Monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym

Metody kwantyfikacji różnych cząstek stanowią krytyczny aspekt większości badań biologicznych. Protokół ten pozwala na precyzyjną kwantyfikację danych dotyczących wirusa w czasie rzeczywistym. Technika ta zastępuje tradycyjny pomiar danych dotyczących wirusów.

Dzięki obiektywnym danym w czasie rzeczywistym znajdujemy się poniżej naszego przedziału ufności, unikając oceny pracujących punktów końcowych. Metodę tę można stosować w przypadku wszystkich wirusów, które wywołują efekt cytopatyczny. Procedurę zademonstruje Quentin Grassin, technik laboratoryjny z naszego laboratorium.

Aby namnażać i amplifikować wirusy H1N1, należy wysiać 7,5 razy 10 do 6 komórek MDCK na dwóch kolbach do hodowli tkankowych o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych zgodnie ze standardowymi protokołami i inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby osiągnąć 90 do 100% konfluencji. Następnego dnia przemyj komórki dwa razy pięcioma mililitrami sterylnego PBS na kolbę na pranie i oznacz jedną kolbę jako kontrolę. Następnie rozcieńczyć rozmrożoną fiolkę z zapasem wirusa grypy A do odpowiedniego stężenia doświadczalnego w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej świeżą pożywkę do rozmnażania wirusa.

Użyć jednego mililitra rozcieńczonego bulionu do zakażenia komórek MDCK przy wielokrotności infekcji 1 razy 10 do ujemnych 3 lub 1 razy 10 do ujemnych 4 jednostek tworzących blaszkę na komórkę i dodać jeden mililitr pożywki do rozmnażania wirusa do kolby kontrolnej. Adsorbować wirusa w komórkach przez 45 minut w temperaturze pokojowej, mieszając co 15 minut. Pod koniec inkubacji usunąć inokulum i zastąpić je 15 mililitrami pożywki do namnażania wirusa uzupełnionej jednym mikrogramem na mililitr trypsyny TPCK, aby ułatwić rozszczepienie wirusowej hemaglutyniny HA0 na podjednostki HA1 i HA2.

Następnie umieść kolbę w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza na trzy dni. Pod koniec inkubacji porównaj komórki w każdej kulturze pod 40-krotnym obiektywem pod mikroskopem świetlnym, aby ocenić wpływ cytopatyczny na komórki. Po zakończeniu efektu cytopatycznego dodaj supernatanty do hodowli komórkowych do 15-milimetrowej probówki i zbierz resztki komórkowe z każdej kultury przez odwirowanie.

Następnie przenieś sklarowany supernatant kultury wirusa do 15-mililitrowej probówki i podziel potomne wirusy na jednorazowe sterylne fiolki kriogeniczne do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby określić odpowiednią ilość komórek do infekcji komórek, przygotuj 24-godzinne, około 80% zlewające się hodowle komórek MDCK, jak pokazano, przed umyciem komórek PBS i zebraniem ich w 45-minutowej inkubacji w trzech mililitrach 0,25% trypsyny-EDTA na kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki się oderwą, należy przerwać reakcję za pomocą siedmiu mililitrów świeżej pożywki hodowlanej na kolbę i policzyć komórki z każdej hodowli.

Rozcieńczyć komórki 4 razy 10 do 5 komórek na mililitr pożywki do hodowli komórkowej i wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia komórek, jak wskazano. Umieść E-płytkę w temperaturze pokojowej na kilka minut przed dodaniem 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowej do każdej studzienki bez dotykania elektrod E-płytki. Odblokuj podstawki i włóż przedni koniec płytki do kieszeni kołyski przyrządu do pomiaru impedancji.

Zamknij drzwi inkubatora i otwórz oprogramowanie. W ustawieniach domyślnego wzorca eksperymentu zaznacz wybrane kołyski i kliknij dwukrotnie górną stronę, aby wprowadzić nazwę eksperymentu. Kliknij przycisk Układ i wprowadź niezbędne informacje o próbce dla każdego wybranego dołka płyty.

Kliknij Zaplanuj, Kroki i Dodaj krok. Oprogramowanie automatycznie doda jednosekundowy krok, aby zmierzyć impedancję tła Kliknij Wykonaj i Start, Kontynuuj. Kliknij przycisk Kreśl i Dodaj, aby wybrać odpowiednie studnie, potwierdzając, że impedancja tła mieści się w zakresie od minus 0,1 do 0,1 przed przejściem do następnego kroku.

