Name: Monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj metodę monitorowania przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem przy użyciu analizy impedancji komórek w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia precyzyjną ilościową ocenę cząstek wirusowych bez konieczności stosowania pracochłonnych metod końcowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Handle wszystkie wirusy grypy zgodnie z odpowiednimi wymaganiami poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2 lub wyższym, w zależności od podtypu). Stosować szczepy IAV o niskiej historii pasażu (mniej niż 5 razy na komórkach MDCK), aby zapewnić niską zmienność między eksperymentami.
1. Przygotowanie odczynników i materiałów wyjściowych
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek MDCK i sterylnej pożywki do hodowli komórkowych
	<ol>
		<li>Hoduj komórki Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (MEM) uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą (FCS) i antybiotykami (100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny).</li>
		<li>Po rozmrożeniu należy pasować komórki MDCK co najmniej 2 razy przed ich zakażeniem, aby zapewnić całkowite wyzdrowienie (ale mniej niż 30 pasaży, aby uniknąć dryfu w fenotypach komórek).</li>
		<li>Wysiew 75 cm2 kolby do hodowli tkankowych zawierające 30 ml sterylnego 1x MEM z 7,5 x 106 komórek MDCK i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie sprzętu do monitorowania impedancji
	<ol>
		<li>Umieścić instrument w inkubatorze w temperaturze 35 °C i pozostawić do rozgrzania przez co najmniej 2 godziny.</li>
		<li>Podłącz go do jednostki sterującej umieszczonej na zewnątrz inkubatora.</li>
		<li>Przejdź do procedur czyszczenia zgodnie z zaleceniami producenta przed rozpoczęciem pozostałej części eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja zapasów IAV na komórkach MDCK
	<ol>
		<li>Aby namnażać i amplifikować wirusy H1N1, należy wysiać 7,5 x 106 komórek MDCK na dwóch kolbach do hodowli tkankowych o średnicy 75cm2 i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, aby osiągnąć 90%–100% konfluencji.</li>
		<li>Zdekantować pożywkę do hodowli komórkowych z monowarstwy komórek w kolbach o długości 75 cm2. Umyj komórki 5 ml sterylnego 1x PBS.</li>
		<li>Usuń PBS i dodaj 5 ml 1x PBS, aby ponownie umyć komórki.</li>
		<li>Oznaczyć jedną kolbę jako kontrolę i usunąć PBS przed dodaniem 15 ml pożywki do namnażania wirusa (1x MEM z 0% FCS) ostrożnie na monowarstwę. Inkubować tę kolbę w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 35 °C z 5% CO2 . Użyj go do porównania po 3 dniach rozmnażania.</li>
		<li>Rozmrozić jedną fiolkę z zapasem IAV w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć wirusa do odpowiedniego stężenia w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę do namnażania wirusa (1x MEM z 0% FCS).</li>
		<li>Usunąć 1x PBS z kolby o średnicy 75cm2 i zainfekować komórki MDCK przy wielokrotności infekcji (MOI) 1 x 10-3 lub 1 x 10-4 jednostki tworzące płytkę na komórkę (pfu/komórkę), dodając 1 ml rozcieńczonego wirusa do monowarstwy komórki.</li>
		<li>Adsorbować wirusa do komórek MDCK przez 45 minut w temperaturze pokojowej, mieszając kolbę regularnie co 15 minut.</li>
		<li>Delikatnie usunąć inokulum i dodać 15 ml pożywki do namnażania wirusa na kolbę zawierającą 1 μg/ml trypsyny TPCK (trypsyna/L-1-tozyloamid-2-fenyloetylochlorometyloketon), aby rozszczepić wirusową hemaglutyninę HA0 na podjednostki HA1 i HA2 (zdarzenie, które jest wymagane do fuzji HA z błoną endosomalną i uwolnienia genomu wirusa)22.</li>
		<li>Inkubować kolby w temperaturze 35 °C i 5% CO2 przez co najmniej 3 dni w celu replikacji wirusa.</li>
		<li>Obserwuj komórki MDCK pod mikroskopem przy 40-krotnym powiększeniu i poszukaj efektów cytopatycznych (CPE) na komórkach (porównując z kolbą kontrolną komórek). Jeśli CPE nie jest kompletny (tj. około 80% komórek jest odłączonych od substratu), należy umieścić kolby z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 24 godziny.</li>
		<li>Po zakończeniu CPE zdekantować supernatant do hodowli komórkowych i odwirować przy 300 x g przez 10 minut, aby osadzać resztki komórkowe.</li>
		<li>Przenieść oczyszczony supernatant do probówki o pojemności 15 ml, a podwielokrotne wirusy potomne do sterylnych fiolek kriogenicznych jednorazowego użytku. Natychmiast umieść krioprobówki w temperaturze -80 °C, aby zamrozić i przechowywać wirusy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Określenie odpowiedniej ilości komórek do infekowania komórek
UWAGA: Podczas wszystkich eksperymentów, trzymaj płytki na powierzchniach nieelektrostatycznych przez cały czas, takich jak papierowe opakowania. Postępuj zgodnie z sekcją 2 poniżej, aby określić najbardziej odpowiednie stężenie komórek, które mają być wysiewane na elektronicznej płytce do mikromiareczkowania (zaprojektowanej jako E-Plate).
<ol>
	<li>Przygotować komórki MDCK w kolbach o długości 75cm2 w celu uzyskania świeżo podzielonych komórek (około 80% konfluencji) na 24 godziny przed eksperymentem.</li>
	<li>Umyj komórki 5 ml 1x PBS i odłącz je, dodając 3 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Dodać 7 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych i policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek z barwieniem błękitem trypanowym.</li>
	<li>Dostosuj stężenie komórek do 400 000 komórek/ml za pomocą pożywki do hodowli komórkowych. Wykonaj dwukrotne seryjne rozcieńczenia w dodatkowych probówkach, aby uzyskać gęstość komórek 200 000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; i 6 250 komórek/ml. Dostosuj zakres rozcieńczania komórek do typu komórki i ich zachowania wzrostu.</li>
