Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)
August 14th, 2020
Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.
Główną zaletą naszej metody ChIP-exo jest lepsza rozdzielczość mapowania interakcji białkowego DNA w komórce w porównaniu z konwencjonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny. Aby przygotować kulki magnetyczne białka G dla ChIP, wymieszaj kulki magnetyczne do uzyskania jednorodnej konsystencji. Następnie dodaj 25 mikrolitrów kulek magnetycznych do dwumililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania białka.
Dodaj jeden mililitr roztworu blokującego do kulek. Dobrze wymieszaj pipetując, a następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę. Gdy supernatant jest czysty, należy go usunąć.
Następnie dodaj jeden mililitr roztworu blokującego do kulek. Umieść rurkę na bujanej platformie w temperaturze czterech stopni Celsjusza i kołysz się przez 10 minut, a następnie krótko zakręć rurką. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.
Dodaj 500 mikrolitrów roztworu blokującego do kulek magnetycznych. Krótko obrócić przeciwciało przeciwko wysepce 1, a następnie dodać cztery mikrogramy przeciwciała do probówki zawierającej kulki magnetyczne. Umieść probówkę zawierającą kulki magnetyczne i przeciwciało Islet-1 na platformie kołyszącej w temperaturze czterech stopni Celsjusza i kołysz się przez sześć do 24 godzin.
Aby rozpocząć immunoprecypitację chromatyny, umyj kulki pokryte przeciwciałem w jednym mililitrze roztworu blokującego. Umieść probówkę zawierającą kulki pokryte przeciwciałem na platformie kołyszącej w temperaturze czterech stopni Celsjusza na pięć minut. Po krótkim odwirowaniu umieść rurkę na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.
Zawiesić kulki pokryte przeciwciałem w 50 mikrolitrach roztworu blokującego. Dodaj jeden mililitr sonikowanych lizatów do kulek pokrytych przeciwciałami, a następnie inkubuj próbkę na platformie kołyszącej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po pozostawieniu próbki do inkubacji przez noc, zbierz płyn z nakrętki, krótko obracając probówkę, a następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym.
Po minucie ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety. Następnie wykonaj serię prań w następujący sposób. Dodać jeden mililitr buforu do płukania na zimno zawierającego CPI do próbki.
Mieszać próbkę na kołyszącej się platformie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Krótko obróć probówkę z próbką, a następnie umieść ją na stojaku magnetycznym. Po jednej minucie usunąć supernatant za pomocą pipety.
W przypadku pierwszej reakcji enzymatycznej i naprawy oraz ogonowania DA dodaj 38 mikrolitrów autoklawowanej podwójnie destylowanej wody do próbki, a następnie dodaj mieszankę reakcji przygotowania końcowego i mieszaninę enzymów przygotowania końcowego. Wymieszać zawartość probówki przez pipetowanie, a następnie inkubować próbkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przemyj kulki próbki buforem do płukania o wysokiej zawartości soli, buforem do płukania chlorku litu i 10-milimolowym buforem chlorowodoru Tris, jak opisano wcześniej.
Aby przeprowadzić ligację adaptera indeksującego, dodaj do próbki 27 mikrolitrów zimnego 10-milimolowego buforu chlorowodoru Tris. Następnie dodaj adapter indeksujący, wzmacniacz ligacji i główną mieszankę ligazy. Inkubować próbkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Ponownie przemyj kulki próbki buforem do płukania o wysokiej zawartości soli, buforem do płukania chlorku litu i 10-milimolowym buforem chlorowodoru Tris. Następnie dodać 47 mikrolitrów zimnego 10-milimolowego buforu chlorowodoru Tris do próbki. Aby naprawić nacięcie w DNA wynikające z brakującego wiązania fosfodiestrowego, dodaj 11,1 mikrolitra mieszanki wypełniającej do próbki.
Inkubować próbkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po serii przemyć dodać do próbki 50 mikrolitrów zimnej, autoklawowanej, podwójnie destylowanej wody. Aby roztrawić DNA ChIP w kierunku od pięciu pierwszych do trzech, dodaj bufor egzonukleazy lambda i egzonukleazę lambda i wymieszaj próbkę przez pipetowanie.
Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po zakończeniu trawienia powtórz trzy płukania po raz ostatni. Aby wymyć próbkę ChIP z kulek, ponownie zawieś próbkę w 75 mikrolitrach buforu elucyjnego ChIP i inkubatorze w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut w temperaturze 130 razy G. Dodaj 2,5 mikrolitra po 20 miligramów na mililitr proteinazy K do próbki.
Krótko zawirować próbkę, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Krótko obróć próbkę i umieść ją na stojaku magnetycznym. Po minucie przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Oczyść i wymyj DNA. Po oczyszczeniu wymytego DNA przenieś 16 mikrolitrów wyekstrahowanej próbki DNA do probówki PCR. Dodać do próbki 1,2 mikrolitra mieszanki do denaturacji i wyżarzania podkładu.
Za pomocą programu opisanego w tabeli szóstej manuskryptu należy dokonać denaturacji i wyżarzania starterów do matrycy DNA. Dodać trzy mikrolitry mieszanki przedłużającej starter do próbki i uruchomić program PCR opisany w tabeli siódmej manuskryptu. Dodać 4,1 mikrolitra mieszanki ogonowej DA do próbki i uruchomić próbkę za pomocą programu PCR w tabeli ósmej manuskryptu.
