Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura
15 kwietnia 2020
Przedstawiamy protokół izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serc szczurów poprzez sekwencyjne trawienie tkanek w buforze trawiennym, pobieranie komórek z powtarzających się cykli wirowania i oczyszczanie komórek za pomocą mikrogranulek anty-szczurzych CD31.
W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolowania komórek wsierdzia i komórek śródbłonka naczyń wieńcowych oddzielnie od serca, aby pomóc ludziom zrozumieć ekspresję i funkcję genów specyficznych dla typu komórki. Głównymi zaletami tej metody są wysoka czystość i żywotność wyizolowanych EWG i CEC oraz to, że komórki zachowują swoje właściwości fizjologiczne po izolacji. CEC i EEC różnią się pod wieloma względami, więc możliwość niezależnego badania tych populacji komórek umożliwia badanie mechanizmów specyficznych dla typu komórek w różnych chorobach serca.
Metoda ta może ułatwić badanie czynników transkryptomicznych i epigenetycznych odpowiedzialnych za liczne choroby serca w sposób specyficzny dla typu komórki. Najtrudniejszymi częściami tej metody jest określenie różnych porcji serca i prawidłowe wyczucie czasu trawienia, aby uniknąć zanieczyszczenia typu komórki. Procedurę zademonstruje Yifei Miao, naukowiec z mojego laboratorium.
Po zebraniu serc od sześciu 50 do 100 gramowych szczurów Sprague Dawley, umyj narządy 50 mililitrami zimnego HBSS trzy razy, aby usunąć nadmiar krwi i umieść jedno serce pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść serce na jego bardziej płaskiej tylnej powierzchni, aby zidentyfikować lewą i prawą stronę tkanki oraz zlokalizować tętnicę płucną. Za pomocą nożyczek przeciąć tętnicę płucną do prawej komory i przeciąć wzdłuż przegrody, aż do osiągnięcia wierzchołka.
Kontynuuj cięcie od wierzchołka w górę tylnej strony serca wzdłuż przegrody, aż do połączenia tętnicy płucnej i prawej komory komory. Zaczynając od tego punktu, odetnij zarówno przednią, jak i tylną stronę serca prostopadle do poprzedniego punktu rozwarstwienia i z dala od przegrody, aż wolna ściana prawej komory zostanie uwolniona od reszty serca. Następnie umieść prawą wolną ścianę komory w pięciomililitrowej probówce DMEM i ponownie zlokalizuj aortę, aby ułatwić zebranie wolnej ściany lewej komory w taki sam sposób, jak pokazano.
Po zebraniu wszystkich wolnych ścianek komór przenieś próbki tkanek do 60-centymetrowego naczynia hodowlanego, tak aby ich wewnętrzne powierzchnie leżały w naczyniu stroną do dołu. Używając jednomililitrowej końcówki pipety, dodaj 0,5 do jednego mililitra buforu wytrawiającego do naczynia bezpośrednio pod kawałkami tkanki, aż zanurzą się tylko wewnętrzne powierzchnie tkanek. Aby uniknąć niepożądanego zanieczyszczenia komórek, ważne jest, aby tylko wewnętrzna powierzchnia komory była zanurzona w buforze trawiennym i była trawiona dokładnie przez pięć minut.
Po pięciu minutach w inkubatorze do hodowli komórkowych przerwij trawienie pięciokrotnie większą objętością pożywki dla komórek śródbłonka. Następnie za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przepłukać wewnętrzną powierzchnię każdej komory świeżym podłożem, przenosząc spływ przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki zbiorczej na lodzie. W celu trawienia komórek śródbłonka wieńcowego przeciąć wzdłuż zewnętrznej powierzchni lewej komory bez zanieczyszczenia warstwą wewnętrzną i umieścić każdy fragment rurki w oddzielnej pięciomililitrowej probówce zawierającej jeden mililitr buforu do wytrawiania.
Aby uniknąć zanieczyszczenia przez EWG, ważne jest, aby ciąć tylko z zewnętrznej powierzchni komory. Za pomocą nożyczek preparacyjnych zmiel ścianę komory na małe milimetrowe kawałki i umieść probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 do 20 minut z wirowaniem co dwie do trzech minut. Gdy zmielone kawałki są małe, ale widoczne, dodaj cztery mililitry pożywki z komórek śródbłonka do probówki i użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby przenieść całą objętość roztworu przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki zbiorczej na lodzie.
