Name: Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę ChIP-exo do mapowania interakcji białko-DNA w neuronach mysich komórek macierzystych. Technika zapewnia rozdzielczość bliską parze zasad i wysoki stosunek sygnału do szumu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkowi laboratorium Rhee za udostępnienie niepublikowanych danych i cennych dyskusji. Prace te były wspierane przez grant Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) RGPIN-2018-06404 (HR).

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatten%2C+DK+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biology. 14 (12), 147(2013).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).</li>
<li>Starick, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+signal+associated+with+DNA-binding+motifs+provides+insight+into+the+genomic+binding+of+the+glucocorticoid+receptor+and+cooperating+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors.</a> Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).</li>
<li>Han, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Organization+of+GATA1+and+TAL1+Determined+at+High+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution.</a> Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+Structures+and+Nucleosome+Asymmetry+across+a+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome.</a> Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).</li>
<li>Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+regulon+of+a+GntR+family+regulator+via+transcriptome+and+ChIP-exo+analyses+and+its+contribution+to+virulence+in+Xanthomonas+citri%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri.</a> Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+assessment+of+transcriptional+regulation+on+central+carbon+metabolism+by+Cra+and+CRP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP.</a> Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).</li>
<li>Niu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+binding+interactions+of+mouse+and+human+constitutive+androstane+receptors+reveal+novel+gene+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets.</a> Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).</li>
<li>Uuskula-Reimand, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+beta+interacts+with+cohesin+and+CTCF+at+topological+domain+borders%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders.</a> Genome Biology. 17, (2016).</li>
<li>Rhee, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Terminal+Effector+Genes+in+Mammalian+Neurons+Is+Maintained+by+a+Dynamic+Relay+of+Transient+Enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers.</a> Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> Plos One. 11 (2), (2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+Gene+Network+Mediates+Cellular+Response+to+the+Anticancer+PAD+Inhibitor+YW3-56+in+Triple-Negative+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).</li>
<li>Barfeld, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Myc+Antagonises+the+Transcriptional+Activity+of+the+Androgen+Receptor+in+Prostate+Cancer+Affecting+Key+Gene+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Ebiomedicine%22%5BJournal%5D)">c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks.</a> Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).</li>
<li>McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+ChIP-exo+profiling+of+Pol+II%2C+H2A.Z%2C+and+H3K4me3+in+human+K562+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells.</a> Scientific Data. 5, 180030(2018).</li>
<li>Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+transcriptional+profiling+of+triple+negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer.</a> Scientific Data. 6, 190033(2019).</li>
<li>Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+ChIP-exo+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Simplified ChIP-exo assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 2842(2018).</li>
<li>Perreault, A. A., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ChIP-exo+Method%3A+Identifying+Protein-DNA+Interactions+with+Near+Base+Pair+Precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Immunoprecipitation+%28ChIP%29+of+Histone+Modifications+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).</li>
<li>Terranova, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+Platform+for+Genome-wide+Mapping+of+Chromatin+States+Using+High-throughput+ChIP-sequencing+in+Tumor+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).</li>
<li>Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Parameters+for+Efficient+Sonication+and+Improved+Chromatin+Immunoprecipitation+of+High+Molecular+Weight+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins.</a> PLos One. 11 (1), (2016).</li>
<li>Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+protein-DNA+binding+event+subtypes+in+ChIP-exo+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data.</a> Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).</li>
<li>Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWR-C+and+INO80+chromatin+remodelers+recognize+nucleosome-free+regions+near+%2B1+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes.</a> Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).</li>
<li>Vinayachandran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+precise+reprogramming+of+yeast+protein-genome+interactions+in+response+to+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock.</a> Genome Research. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole ChIP, po którym następuje trawienie egzonukleazą, jest wykorzystywane do uzyskania bibliotek DNA do identyfikacji interakcji białko-DNA w komórkach ssaków w bardzo wysokiej rozdzielczości mapowania. Na jakość eksperymentu ChIP-exo składa się wiele zmiennych. Krytyczne parametry eksperymentalne obejmują jakość przeciwciał, optymalizację sonikacji oraz liczbę cykli LM-PCR. Te krytyczne parametry eksperymentalne są również tym, co może ograniczać eksperymenty ChIP-exo i zostaną omówione poniżej.
<p class...