	<li>Pozostawić E-płytkę (tabela materiałów) w temperaturze pokojowej na kilka minut i dodać 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Nie dotykaj elektrod E-Plate.</li>
	<li>Odblokuj podstawki i włóż przedni koniec płytki do kieszeni kołyski przyrządu do pomiaru impedancji (tabela materiałów). Zamknij drzwi inkubatora.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie.
	<ol>
		<li>W polu "Domyślna konfiguracja wzorca eksperymentu" wybierz wybraną podstawkę (podstawki) i kliknij dwukrotnie górną stronę, a następnie wprowadź nazwę eksperymentu. Kliknij "Układ" i wprowadź niezbędne informacje o próbce dla każdego wybranego dołka płyty; następnie kliknij "Zastosuj" po zakończeniu. Kliknij "Zaplanuj" | "Kroki" | "Dodaj krok". Oprogramowanie automatycznie dodaje krok 1 s w celu zmierzenia impedancji tła (CI).</li>
		<li>Kliknij "Start/Kontynuuj" w zakładce "Wykonaj". Kliknij "Wykres", dodaj wszystkie próbki, wybierając odpowiednie dołki i upewnij się, że CI wynosi od -0,1 do 0,1 przed przejściem do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij płytkę z kołyski.</li>
	<li>Dodać 100 μl każdej zawiesiny komórkowej z kroku 2.4 po dwa egzemplarze do odpowiednich studzienek i 100 μl pożywki komórkowej do studzienek używanych jako kontrole. Pozostaw płytkę E w okapie z przepływem laminarnym na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie komórek na dnie studzienek.</li>
	<li>Włóż płytkę E do kieszeni kołyski. Kliknij "Zaplanuj" | "Dodaj krok" w oprogramowaniu i wprowadź wartości, aby monitorować komórki co 30 minut przez 200 powtórzeń. Następnie wybierz "Start/Kontynuuj".</li>
	<li>Sprawdź i wykreśl dane CI, klikając przycisk "Drukuj" w oprogramowaniu. Stężenie komórek, które znajdują się tuż przed fazą stacjonarną należy dobrać na płytkę 24 godziny po wysianiu, w celu uzyskania komórek, które podczas infekcji wirusowej są jeszcze w fazie wzrostu. Faza stacjonarna jest osiągana, gdy CI osiąga maksimum.</li>
</ol>
3. Korelacja między wartościami CIT50 a wielokrotnością infekcji
<ol>
	<li>Dodać 100 μl sterylnej pożywki hodowlanej 1x MEM do każdego dołka E-płytki. Włóż płytkę E do kieszeni kołyski instrumentu w temperaturze 35 °C. Zmierz tło zgodnie z opisem w kroku 2.7.</li>
	<li>Wyjmij płytkę E z podstawki.</li>
	<li>Wysiewać 3 x 104 świeżo rozszczepionych komórek MDCK na każdym dołku elektronicznej płytki do mikromiareczkowania i hodować je przez 24 godziny w temperaturze 35 °C z 5% CO2 , tak aby znajdowały się w fazie replikacji podczas zakażenia IAV.</li>
	<li>Zainfekuj komórki MDCK różnymi 10-krotnymi rozcieńczeniami znanego miana wirusa H1N1 o nazwie 6 log10 TCID50/ml, stosując odwrotne pipetowanie w celu odtworzenia, wykonując poniższe czynności:
	<ol>
		<li>Przepłukać komórki MDCK 2x 100 μL MEM bez FCS (pożywki do namnażania wirusa). Należy pamiętać o usunięciu wszystkich pożywek po drugim myciu, aby uniknąć dalszego rozcieńczania inokulum.</li>
		<li>Dodać 100 μl zawiesiny wirusa do każdej studzienki za pomocą pipety jednokanałowej. Aby uniknąć zanieczyszczenia, zacznij od lewej do prawej, a następnie od góry do dołu na talerzu, jednocześnie przykrywając pozostałe studzienki pokrywką.</li>
		<li>Włóż płytkę do kieszeni kołyski instrumentu w temperaturze 35 °C. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć gwałtownych ruchów prowadzących do zanieczyszczenia.</li>
		<li>Rozpocznij monitorowanie impedancji ogniwa co 15 minut przez co najmniej 100 godzin, jak opisano w kroku 2.10.</li>
		<li>Po dwóch cyklach pomiarów (tj. 30 minut) zatrzymaj aparat klikając na "Pauza" w zakładce "Wykonaj" i wyjmij E-tabliczkę z kołyski.</li>
		<li>Dodać 1 μg/ml trypsyny TPCK do pożywki do rozmnażania wirusa, aby rozszczepić hemaglutyninę wirusa.</li>
		<li>Dodać 100 μl pożywki do rozmnażania wirusów zawierającej trypsynę TPCK do każdej studzienki i włożyć płytkę E do kieszeni kołyski.</li>
		<li>Kliknij "Start/Kontynuuj" w zakładce "Wykonaj". 
		UWAGA: Nie zapomnij stworzyć kontroli negatywnej odpowiadającej fałszywie zainfekowanym komórkom, zastępując zawiesinę wirusa pożywką do rozmnażania wirusa.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kinetyka przeżycia IAV
<ol>
	<li>Wystawić IAV na działanie soli destylowanej w temperaturze 35 °C i przetestować ich zakaźność w czasie, mierząc spadek impedancji komórek.
	<ol>
		<li>Przygotować solankową wodę destylowaną, dodając NaCl do końcowego stężenia 35 g/l w wodzie destylowanej. Dodaj 900 μl soli fizjologicznej do 2 ml krioprobówek.</li>
		<li>Dodaj 100 μl wywaru wirusowego do soli fizjologicznej i umieść krioprobówki w inkubatorze (35 °C, 5% CO2) na 1 godzinę, 24 godziny lub 48 godzin.</li>
		<li>Zasiać 100 μl (zawierających 3 x 104) świeżo rozszczepionych komórek MDCK na 16-dołkowej płytce do mikromiareczkowania i rosnąć przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Zakażone komórki 100 μl wystawionych wirusów (uprzednio rozcieńczonych 10 razy w pożywkach hodowlanych) przy użyciu metody odwrotnego pipetowania w celu odtworzenia przez powtórzenie sekcji 3.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitoruj impedancję ogniwa co 15 minut przez co najmniej 100 godzin.</li>
</ol>
5. Ocena utraty zakaźności
<ol>
	<li>Wyznaczanie wartości CIT50 w celu ilościowego określenia spadku CI z powodu efektów cytopatycznych wywołanych przez wirusa za pomocą wartości CIT50.
	<ol>
		<li>Kliknij "Drukuj" i dodaj wszystkie próbki, klikając "Dodaj wszystko". Wyeksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego, klikając "Eksportuj informacje o eksperymencie". Rozważ początkowy CI jako wartość impedancji komórkowej zmierzoną 5 godzin po zakażeniu komórki przez narażone wirusy (tj. 24 godziny po wysiewie komórek MDCK na płytce E mikromiareczkowania).</li>