Aby wyizolować populacje komórek CD31 dodatnich po ich strawieniu, należy osadzać komórki przez odwirowanie i aspirować supernatanty. Jeśli jakiekolwiek granulki są czerwone, ponownie zawieś komórki w jednym do dwóch mililitrów buforu do lizy czerwonych krwinek na probówkę na pięciominutową inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przerwij lizę za pomocą 10 mililitrów PBS i zbierz komórki za pomocą drugiego odwirowania.
Następnie dodaj 90 mikrolitrów buforu sortującego i 10 mikrolitrów przeciwciała anty-CD31 PE do każdej probówki komórek. Po wirowaniu inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać 10 mililitrów buforu sortującego do probówek po dokładnym wymieszaniu i zebrać komórki przez odwirowanie.
Ponownie zawiesić granulki w 80 mikrolitrach buforu sortującego na probówkę, a następnie dodać 20 mikrolitrów mikrogranulek anty-PE. Po wirowaniu umieść probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut, a następnie przemyj 10 mililitrów buforu sortującego przez odwirowanie, jak pokazano. Zawiesić granulki w 500 mikrolitrach buforu sortującego na lodzie i umieścić kolumnę zawierającą super kulki paramagnetyczne w separatorze magnetycznym.
Przepłukać kolumnę trzema mililitrami buforu sortującego. Po opróżnieniu kolumny dodać do niej 500 mikrolitrów zawiesiny komórek śródbłonka wsierdzia, a następnie cztery przepłuczenia trzema mililitrami buforu sortującego na przemycie. Po ostatnim płukaniu przenieś kolumnę do nowej 15-mililitrowej probówki zbiorczej i użyj tłoka kolumny i pięciu mililitrów świeżej pożywki z komórek śródbłonka, aby wypłukać dodatnie komórki CD31 z kolumny do probówki zbiorczej.
Następnie zbierz izolowane komórki śródbłonka przez odwirowanie. Zgodnie z przewidywaniami, ilościowy PCR ujawnia, że w porównaniu z beta-aktyną, komórki śródbłonka wsierdzia wyrażały wyższe poziomy markerów wsierdzia Npr3, Hapln1 i Cdn11 w porównaniu z komórkami śródbłonka wieńcowego. Podobnie komórki śródbłonka wieńca wyrażały wyższe poziomy markerów wieńcowych Fabp4, Mgll i Cd36 w porównaniu z komórkami śródbłonka wsierdzia.
Ponadto oba typy komórek wykazywały ekspresję genu markera komórek śródbłonka Cdh5 z nieco wyższymi poziomami obserwowanymi w komórkach śródbłonka naczyń wieńcowych. Możemy dalej oczyszczać komórki za pomocą FACS i przeciwciał specyficznych dla populacji komórek. Na przykład możemy użyć anty-Npr3 do sortowania EEC i anty-Cd36 do sortowania CEC.
Technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania roli EEC i CEC w rozwoju i chorobach serca w sposób specyficzny dla typu komórki.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolacji komórek śródbłonka wsierdziowego i wieńcowego z serc szczurzych. Metoda ta zapewnia wysoką czystość i żywotność izolowanych komórek, co umożliwia badanie mechanizmów specyficznych dla danego typu komórek w chorobach serca.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Badania sercowo-naczyniowe
- Izolacja komórek śródbłonka
Wprowadzenie
- Komórki śródbłonka wsiercowego oraz wieńcowego charakteryzują się odmiennymi funkcjami i ekspresją genów.
- Zrozumienie tych różnic jest kluczowe dla badania chorób serca.
- Celem protokołu jest zachowanie właściwości fizjologicznych podczas izolacji.
- Badania specyficzne dla danego typu komórek mogą dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów chorobowych.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody izolacji specyficznych populacji komórek śródbłonka.
- Ułatwienie badań nad czynnikami transkrypcyjnymi i epigenetycznymi w chorobach serca.
- Umożliwienie niezależnego badania komórek śródbłonka endokardium oraz tętnic wieńcowych.
Zastosowane metody
- Sekwencyjne trawienie tkanek przy użyciu buforu do trawienia.
- Zbiór komórek poprzez cykle wirowania.
- Oczyszczanie komórek za pomocą mikrokulek anty-CD31 szczura.
- Staranna dyssekcja w celu uniknięcia kontaminacji między typami komórek.
Główne wyniki
- Komórki śródbłonka wsierdziowego wykazywały wyższy poziom ekspresji specyficznych markerów w porównaniu do komórek śródbłonka wieńcowego.
- Komórki śródbłonka wieńcowego wykazywały podwyższoną ekspresję swoich unikalnych markerów.