Lokalizacje interakcji białko-DNA dostarczają wglądu w mechanizmy regulacji genów. Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChIP-seq) jest stosowana od dekady do badania interakcji białko-DNA w całym genomie w żywych komórkach1,2. Jednak metoda ChIP-seq jest ograniczona przez niejednorodność fragmentacji DNA i zanieczyszczenie niezwiązanego DNA, które prowadzą do niskiej rozdzielczości mapowania, wyników fałszywie dodatnich, nieodebranych połączeń i niespecyficznego sygnału tła. Połączenie ChIP z trawieniem egzonukleazą (ChIP-exo) ulepsza metodę ChIP-seq poprzez przycinanie DNA ChIP do punktów sieciowania białko-DNA, zapewniając rozdzielczość bliską parom zasad i niski sygnał tła3,4,5. Znacznie lepsza rozdzielczość mapowania i niskie tło zapewniane przez ChIP-exo pozwalają na dokładne i kompleksowe określenie lokalizacji wiązania białko-DNA w całym genomie. ChIP-exo jest w stanie ujawnić funkcjonalnie odrębne motywy wiążące DNA, kooperacyjne interakcje między czynnikami transkrypcyjnymi (TF) i wiele miejsc sieciowania białko-DNA w określonym miejscu wiązania genomu, niewykrywalne przez inne metody mapowania genomowego3,4,6,7.
ChIP-exo było początkowo używane w pączkujących drożdżach do zbadania specyficznego dla sekwencji wiązania DNA TF, do zbadania precyzyjnej organizacji kompleksu transkrypcyjnego przed inicjacją i subnukleosomalnej struktury poszczególnych histonów w całym genomie4,8,9. Od czasu wprowadzenia w 2011 roku4, ChIP-exo jest z powodzeniem stosowany w wielu innych organizmach, w tym w bakteriach, myszach i komórkach ludzkich7,10,11,12,13,14,15,16,17. W 2016 roku Rhee et al.14 po raz pierwszy zastosowali ChIP-exo w neuronach ssaków, aby zrozumieć, w jaki sposób ekspresja genów neuronalnych została utrzymana po obniżeniu programowania TF Lhx3, który tworzy kompleks heterodimerowy z innym programującym TF Isl1. Badanie to wykazało, że przy braku Lhx3, Isl1 jest rekrutowany do nowych wzmacniaczy neuronalnych związanych przez Onecut1 TF w celu utrzymania ekspresji genów efektorowych neuronów. W tym badaniu ChIP-exo ujawniło, w jaki sposób wiele TF dynamicznie rozpoznaje typ komórki i elementy regulatorowe DNA specyficzne dla etapu komórki w sposób kombinatoryczny przy rozdzielczości mapowania bliska nukleotydom. W innych badaniach wykorzystano również metodę ChIP-exo, aby zrozumieć wzajemne oddziaływanie między białkami a DNA w innych liniach komórkowych ssaków. Han et al.7 użyli ChIP-exo do zbadania organizacji całego genomu TF GATA1 i TAL1 w mysich komórkach erytroidalnych za pomocą ChIP-exo. Badanie to wykazało, że TAL1 jest rekrutowany bezpośrednio do DNA, a nie pośrednio poprzez interakcje białko-białko z GATA1 podczas różnicowania erytroidalnego. W ostatnich badaniach wykorzystano również ChIP-exo do profilowania lokalizacji wiązania CTCF w całym genomie, polimerazy RNA II i znaczników histonów w celu zbadania mechanizmów epigenomicznych i transkrypcyjnych w ludzkich liniach komórkowych18,19.
