Name: Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serca szczura. Technika zapewnia wysoką czystość i żywotność komórek, umożliwiając badanie specyficznych mechanizmów komórkowych w chorobach serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy bardzo dziękują dr Lingli Wang za pomoc w protokole dla zwierząt, a Departamentowi Pediatrii w Stanford za wsparcie infrastruktury. Prace te były wspierane przez NIH/NHLBI K99 HL135258 (do MG).

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Panel Administracyjny ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (APLAC31608) na Uniwersytecie Stanforda.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotować bufor do wytrawiania, używając odczynników wymienionych w tabeli 1.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy DNazy I: Rozpuścić DNazę I w wodzie wolnej od RNaz do roztworu podstawowego o stężeniu 2000 jednostek/ml (1 mg/ml). Podwielokrotność roztworu podstawowego należy rozdzielić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór liberazy: Rozpuścić liberazę w wodzie wolnej od RNaz do uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 5 mg/ml. Obracać go na runie rolkowej w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Podwielokrotność roztworu podstawowego należy rozdzielić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor sortujący, rozcieńczając 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 10% roztworu podstawowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 2 mM EDTA i 0,5% BSA.</li>
</ol>
2. Kolekcja serc
UWAGA: W tym protokole użyto sześciu szczurów Sprague Dawley o wadze 50–100 g. Nie zaobserwowano różnicy między płciami.
<ol>
	<li>Poddaj szczura eutanazji CO2 i umieść go w pozycji leżącej na platformie sekcyjnej. Przypnij kończyny i wysterylizuj zarówno brzuch, jak i klatkę piersiową 70% etanolem.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną nożyczkami i wbij igłę 21 G w część żyły głównej tylnej znajdującą się za jelitami. Odciągnąć tłok strzykawki do tyłu, pobierając krew z żyły, aż wątroba stanie się jaśniejsza i nie będzie można pobrać więcej krwi, co wskazuje na wystarczające usunięcie krwi.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek ostrożnie otwórz klatkę piersiową, aby uniknąć uszkodzenia płuc i serca. Podnieś łuk aorty/przedsionek za pomocą kleszczy i przetnij aortę, tętnicę płucną, żyły płucne i żyłę główną, aby uwolnić i usunąć serce.</li>
	<li>Umyj serce 50 ml zimnego 1x buforu Hanks' balanced salt solution (HBSS) 3x, aby usunąć nadmiar krwi.</li>
	<li>Pod mikroskopem mikrodyparacyjnym usuń prawą wolną ścianę komory do probówki o pojemności 5 ml zawierającej zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B).
	<ol>
		<li>Połóż serce na jego bardziej płaskiej, tylnej powierzchni, aby zidentyfikować lewą i prawą stronę.</li>
		<li>Zlokalizuj tętnicę płucną, najbardziej przednią z żył i tętnic rozgałęziających się od szczytu serca i przetnij tętnicę płucną w dół do prawej komory komory. Na przedniej powierzchni serca przeciąć wzdłuż przegrody, aż dojdziesz do wierzchołka. Kontynuuj cięcie od wierzchołka w górę tylnej strony serca wzdłuż przegrody, aż do punktu połączenia tętnicy płucnej i prawej komory komory (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Zaczynając od tętnicy płucnej i punktu połączenia prawej komory, przeciąć zarówno przednią, jak i tylną stronę serca prostopadle do poprzedniego rozwarstwienia i z dala od przegrody, aż wolna ściana prawej komory zostanie uwolniona od reszty serca (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod mikroskopem mikrodyparacyjnym usuń wolną ścianę lewej komory do probówki o pojemności 5 ml zawierającej DMEM (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C, D).
	<ol>
		<li>Zlokalizuj aortę, rozgałęziającą się od szczytu serca za tętnicą płucną i powtórz metodę opisaną w kroku 2.5, aby odciąć wolną ścianę lewej komory.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trawienie EWG
<ol>
	<li>Umieść zarówno prawą, jak i lewą wolną ścianę komory w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 cm, z wewnętrzną powierzchnią leżącą płasko, skierowaną w dół (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Wewnętrzna powierzchnia to wewnętrzna powierzchnia lekko wklęsłej komory, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2A,C.</li>
	<li>Dodaj 0,5–1 ml buforu wytrawiającego do naczynia, umieszczając końcówkę pipety bezpośrednio pod tkanką. Kontynuuj, aż zanurzona zostanie tylko wewnętrzna powierzchnia.</li>
	<li>Inkubować naczynie w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Dodaj pożywkę EC do naczynia hodowlanego, aby zatrzymać trawienie. 
	UWAGA: Ilość buforu wytrawiającego do pożywki EC należy utrzymywać w stosunku 1:5.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przepłukać wewnętrzną powierzchnię komór pożywką EC i przenieść spływ do probówki zbiorczej o pojemności 50 ml przez sitko o średnicy 40 mm (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2E). Przechowuj kolekcje na lodzie w celu dalszego oczyszczenia.</li>
</ol>
4. Trawienie CEC
<ol>
	<li>Przeciąć wzdłuż zewnętrznej powierzchni lewej komory bez zanieczyszczenia warstwą wewnętrzną (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B, D) i umieścić każdą z nich w oddzielnej probówce o pojemności 5 ml zawierającej 1 ml buforu wytrawiającego. 
	UWAGA: Lewą komorę można zidentyfikować jako grubszą komorę, a zewnętrzną powierzchnię można określić jako zewnętrzną powierzchnię lekko wklęsłej komory.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych zmiel ścianę komory na małe, 1 mm3 kawałki.</li>
	<li>Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez około 15–20 minut. Wirować co 2–3 minuty.</li>
	<li>Odpipetować 4 ml pożywki EC do probówki o pojemności 5 ml, aby zakończyć trawienie.</li>