		<li>Oblicz wartość CIT50 odpowiadającą czasowi niezbędnemu do zmierzenia spadku o 50% w stosunku do początkowego CI. Aby obliczyć wartość CIT50, należy zanotować wartość CI przy 5 hpi dla każdej próbki. Następnie znajdź punkt czasowy, w którym wartość CI jest równa połowie wartości CI przy 5 hpi, korzystając z funkcji indeksu i dopasowania w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie średniego nachylenia inaktywacji
	<ol>
		<li>Określ wartości CIT50 dla każdej narażonej zawiesiny wirusa, w różnych czasach ekspozycji (w dniach).</li>
		<li>Oblicz nachylenie regresji liniowej na podstawie wartości wykreślonych przez CIT50, określane jako nachylenie inaktywacji i wyrażone w CIT50.dzień-1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+of+influenza+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+and+Other+Respiratory+Viruses%22%5BJournal%5D)">Routes of influenza transmission.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, Suppl 2 42-51 (2013).</li>
<li>Sooryanarain, H., Elankumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Role+in+Influenza+Virus+Outbreaks%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Animal+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).</li>
<li>Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abiotic+factors+affecting+the+persistence+of+avian+influenza+virus+in+surface+waters+of+waterfowl+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).</li>
<li>Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH%2C+temperature%2C+and+salinity+on+persistence+of+avian+influenza+viruses+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).</li>
<li>Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Stability+of+Swine+and+Human+Pandemic+Influenza+Viruses+in+Water+under+Variable+Conditions+of+Temperature%2C+Salinity%2C+and+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+influenza+A+virus+RNA+in+Siberian+lake+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice.</a> Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).</li>
<li>Nazir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Study+on+Tenacity+of+Avian+Influenza+Viruses+in+Water+%28Distilled+Water%2C+Normal+Saline%2C+and+Surface+Water%29+at+Different+Temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Diseases%22%5BJournal%5D)">Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures.</a> Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).</li>
<li>Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+H5+and+H7+avian+influenza+viruses+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Diseases%22%5BJournal%5D)">Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 51, 1 Suppl 285-289 (2007).</li>
<li>Dublineau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+the+2009+pandemic+influenza+A+%28H1N1%29+virus+in+water+and+on+non-porous+surface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface.</a> PLoS ONE. 6 (11), 28043(2011).</li>
<li>Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4">https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4</a> (2020).</li>
<li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza%3A+Propagation%2C+Quantification%2C+and+Storage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influenza: Propagation, Quantification, and Storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+Plaque+Assay+of+Influenza+Virus+in+an+Established+Line+of+Canine+Kidney+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells.</a> Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).</li>
<li>Witkowski, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+impedance+measurement+as+a+new+tool+for+poxvirus+titration%2C+antibody+neutralization+testing+and+evaluation+of+antiviral+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).</li>
<li>Lebourgeois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Real-Time+Cell+Analysis+%28RTCA%29+Method+as+a+Fast+and+Accurate+Method+for+Detecting+Infectious+Particles+of+the+Adapted+Strain+of+Hepatitis+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335(2018).</li>
<li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic%2C+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li>
<li>Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+flavivirus+induced+cytopathogenesis+using+cell+electric+impedance+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology.</a> Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).</li>
<li>Charretier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+real-time+cell+analysis+method+for+determining+viral+infectious+titers+during+development+of+a+viral+vaccine+production+process%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process.</a> Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).</li>
<li>Tian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Analysis+for+Measuring+Viral+Cytopathogenesis+and+the+Efficacy+of+Neutralizing+Antibodies+to+the+2009+Influenza+A+%28H1N1%29+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus.</a> PLoS ONE. 7 (2), 31965(2012).</li>
<li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic%2C+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li>
<li>Thieulent, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+evaluation+of+antiviral+compounds+against+Equid+alpha-herpesviruses+using+an+impedance-based+cellular+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay.</a> Virology. 526, 105-116 (2019).</li>
<li>Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Segment+Composition+Influences+Viral+Stability+in+the+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1496(2018).</li>
<li>Wiley, D. C., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+the+hemagglutinin+membrane+glycoprotein+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus.</a> Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

