Worm-align i Worm_CP, dwa potoki typu open source do prostowania i kwantyfikacji danych obrazu fluorescencji uzyskanych z Caenorhabditis elegans

Opisujemy tutaj prosty przepływ pracy oparty na otwartym kodzie źródłowym Fidżi o nazwie Worm-align, który może być używany do generowania jedno- lub wielokanałowych montaży wyprostowanych robaków będących przedmiotem zainteresowania na podstawie surowych obrazów mikroskopowych. Ponieważ ten przepływ pracy opiera się na wybranych przez użytkownika zwierzętach będących przedmiotem zainteresowania, może być szczególnie przydatny podczas analizowania obrazów z C.elegans, gdzie nie wszystkie robaki są w odpowiednim stadium lub stanie. Należy zauważyć, że dane wyjściowe Worm-align mogą być wykorzystane do późniejszej kwantyfikacji fluorescencji za pomocą Fidżi lub innego oprogramowania do analizy obrazu.

Tutaj demonstrujemy kwantyfikację fluorescencji przy użyciu potoku CellProfiler Worm_CP. Zacznij od stworzenia mikropipety do jamy ustnej, rozciągając cienką szklaną kapilarnę w płomieniu palnika Bunsena. Po rozciągnięciu w płomieniu rozbij kapilatę na dwie części, jeśli nie rozpadła się na dwie części po rozciągnięciu.

Jeśli rozpadł się na dwie części, odetnij koniec najdłuższego. Wybierz dłuższy kawałek i sprawdź, czy kapilara jest otwarta, próbując zassać wodę. Odłącz adapter od trzymilimetrowej silikonowej rurki.

Podłącz szklaną kapilarnę do adaptera kapilarycznego połączonego z sześciomilimetrową silikonową rurką. Następnie podłącz drugi koniec sześciomilimetrowej rurki do filtra 0,2 mikrometra i trzymilimetrowej silikonowej rurki na drugim końcu. Podłącz jednomilimetrową końcówkę filtra do wolnego końca trzymilimetrowej silikonowej rurki, aby zassać płyn.

Pod mikroskopem preparacyjnym usuń jak najwięcej płynu wokół osadu nieruchomych robaków za pomocą mikropipety doustnej. Szybko dodaj 10 mikrolitrów podłoża montażowego na dno tuby. Opłucz końcówkę o pojemności 10 mikrolitrów w PBS śladami detergentu, aby zapobiec przywieraniu robaków do boków plastikowej końcówki pipety.

Następnie odetnij sam koniec końcówki nożyczkami. Przenieść osiem mikrolitrów podłoża montażowego z robakami na wcześniej przygotowaną podkładkę agarozową. Obserwując szkiełko pod mikroskopem, delikatnie nim poruszaj, aby uniknąć nakładania się robaków.

Następnie przykryj kroplę podłoża montażowego na podkładce agarozowej szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów. Aby zamontować żywe robaki, należy odpipetować trzy do czterech mikrolitrów trzymilimolowego lewamizolu rozpuszczonego w M9 na podkładkę agarozową. Wybierz od 30 do 50 robaków na każdy warunek do kropli lewamizolu.

Następnie przykryj kroplę szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów i zobrazuj robaki w ciągu godziny. Zainstaluj pakiet oprogramowania do analizy obrazów typu open source Fiji firmy ImageJ lub, jeśli jest już zainstalowany na komputerze, sprawdź, czy jest w wersji 1.52A lub nowszej, a następnie pobierz repozytorium Worm-align z GitHub i zapisz je na komputerze. Po pobraniu i zainstalowaniu wszystkich komponentów potoku otwórz Fiji i uruchom makro Worm-align, klikając wtyczki, makra i uruchom na pasku menu głównego.

Zlokalizuj skrypt Worm-align. ijm i kliknij przycisk Otwórz. Przejdź do folderu wejściowego z obrazami do analizy i kliknij przycisk wybierz, upewniając się, że wybrany folder zawiera tylko pliki obrazów.

Makro automatycznie wygeneruje folder wyjściowy, w którym zostaną zapisane wszystkie wyniki. Nazwa folderu będzie taka sama jak folderu wejściowego z danymi wyjściowymi jako poprawka po poprawie. Pozwól makrowi otworzyć pierwszy obraz w folderze wejściowym i użyj go jako reprezentatywnego obrazu, aby wyodrębnić ustawienia wymagane do wygenerowania montażu, w tym szerokość robaków, jasność i kontrast.

Korzystając z narzędzia do rysowania linii prostych, narysuj linię na całej szerokości robaka i kliknij przycisk OK. Użyj długości tej linii, aby określić wysokość przyciętych obszarów dla pojedynczych robaków. Dla każdego kanału określ nazwę, tabelę przeglądową i określ, czy powinien on zostać uwzględniony w montażu, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie dostosuj ustawienia jasności i kontrastu dla kanałów za pomocą suwaków. Powtórz ten proces dla pozostałych kanałów.

Po skonfigurowaniu wszystkich ustawień zostaną one zapisane w tabeli ustawień i zapisane w podfolderze CellProfiler folderu wyjściowego. Generowany jest obraz, który pokazuje, jak będą wyglądać wszystkie obrazy po zastosowaniu ustawień. Jeśli obraz jest zadowalający, zaznacz górne pole.

Drugie i trzecie pole panelu zaznacz wszystkie ustawienia określa opcje generowania montażu. Pozostaw oba pola zaznaczone i kliknij przycisk OK, aby uruchomić pozostałą część makra. Niezaznaczenie górnego pola spowoduje ponowne uruchomienie konfiguracji makra.