Następnie dodać 21,5 mikrolitra uniwersalnej mieszanki do ligacji adaptera do próbki i inkubować przez 15 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Dodać 29 mikrolitrów mieszanki LM-PCR do próbki, a następnie uruchomić próbkę za pomocą programu z tabeli 10 manuskryptu. Po 18 cyklach LM-PCR, próbki ChIP-exo z mysich neuronów ruchowych poddano elektroforezie na 1,5% żelu agarozowym.
Wyniki dla ChIP-exo Islet-1 wykazały amplifikowane biblioteki DNA około 200 do 400 par zasad, co wskazuje, że biblioteki ChIP-exo zostały pomyślnie amplifikowane przez LM-PCR. Pasmo wokół 100 par zasad reprezentuje artefakty z adapterów i starterów PCR. Kontrola braku przeciwciał pokazuje, że niespecyficzne DNA tła zostało strawione przez leczenie egzonukleazą lambda.
Za pomocą ChIP-exo i ChIP-seq zidentyfikowano lokalizacje związane z wysepką 1. Sygnał ChIP-exo był silnie skoncentrowany w miejscach wiązania wysepki-1, wykrywając wiele zgrupowanych wzorców wiązania czynnika transkrypcyjnego wyspy trzustkowej-1. Sygnał ChIP-seq wyświetlał szersze sygnały, co wskazuje, że ChIP-exo miał wyższą rozdzielczość mapowania niż ChIP-seq dla Islet-1.
Wiele czynników transkrypcyjnych często wiąże DNA obok siebie jako kompleks białko-DNA. ChIP-exo pozwala nam zbadać, w jaki sposób wiele czynników transkrypcyjnych rozpoznaje i reguluje docelowe DNA.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę mapowania genomowego, która poprawia rozdzielczość interakcji białko-DNA w neuronach ssaków. Wykorzystując DNA immunoprecypitowane z chromatyny, przetworzone trawieniem egzonukleazowym, a następnie sekwencjonowaniem o wysokiej wydajności, metoda osiąga prawie jednonukleotydową rozdzielczość mapowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Genomika
- Regulacja genów
Tło
- Rozumienie interakcji białko-DNA jest kluczowe dla regulacji genów.
- Konwencjonalne metody mają ograniczenia w rozdzielczości mapowania.
- ChIP-exo oferuje lepsze możliwości wykrywania.
- Ta metoda jest szczególnie przydatna w badaniu neuronów ssaków.
Cel badania
- Poprawić rozdzielczość mapowania interakcji białko-DNA.
- Zapewnić niezawodną metodę mapowania genomowego.
- Zwiększyć zrozumienie mechanizmów regulacji genów.
Zastosowanie metod
- Immunoprecypitacja chromatyny połączona z trawieniem egzonukleazowym.
- Wysokowydajne sekwencjonowanie do pozyskiwania danych.
- Przygotowanie magnesowych kul białka G do ChIP.
- Mieszanie i rozwiązania blokujące dla optymalnego wiązania.
Główne wyniki
- Osiągnięto prawie jednonukleotydową rozdzielczość w mapowaniu.
- Wykazano wysoki stosunek sygnału do szumu w wynikach.
- Walidowano metodę w kontekście neuronalnym ssaków.
- Dostarczono wglądu w interakcje białko-DNA.
Wnioski
- Metoda ChIP-exo znacznie poprawia rozdzielczość mapowania.
- Ta technika jest przydatna w badaniu regulacji genów.
- Przyszłe zastosowania mogą zwiększyć nasze zrozumienie funkcji neuronalnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of protein-DNA interactions enables precise target validation in early discovery by clarifying transcription factor binding sites with near base-pair accuracy. This reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies and supports predictive confidence in lead identification for neurological disease models. The method enhances de-risking of therapeutic hypotheses by distinguishing specific from non-specific genomic signals.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulatory mechanisms in disease-relevant neuronal systems.
- Operational Value: Provides high-sensitivity detection of protein-DNA binding with reduced background noise.
- Predictive Value: Supports functional target validation by mapping clustered transcription factor binding patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, high-resolution binding profiles for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible DNA libraries suitable for downstream sequencing workflows.
- Scalability Value: Enables platform reuse across multiple transcription factors in neuronal models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-stage binding data to disease-relevant gene regulation in stem cell-derived neurons.
- Operational Value: Ensures continuity from target identification to preclinical validation via consistent genomic readouts.
- Risk Mitigation: Supports de-risking of mechanistic models by eliminating false-positive binding signals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by delivering precise genomic binding data that informs target selection and prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through high-resolution mapping of transcription factor occupancy.
- Screening: Enables assay readiness via standardized, exonuclease-digested DNA libraries with uniform fragment sizes.
- Analytics: Delivers quantitative binding signals that allow comparison of protein-DNA interactions across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating binding sites in disease-relevant neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable genomic mapping capability for multiple targets in neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through near base-pair mapping resolution.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled exonuclease digestion and library preparation.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false positives in binding site identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on high-confidence genomic binding data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin immunoprecipitation and enzymatic DNA processing.
- Dependent on access to magnetic bead handling, exonuclease enzymes, and high-throughput sequencing.
- Needs cross-team standardization for antibody validation and wash stringency.
- Adaptation considerations include optimization for different transcription factors and neuronal subtypes.
- Practical limitations include input DNA quality and antibody specificity affecting signal clarity.