RTCA to technologia oparta na impedancji, która jest coraz częściej wykorzystywana do monitorowania właściwości komórek w czasie rzeczywistym, takich jak przyleganie komórek, proliferacja, migracja i cytotoksyczność. W tym badaniu zdolność tej technologii do oceny przeżywalności IAV poza gospodarzem została wykazana poprzez pomiar nachylenia inaktywacji wirusa. Wyszukane techniki, takie jak TCID50 i testy płytki miażdżycowej, są zastępowane obiektywną oceną żywotności komórek w czasie rzeczywistym, odzwiercied...

Transmisja wirusa opiera się na kombinacji kilku czynników. W przypadku wirusa wydzielanego w środowisku jego transmisja zależy również od zdolności do przetrwania w warunkach poza gospodarzem. Ogólne badanie inaktywacji wirusa jest zatem kluczowym krokiem w pomaganiu krajowym organom ds. zdrowia i decydentom we wdrażaniu środków kontroli i bezpieczeństwa biologicznego.
Wiedza na temat trwałości wirusa w warunkach naturalnych i laboratoryjnych znacznie wzrosła w ciągu ostatniej dekady. W przypadku wirusów grypy typu A (IAV) ich drogi przenoszenia narażają cząsteczki wirusa na szeroki zakres warunków środowiskowych. W szczególności mogą być przenoszone przez: 1) drogą fekalno-oralną przez wodę (tj. ptasie wirusy) lub 2) bezpośredni lub pośredni kontakt z zanieczyszczonymi źrótnami, a także aerozolami i kropelkami oddechowymi (tj. wirusami drobiu i ssaków)1. W każdym razie IAV są poddawane różnym parametrom fizykochemicznym (tj. pH, zasoleniu, temperaturze i wilgotności), co mniej lub bardziej szybko wpływa na ich zakaźność2,3,4,5,6,7,8,9. Niezwykle ważne, zwłaszcza w odniesieniu do wirusów odzwierzęcych i pandemicznych, jest ocena potencjału czynników środowiskowych do wpływania na dynamikę wirusa oraz ryzyka narażenia i przenoszenia międzygatunkowego.
Do tej pory tradycyjne techniki wirusologiczne (np. określanie miana wirusa za pomocą testów płytki nazębnej lub szacowania dawki zakaźnej 50% w kulturach tkankowych) były używane do oceny zakaźności IAV w czasie; ale te techniki są czasochłonne i wymagają wielu materiałów10,11,12. Pomiar impedancji zakażonych komórek w czasie za pomocą mikroelektrod służy jako użyteczne narzędzie do monitorowania przeżywalności IAV w różnych warunkach środowiskowych, a także ogólnej inaktywacji wirusa. Metoda ta dostarcza obiektywnych danych w czasie rzeczywistym, które zastępują subiektywną obserwację efektów cytopatycznych przez człowieka. Można go wykorzystać do określenia miareczkowania wirusa, zastępując w ten sposób tradycyjne pomiary niższymi przedziałami ufności i unikając pracochłonnych testów końcowych.
Istnieje liniowa korelacja między wynikami miareczkowania uzyskanymi przez pomiar impedancji komórek a klasycznym testem płytki miażdżycowej lub metodami TCID50. W związku z tym dane uzyskane metodą miareczkowania opartego na impedancji można łatwo przekształcić w wartości TCID50 lub pfu, tworząc krzywą standardową z szeregowym rozcieńczeniem wirusa13,14,15,16,17. Wykrywanie, oznaczanie ilościowe i skuteczność przeciwciał neutralizujących obecnych w próbkach surowicy można również osiągnąć za pomocą tego podejścia eksperymentalnego18,19. Ostatnio testy komórkowe oparte na impedancji zostały wykorzystane do badań przesiewowych i oceny związków przeciwwirusowych przeciwko alfaherpeswirusom koniowatych20.
Ta technologia została wykorzystana do oceny trwałości IAV w słonej wodzie w różnych temperaturach oraz do identyfikacji mutacji w hemaglutyninie IAV, które zwiększają lub zmniejszają trwałość IAV w środowisku21. Takie badania przesiewowe wymagałyby intensywnych prac w przypadku stosowania tradycyjnych metod miareczkowania. Jednak ta metodologia może być stosowana w przypadku każdego wirusa, który ma wpływ na morfologię komórek, liczbę komórek i siłę przyczepiania się komórek. Może być również stosowany do monitorowania trwałości w różnych warunkach środowiskowych (tj. w powietrzu, w wodzie lub na powierzchniach).
Opisany tutaj protokół stosuje jako przykład przeżywalność IAV w wodzie. Wirusy grypy ludzkiej są narażone na różne parametry fizykochemiczne przez dłuższy czas. Słona woda (35 g/L NaCl) o temperaturze 35 °C została wybrana jako model środowiskowy na podstawie poprzednich wyników9. Szczątkowa zakaźność narażonych wirusów jest określana ilościowo w różnych punktach czasowych poprzez infekcję komórkową. Komórki MDCK, typ ogniwa referencyjnego do amplifikacji IAV, są wysiewane na 16-dołkowych płytkach mikromiareczkowych pokrytych czujnikami mikroelektrodowymi i infekowane przez naświetlone wirusy 24 godziny później. Impedancja ogniwa jest mierzona co 15 minut i wyrażana jako dowolna jednostka zwana indeksem komórki (CI). Efekty cytopatyczne wywołane przez wirusa grypy, których szybkość wystąpienia zależy bezpośrednio od liczby zakaźnych cząstek wirusa zaszczepionych w hodowli komórkowej, prowadzą do zmniejszenia CI, który jest następnie określany ilościowo jako wartość CIT50. Wartość ta odpowiada czasowi niezbędnemu do zmierzenia 50% redukcji w stosunku do początkowego CI (tj. przed dodaniem wirusa). Wartości CIT50 obliczone dla kilku czasów narażenia środowiskowego pozwalają na odliczenie nachylenia inaktywacji wirusa po regresji liniowej wartości CIT50.