Dostępnych jest kilka wersji protokołu ChIP-exo3,5,20. Jednak te protokoły ChIP-exo są trudne do naśladowania dla badaczy, którzy nie są zaznajomieni z przygotowywaniem bibliotek sekwencjonowania nowej generacji. Opublikowano doskonałą wersję protokołu ChIP-exo z łatwymi do wykonania instrukcjami i video21, ale zawierała wiele etapów enzymatycznych, które wymagają znacznej ilości czasu na wykonanie. W tym miejscu przedstawiamy nową wersję protokołu ChIP-exo zawierającą zredukowane etapy enzymatyczne i czasy inkubacji oraz wyjaśnienia dla każdego kroku enzymatycznego21. Reakcje naprawy końcówki i ogonowania dA są łączone w jednym kroku za pomocą enzymu przygotowania końca. Czas inkubacji dla etapów podwiązania indeksowego i uniwersalnego adaptera został skrócony z 2 godzin do 15 minut przy użyciu wzmacniacza ligacji. Reakcja kinazy po etapie ligacji adaptera indeksowego opisanym w poprzednim protokole ChIP-exo jest usuwana. Zamiast tego grupa fosforanowa jest dodawana podczas syntezy oligo DNA do jednego z końców 5' adaptera indeksowego (Tabela 1), który zostanie wykorzystany do etapu trawienia egzonukleazą lambda. Podczas gdy poprzedni protokół ChIP-exo wykorzystywał trawienie egzonukleazą RecJf w celu wyeliminowania jednoniciowych zanieczyszczeń DNA, ten etap trawienia jest tutaj usuwany, ponieważ nie jest krytyczny dla jakości biblioteki ChIP-exo. Ponadto, w celu oczyszczenia usieciowanego DNA po elucji ChIP, zamiast metody ekstrakcji fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (PCIA) stosuje się metodę oczyszczania kulek magnetycznych. Skraca to czas inkubacji ekstrakcji DNA. Co ważne, usuwa większość dimerów adapterowych powstających podczas ligacji adaptera indeksowego, co może mieć wpływ na skuteczność PCR za pośrednictwem ligacji.
Przedstawiony tutaj protokół ChIP-exo jest zoptymalizowany do wykrywania precyzyjnych interakcji białko-DNA w neuronach ssaków zróżnicowanych od mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES). Krótko mówiąc, zebrane i usieciowane komórki neuronalne są poddawane lizie, aby umożliwić poddanie chromatyny działaniu sonikacji, a następnie sonikowane, aby uzyskać fragmenty DNA o odpowiedniej wielkości (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Kulki pokryte przeciwciałami są następnie wykorzystywane do selektywnego immunoprecypitacji fragmentarycznej, rozpuszczalnej chromatyny do białka będącego przedmiotem zainteresowania. Podczas gdy immunoprecypitowane DNA nadal znajduje się na kulkach, przeprowadza się naprawę końcową, ligację adapterów sekwencjonowania, reakcję wypełnienia i etapy trawienia egzonukleazą lambda od 5 do 3 stóp. Etap trawienia egzonukleazą jest tym, co nadaje ChIP-exo ultrawysoką rozdzielczość i wysoki stosunek sygnału do szumu. Egzonukleaza lambda przycina immunologicznie wytrącone DNA o kilka par zasad (bp) od miejsca sieciowania, powodując w ten sposób degradację zanieczyszczającego DNA. DNA ChIP poddane działaniu egzonukleazy jest eluowane z kulek pokrytych przeciwciałem, wiązania krzyżowe białko-DNA są odwracane, a białka ulegają degradacji. DNA jest ekstrahowane i denaturowane do jednoniciowego DNA ChIP, a następnie wyżarzanie i wydłużanie starterów w celu wytworzenia dwuniciowego DNA (dsDNA). Następnie wykonuje się podwiązanie uniwersalnego adaptera do końców poddanych działaniu egzonukleazy. Powstałe DNA jest oczyszczane, a następnie amplifikowane metodą PCR, oczyszczane żelem i poddawane sekwencjonowaniu nowej generacji.
Protokół ChIP-exo jest dłuższy niż protokół ChIP-seq, ale nie jest zbyt trudny technicznie. Każde pomyślnie immunoprecypitowane DNA ChIP może zostać poddane działaniu ChIP-exo, z kilkoma dodatkowymi etapami enzymatycznymi. Godne uwagi zalety ChIP-exo, takie jak ultrawysoka rozdzielczość mapowania, zmniejszony sygnał tła oraz zmniejszona liczba wyników fałszywie dodatnich i ujemnych w odniesieniu do miejsc wiązania genomu, przewyższają koszt czasu.