Następnie wyjmij płytkę z kołyski i dodaj 100 mikrolitrów każdej zawiesiny komórkowej do odpowiednich studzienek w dwóch dołek. Pozostaw płytkę E w okapie z przepływem laminarnym na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie komórek na dnie studzienek przed załadowaniem płytki E do kieszeni kołyski. Kliknij pozycję Zaplanuj i dodaj krok, a następnie wprowadź wartości, aby monitorować komórki co 30 minut przez 200 powtórzeń przed wybraniem opcji Uruchom, kontynuuj.

Aby sprawdzić i wykreślić dane dotyczące impedancji komórki, kliknij przycisk Wykres i wybierz stężenie komórek, które jest tuż przed fazą stacjonarną 24 godziny po wysiewie, aby uzyskać komórki, które są jeszcze w fazie wzrostu podczas infekcji wirusowej. Aby określić korelację między wartościami CIT50 a wielokrotnością infekcji, po wyhodowaniu 3 razy 10 do 4 świeżo rozszczepionych komórek MDCK do każdej studzienki elektronicznej płytki mikromiareczkowej przez 24 godziny, umyj komórki dwa razy 100 mikrolitrami świeżej pożywki do rozmnażania wirusa na studzienkę, na płukanie i użyj jednokanałowej pipety, aby dodać 100 mikrolitrów zawiesiny wirusa do każdej studzienki. Po dodaniu wszystkich rozcieńczeń wirusa, delikatnie załaduj płytkę do kieszeni kołyski instrumentu w temperaturze 35 stopni Celsjusza i rozpocznij monitorowanie impedancji ogniwa co 15 minut przez co najmniej 100 godzin, jak pokazano.

Po dwóch cyklach pomiarów kliknij, aby zatrzymać aparat i wyjmij płytkę E z kołyski. Dodać 100 mikrolitrów pożywki do namnażania wirusa uzupełnionej trypsyną TPCK do każdej studzienki i włożyć E-płytkę z powrotem do kieszeni kołyski. Następnie rozpocznij analizę.

Aby ocenić kinetykę przeżycia wirusa grypy A, dodaj chlorek sodu do końcowego stężenia 35 gramów na litr w wodzie destylowanej i dodaj 900 mikrolitrów powstałego roztworu soli do dwumililitrowych krioprobówek. Dodaj 100 mikrolitrów materiału wirusowego do każdej krioprobówki i umieść probówki w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza na odpowiedni okres eksperymentalny. Dzień przed zakończeniem inkubacji należy wysiać 3 razy 10 do 4 świeżo rozdrobnionych komórek MDCK i 100 mikrolitrów pożywki do rozmnażania wirusa na studzience na 16-dołkowej płytce do mikromiareczkowania w powtarzających się krokach, umożliwiając pomiar impedancji tła i równomiernego rozmieszczenia komórek na dnie studzienek.

Następnie hoduj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia umyj komórki dwukrotnie, a następnie zainfekuj je 100 mikrolitrami wirusa destylowanego z soli fizjologicznej, rozcieńczonego 10 razy w świeżej pożywce hodowlanej, jak pokazano, i monitoruj impedancję komórek co 15 minut przez co najmniej 100 godzin. Tutaj pokazano surowe dane uzyskane po 120 godzinach z różnymi stężeniami komórek MDCK.

Po 24 godzinach pomiary indeksu komórkowego wykazały, że komórki w studzienkach wysianych 3 razy 10 do 4 komórek nadal znajdowały się w wykładniczej fazie wzrostu, dlatego to stężenie komórek wykorzystano do kolejnych eksperymentów. Hodowle komórkowe MDCK wykazują wyraźną liniową zależność między CIT50 a początkową wielokrotnością infekcji wirusem grypy. Wyniki typowego eksperymentu kinetycznego dotyczącego przeżycia wskazują na spadek indeksu komórkowego z powodu wywołanego przez wirusa efektu cytopatycznego.

CIT50 może być używany do obliczania nachylenia inaktywacji wirusa dla każdego wirusa w każdym stanie w celu określenia, który wirus miał największą stabilność w badanym środowisku. Stabilność wirusa pośrednio koreluje ze stopniem inaktywacji, co pozwala na przykład na zidentyfikowanie reszt aminokwasowych w glikoproteinie hemaglutyniny, które są zaangażowane w przetrwanie wirusa grypy A poza gospodarzem. Ta technika jest bardzo wrażliwa na małe zmiany.

Dlatego zaleca się korzystanie z automatycznego licznika komórek w celu uzyskania powtarzalnych wyników między eksperymentami. Metoda ta może być również stosowana do porównywania replikacji różnych wirusów, do badania tropizmu wirusa dla kilku linii komórkowych jednocześnie lub do badania określonych etapów cyklu wirusowego.