Następnie makro przystępuje do otwierania wszystkich obrazów w folderze wejściowym. Dla każdego obrazu narysuj linie na osi podłużnej wszystkich robaków, które mają zostać uwzględnione w montażu, za pomocą narzędzia do segmentacji lub linii odręcznej. Narysuj linie konsekwentnie od głowy do ogona lub odwrotnie na całej długości robaków i dodaj każdą linię do menedżera ROI, klikając Control T. Po dodaniu wszystkich żądanych robaków kliknij OK. Worm-align wygeneruje następnie przycięte obrazy pojedynczych wybranych robaków, które zostaną zapisane w podfolderze pojedynczego robaka w folderze wyjściowym.

Montaże wszystkich wybranych robaków zostaną zapisane w wyrównanym folderze. Pobierz i zainstaluj program CellProfiler 2.2.0, klikając łącze do poprzednich wersji programu CellProfiler na stronie pobierania i wybierając wymagany system operacyjny. Przed uruchomieniem potoku Worm_CP upewnij się, że wszystkie oczekiwane obrazy wyjściowe znajdują się w podfolderze CellProfiler folderu wyjściowego Worm-align

Przetworzona kopia oryginalnego obrazu, binarna maska obrazu populacji robaków, maska wyrównania, jeśli linia jest narysowana na wybranych robakach i jeden obraz reprezentujący każdy z kanałów na oryginalnym obrazie. Otwórz CellProfiler, a następnie kliknij moduł wejściowy obrazów i przeciągnij folder modułu CellProfiler do okna z napisem upuść tutaj pliki i foldery. Jeśli istnieje lista obrazów z poprzedniej analizy, najpierw usuń je, klikając prawym przyciskiem myszy w oknie i wybierając opcję wyczyść listę plików.

Kliknij moduł wprowadzania metadanych i drugą metodę ekstrakcji, kliknij żółty folder i przejdź do podfolderu CellProfiler w folderze wyjściowym Worm-align. Wybierz plik ustawień, a następnie kliknij przycisk Aktualizuj. Następnie kliknij moduł wejściowy nazw i typów i upewnij się, że wszystkie obrazy wymagane dla potoku są obecne.

Przed uruchomieniem potoku wybierz miejsce docelowe dla wyników wyjściowych w module wyjściowym. Użyj trybu testowego, aby zobaczyć, jak działa potok, klikając przycisk rozpocznij tryb testowy i zezwól mu na uruchomienie pierwszego obrazu w folderze. Jeśli wydajność potoku jest zadowalająca, kliknij pozycję Wyjdź z trybu testu i przeanalizuj obrazy.

Przed rozpoczęciem analizy upewnij się, że wszystkie oczy przed modułem analizy są zamknięte. Po zakończeniu analizy otwórz folder wyjściowy Worm_CP, który składa się z dwóch plików CSV, robaków CSV i wierszy CSV. Hodowla i obrazowanie C. elegans zgodnie z metodą opisaną w tym protokole daje duże obrazy przeglądowe populacji robaków.

Wynik potoku w dużej mierze zależy od jakości linii narysowanych na obrazach. Pokazano tutaj kilka przykładów linii i ich dane wyjściowe z Worm-align. Podczas korzystania ze skryptu Worm-align możliwa jest wizualna identyfikacja przecinających się robaków na podstawie obrazów nakładki znajdujących się w podfolderze danych, a także z paneli poszczególnych robaków w montażu.

Tabela kontroli jakości może być również używana do identyfikowania nakładających się robaków. Jednak przecinające się linie są problematyczne dla Worm_CP rurociągu. Dzieje się tak, ponieważ Worm_CP używa maski linii, a nie obszarów zainteresowania, aby pomóc w identyfikacji poszczególnych robaków.

W związku z tym CellProfiler podzieli jeden z robaków na dwa obiekty. Rurociąg Worm_CP został wykorzystany do ilościowego określenia intensywności fluorescencji od utrwalonych zwierząt znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym, który włącza się do kropelek lipidów. Zawartość lipidów w kropelkach zmniejsza się o 17% między zwierzętami typu dzikiego i zmutowanymi DBL1 przy użyciu ręcznej kwantyfikacji oraz o 12% przy użyciu Worm_CP rurociągu.

Worm_CP wykorzystano również do ilościowego określenia reakcji na szok cieplny u żywych robaków wykazujących ekspresję GFP pod kontrolą genu indukowanego szokiem cieplnym. Przy braku stresu cieplnego robaki nie indukowały ekspresji GFP. Kiedy robaki są wystawione na krótki szok cieplny, indukowana jest ekspresja GFP.

Wynik Worm_CP zależy w dużej mierze od jakości linii rysowanych za pomocą Worm-align. Upewnij się, że linie się nie stykają ani nie nakładają na siebie i narysuj wszystkie linie w tym samym kierunku. Sprawdzenie tabeli kontroli jakości może pomóc w zidentyfikowaniu linii, które stykają się lub nakładają na siebie, dzięki czemu można wykluczyć te przypadki z analizy.

Dane wyjściowe Worm-align mogą być wykorzystane do późniejszej kwantyfikacji na Fidżi lub w innych pakietach oprogramowania do analizy obrazu. Pokazaliśmy tutaj bardzo podstawowy potok CellProfiler, do którego można bardzo łatwo włączyć inne moduły analityczne, na przykład w celu zliczenia liczby kropelek lipidów lub ilościowego określenia intensywności pojedynczych kropelek w robaku. Jedną z zalet tej techniki jest możliwość szybkiego ilościowego określenia fluorescencji pojedynczych robaków.

W naszym laboratorium jesteśmy zainteresowani indywidualną żywotnością przy użyciu reporterów fluorescencyjnych i rutynowo używamy do tego celu Worm-align i Worm_CP.