<table><tbody><tr><td>Agaroza, UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td>Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.6) i oczyszczanie żelem amplifikowanego DNA LM-PCR (sekcja 19.1)</td></tr><tr><td>Albumina, surowica bydlęca (BSA), wolna od proteazy, izolacja szoku cieplnego, min. 98%</td><td>BioShop</td><td>ALB003</td><td>Roztwór blokujący</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko Isl1</td><td>DSHB</td><td>39.3F7</td><td>Inkuacja przeciwciała z kulkami (sekcja 5.6)</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico& nbsp;</td><td>Diagenoda</td><td>B01060010</td><td>Sonikacja chromatyny (sekcja 3.3)</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA), klasa biologii molekularnej</td><td>New England BioLabs</td><td>B9000S</td><td>Reakcja wypełniania na kulkach (sekcja 10.2) i denaturacja, wyżarzanie startera i rozszerzanie startera (sekcja 14.2)</td></tr> <tr><td>Wirówka 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000138</td><td>Sonikacja chromatyny (sekcja 3.5), kontrola sonikacji (sekcja 4.3.1, 4.3.3 i 4.3.4)</td></tr><tr><td>Wirówka 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.3), liza komórek (sekcja 2.2 i 2.3), sonikacja chromatyny (sekcja 3.1)</td></tr> <tr><td>cOmpete, Mini, wolny od EDTA inhibitor proteazy Koktajl</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Dodawany do wszystkich, z wyjątkiem buforu proteinazy K i buforu elucyjnego ChIP</td></tr><tr><td>Roztwór dATP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440S</td><td>Reakcja dA-tailing (sekcja 15.1)</td></tr><tr><td>Kwas deoksycholowy Sól sodowa</td><td>fisher scientific</td><td>BP349</td><td>Bufor do lizy 3, Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli i Bufor do płukania LiCl</td></tr><tr><td>dNTP Mix, Klasa biologii molekularnej</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Reakcja wypełniania na kulkach (sekcja 10.2) i denaturacja, wyżarzanie i rozszerzanie podkładu (sekcja 14.2)</td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td>PCR z podwiązaniem (sekcja 18.1)</td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M, sterylny roztwór, pH 8,0</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td>Bufor do lizy 1-3, kontrola sonikacji (sekcja 4.1), bufor do płukania o wysokiej zawartości soli, bufor płuczący LiCl i bufor elucyjny ChIP</td></tr><tr><td>Bezwodny alkohol etylowy, 100%</td> <td>alkohole handlowe</td><td>P006EAAN</td><td>Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.3)</td></tr><tr><td>Formaldehyd, 36,5-38%, zawiera 10-15% metanol</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Żniwa, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.1)</td></tr><tr><td>Glicerol, klasa odczynnika, min 99,5%</td><td>BioShop</td><td>GLY002</td><td>Bufor do lizy 1</td></tr><tr><td>Glicyna, klasa biotechnologiczna, min. 99%</td><td>BioShop</td><td>GLN001</td><td>Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.2)</td></tr><tr><td>Glikogen, klasa RNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td>Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.3)</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M sterylnie przefiltrowany roztwór, pH 7,3&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>HEP003</td><td>Bufor do lizy 1, bufor do płukania o wysokiej zawartości soli</td></tr><tr><td>Fragment Klenowa (3->5 egzo-)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212S</td><td>Reakcja dA-ogonowa (sekcja 15.1)</td></tr><tr><td>Egzonukleaza lambda</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>M0262S</td><td>Trawienie egzonukleazą lambda na kulkach (sekcja 11.2)</td></tr><tr><td>Wzmacniacz ligazy</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>Zestaw biblioteki DNA NEBNext Ultra II. Ligacja adaptera indeksowego na koralikach (sekcja 9.1) i uniwersalna ligacja adaptera (sekcja 16.1)</td></tr><tr><td>Ligase Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Indeks Ligacja adaptera na kulkach (sekcja 9.1) i uniwersalna ligacja adaptera (sekcja 16.1)</td></tr><tr><td>Chlorek litu (LiCl), odczynnik Bioshop</td><td></td><td>LIT704</td><td>LiCl Wash Buffer</td></tr><tr><td>Kulki magnetyczne do ChIP (Dynabeads Protein G)</td><td>Dynabeads Protein G (kulki magnetyczne do ChIP)</td><td>Dynabeads Protein G (kulki magnetyczne do ChIP)</td><td>Inkubacja przeciwciał z kulkami (sekcja 5)</td></tr><tr><td>Kulki magnetyczne do oczyszczania DNA (AMPure XP