<table><tbody><tr><td>0,25%Trypsyna</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kolba do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>E-Plate 16 (6 płytek)</td><td>ACEA Biosciences, Inc</td><td>5469830001</td><td>E-płyty są dostępne w różnych opakowaniach</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Life technologies (gibco)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM 1X</td><td>Life technologies (gibco)</td> <td>31095029</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Life technologies (gibco)</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Technologie życia (gibco)</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>TPCK-Trypsin</td><td>Worthington</td><td>LS003740</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Narzędzie do analizy komórek w czasie rzeczywistym S16</td><td>ACEA Biosciences, Inc</td><td>380601310</td><td>Aparaty xCELLigence RTCA S16 są dostępne w różnych formatach (16-dołkowe, 96-dołkowe, jedno lub wielopłytkowe)</td></tr></tbody></table>

monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Metody kwantyfikacji cząsteczek wirusa stanowią krytyczny aspekt wielu badań wirusologicznych. Chociaż istnieje kilka niezawodnych technik, są one albo czasochłonne, albo nie są w stanie wykryć niewielkich zmian. Przedstawiono tutaj protokół precyzyjnego oznaczania ilościowego miana wirusa poprzez analizę zmian impedancji elektrycznej zakażonych komórek w czasie rzeczywistym. Impedancja komórkowa jest mierzona za pomocą biosensorów ze złotymi mikroelektrodami umieszczonymi pod komórkami w mikropłytkach, których wielkość zależy od liczby ogniw oraz ich wielkości i kształtu. Protokół ten umożliwia analizę w czasie rzeczywistym proliferacji, żywotności, morfologii i migracji komórek ze zwiększoną czułością. Podano również przykład praktycznego zastosowania polegającego na ilościowym określeniu rozkładu wirusa grypy A (IAV) na podstawie różnych parametrów fizykochemicznych wpływających na zakaźność wirusa w czasie (tj. temperatury, zasolenia i pH). W przypadku takich zastosowań protokół zmniejsza potrzebne obciążenie pracą, a jednocześnie generuje precyzyjne dane ilościowe dotyczące cząstek zakaźnych wirusów. Pozwala to na porównanie stoków inaktywacji wśród różnych IAV, co odzwierciedla ich zdolność do utrzymywania się w danym środowisku. Protokół ten jest łatwy do wykonania, jest wysoce powtarzalny i może być stosowany do dowolnego wirusa wywołującego efekty cytopatyczne w hodowli komórkowej.