	<li>Przenieść roztwór za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml do probówki o pojemności 50 ml przez sitko o średnicy 40 mm (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2E). Przechowuj kolekcje na lodzie w celu dalszego oczyszczenia.</li>
</ol>
5. Kolekcja komórek
<ol>
	<li>Odwirować probówki o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie odessać supernatant.</li>
	<li>Jeśli osad wydaje się czerwony, ponownie zawieś go w 1-2 ml 1x buforu lizującego czerwone krwinki (RBC) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F). 
	UWAGA: Jeśli nie ma RBC, przejdź do kroku 6.</li>
	<li>Inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Odpipetować 10 ml PBS do probówek o pojemności 50 ml, aby zatrzymać lizę.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać supernatant.</li>
</ol>
6. Sortowanie EC
<ol>
	<li>Dodać 90 μl buforu sortującego i 10 μl przeciwciała anty-CD31 PE do probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Zwirować probówki, a następnie inkubować je przez 10 minut w lodówce o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 10 ml buforu sortującego do probówek, dokładnie wymieszać, a następnie odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 80 μl buforu sortującego i 20 μl mikrogranulek anty-PE.</li>
	<li>Wirować probówki i inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 10 ml buforu sortującego do probówek, dokładnie wymieszać, a następnie odwirować je przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu sortującego.</li>
	<li>Umieścić kolumnę zawierającą kulki superparamagnetyczne w separatorze magnetycznym i przepłukać kolumnę 3 ml buforu sortującego.</li>
	<li>Po "zatrzymaniu przepływu" należy odpipetować 500 μl zawiesiny komórek do kolumn, a następnie przemyć kolumny buforem sortującym. Powtórz mycie 3 razy, każde z 3 ml buforu sortującego (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2G).</li>
	<li>Wyjmij kolumny z separatora i umieść je na nowej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Za pomocą pipety dodać 5 ml pożywki EC do kolumn i przecisnąć roztwór za pomocą tłoka kolumny.</li>
	<li>Odwirować probówki zbiorcze o stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać supernatant.</li>
	<li>Ekstrahować RNA z osadu komórkowego próbek EWG i CEC za pomocą zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Można uzyskać minimum 500 ng RNA. 
	UWAGA: Po ekstrakcji RNA próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja 500 ng RNA, aby uzyskać cDNA za pomocą losowego startera i zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wykonaj ilościowy PCR w celu walidacji populacji wsierdzia i śródbłonka (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2H). Sekwencje starterów są wymienione w Tabeli 2.
	<ol>
		<li>Dodać 5 μl cDNA EWG lub CEC (1 ng/μl) do studzienek płytki 384 qPCR. Dodaj cDNA EWG lub CEC do wystarczającej liczby studzienek, tak aby na liczbę starterów przypadały trzy dołki.</li>
		<li>Wymieszaj 6 μl zielonego buforu 2x qPCR SYBR z 0,5 μl każdego startera 10 μM, w tym starterów do przodu i do tyłu, i dodaj je do jednego dołka odpowiadającego każdemu genowi kandydującemu.</li>
		<li>Uszczelnić płytkę folią z tworzywa sztucznego i wirować przez 1 minutę przy 300 x g przy temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieścić płytkę w maszynie qPCR, a następnie uruchomić program w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, następnie w temperaturze 95 °C przez 15 s, a następnie w temperaturze 55 °C przez 60 s. Powtórz kolejne dwa kroki przez 45 cykli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Sequencing+of+the+Healthy+and+Diseased+Heart+Reveals+Cytoskeleton-Associated+Protein+4+as+a+New+Modulator+of+Fibroblasts+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li>
<li>Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+endocardial+endothelial+cells+from+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29+and+Atlantic+cod+%28Gadus+morhua%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases.</a> Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).</li>
<li>Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+Cell+Plasticity+in+Cardiac+Development%2C+Diseases+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration.</a> Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).</li>
<li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+coronary+artery-derived+endothelial+cells+in+vivo+from+patients+undergoing+percutaneous+coronary+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions.</a> Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).</li>
<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li>
<li>Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+coronary+endothelium+is+a+mosaic+of+sinus+venosus-+and+ventricle-derived+endothelial+cells+in+a+region-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner.</a> Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardium+Minimally+Contributes+to+Coronary+Endothelium+in+the+Embryonic+Ventricular+Free+Walls%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls.</a> Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).</li>
<li>Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and coronary artery disease.</a> Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).</li>
<li>Jacques, D., Bkaily, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+endothelial+cell+hypertrophy+takes+place+during+the+development+of+hereditary+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy.</a> Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).</li>
<li>Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome%3A+A+New+Paradigm+for+an+Old+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulated+RGS5+by+genetic+variants+impairs+endothelial+cell+function+and+contributes+to+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease.</a> Cardiovascular Research. , (2019).</li>
<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Endocardial+Defect+in+Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