Beads)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Ekstrakcja DNA (sekcja 13.3) i oczyszczanie DNA (sekcja 17.1)</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny (magnes DynaMag-2)</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Używany w wielu krokach w sekcjach: 5 - 11, 13</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu MinElute</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28604</td><td>Oczyszczanie żelowe amplifikowanego DNA PCR (sekcja 19.2)</td></tr><tr><td>Roztwór soli sodowej N-lauroilosarkozyny, 30% roztwór wodny, &ge; 97,0% (HPLC)</td><td>Sigma</td><td>61747</td><td>Bufor do lizy 3</td></tr><tr><td>Etoksylan oktylofenolu (IGEPAL CA630)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>Bufor do lizy 1 i bufor do płukania LiCl</td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy, klasa biotechnologiczna (25:24:1)</td><td>BioShop</td><td>PHE512</td><td>Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.1)</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA phi29</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269L</td><td>Reakcja wypełniania na kulkach (sekcja 10.2) i denaturacja, wyżarzanie i przedłużanie gruntu (sekcja 14.3 i 14.4)</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td>Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.3) oraz chromatyna sonikująca (sekcja 3.1), inkubacja przeciwciał za pomocą kulek (sekcja 5.1)</td></tr><tr><td>Podstawowy zasilacz PowerPac</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.6) i oczyszczanie żelem amplifikowanego DNA LM-PCR (sekcja 19.1)</td></tr><tr><td>System ProFlex PCR</td><td>System Biosystems stosowany</td><td>System</td> <td>ProFlex PCRstosowany w sekcjach: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 i 18.2</td></tr><tr><td>Białkowa rurka LoBind, 2,0 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>Inkubacja przeciwciał z kulkami (sekcja 5.2) i immunoprecypitacja chromatyny (sekcja 6.3)</td></tr><tr><td>Roztwór proteinazy K,</td> kontrola <td>25530049</td><td>invitrogenu</td> klasy RNA <td>Sonikacja (sekcja 4.2) oraz elucja i odwrotne sieciowanie (sekcja 12.3)</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 4.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Oczyszczanie żelowe amplifikowanego DNA PCR (sekcja 19.3)</td></tr><tr><td>Test BR Quibit dsDNA zestaw</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>Żelowe oczyszczanie amplifikowanego DNA PCR (sekcja 19.3)</td></tr><tr><td>Rnaza A, Dnazy i wolne od proteazy</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td>Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.2) i ekstrakcji DNA (sekcja 13.2)</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl), Bioodczynnik&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Bufor do lizy 1-3, Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS), klasa elektroforezy</td><td>BioShop</td><td>SDS001</td><td>Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), bufor do płukania o wysokiej zawartości soli i bufor elucyjny ChIP</td></tr><tr><td>Koraliki soniczne i 15 ml probówek Bioruptor</td><td>Diagenoda</td><td>C01020031</td><td>Chromatyna sonikująca (sekcja 3.1 i 3.2)</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td>Sekcja 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 i 16.2</td></tr><tr><td>Roztwór chlorowodorku Trizma (Tris-HCl), z certyfikatem BioPerformance, 1 M, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>T2194</td><td>10 mM Tris-HCl Bufor</td></tr><tr><td>roztwór chlorowodorku Trizma (Tris-HCl), z certyfikatem BioPerformance, 1 M, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>T2694</td><td>Bufor do lizy 2, bufor do lizy 3, sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), bufor płuczący LiCl i</td></tr><tr><td>moduł naprawczy końca elucyjnego Ultra II Ultra II (24 rxn -> 120 rxn)</td> <td>New England BioLabs</td><td>E7546S</td><td>Mieszanka reakcyjna przygotowania końcowego i mieszanina enzymów przygotowania końcowego. Naprawa końcowa i reakcja ogona dA na kulkach (sekcja 8.2)</td></tr><tr><td>VWR Mini Tube Rocker, zmienna prędkość</td><td>VWR</td><td>10159-752</td><td>Stosowany w wielu etapach w sekcjach: 1, 2, 5, 6 i 7</td></tr><tr><td>2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanol, Triton X-100, odczynnik BioShop</td><td></td><td>TRX506</td><td>Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (sekcja 3.4) i bufor do płukania o wysokiej zawartości soli</td></tr></tbody></table>

mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-dna w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (chip-exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identyfikacja specyficznych interakcji białko-DNA w genomie jest ważna dla zrozumienia regulacji genów. Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChIP-seq) jest szeroko stosowana do identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących DNA w całym genomie. Jednak metoda ChIP-seq jest ograniczona przez niejednorodność długości sonikowanych fragmentów DNA i niespecyficznego DNA tła, co skutkuje niską rozdzielczością mapowania i niepewnością co do miejsc wiązania DNA. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, połączenie ChIP z trawieniem egzonukleazą (ChIP-exo) wykorzystuje trawienie egzonukleazą od 5' do 3' w celu przycięcia niejednorodnej wielkości immunologicznego DNA do miejsca sieciowania białko-DNA. Leczenie egzonukleazą eliminuje również niespecyficzne DNA tła. Przygotowane w bibliotece i strawione egzonukleazą DNA można wysłać do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ChIP-exo pozwala na rozdzielczość mapowania blisko par zasad z większą czułością wykrywania i zmniejszonym sygnałem tła. Zoptymalizowany protokół ChIP-exo dla komórek ssaków i sekwencjonowania nowej generacji opisano poniżej.

Rysunek 2A przedstawia wyniki sonikacji po lizie komórek i sonikacji z różną liczbą cykli neuronów ruchowych zróżnicowanych z mysich komórek ES. Optymalna liczba cykli sonikacji (na przykład 12 cykli na Rysunku 2A) spowodowała uzyskanie wysokiej intensywności DNA w fragmentach DNA o wielkości 100−400 bp. Wysokiej jakości biblioteki ChIP-exo zależą od wielkości i ilości pofragmentowanego DNA chromatyny. Dlatego przed rozpoczęciem ChIP-exo zaleca się optymalizację...