- Oba typy komórek wykazywały ekspresję pan-śródbłonkowego genu markerowego Cdh5.
- Ilościowy PCR potwierdził odmienne profile ekspresji genów.
Wnioski
- Protokół ten pozwala na skuteczną izolację populacji komórek śródbłonka o wysokiej czystości.
- Izolowane komórki zachowują cechy fizjologiczne niezbędne do dalszych badań.
- Metoda ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia mechanizmów chorób serca.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja komórek śródbłonka endokardialnego i wieńcowego umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w procesie walidacji celów terapeutycznych w chorobach układu sercowo-naczyniowego poprzez wyjaśnienie wkładu poszczególnych typów komórek w fenotypy chorobowe. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć, rozróżniając patogenne szlaki charakterystyczne dla każdej populacji komórek śródbłonka. Zachowanie właściwości fizjologicznych po izolacji zapewnia istotność translacyjną dla modelowania przedklinicznego oraz dopasowania biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację EEC i CEC w celu oceny ich odrębnych ról w patogenezie serca.
- Wartość operacyjna: Dostarcza oczyszczone populacje komórek do testów funkcjonalnych, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w wyborze celów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez profilowanie ekspresji biomarkerów specyficznych dla danej komórki (np. Npr3/Hapln1/Cdh11 dla EEC; Fabp4/Mgll/Cd36 dla CEC).
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Tworzenie systemów istotnych dla patogenezy chorób z walidowanymi podtypami śródbłonka do screeningu związków.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji testów dzięki zastosowaniu wysokiej czystości i żywotności komórek, które zachowują markery pan-śródbłonkowe (Cdh5) oraz specyficzne dla danego podtypu.
- Skalowalność: Umożliwienie ponownego wykorzystania platformy w programach dotyczących różnych wskazań sercowo-naczyniowych dzięki powtarzalnym protokołom izolacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia modelowanie istotne dla chorób poprzez zachowanie profili ekspresji genów specyficznych dla danego typu komórek po izolacji.
- Wartość operacyjna: Wspiera dopasowanie translacyjnych biomarkerów poprzez wzbogacanie markerów w izolowanych populacjach, zweryfikowane metodą qPCR.
- Minimalizacja ryzyka: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez powiązanie walidacji celu na etapie odkrywania z walidacją funkcjonalną w modelach chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków — od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną — dostarczając podtypów komórek śródbłonka służących do mechanistycznej redukcji ryzyka.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie niezależnego badania wkładu EEC i CEC w sygnalizację kardiologiczną.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analiz dzięki standaryzowanej izolacji, dającej ilościowe wyniki do oceny odpowiedzi na związki chemiczne.
- Analityka: Dostarcza mierzalne odczyty (np. ekspresję genów markerowych za pomocą qPCR), które pozwalają na analizę porównawczą między typami komórek a warunkami traktowania.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez zachowanie stabilności fenotypowej i ekspresję markerów istotnych dla choroby w izolowanych komórkach.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania w programach B+R w zakresie układu sercowo-naczyniowego, wymagających rozróżnienia podtypów śródbłonka.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki walidacji celu oraz redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach sercowo-naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność izolacji komórek śródbłonka w celu wdrożenia w wielu projektach.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji go/no-go dzięki komórkowym danym funkcjonalnym, co zwiększa efektywność kapitałową i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko, oparta na danych dotyczących modulacji szlaków i zaangażowania celu specyficznego dla podtypu śródbłonka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w sekcji tkanki serca oraz w pracy z komórkami śródbłonka, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
- Zależy od precyzyjnego czasu trawienia enzymatycznego (5 min dla warstwy wsierdzia; 15–20 min dla warstwy wieńcowej) w celu utrzymania żywotności i czystości.
- Wymaga dostępu do kolumn separacji magnetycznej, wirówek oraz cytometrii przepływowej do opcjonalnego oczyszczania metodą FACS.
- Wymaga ustandaryzowanych składów pożywek dla komórek śródbłonka oraz buforów do sortowania we wszystkich laboratoriach w celu zapewnienia powtarzalności.
- Ograniczone przez dostępność tkanki oraz konieczność natychmiastowego przetworzenia po wycięciu w celu zachowania właściwości fizjologicznych.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:11
Heart Isolation
2:34
Endocardial Endothelial Cell (EEC) Digestion
3:34
Coronary Endothelial Cell (CEC) Digestion
4:36
Endothelial Cell (EC) Sorting
6:56
Results: Representative qPCR Data CEC and EEC Isolation Verification
7:46
Conclusion