CEC i EEC różnią się pochodzeniem, markerami i funkcjami, a zatem mogą odgrywać wyjątkową rolę w rozwoju i chorobie. Istniejące protokoły izolacji komórek śródbłonka są ograniczone do tkanek makronaczyniowych, zaniedbując pobieranie EWG, ograniczając w ten sposób badanie funkcji specyficznych dla CEC i EWG. Niezbędne jest wyizolowanie i zbadanie tych dwóch populacji niezależnie, ponieważ wiedza ta może stanowić punkt odniesienia dla różnicowania iPSC na CEC i EEC dla przyszłych badań i ułatwić badanie tych populacji komórek pod kątem potencjalnych celów terapeutycznych dla różnych chorób serca. Ten nowatorski protokół przedstawia metodę izolacji EWG od wewnętrznej powierzchni i CEC od zewnętrznej powierzchni wolnej ściany komorowej dorosłych szczurów.
Bardzo ważne jest, aby w tym protokole bardzo precyzyjnie kontrolować czas dla każdego kroku. Ponieważ liczba EEC w tkance serca szczura jest bardzo ograniczona, zminimalizowaliśmy czas trawienia wewnętrznej warstwy serca, aby zapobiec uszkodzeniu komórek, a co ważniejsze, zanieczyszczeniu CEC. Natychmiastowe dodanie roztworu pożywki EC w celu zakończenia reakcji enzymatycznej jest również bardzo ważne dla utrzymania wysokiej żywotności komórek. Czerwona osadka po pobraniu komórek sugeruje obecność dużej liczby krwinek czerwonych. W zależności od ilości zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi, można dodać 1–2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych w celu degradacji krwinek czerwonych. Inkubacja musi być starannie zaplanowana, aby uniknąć znacznego uszkodzenia komórek, a PBS jest natychmiast dodawany w celu zakończenia reakcji. Korzystając z obecnego protokołu, byliśmy w stanie wyizolować 105 EEC z sześciu serc szczurów. Komórki te można umieścić na naczyniu do hodowli komórkowej w celu dalszej ekspansji i charakterystyki.
Podczas przygotowywania tkanki do pobrania wolnej ścianki, serce przemyto HBSS w celu usunięcia większości pozostałych krwinek czerwonych. HBSS jest zalecaną pożywką ze względu na jej przejrzysty wygląd, który umożliwia wizualizację komórek krwi, w przeciwieństwie do DMED zawierającego czerwień fenolową. Skład buforu trawiennego zapewnia wystarczające uwolnienie komórek śródbłonka, w którym enzym trawienia liberazy zdziera tkankę z odsłoniętych komórek, DNaza I eliminuje DNA z martwych komórek, aby promować odwarstwienie komórek, które może być hamowane przez jakość adhezyjną DNA, bufor HEPES równoważy pH, a DMEM jest zmodyfikowaną pożywką podstawową o wyższym stężeniu aminokwasów i witamin dla lepszego utrzymania komórek i zawiera niezbędny wapń , aby aktywować liberase.
Zgodnie z sekwencjonowaniem RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) uzyskanym zarówno z serca człowieka15, jak i myszy10, zgłoszono kilka markerów przypisywanych do określonych populacji EC. Wybraliśmy niektóre z najbardziej wzbogaconych genów, aby zbadać czystość wyizolowanych EEC (tj. Npr3, Cdh11 i Hapln1) i EEC (tj. Mgll, Fabp4 i Cd36). W stosunku do β-aktyny, markery Npr3, Cdh11 i Hapln1 wykazały zwiększoną ekspresję w EWG w porównaniu z CEC. Podobnie, ekspresja markerów Mgll, Fabp4 i Cd36 była większa w CEC w porównaniu z EWG. Jednoznacznie wyrażone markery dla każdej próbki są zgodne z markerami charakterystycznymi odpowiednio dla EWG i CEC, co wskazuje na udaną izolację.
Obecny protokół nie może jednak wykluczyć zanieczyszczenia krzyżowego między dwiema populacjami EC podczas izolacji, nawet przy starannie kontrolowanym sekwencyjnym trawieniu. Dlatego niektóre markery powierzchni komórek można zastosować w celu dalszego oczyszczenia. Na przykład NPR3 ogólnie oznacza wsierdzie10, podczas gdy APJ może śledzić większość CEC16. Ponieważ te dwa markery ulegają ekspresji na powierzchni komórki, można je wykorzystać do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), a przeciwciała do dalszego oczyszczania odrębnych populacji EC. Ponadto, sekwencja scRNA-seq serca człowieka15 imyszy 10 może potwierdzić wzbogacenie Npr3 w EEC, a Cd36 może być potencjalnie wykorzystany do oczyszczania CEC.
Podsumowując, przedstawiony protokół nakreśla niezależną izolację EEC i CEC od serca szczura. Kompleksowa identyfikacja właściwości komórkowych, możliwa dzięki izolacji komórek, może być wykorzystana do istotnych dalszych zastosowań.