Surowe dane uzyskane po 120 h dla różnych stężeń komórek MDCK, od 15 000 do 120 000 komórek na dołek, przedstawiono na Ryc. 1. Pomiary CI po 24 h wykazały, że komórki w dołkach zasianych w liczbie 30 000 nadal znajdowały się w fazie wykładniczego wzrostu, dlatego to stężenie komórek wykorzystano w dalszych eksperymentach. Ryc. 2 ilustruje liniową korelację między wartościami CIT50 a początkową wielokrotnością infekcji. Komórki MDCK hodowano przez 24 h...

Zgłoszono tutaj protokół do ilościowego oznaczania zakaźnych cząsteczek wirusa za pomocą monitorowania w czasie rzeczywistym impedancji elektrycznej zainfekowanych komórek. Praktyczne zastosowanie tej metody przedstawiono poprzez ilościowe określenie rozpadu wirusa grypy A przy różnych parametrach fizykochemicznych naśladujących warunki środowiskowe.

Monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Metody kwantyfikacji różnych cząstek stanowią krytyczny aspekt większości badań biologicznych. Protokół ten pozwala na precyzyjną kwantyfikację danych dotyczących wirusa w czasie rzeczywistym. Technika ta zastępuje tradycyjny pomiar danych dotyczących wirusów.Dzięki obiektywnym danym w czasie rzeczywistym znajdujemy się poniżej naszego przedziału ufności, unikając oceny pracujących punktów końcowych. Metodę tę można stosować w przypadku wszystkich wirusów, które wywołują efekt cytopatyczny. Procedurę zademonstruje Quentin Grassin, technik laboratoryjny z naszego laboratorium.Aby namnażać i amplifikować wirusy H1N1, należy wysiać 7,5 razy 10 do 6 komórek MDCK na dwóch kolbach do hodowli tkankowych o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych zgodnie ze standardowymi protokołami i inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby osiągnąć 90 do 100% konfluencji. Następnego dnia przemyj komórki dwa razy pięcioma mililitrami sterylnego PBS na kolbę na pranie i oznacz jedną kolbę jako kontrolę. Następnie rozcieńczyć rozmrożoną fiolkę z zapasem wirusa grypy A do odpowiedniego stężenia doświadczalnego w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej świeżą pożywkę do rozmnażania wirusa.Użyć jednego mililitra rozcieńczonego bulionu do zakażenia komórek MDCK przy wielokrotności infekcji 1 razy 10 do ujemnych 3 lub 1 razy 10 do ujemnych 4 jednostek tworzących blaszkę na komórkę i dodać jeden mililitr pożywki do rozmnażania wirusa do kolby kontrolnej. Adsorbować wirusa w komórkach przez 45 minut w temperaturze pokojowej, mieszając co 15 minut. Pod koniec inkubacji usunąć inokulum i zastąpić je 15 mililitrami pożywki do namnażania wirusa uzupełnionej jednym mikrogramem na mililitr trypsyny TPCK, aby ułatwić rozszczepienie wirusowej hemaglutyniny HA0 na podjednostki HA1 i HA2.Następnie umieść kolbę w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza na trzy dni. Pod koniec inkubacji porównaj komórki w każdej kulturze pod 40-krotnym obiektywem pod mikroskopem świetlnym, aby ocenić wpływ cytopatyczny na komórki. Po zakończeniu efektu cytopatycznego dodaj supernatanty do hodowli komórkowych do 15-milimetrowej probówki i zbierz resztki komórkowe z każdej kultury przez odwirowanie.Następnie przenieś sklarowany supernatant kultury wirusa do 15-mililitrowej probówki i podziel potomne wirusy na jednorazowe sterylne fiolki kriogeniczne do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby określić odpowiednią ilość komórek do infekcji komórek, przygotuj 24-godzinne, około 80% zlewające się hodowle komórek MDCK, jak pokazano, przed umyciem komórek PBS i zebraniem ich w 45-minutowej inkubacji w trzech mililitrach 0,25% trypsyny-EDTA na kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki się oderwą, należy przerwać reakcję za pomocą siedmiu mililitrów świeżej pożywki hodowlanej na kolbę i policzyć komórki z każdej hodowli.Rozcieńczyć komórki 4 razy 10 do 5 komórek na mililitr pożywki do hodowli komórkowej i wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia komórek, jak wskazano. Umieść E-płytkę w temperaturze pokojowej na kilka minut przed dodaniem 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowej do każdej studzienki bez dotykania elektrod E-płytki. Odblokuj podstawki i włóż przedni koniec płytki do kieszeni kołyski przyrządu do pomiaru impedancji.Zamknij drzwi inkubatora i otwórz oprogramowanie. W ustawieniach domyślnego wzorca eksperymentu zaznacz wybrane kołyski i kliknij dwukrotnie górną stronę, aby wprowadzić nazwę eksperymentu. Kliknij przycisk Układ i wprowadź niezbędne informacje