbek. Opisana tutaj metoda może być dalej dostosowywana do konkretnych zastosowań, w tym badań stabilności próbek biologicznych oraz tych, w przypadku których dodanie przeciwutleniaczy lub innych rodzajów środków konserwujących próbki przed analizą jest właściwe lub obowiązkowe.Aby uniknąć bardzo zmiennych wyników, należy przygotować świeże odczynniki, upewniając się, że pH nie jest większe niż cztery dla odczynników barwiących i usunąć wszelkie pęcherzyki z płytki pęczniejącej nidese przed pomiarem absorbancji. Zacznij od przygotowania 0,8% wodnego roztworu kwasu tiobarbiturowego. Przygotuj pięciomolowy roztwór wodorotlenku sodu, rozpuszczając cztery gramy kulek wodorotlenku sodu w 20 mililitrach wody.Roztwór należy przechowywać w plastikowym pojemniku. Powinien być świeżo przygotowany do każdej partii. Dodaj cztery gramy kwasu tiobarbiturowego do 450 mililitrów wody dejonizowanej i użyj mieszadła magnetycznego, aby delikatnie go rozpuścić.Powoli dodawać około czterech mililitrów roztworu wodorotlenku sodu w odstępach co 100 mikrolitrów, sprawdzając pH, gdy cząsteczki kwasu tiobarbiturowego rozpuszczają się. Kontynuuj dodawanie wodorotlenku sodu, aż wszystkie cząstki się rozpuszczą. Sprawdź, czy pH roztworu nie jest wyższe niż cztery za pomocą paska pH, a następnie doprowadzić końcową objętość do 500 mililitrów wodą dejonizowaną i przechowywać wodny roztwór tiobarbiturowego kwasu barbarzyńskiego w temperaturze pokojowej.Przygotować roztwory wzorcowej MDA bis dimetyloacetalu w dwóch mililitrowych probówkach polipropylenowych z zatrzaskiem. Rozcieńczając 200-mikromolowy roztwór podstawowy w wodzie, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu. Odwiruj próbki.Oznacz szklane probówki dla próbek, które mają być analizowane, a następnie dodaj 100 mikrolitrów przygotowanej próbki do każdej probówki. Dodaj 200 mikrolitrów 8,1% SDS do każdej próbki i delikatnie obracaj szklaną rurkę okrężnymi ruchami, aby wymieszać. Do każdej próbki dodać 1,5 mililitra 3,5-molowego buforu octanu sodu, a następnie dodać 1,5 mililitra wodnego 0,8% roztworu kwasu tiobarbiturowego.Doprowadź końcówkę w każdej probówce do czterech mililitrów, dodając 700 mikrolitrów wody dejonizowanej. Szczelnie zakryj szklane rurki i inkubuj je w bloku grzewczym ustawionym na 95 stopni Celsjusza przez godzinę. Przykryj probówki folią aluminiową, aby zapobiec kondensacji, a następnie wyjmij probówki z bloku i inkubuj je na lodzie przez 30 minut.Po inkubacji odwirować próbki i wzorce w temperaturze 1 500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść 150 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki do studzienki na płytce 96-dołkowej, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety. Zmierzyć absorbancję próbek przy 532 nanometrach, a następnie odjąć średni odczyt absorbentu próbek ślepych od odczytów wszystkich innych absorbentów.Utwórz krzywą wzorcową i użyj jej do obliczenia nieznanych stężeń próbki. Wygenerowano krzywe wzorcowe MDA bis dimetyloacetolu w celu określenia granic wykrywalności i czułości testu oraz poziomów utlenienia w trzech różnych próbkach biologicznych. Łącznie przeprowadzono 9 testów TBARS na trzech próbkach w różnych dniach.Aby określić granice wykrywalności, mierzono absorbancję próbek zerowych w trzech różnych dniach. Minimalne stężenie substancji TBARS potrzebne do wytworzenia wykrywalnego sygnału niepochłaniającego szumów wynosi 1,1 mikromola. A czułość testu wynosi około 0,0016 jednostki absorbentów na mikromolowy wzrost stężenia.Test TBARS może być stosowany do wykrywania zmian w peroksydacji lipidów różnych matryc biologicznych. Aby to zademonstrować, zastosowano chlorek dwóch miedzi do indukcji utleniania in vitro lizatów komórkowych HEPG2 w ludzkiej surowicy i lipoprotein o niskiej gęstości. Test TBARS przeprowadzono na próbkach LDL zawierających EDTA, a poziomy TBARS nie zmieniły się między dwiema próbkami LDL poddanymi działaniu miedzi i niepoddanymi działaniu substancji.Jednak po usunięciu EDTA przez filtrację spinową, LDL uległ utlenianiu za pośrednictwem miedzi dwóch. Aby zilustrować zakres dynamiczny testu TBARS w surowicy ludzkiej, do próbek dodano stężenie dwóch milimolowych jonów miedzi, co spowodowało sześcio- do siedmiokrotnego wzrostu TBARS. Próbując zastosować ten protokół, nie należy pozostawiać próbek na lodzie dłużej niż 10 minut, a po odwirowaniu pozostawić je w temperaturze pokojowej.W przypadku partii lub podzbiorów próbek biologicznych, które nie zostały pierwotnie zebrane, przetworzone i przechowywane razem, należy statystycznie ocenić dane pod kątem efektów partii, aby upewnić się, że sztuczne utlenianie nie przyczyniło się do uzyskania wyników. Celowe, mierzalne utlenianie invitro lipoprotein o niskiej gęstości umożliwia zrozumienie, w jaki sposób utlenianie wpływa na biologię funkcjonowania.