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół (zmodyfikowany z Gladka et al.1) do preparowania i późniejszej izolacji komórek śródbłonka wsierdzia (EEC) i komórek śródbłonka wieńcowego (CEC) z serc szczurów. Możliwość niezależnego badania tych populacji komórek umożliwiłaby zbadanie specyficznych dla typu komórek mechanizmów leżących u podstaw różnych chorób serca, które mogłyby służyć jako potencjalne cele terapeutyczne. Skuteczna metoda niezależnego zbierania tych populacji komórek nie została jednak jeszcze opublikowana.
CEC różnią się od EEC pod względem pochodzenia, markerów i funkcji podczas rozwoju i choroby serca1,2,3,4,5,6,7. EEC wywodzą się z brzusznej powierzchni mezodermy serca3. Powstają z komórek progenitorowych Flk1+ w odpowiedzi na sygnalizację VEGF i HIF i tworzą najbardziej wewnętrzną warstwę trzech dyskretnych regionów rozwijającego się serca: przedsionka, komory i zatoki żylnej3,6. Śledzenie linii genetycznej sugeruje, że pluripotencjalne komórki wsierdzia zatoki żylnej pochodzą z komórek żylnych, które migrują, tworząc warstwę podnasierdziową3. Następnie warstwa podnasierdziowa różnicuje się w tętnice wieńcowe i żyły, w tym CEC, które pozostają w poprzek wolnej ściany komory obwodowej3,4. Ten szlak wsierdzia do śródbłonka jest regulowany przez sygnalizację VEGFC, ELA/APJ i SOX173,4,6,8,9. Wsierdzie komorowe wyprowadza mniej CEC przegrody międzykomorowej w wyniku nieznanego mechanizmu3. Następnie, miejscowe różnicowanie między EEC i CEC jest sugerowane przez markery specyficzne dla tych dwóch populacji komórek, w tym ekspresję Mgll, Fabp4 i Cd36 w CEC lub ekspresję Npr3, Cdh11 i Hapln1 w EECs3,5,10.
EEC i CEC odgrywają różne role w funkcjonowaniu serca. Przejście wsierdziowe do mezenchymalnej, tworzenie zastawek, dojrzewanie komory, regulacja drogi odpływu i rozwój kanału przedsionkowo-komorowego są zależne od EECs6. Alternatywnie, CEC przyczyniają się do napięcia naczynioruchowego i zapalenia tętnic wieńcowych11. Te różnice w funkcji skutkują zindywidualizowanymi rolami w rozwoju choroby4,12. Na przykład, dowody sugerują, że nieprawidłowo działające EEC mogą prowadzić do wrodzonej choroby zastawek6, myocardium6, efekt przegrody przedsionkowo-komorowej6, fibroelastoza wsierdzia13, zespół niedorozwoju lewego serca13, hipoplazja komorowa13, oraz przerost mięśnia sercowego12. Podobnie, badania wykazały, że nieprawidłowe CEC przyczyniają się do choroby wieńcowej14 i zakrzepicy11.
Skuteczna izolacja EEC i CEC jest niezbędna do uzyskania wszechstronnej wiedzy o tych dwóch populacjach komórek, która może być wykorzystana zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych. Określenie czynników wzrostu i różnicowania tych populacji komórek dostarczyłoby odniesienia do różnicowania podtypów śródbłonka od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Co więcej, pełna identyfikacja różnic w rozwoju, regulacji i funkcjonowaniu EEC i CEC jest niezbędna do zrozumienia czynników genomicznych i epigenomicznych odpowiedzialnych za liczne choroby serca w sposób specyficzny dla typu komórki. W tym artykule przedstawiono kroki prowadzące do pomyślnego niezależnego pobierania EEC i CEC oraz przedstawiono dowody na separację poprzez ocenę poziomów ekspresji genów markerów specyficznych dla typu komórki.