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Główną zaletą naszej metody ChIP-exo jest lepsza rozdzielczość mapowania interakcji białkowego DNA w komórce w porównaniu z konwencjonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny. Aby przygotować kulki magnetyczne białka G dla ChIP, wymieszaj kulki magnetyczne do uzyskania jednorodnej konsystencji. Następnie dodaj 25 mikrolitrów kulek magnetycznych do dwumililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania białka.Dodaj jeden mililitr roztworu blokującego do kulek. Dobrze wymieszaj pipetując, a następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę. Gdy supernatant jest czysty, należy go usunąć.Następnie dodaj jeden mililitr roztworu blokującego do kulek. Umieść rurkę na bujanej platformie w temperaturze czterech stopni Celsjusza i kołysz się przez 10 minut, a następnie krótko zakręć rurką. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.Dodaj 500 mikrolitrów roztworu blokującego do kulek magnetycznych. Krótko obrócić przeciwciało przeciwko wysepce 1, a następnie dodać cztery mikrogramy przeciwciała do probówki zawierającej kulki magnetyczne. Umieść probówkę zawierającą kulki magnetyczne i przeciwciało Islet-1 na platformie kołyszącej w temperaturze czterech stopni Celsjusza i kołysz się przez sześć do 24 godzin.Aby rozpocząć immunoprecypitację chromatyny, umyj kulki pokryte przeciwciałem w jednym mililitrze roztworu blokującego. Umieść probówkę zawierającą kulki pokryte przeciwciałem na platformie kołyszącej w temperaturze czterech stopni Celsjusza na pięć minut. Po krótkim odwirowaniu umieść rurkę na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.Zawiesić kulki pokryte przeciwciałem w 50 mikrolitrach roztworu blokującego. Dodaj jeden mililitr sonikowanych lizatów do kulek pokrytych przeciwciałami, a następnie inkubuj próbkę na platformie kołyszącej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po pozostawieniu próbki do inkubacji przez noc, zbierz płyn z nakrętki, krótko obracając probówkę, a następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym.Po minucie ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety. Następnie wykonaj serię prań w następujący sposób. Dodać jeden mililitr buforu do płukania na zimno zawierającego CPI do próbki.Mieszać próbkę na kołyszącej się platformie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Krótko obróć probówkę z próbką, a następnie umieść ją na stojaku magnetycznym. Po jednej minucie usunąć supernatant za pomocą pipety.W przypadku pierwszej reakcji enzymatycznej i naprawy oraz ogonowania DA dodaj 38 mikrolitrów autoklawowanej podwójnie destylowanej wody do próbki, a następnie dodaj mieszankę reakcji przygotowania końcowego i mieszaninę enzymów przygotowania końcowego. Wymieszać zawartość probówki przez pipetowanie, a następnie inkubować próbkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przemyj kulki próbki buforem do płukania o wysokiej zawartości soli, buforem do płukania chlorku litu i 10-milimolowym buforem chlorowodoru Tris, jak opisano wcześniej.Aby przeprowadzić ligację adaptera indeksującego, dodaj do próbki 27 mikrolitrów zimnego 10-milimolowego buforu chlorowodoru Tris. Następnie dodaj adapter indeksujący, wzmacniacz ligacji i główną mieszankę ligazy. Inkubować próbkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut.Ponownie przemyj kulki próbki buforem do płukania o wysokiej zawartości soli, buforem do płukania chlorku litu i 10-milimolowym buforem chlorowodoru Tris. Następnie dodać 47 mikrolitrów zimnego 10-milimolowego buforu chlorowodoru Tris do próbki. Aby naprawić nacięcie w DNA wynikające z brakującego wiązania fosfodiestrowego, dodaj 11,1 mikrolitra mieszanki wypełniającej do próbki.Inkubować próbkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po serii przemyć dodać do próbki 50 mikrolitrów zimnej, autoklawowanej, podwójnie destylowanej wody. Aby roztrawić DNA ChIP w kierunku od pięciu pierwszych do trzech, dodaj bufor egzonukleazy lambda i egzonukleazę lambda i wymieszaj próbkę przez pipetowanie.Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po zakończeniu trawienia powtórz trzy płukania po raz ostatni. Aby wymyć próbkę ChIP z kulek, ponownie zawieś próbkę w 75 mikrolitrach buforu elucyjnego ChIP i inkubatorze w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut w temperaturze 130 razy G. Dodaj 2,5 mikrolitra po 20 miligramów na mililitr proteinazy K do próbki.Krótko zawirować próbkę, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Krótko obróć próbkę i umieść ją na stojaku magnetycznym. Po minucie przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Oczyść i wymyj DNA. Po oczyszczeniu wymytego DNA przenieś 16 mikrolitrów wyekstrahowanej próbki DNA do probówki PCR. Dodać do próbki 1,2 mikrolitra mieszanki do denaturacji i wyżarzania podkładu.Za pomocą programu opisanego w tabeli szóstej manuskryptu należy dokonać denaturacji i wyżarzania starterów do matrycy DNA. Dodać trzy mikrolitry mieszanki przedłużającej starter do próbki i uruchomić program PCR opisany w tabeli siódmej manuskryptu. Dodać 4,1 mikrolitra mieszanki ogonowej DA do próbki i uruchomić próbkę za pomocą programu PCR w tabeli ósmej manuskryptu.Następnie dodać 21,5 mikrolitra uniwersalnej mieszanki do ligacji adaptera do próbki i inkubować przez 15 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Dodać 29 mikrolitrów mieszanki LM-PCR do próbki, a następnie uruchomić próbkę za pomocą programu z tabeli 10 manuskryptu. Po 18 cyklach LM-PCR, próbki ChIP-exo z mysich neuronów ruchowych poddano elektroforezie na 1,5% żelu agarozowym.Wyniki dla ChIP-exo Islet-1 wykazały amplifikowane biblioteki DNA około 200 do 400 par zasad, co wskazuje, że biblioteki ChIP-exo zostały pomyślnie amplifikowane przez LM-PCR. Pasmo wokół 100 par zasad reprezentuje artefakty z adapterów i starterów PCR. Kontrola braku przeciwciał pokazuje, że niespecyficzne DNA tła zostało strawione przez leczenie egzonukleazą lambda.Za pomocą ChIP-exo i ChIP-seq zidentyfikowano lokalizacje związane z wysepką 1. Sygnał ChIP-exo był silnie skoncentrowany w miejscach wiązania wysepki-1, wykrywając wiele zgrupowanych wzorców wiązania czynnika transkrypcyjnego wyspy trzustkowej-1. Sygnał ChIP-seq wyświetlał szersze sygnały, co wskazuje, że ChIP-exo miał wyższą rozdzielczość mapowania niż ChIP-seq dla Islet-1.Wiele czynników transkrypcyjnych często wiąże DNA obok siebie jako kompleks białko-DNA. ChIP-exo pozwala nam zbadać, w jaki sposób wiele czynników transkrypcyjnych rozpoznaje i reguluje docelowe DNA.