evaluation-oxidative-stress-biological-samples-using-thiobarbituric

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Poziom reaktywnych form tlenu wzrasta, gdy komórki znajdują się w warunkach stresowych. Przedstawiamy tutaj przykład barwienia 3',3'-diaminobenzydyną oraz znakowania cysTMT i spektrometrii mas w celu profilowania proteomu redoks w liściach pomidora traktowanych Pseudomonas syringae.

Profilowanie proteomu redoks grup tiolowych z wykorzystaniem spektrometrii mas z tagowaniem izotopowym

Ten film demonstruje test substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego (TBARS) do oceny stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych.

Test substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym w celu oceny stresu oksydacyjnego w surowicy ludzkiej

Ten film demonstruje test punktowy dostosowany do oceny reakcji szczepów bakteryjnych na stres oksydacyjny. Niektóre szczepy wytwarzają pyomelaninę, pigment przeciwutleniający. I odwrotnie, szczepy poddane działaniu czynnika testowego, prowadzące do zmniejszenia produkcji pyomelaniny, wykazują zwiększoną podatność na stres oksydacyjny, co skutkuje zmniejszoną żywotnością komórek w porównaniu ze szczepami wytwarzającymi pyomelaninę.

Test punktowy do oceny reakcji na stres oksydacyjny w szczepach bakteryjnych

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

W tym artykule przedstawiono znormalizowane metody ekotoksykologiczne do oceny biomarkerów u neotropikalnych gatunków bezogonowych. W szczególności w artykule tym szczegółowo opisano kilka metodologii w różnych skalach oceny ekotoksykologicznej, takich jak poziom genetyczny, komórkowo-histologiczny, biochemiczny, morfologiczny i indywidualny.

Metodologie ekotoksykologiczne do oceny biomarkerów w różnych skalach u anuranów neotropikalnych

Kwantyfikacja zarówno utlenionych, jak i zredukowanych form glutationu (odpowiednio GSSG i GSH) została osiągnięta dzięki zastosowaniu aldehydu ortoftaldehydu (OPA). OPA staje się wysoce fluorescencyjny po sprzęgnięciu z GSH, ale nie jest w stanie sprzęgnąć GSSG, dopóki nie zostanie zredukowany. W tym miejscu opisujemy test wieloparametryczny do ilościowego określenia obu przy użyciu kwantyfikacji białka w celu normalizacji.

Szybkie oznaczanie ilościowe utlenionych i zredukowanych form glutationu przy użyciu orto-ftaldehydu w hodowanych komórkach ssaków in vitro

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Opisano metodę syntezy wrażliwych na powietrze tytanowych i wanadowych środków przeciwnowotworowych, wraz z oceną ich aktywności cytotoksycznej w stosunku do ludzkiej linii komórek rakowych za pomocą testu MTT.

Przeciwnowotworowe kompleksy metalowe: synteza i ocena cytotoksyczności za pomocą testu MTT

Poznaj metodę TBARS do oceny stresu oksydacyjnego w surowicy i lizatach komórkowych. Ta ekonomiczna technika spektrofotometryczna umożliwia porównanie poziomów peroksydacji lipidów między próbkami.

Ocena stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych za pomocą testu substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego

Przeglądaj więcej filmów