<table><tbody><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1M</td></tr><tr><td>15ml Probówki</td><td>Eppendorf</td><td>0030122151</td><td></td></tr><tr><td>50ml Probówki</td><td>Nunc</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>5ml</td><td>Eppendorf</td><td>30119401</td><td></td></tr><tr><td>ACK Bufor lizujący</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-115-505</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki anty-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>10%</td></tr> <tr><td>CFX384 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-rad</td><td>1855485</td><td>do qPCR</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LK 003172</td><td>1 mg / ml w wodzie</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10313021</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EC Medium</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0,5 m</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) X1</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do PCR Hard-Shell 384-Well, cienkościenne, listwowe, przezroczyste/białe</td><td>Bio-rad</td><td>HSP3805</td><td>Do qPCR</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401119001</td><td>5 mg / mL</td></tr><tr><td>MACS LS</td><td>Kolumna Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Do izolacji EC</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Do izolacji EC</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR Plate Sealing Folia, klej, optyczna</td><td>Bio-rad</td><td>MSB1001</td> Do kleszczyków <td>qPCR</td></tr> o <tr><td>wąskim wzorze</td><td>FST</td><td>11002-12</td><td>Do zbioru serca</td></tr><tr><td>Nylonowe sterylne sitko</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>40 mm</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) X1</td><td>Gibco</td><td>1001023</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td>Do zestawu mikroprzygotowawczego qPCR</td></tr><tr><td>Quick-RNA Zymo</td><td>Research</td><td>R1050</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>S& Kleszcze T - Końcówki SuperGrip</td><td>FST</td><td>00632-11</td><td>Do zbioru serca</td></tr><tr><td>Nożyczki do zeza - Węglik wolframu</td><td>FST</td><td>14574-11</td><td>Do zbioru serca</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas - mikroząbkowane</td><td>FST</td><td>15007-08</td><td>Do zbioru serca</td></tr></tbody></table>

izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Wykazano, że komórki śródbłonka wsierdzia (EEC) i komórki śródbłonka wieńcowego (CEC) różnią się pochodzeniem, rozwojem, markerami i funkcjami. W związku z tym te dwie populacje komórek odgrywają wyjątkową rolę w chorobach serca. Obecne badania z udziałem izolowanych komórek śródbłonka dotyczą populacji komórek składających się zarówno z EWG, jak i CEC. Protokół ten przedstawia metodę niezależnej izolacji tych dwóch populacji komórek w celu scharakteryzowania specyficznego dla komórki. Po zebraniu wolnej ściany lewej i prawej komory, komórki śródbłonka z powierzchni zewnętrznej i wewnętrznej są oddzielnie uwalniane za pomocą roztworu buforowego do wytrawiania. Sekwencyjne trawienie zewnętrznej powierzchni i wewnętrznej warstwy wsierdzia zachowało separację dwóch populacji komórek śródbłonka. Oddzielna izolacja EWG i CEC jest następnie weryfikowana poprzez identyfikację markerów specyficznych dla każdej populacji. Opierając się na wcześniej opublikowanym profilowaniu RNA pojedynczej komórki w sercu myszy, ekspresja genów Npr3, Hapln1 i Cdh11 jest unikalna dla EEC; podczas gdy ekspresja genów Fabp4, Mgll i Cd36 jest unikalna dla CEC. Dane qPCR ujawniły wzbogaconą ekspresję tych charakterystycznych markerów w odpowiednich próbkach, co wskazuje na pomyślną izolację EEC i CEC, a także utrzymanie fenotypu komórki, umożliwiając dalszą analizę funkcjonalną specyficzną dla komórki.

Proces izolacji EEC i CEC opisano na Rysunku 2. Prawidłową izolację EEC i CEC potwierdzono poprzez ocenę obecności pan-endotelialnych markerów komórkowych, a także markerów charakterystycznych dla obu populacji podtypów. Zgodnie z przewidywaniami, analiza qPCR wykazała, że w stosunku do β-aktyny, komórki EEC wykazywały wyższy poziom ekspresji markerów endokardialnych Npr3, Hapln1 oraz Cdh11 w porównaniu z CEC (Rysunek 3A). Analogicznie, komórki CEC wykazywały wyższy poziom ekspresji markerów wieńcowych Fabp4, Mgll oraz Cd36 w porównaniu z EEC (Rysunek 3B). Ponadto zarówno EEC, jak i CEC wykazywały ekspresję genu pan-EC Cdh5, z nieco wyższym poziomem w przypadku CEC (Rysunek 3C).
 
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig1v5.jpg" /> 
Rysunek 1: Schemat sekcji serca.&#160;(A) Pierwsze cięcie wykonane w celu oddzielenia wolnej ściany prawej komory od przegrody. (B) Drugie cięcie wykonane w celu całkowitego uwolnienia prawej komory. (C) Pierwsze cięcie wykonane w celu oddzielenia wolnej ściany lewej komory od przegrody. (D) Drugie cięcie wykonane w celu całkowitego uwolnienia lewej komory. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig1v4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
 
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig2v5.jpg" /> 
Rysunek 2: Schemat przygotowania do trawienia CEC i EEC oraz następujący po nim układ do sortowania komórek.&#160;(A) Wewnętrzna wolna ściana komory oraz (B) zewnętrzna wolna ściana komory zostały odpowiednio (C) zanurzone w buforze do trawienia lub (D) trawione w buforze do trawienia. (E) Zbieranie i filtrowanie zawiesin komórkowych, a następnie (F) lizy erytrocytów (RBC) i (G) magnetycznego sortowania komórek (MACS) z użyciem przeciwciała CD31. (h) Oczyszczone komórki EC zostały poddane analizie w celu weryfikacji ekspresji genów przy użyciu qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig2v4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
 
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig3v5.jpg" /> 
Rycina 3: Dane qPCR potwierdzające izolację CEC i EEC.&#160;(A) Poziomy ekspresji genów markerów EEC Npr3, Cdh11 oraz Hapln1 w komórkach EEC i CEC zostały określone metodą PCR w czasie rzeczywistym. (B) Poziomy ekspresji genów markerów CEC Mgll, Fabp4 oraz Cd36 w komórkach EEC i CEC zostały określone metodą PCR w czasie rzeczywistym. (C) Poziom ekspresji ogólnego markera EC Cdh5 w komórkach EEC i CEC został określony metodą PCR w czasie rzeczywistym. (n = 3 w każdej grupie). Słupki przedstawiają średnią ± SEM. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0.01 względem EEC, nieparzysty test t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig3v4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Tabela 1. Bufor do trawienia (1,5 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;</td>
			<td>Stężenie roztworu zapasu</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
			<td>Objętość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM</td>
			<td>5 mg/ml</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
			<td>150 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaza I</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>20 µg/ml</td>
			<td>30 $\mu$l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>15 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1305 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład buforu do trawienia.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Tabela 2. Sekwencje starterów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nazwa genu</td>
			<td>Przedmowa</td>
			<td>Odwrócenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Npr3</td>
			<td>TCCTTGCAAATCATGTGGCCTA</td>
			<td>GGAATCTTCCCGCAGCTCTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdh11</td>
			<td>GTGAATGGGACTGGGACTGG</td>
			<td>GTAATTTCTGGGGCCCTTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hapln1</td>
			<td>CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG</td>
			<td>GGGCCATTTTCAGCTTGGATG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mgll</td>
			<td>CCCGGGGCCCAAAGAC</td>
			<td>GAAGATGAGGGCCTTGGGTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabp4</td>
			<td>AGAAGTGGGAGTTGGCTTCG</td>
			<td>ACTCTCTGACCGGATGACGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cd36</td>
			<td>GCAAAACGACTGCAGGTCAA</td>
			<td>CCCGGTCACTTGGTTTCTGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdh5</td>
			<td>CCATTGAGACAGACCCCGAC</td>
			<td>TGTGGAACGTGTACTGCTGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-aktyna</td>
			<td>TCTGTGTGGATTGGTGGCTC</td>
			<td>CGGACTCATCGTACTCCTGC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Sekwencje starterów

Przedstawiamy protokół izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serc szczurów poprzez sekwencyjne trawienie tkanek w buforze trawiennym, pobieranie komórek z powtarzających się cykli wirowania i oczyszczanie komórek za pomocą mikrogranulek anty-szczurzych CD31.

Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolowania komórek wsierdzia i komórek śródbłonka naczyń wieńcowych oddzielnie od serca, aby pomóc ludziom zrozumieć ekspresję i funkcję genów specyficznych dla typu komórki. Głównymi zaletami tej metody są wysoka czystość i żywotność wyizolowanych EWG i CEC oraz to, że komórki zachowują swoje właściwości fizjologiczne po izolacji. CEC i EEC różnią się pod wieloma względami, więc możliwość niezależnego badania tych populacji komórek umożliwia badanie mechanizmów specyficznych dla typu komórek w różnych chorobach serca.Metoda ta może ułatwić badanie czynników transkryptomicznych i epigenetycznych odpowiedzialnych za liczne choroby serca w sposób specyficzny dla typu komórki. Najtrudniejszymi częściami tej metody jest określenie różnych porcji serca i prawidłowe wyczucie czasu trawienia, aby uniknąć zanieczyszczenia typu komórki. Procedurę zademonstruje Yifei Miao, naukowiec z mojego laboratorium.Po zebraniu serc od sześciu 50 do 100 gramowych szczurów Sprague Dawley, umyj narządy 50 mililitrami zimnego HBSS trzy razy, aby usunąć nadmiar krwi i umieść jedno serce pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść serce na jego bardziej płaskiej tylnej powierzchni, aby zidentyfikować lewą i prawą stronę tkanki oraz zlokalizować tętnicę płucną. Za pomocą nożyczek przeciąć tętnicę płucną do prawej komory i przeciąć wzdłuż przegrody, aż do osiągnięcia wierzchołka.Kontynuuj cięcie od wierzchołka w górę tylnej strony serca wzdłuż przegrody, aż do połączenia tętnicy płucnej i prawej komory komory. Zaczynając od tego punktu, odetnij zarówno przednią, jak i tylną stronę serca prostopadle do poprzedniego punktu rozwarstwienia i z dala od przegrody, aż wolna ściana prawej komory zostanie uwolniona od reszty serca. Następnie umieść prawą wolną ścianę komory w pięciomililitrowej probówce DMEM i ponownie zlokalizuj aortę, aby ułatwić zebranie wolnej ściany lewej komory w taki sam sposób, jak pokazano.Po zebraniu wszystkich wolnych ścianek komór przenieś próbki tkanek do 60-centymetrowego naczynia hodowlanego, tak aby ich wewnętrzne powierzchnie leżały w naczyniu stroną do dołu. Używając jednomililitrowej końcówki pipety, dodaj 0,5 do jednego mililitra buforu wytrawiającego do naczynia bezpośrednio pod kawałkami tkanki, aż zanurzą się tylko wewnętrzne powierzchnie tkanek. Aby uniknąć niepożądanego zanieczyszczenia komórek, ważne jest, aby tylko wewnętrzna powierzchnia komory była zanurzona w buforze trawiennym i była trawiona dokładnie przez pięć minut.Po pięciu minutach w inkubatorze do hodowli komórkowych przerwij trawienie pięciokrotnie większą objętością pożywki dla komórek śródbłonka. Następnie za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przepłukać wewnętrzną powierzchnię każdej komory świeżym podłożem, przenosząc spływ przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki zbiorczej na lodzie. W celu trawienia komórek śródbłonka wieńcowego przeciąć wzdłuż zewnętrznej powierzchni lewej komory bez zanieczyszczenia warstwą wewnętrzną i umieścić każdy fragment rurki w oddzielnej pięciomililitrowej probówce zawierającej jeden mililitr buforu do wytrawiania.Aby uniknąć zanieczyszczenia przez EWG, ważne jest, aby ciąć tylko z zewnętrznej powierzchni komory. Za pomocą nożyczek preparacyjnych zmiel ścianę komory na małe milimetrowe kawałki i umieść probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 do 20 minut z wirowaniem co dwie do trzech minut. Gdy zmielone kawałki są małe, ale widoczne, dodaj cztery mililitry pożywki z komórek śródbłonka do probówki i użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby przenieść całą objętość roztworu przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki zbiorczej na lodzie.Aby wyizolować populacje komórek CD31 dodatnich po ich strawieniu, należy osadzać komórki przez odwirowanie i aspirować supernatanty. Jeśli jakiekolwiek granulki są czerwone, ponownie zawieś komórki w jednym do dwóch mililitrów buforu do lizy czerwonych krwinek na probówkę na pięciominutową inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przerwij lizę za pomocą 10 mililitrów PBS i zbierz komórki za pomocą drugiego odwirowania.Następnie dodaj 90 mikrolitrów buforu sortującego i 10 mikrolitrów przeciwciała anty-CD31 PE do każdej probówki komórek. Po wirowaniu inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać 10 mililitrów buforu sortującego do probówek po dokładnym wymieszaniu i zebrać komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić granulki w 80 mikrolitrach buforu sortującego na probówkę, a następnie dodać 20 mikrolitrów mikrogranulek anty-PE. Po wirowaniu umieść probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut, a następnie przemyj 10 mililitrów buforu sortującego przez odwirowanie, jak pokazano. Zawiesić granulki w 500 mikrolitrach buforu sortującego na lodzie i umieścić kolumnę zawierającą super kulki paramagnetyczne w separatorze magnetycznym.Przepłukać kolumnę trzema mililitrami buforu sortującego. Po opróżnieniu kolumny dodać do niej 500 mikrolitrów zawiesiny komórek śródbłonka wsierdzia, a następnie cztery przepłuczenia trzema mililitrami buforu sortującego na przemycie. Po ostatnim płukaniu przenieś kolumnę do nowej 15-mililitrowej probówki zbiorczej i użyj tłoka kolumny i pięciu mililitrów świeżej pożywki z komórek śródbłonka, aby wypłukać dodatnie komórki CD31 z kolumny do probówki zbiorczej.Następnie zbierz izolowane komórki śródbłonka przez odwirowanie. Zgodnie z przewidywaniami, ilościowy PCR ujawnia, że w porównaniu z beta-aktyną, komórki śródbłonka wsierdzia wyrażały wyższe poziomy markerów wsierdzia Npr3, Hapln1 i Cdn11 w porównaniu z komórkami śródbłonka wieńcowego. Podobnie komórki śródbłonka wieńca wyrażały wyższe poziomy markerów wieńcowych Fabp4, Mgll i Cd36 w porównaniu z komórkami śródbłonka wsierdzia.Ponadto oba typy komórek wykazywały ekspresję genu markera komórek śródbłonka Cdh5 z nieco wyższymi poziomami obserwowanymi w komórkach śródbłonka naczyń wieńcowych. Możemy dalej oczyszczać komórki za pomocą FACS i przeciwciał specyficznych dla populacji komórek. Na przykład możemy użyć anty-Npr3 do sortowania EEC i anty-Cd36 do sortowania CEC.Technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania roli EEC i CEC w rozwoju i chorobach serca w sposób specyficzny dla typu komórki.