high-resolution-mapping-protein-dna-interactions-mouse-stem-cell

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film demonstruje immunoprecypitację fragmentów DNA usieciowanych z białkiem docelowym z lizatów neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem specyficznym dla białka docelowego.

Immunoprecypitacja docelowych kompleksów białko-DNA z lizatu neuronu ruchowego

Źródło: Mendez, F. M.  i inni., Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu. J. Vis. Exp. (2018). Ten film pokazuje izolację kompleksów białko-DNA z komórek neurosfery pochodzących z guza mózgu myszy przy użyciu natywnej immunoprecypitacji chromatyny. Szczegółowo opisuje etapy przygotowania chromatyny, immunoprecypitacji, płukania i trawienia białek w celu uwolnienia DNA do dalszej analizy.

Immunoprecypitacja chromatyny natywnej komórek neurosfery

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający osiągnąć rozdzielczość oddziaływań białko-DNA w pobliżu par zasad. Uzyskuje się to poprzez traktowanie egzonukleazą fragmentów DNA selektywnie wzbogaconych przez immunoprecypitację chromatyny (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości.

Metoda ChIP-exo: identyfikacja interakcji białko-DNA z precyzją bliską par zasad

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Ta praca opisuje protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) przy użyciu dojrzałej linii mysich komórek T. Protokół ten jest odpowiedni do badania rozkładu określonych znaczników histonowych w określonych miejscach promotora lub w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w liniach mysich limfocytów T

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Protokół mapowania trójwymiarowej organizacji genomu z rozdzielczością nukleosomów przy użyciu metody przechwytywania konformacji chromosomów w całym genomie Micro-C-XL jest przedstawiony tutaj.

Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

Poznaj metodę ChIP-exo do mapowania interakcji białko-DNA w neuronach mysich komórek macierzystych. Technika zapewnia rozdzielczość bliską parze zasad i wysoki stosunek sygnału do szumu.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo) (Wideo) | JoVE Journal

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Przeglądaj więcej filmów