o próbce dla każdego wybranego dołka płyty.Kliknij Zaplanuj, Kroki i Dodaj krok. Oprogramowanie automatycznie doda jednosekundowy krok, aby zmierzyć impedancję tła Kliknij Wykonaj i Start, Kontynuuj. Kliknij przycisk Kreśl i Dodaj, aby wybrać odpowiednie studnie, potwierdzając, że impedancja tła mieści się w zakresie od minus 0,1 do 0,1 przed przejściem do następnego kroku.Następnie wyjmij płytkę z kołyski i dodaj 100 mikrolitrów każdej zawiesiny komórkowej do odpowiednich studzienek w dwóch dołek. Pozostaw płytkę E w okapie z przepływem laminarnym na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie komórek na dnie studzienek przed załadowaniem płytki E do kieszeni kołyski. Kliknij pozycję Zaplanuj i dodaj krok, a następnie wprowadź wartości, aby monitorować komórki co 30 minut przez 200 powtórzeń przed wybraniem opcji Uruchom, kontynuuj.Aby sprawdzić i wykreślić dane dotyczące impedancji komórki, kliknij przycisk Wykres i wybierz stężenie komórek, które jest tuż przed fazą stacjonarną 24 godziny po wysiewie, aby uzyskać komórki, które są jeszcze w fazie wzrostu podczas infekcji wirusowej. Aby określić korelację między wartościami CIT50 a wielokrotnością infekcji, po wyhodowaniu 3 razy 10 do 4 świeżo rozszczepionych komórek MDCK do każdej studzienki elektronicznej płytki mikromiareczkowej przez 24 godziny, umyj komórki dwa razy 100 mikrolitrami świeżej pożywki do rozmnażania wirusa na studzienkę, na płukanie i użyj jednokanałowej pipety, aby dodać 100 mikrolitrów zawiesiny wirusa do każdej studzienki. Po dodaniu wszystkich rozcieńczeń wirusa, delikatnie załaduj płytkę do kieszeni kołyski instrumentu w temperaturze 35 stopni Celsjusza i rozpocznij monitorowanie impedancji ogniwa co 15 minut przez co najmniej 100 godzin, jak pokazano.Po dwóch cyklach pomiarów kliknij, aby zatrzymać aparat i wyjmij płytkę E z kołyski. Dodać 100 mikrolitrów pożywki do namnażania wirusa uzupełnionej trypsyną TPCK do każdej studzienki i włożyć E-płytkę z powrotem do kieszeni kołyski. Następnie rozpocznij analizę.Aby ocenić kinetykę przeżycia wirusa grypy A, dodaj chlorek sodu do końcowego stężenia 35 gramów na litr w wodzie destylowanej i dodaj 900 mikrolitrów powstałego roztworu soli do dwumililitrowych krioprobówek. Dodaj 100 mikrolitrów materiału wirusowego do każdej krioprobówki i umieść probówki w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza na odpowiedni okres eksperymentalny. Dzień przed zakończeniem inkubacji należy wysiać 3 razy 10 do 4 świeżo rozdrobnionych komórek MDCK i 100 mikrolitrów pożywki do rozmnażania wirusa na studzience na 16-dołkowej płytce do mikromiareczkowania w powtarzających się krokach, umożliwiając pomiar impedancji tła i równomiernego rozmieszczenia komórek na dnie studzienek.Następnie hoduj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia umyj komórki dwukrotnie, a następnie zainfekuj je 100 mikrolitrami wirusa destylowanego z soli fizjologicznej, rozcieńczonego 10 razy w świeżej pożywce hodowlanej, jak pokazano, i monitoruj impedancję komórek co 15 minut przez co najmniej 100 godzin. Tutaj pokazano surowe dane uzyskane po 120 godzinach z różnymi stężeniami komórek MDCK.Po 24 godzinach pomiary indeksu komórkowego wykazały, że komórki w studzienkach wysianych 3 razy 10 do 4 komórek nadal znajdowały się w wykładniczej fazie wzrostu, dlatego to stężenie komórek wykorzystano do kolejnych eksperymentów. Hodowle komórkowe MDCK wykazują wyraźną liniową zależność między CIT50 a początkową wielokrotnością infekcji wirusem grypy. Wyniki typowego eksperymentu kinetycznego dotyczącego przeżycia wskazują na spadek indeksu komórkowego z powodu wywołanego przez wirusa efektu cytopatycznego.CIT50 może być używany do obliczania nachylenia inaktywacji wirusa dla każdego wirusa w każdym stanie w celu określenia, który wirus miał największą stabilność w badanym środowisku. Stabilność wirusa pośrednio koreluje ze stopniem inaktywacji, co pozwala na przykład na zidentyfikowanie reszt aminokwasowych w glikoproteinie hemaglutyniny, które są zaangażowane w przetrwanie wirusa grypy A poza gospodarzem. Ta technika jest bardzo wrażliwa na małe zmiany.Dlatego zaleca się korzystanie z automatycznego licznika komórek w celu uzyskania powtarzalnych wyników między eksperymentami. Metoda ta może być również stosowana do porównywania replikacji różnych wirusów, do badania tropizmu wirusa dla kilku linii komórkowych jednocześnie lub do badania określonych etapów cyklu wirusowego.