isolation-endocardial-coronary-endothelial-cells-from-ventricular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli czystych populacji komórek śródbłonka zastawek serca (VEC). Komórki VEC można izolować z obu stron cuspisu lub płatka zastawki, a bezpośrednio po tym procesie możliwe jest łatwe wyizolowanie znajdujących się pod nimi komórek śródmiąższowych (VIC).

Izolacja komórek śródbłonka zastawek

Niniejsza metoda izolacji funkcjonalnych komórek odpornościowych z serca stanowi alternatywę dla konwencjonalnych metod trawienia kolagenazą, która powoduje niepożądaną aktywację komórek odpornościowych, prowadząc do obniżenia ich reaktywności. Nasza metoda izolacji pozwala na uzyskanie funkcjonalnych komórek odpornościowych serca dzięki uniknięciu problemów związanych z trawieniem enzymatycznym.

Izolacja funkcjonalnych komórek odpornościowych serca

Pierwotna hodowla komórkowa jest użyteczną techniką do analizy określonych populacji komórek, szczególnie z transgenicznych zarodków myszy w określonych stadiach rozwoju. W tym przypadku komory embrionalne są preparowane i dysocjowane, a kulki sprzężone z przeciwciałami rozpoznają i oddzielają komórki śródbłonka do dalszej analizy.

Izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór

Zdolność do izolowania komórek śródbłonka zastawki serca (VEC) jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, utrzymania i choroby zastawki.  W tym miejscu opisujemy izolację VEC od embrionalnych i dorosłych myszy Tie2-GFP za pomocą FACS, co pozwoli na badania określające udział VEC w procesach rozwojowych i chorobowych.

Izolacja komórek śródbłonka mysiej zastawki

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

Poznaj metodę izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serca szczura. Technika zapewnia wysoką czystość i żywotność komórek, umożliwiając badanie specyficznych mechanizmów komórkowych w chorobach serca.

Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura

Przeglądaj więcej filmów