monitoring-influenza-virus-survival-outside-host-using-real-time-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

W tym filmie pokazujemy proces monitorowania zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym, w tym proliferację przylegających komórek, za pomocą testu impedancji komórkowej. W tym przypadku przylegające ogniwa działają jak izolatory, ograniczając przepływ prądu między elektrodami i zwiększając impedancję.

Analiza oparta na impedancji komórkowej do monitorowania procesów komórkowych w czasie rzeczywistym

W tym filmie omawiamy korelację między CIT50 a mnogością infekcji wirusowych. Komórki zakażone wirusem wykazują działanie cytopatyczne, powodując ich śmierć i oderwanie od złotej mikroelektrody, co z kolei zmniejsza impedancję.

Test komórkowy oparty na impedancji do pomiaru wielości infekcji wirusem grypy

Ten film opisuje technikę opartą na impedancji komórkowej do badania kinetyki przetrwania wirusów wywołujących efekty cytopatyczne. Metoda mierzy impedancję elektryczną zakażonych wirusem przylegających komórek wstępnie potraktowanych solą fizjologiczną.

Test kinetyki przeżycia oparty na impedancji komórkowej w celu oceny przeżycia wirusa

Prezentujemy protokół opisujący półilościową metodę pomiaru zarówno przyczepiania wirusa grypy A do komórek A549, jak i internalizacji cząsteczek wirusa do komórek docelowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Wirusy grypy A (IAV) są zakaźnymi patogenami układu oddechowego, które powodują coroczne epidemie i sporadyczne pandemie. W tym miejscu opisujemy protokół śledzenia infekcji wirusowych in vivo przy użyciu nowej rekombinowanej lucyferazy i bi-reporterowego IAV z ekspresją fluorescencji (BIRFLU). Takie podejście zapewnia naukowcom doskonałe narzędzie do badania IAV in vivo.

Lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Obecne badanie opisuje protokół monitorowania zmian w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) podczas infekcji wirusowej za pomocą systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA).

Monitorowanie zmian w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej po zakażeniu wirusowym za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji

Opisany tutaj test TCID50 wykorzystuje bezoznakowe pomiary impedancji w czasie rzeczywistym oraz moduł Virology systemu, aby obiektywnie monitorować efekty cytopatyczne (CPE) wywołane wirusem w czasie rzeczywistym. Ten uprościony test znacznie skraca czas pracy praktycznej, jednocześnie wspierając wysokoprzepustowe, ilościowe pomiary kinetyczne CPE oraz umożliwiając zautomatyzowane, w czasie rzeczywistym obliczenia TCID50.

Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego

Poznaj metodę monitorowania przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem przy użyciu analizy impedancji komórek w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia precyzyjną ilościową ocenę cząstek wirusowych bez konieczności stosowania pracochłonnych metod końcowych.

Monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów