Name: Worm-align i Worm_CP, dwa potoki typu open source do prostowania i kwantyfikacji danych obrazu fluorescencji uzyskanych z Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Poznaj Worm-align i Worm_CP, otwarte potoki do prostowania i kwantyfikacji fluorescencji w Caenorhabditis elegans. Uprość analizę obrazów mikroskopowych i uzyskaj precyzyjne wyniki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Christianowi Lanctôtowi z BIOCEV (Praga, Czechy) za nauczenie nas techniki mikropipet doustnych do montażu stałych robaków oraz dr Fatimie Santos i dr Debbie Drage za podzielenie się ustawieniami bezpieczeństwa mikropipety do jamy ustnej. Dziękujemy również Francesce Hodge za redakcję manuskryptu, Sharlene Murdoch i Babraham Institute Facilities za ich wsparcie. OC jest wspierane przez ERC 638426 i BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol><li>Shave, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OrthoList%3A+A+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), 20085(2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Letizia, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-enabled+phenotyping+of+a+whole+population+of+C.+elegans+worms+over+their+embryonic+and+post-embryonic+development+at+single-organism+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution.</a> Microsystems & Nanoengineering. 4 (6), (2018).</li>
<li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li>
<li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Platform+for+Long-Term+Culture+and+High-Content+Phenotyping+of+Single+C.+elegans+Worms%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).</li>
<li>Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-content+phenotyping+from+the+first+larval+stage+till+the+onset+of+adulthood+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).</li>
<li>Wählby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714(2012).</li>
<li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response%3A+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Biology. 76 (9), 91-99 (2012).</li>
<li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), (2018).</li>
<li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).</li>
<li>Wählby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+low-throughput+scoring+of+fat+mass+and+body+fat+distribution+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans.</a> Methods. 68 (3), 9(2014).</li>
<li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529(2017).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome. 7, 100(2006).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li>
<li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li>
<li>Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+DBL-1%2FBMP+Regulates+Lipid+Accumulation+via+Interaction+with+Insulin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling.</a> G3. 8 (1), Bethesda. 343-351 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Worm-align to potok przetwarzania obrazu oparty na FIDŻI, który z łatwością generuje montaże wybranych przez użytkownika robaków, w których robaki są prostowane i wyrównywane, aby ułatwić wizualne porównanie, klasyfikację i reprezentację. Chociaż ta funkcja jest również oferowana przez niektóre istniejące narzędzia, w szczególności moduł WormToolbox w CellProfiler7, Worm-align wymaga stosunkowo niewielkiego wcześniejszego doświadczenia w analizie obrazu: użytkownicy muszą tylko śledzić te robaki, które chcieliby wybrać do montażu (i analizy). Chociaż śledzenie robaków na surowych danych obrazu jest łatwym procesem - szczególnie gdy dostępny jest komputer lub tablet z ekranem dotykowym - niezwykle ważne jest, aby linie były prawidłowo narysowane wzdłuż osi podłużnej robaków. Niekompletne linie, które podążają tylko za częścią robaka, spowodują częściowe robaki w montażu (tj. robaki pozbawione główek lub końców ogona) i częściowe maski segmentacji podczas analizy CellProfiler. Ponadto, jeśli linie dwóch pojedynczych ślimaków się przecinają, robaki nie zostaną prawidłowo przetworzone w montażu wyrównania robaka, a także w celu ilościowego określenia fluorescencji. W celu kontroli jakości w folderze danych zapisywany jest obraz nakładki z zaznaczonymi liniami na oryginalnym obrazie wraz z tabelą kontroli jakości. Na tej podstawie problematyczne linie, które doprowadzą do nieprawidłowej segmentacji robaków, można łatwo zidentyfikować i wykluczyć z montażu i/lub późniejszej analizy.
Chociaż bezpośredni wkład eksperymentatora w selekcję robaków może wydawać się nieco czasochłonny, przedstawia on wyraźną przewagę przepływu pracy nad innymi w eksperymentach, w których robaki z różnych stadiów rozwojowych są obecne na tym samym obrazie: Robaki można wybrać podczas "etapu śledzenia", poprzez nakreślenie tylko tych robaków, które są we właściwym stadium rozwoju. Alternatywnie, robaki mogą być filtrowane za pomocą danych wyjściowych z Worm_CP w oparciu o długość linii śledzenia lub obszar maski segmentacji, które są wiarygodnymi wskaźnikami długości/rozmiaru robaków. Prawdopodobnie algorytmy uczenia maszynowego mogą mieć trudności z rozpoznawaniem robaków na różnych etapach rozwoju, ponieważ ich rozmiar i wygląd na obrazach DIC jest tak różny.
Dane wyjściowe Worm-align mogą być wykorzystane do późniejszej kwantyfikacji intensywności fluorescencji u pojedynczych robaków, bezpośrednio na FIDŻI lub na innych platformach oprogramowania do analizy obrazu. Pokazaliśmy to, importując dane wyjściowe Worm-align do prostego potoku CellProfiler (Worm_CP), który umożliwia ilościowe określenie intensywności fluorescencji wielokanałowej w tych pojedynczych robakach, które zostały wybrane podczas uruchamiania potoku Worm-align. Wybraliśmy to podejście ze względu na elastyczność oprogramowania CellProfiler: łatwo jest włączyć do procesu dodatkowe moduły do analizy dodatkowych cech poszczególnych robaków (np. pomiar wielkości kropelek lipidów lub granulek stresu, jąder, mitochondriów). Ponadto maski pojedynczych robaków mogą potencjalnie zostać wykorzystane do wytrenowania nowego modelu dla WormToolbox7.
Główną zaletą tej metody jest to, że jest szybka i wymaga prostej konfiguracji montażu ślimaka. Ta metoda jest szybsza, ponieważ nie wymaga poświęcania czasu na naukę obsługi oprogramowania ani uruchamiania zestawów treningowych za pomocą algorytmu maszynowego7. Co więcej, ta metoda działa zarówno z żywymi, jak i stałymi robakami po prostu zamontowanymi na zwykłych podkładkach agarozowych. Nie ma potrzeby stosowania skomplikowanych komór mikroprzepływowych, opracowanych w innych metodach 5,6.

Stosunkowo prosty organizm, nicień C. elegans, jest niezwykle użytecznym systemem modelowym do badania chorób ludzkich. Około 38% genów w genomie C. elegans ma funkcjonalne odpowiedniki u ludzi1,2. Jedną z unikalnych cech C. elegans jest to, że jest optycznie przezroczysty, co umożliwia łatwy dostęp do informacji in vivo dotyczących (sub)komórkowej ekspresji reporterów fluorescencyjnych w tkankach. To sprawia, że C. elegans jest głównym organizmem modelowym dla ekranów o wysokiej zawartości przy użyciu platform opartych na obrazach3. Jednak jedną z kwestii, która często komplikuje te badania, jest to, że podczas obrazowania gęstych populacji robaków mają one tendencję do krzyżowania się i grupowania, co sprawia, że porównania między poszczególnymi robakami są trudne, zaciemniając dalszą analizę obrazu i ocenę ilościową. 
Istniejące rozwiązania, które rozwiązują ten problem, zazwyczaj polegają na optymalizacji protokołu hodowli i obrazowania, na przykład poprzez użycie konfiguracji mikro-fluidycznych4, co pozwala na uchwycenie pojedynczych robaków na oddzielnych obrazach5,6. Inni zastosowali algorytmy uczenia maszynowego pozwalające na rozpoznawanie pojedynczych robaków, nawet w zbitej populacji. Doskonałym przykładem tego ostatniego jest WormToolbox, który jest modułowym rozszerzeniem platformy analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym, CellProfiler7. WormToolbox oferuje rozwiązanie o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości do analizy C. elegans i wyraźnie korzysta z jego włączenia do CellProfiler, ponieważ można łatwo dołączyć dodatkowe moduły analityczne. Chociaż WormToolbox jest dostarczany ze wstępnie wytrenowanym modelem (DefaultWormModel.xml), ponowne trenowanie algorytmu uczenia maszynowego jest zwykle wymagane dla każdej nowej aplikacji. Samouczki online, jak to zrobić, są dostępne na Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Mimo to instalacja i użytkowanie WormToolbox wymaga od początkujących użytkowników znacznej inwestycji czasu. 
Tutaj opisujemy prosty, ekonomiczny i efektywny czasowo protokół do hodowli i obrazowania populacji C. elegans. Aby umożliwić ocenę poszczególnych robaków w pozyskanych obrazach, opracowaliśmy prosty przepływ pracy oparty na FIDŻI o otwartym kodzie źródłowym, nazwany Worm-align. Worm-align może być używany do generowania jedno- lub wielokanałowych montaży wyprostowanych i wyrównanych ślimaków. Po pierwsze, użytkownik musi ręcznie wybrać poszczególne robaki do analizy, rysując linię od głowy do ogona. Worm-align użyje tego zaznaczenia, aby przyciąć wybrane robaki z obrazu przeglądowego i wygenerować montaż, w którym wybrane robaki są prostowane i wyrównywane, aby ułatwić wizualne porównanie i prezentację. 
Ponadto, wynik Worm-align może być wykorzystany do późniejszej kwantyfikacji intensywności fluorescencji u pojedynczych robaków, bezpośrednio na FIDŻI lub na innych platformach oprogramowania do analizy obrazów. Pokazujemy to, importując dane wyjściowe Worm-align do Worm_CP, potoku korzystającego z oprogramowania CellProfiler o otwartym kodzie źródłowym. Elastyczność CellProfiler umożliwia włączenie dodatkowych modułów do badań przesiewowych o wysokiej zawartości. Wykorzystaliśmy Worm_CP potok do ilościowego określenia reakcji na szok cieplny, dobrze zachowanego mechanizmu ochronnego, który ponownie fałduje białka, które są nieprawidłowo sfałdowane z powodu stresorów, takich jak wysoka temperatura8. W szczególności zastosowaliśmy potok do robaków przenoszących zintegrowany transgen wielokopijny, w którym promotor genu indukowanego szokiem cieplnym, hsp-70 (C12C8.1), napędza białko zielonej fluorescencji (GFP) 9. Użyliśmy również Worm_CP rurociągu na utrwalonych zwierzętach, które zostały oznaczone barwnikiem fluorescencyjnym, który wizualizuje kropelki lipidów (LD), główne organelle magazynujące tłuszcz w C. elegans10. Chociaż ten przepływ pracy nie ma przepustowości oferowanej przez WormToolBox, jest przyjazną dla użytkownika i prostą alternatywą dla wizualnej prezentacji i analizy eksperymentów C. elegans opartych na obrazach.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>MeLford Biolaboratories Ltd</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Probówka aspiratora</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td>do tworzenia mikropipety do ust (patrz krok protokołu)</td></tr><tr><td>Zlewka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/593</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>roztwór podstawowy przygotowany w DMSO w stężeniu 1mg/ml</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>MSE MISTRAL 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolba</td><td></td><td></td><td></td>stożkowa</tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>631-0120</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0,2 &mikro; m dla strzykawki</td><td>Sartrius</td><td>16534-K</td><td>Filtr, do tworzenia mikropipety do ust (patrz krok protokołu)</td></tr><tr><td>Chlorowodorek lewamizolu</td><td>izopropanolu</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Sigma-Aldrich BP212 3mM roztwór przygotowany przez rozpuszczenie lewamizolu w <tr><td>ciekłym azocie</td><td></td><td></td> M9 <td>Instalacja ciekłego azotu</td></tr><tr><td>Końcówka o niskiej retencji 1000&mikro; L</td><td>Starlab</td><td>S1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR chemikalia</td><td>20847.307</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, MENZEL GLASSER</td><td>Thermo Scientific</td><td>BS7011/2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kuchenka mikrofalowa</td><td></td> Nikon Eclipse Ti Delongi <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>M9 przygotowana w laboratorium zgodnie z15</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>></td></tr><tr><td>9cm NGM Płytki</td><td></td><td></td> przygotowane <td>w laboratorium w15</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>przygotowane w laboratorium</td></tr><tr><td>Białkowa tubka LoBind 2ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>SIGMA</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętki pierścieniowe</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z611247-250EA</td><td>szklane rurki mikrokapilarne do tworzenia ust mikropipeta (patrz krok protokołu)</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Stuart Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonowa rurka półprzezroczysta</td><td>Dostawcy laboratoriów naukowych</td><td>TSR0600200P</td><td>ścianka 6,0 mm x 2,0 mm - do tworzenia mikropipety do ust (patrz krok protokołu)</td></tr><tr><td>Sterylizowana woda H2O</td><td></td><td></td><td>MilliQ autoklawizowana w laboratorium</td></tr><tr><td>10&mikro; L Końcówki</td><td>Starlab</td><td>S1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>200 i mikro; L Końcówki</td><td>Starlab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>1000&micro; L Końcówki</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>15mL Probówka wirówkowa</td><td>CORNING</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>VECTOR</td><td>94010</td><td>antifade medium montażowe (H-1000) bez DAPI</td></tr></tbody></table>

worm-align i worm_cp, dwa potoki typu open source do prostowania i kwantyfikacji danych obrazu fluorescencji uzyskanych z caenorhabditis elegans

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Często napotykanym problemem podczas pozyskiwania danych obrazowych od stałych lub znieczulonych C. elegans jest to, że robaki krzyżują się i grupują ze swoimi sąsiadami. Problem ten nasila się wraz ze wzrostem zagęszczenia robaków i stwarza wyzwania dla obrazowania i kwantyfikacji. Opracowaliśmy oparty na FIDŻI przepływ pracy, Worm-align, który może być używany do generowania jedno- lub wielokanałowych montaży wybranych przez użytkownika, wyprostowanych i wyrównanych robaków na podstawie surowych danych obrazowych C. elegans. Worm-align to prosty i przyjazny dla użytkownika przepływ pracy, który nie wymaga wcześniejszego szkolenia ani użytkownika, ani algorytmu analizy. Montaże generowane za pomocą Worm-align mogą pomóc w wizualnej kontroli robaków, ich klasyfikacji i reprezentacji. Ponadto dane wyjściowe Worm-align mogą być wykorzystane do późniejszej kwantyfikacji intensywności fluorescencji u pojedynczych robaków, bezpośrednio na FIDŻI lub na innych platformach oprogramowania do analizy obrazu. Pokazujemy to, importując dane wyjściowe Worm-align do Worm_CP, potoku korzystającego z oprogramowania CellProfiler o otwartym kodzie źródłowym. Elastyczność CellProfiler umożliwia włączenie dodatkowych modułów do badań przesiewowych o wysokiej zawartości. Jako praktyczny przykład wykorzystaliśmy potok na dwóch zestawach danych: pierwszy zestaw danych to obrazy robaków reporterowych szoku cieplnego, które wyrażają białko zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora genu indukowanego szokiem cieplnym HSP-70, a drugi zestaw danych to obrazy uzyskane z utrwalonych robaków, Barwiony dla magazynów tłuszczów barwnikiem fluorescencyjnym.

Worm-align/Worm_CP to prosty proces pracy FIJI/CellProfiler, który może być używany do prostowania i wyrównywania próbek Caenorhabditis elegans oraz do oceny testów opartych na obrazach całych robaków bez konieczności wcześniejszego szkolenia. Zastosowaliśmy Worm-align/Worm_CP do ilościowego oznaczania ekspresji wywołanej szokiem cieplnym u żywych zwierząt lub kropelek lipidów w ustalonych próbkach.

Worm-align i Worm_CP, dwa potoki typu open source do prostowania i kwantyfikacji danych obrazu fluorescencji uzyskanych z Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Opisujemy tutaj prosty przepływ pracy oparty na otwartym kodzie źródłowym Fidżi o nazwie Worm-align, który może być używany do generowania jedno- lub wielokanałowych montaży wyprostowanych robaków będących przedmiotem zainteresowania na podstawie surowych obrazów mikroskopowych. Ponieważ ten przepływ pracy opiera się na wybranych przez użytkownika zwierzętach będących przedmiotem zainteresowania, może być szczególnie przydatny podczas analizowania obrazów z C.elegans, gdzie nie wszystkie robaki są w odpowiednim stadium lub stanie. Należy zauważyć, że dane wyjściowe Worm-align mogą być wykorzystane do późniejszej kwantyfikacji fluorescencji za pomocą Fidżi lub innego oprogramowania do analizy obrazu.Tutaj demonstrujemy kwantyfikację fluorescencji przy użyciu potoku CellProfiler Worm_CP. Zacznij od stworzenia mikropipety do jamy ustnej, rozciągając cienką szklaną kapilarnę w płomieniu palnika Bunsena. Po rozciągnięciu w płomieniu rozbij kapilatę na dwie części, jeśli nie rozpadła się na dwie części po rozciągnięciu.Jeśli rozpadł się na dwie części, odetnij koniec najdłuższego. Wybierz dłuższy kawałek i sprawdź, czy kapilara jest otwarta, próbując zassać wodę. Odłącz adapter od trzymilimetrowej silikonowej rurki.Podłącz szklaną kapilarnę do adaptera kapilarycznego połączonego z sześciomilimetrową silikonową rurką. Następnie podłącz drugi koniec sześciomilimetrowej rurki do filtra 0,2 mikrometra i trzymilimetrowej silikonowej rurki na drugim końcu. Podłącz jednomilimetrową końcówkę filtra do wolnego końca trzymilimetrowej silikonowej rurki, aby zassać płyn.Pod mikroskopem preparacyjnym usuń jak najwięcej płynu wokół osadu nieruchomych robaków za pomocą mikropipety doustnej. Szybko dodaj 10 mikrolitrów podłoża montażowego na dno tuby. Opłucz końcówkę o pojemności 10 mikrolitrów w PBS śladami detergentu, aby zapobiec przywieraniu robaków do boków plastikowej końcówki pipety.Następnie odetnij sam koniec końcówki nożyczkami. Przenieść osiem mikrolitrów podłoża montażowego z robakami na wcześniej przygotowaną podkładkę agarozową. Obserwując szkiełko pod mikroskopem, delikatnie nim poruszaj, aby uniknąć nakładania się robaków.Następnie przykryj kroplę podłoża montażowego na podkładce agarozowej szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów. Aby zamontować żywe robaki, należy odpipetować trzy do czterech mikrolitrów trzymilimolowego lewamizolu rozpuszczonego w M9 na podkładkę agarozową. Wybierz od 30 do 50 robaków na każdy warunek do kropli lewamizolu.Następnie przykryj kroplę szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów i zobrazuj robaki w ciągu godziny. Zainstaluj pakiet oprogramowania do analizy obrazów typu open source Fiji firmy ImageJ lub, jeśli jest już zainstalowany na komputerze, sprawdź, czy jest w wersji 1.52A lub nowszej, a następnie pobierz repozytorium Worm-align z GitHub i zapisz je na komputerze. Po pobraniu i zainstalowaniu wszystkich komponentów potoku otwórz Fiji i uruchom makro Worm-align, klikając wtyczki, makra i uruchom na pasku menu głównego.Zlokalizuj skrypt Worm-align. ijm i kliknij przycisk Otwórz. Przejdź do folderu wejściowego z obrazami do analizy i kliknij przycisk wybierz, upewniając się, że wybrany folder zawiera tylko pliki obrazów.Makro automatycznie wygeneruje folder wyjściowy, w którym zostaną zapisane wszystkie wyniki. Nazwa folderu będzie taka sama jak folderu wejściowego z danymi wyjściowymi jako poprawka po poprawie. Pozwól makrowi otworzyć pierwszy obraz w folderze wejściowym i użyj go jako reprezentatywnego obrazu, aby wyodrębnić ustawienia wymagane do wygenerowania montażu, w tym szerokość robaków, jasność i kontrast.Korzystając z narzędzia do rysowania linii prostych, narysuj linię na całej szerokości robaka i kliknij przycisk OK. Użyj długości tej linii, aby określić wysokość przyciętych obszarów dla pojedynczych robaków. Dla każdego kanału określ nazwę, tabelę przeglądową i określ, czy powinien on zostać uwzględniony w montażu, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie dostosuj ustawienia jasności i kontrastu dla kanałów za pomocą suwaków. Powtórz ten proces dla pozostałych kanałów.Po skonfigurowaniu wszystkich ustawień zostaną one zapisane w tabeli ustawień i zapisane w podfolderze CellProfiler folderu wyjściowego. Generowany jest obraz, który pokazuje, jak będą wyglądać wszystkie obrazy po zastosowaniu ustawień. Jeśli obraz jest zadowalający, zaznacz górne pole.Drugie i trzecie pole panelu zaznacz wszystkie ustawienia określa opcje generowania montażu. Pozostaw oba pola zaznaczone i kliknij przycisk OK, aby uruchomić pozostałą część makra. Niezaznaczenie górnego pola spowoduje ponowne uruchomienie konfiguracji makra.Następnie makro przystępuje do otwierania wszystkich obrazów w folderze wejściowym. Dla każdego obrazu narysuj linie na osi podłużnej wszystkich robaków, które mają zostać uwzględnione w montażu, za pomocą narzędzia do segmentacji lub linii odręcznej. Narysuj linie konsekwentnie od głowy do ogona lub odwrotnie na całej długości robaków i dodaj każdą linię do menedżera ROI, klikając Control T. Po dodaniu wszystkich żądanych robaków kliknij OK. Worm-align wygeneruje następnie przycięte obrazy pojedynczych wybranych robaków, które zostaną zapisane w podfolderze pojedynczego robaka w folderze wyjściowym.Montaże wszystkich wybranych robaków zostaną zapisane w wyrównanym folderze. Pobierz i zainstaluj program CellProfiler 2.2.0, klikając łącze do poprzednich wersji programu CellProfiler na stronie pobierania i wybierając wymagany system operacyjny. Przed uruchomieniem potoku Worm_CP upewnij się, że wszystkie oczekiwane obrazy wyjściowe znajdują się w podfolderze CellProfiler folderu wyjściowego Worm-align.Przetworzona kopia oryginalnego obrazu, binarna maska obrazu populacji robaków, maska wyrównania, jeśli linia jest narysowana na wybranych robakach i jeden obraz reprezentujący każdy z kanałów na oryginalnym obrazie. Otwórz CellProfiler, a następnie kliknij moduł wejściowy obrazów i przeciągnij folder modułu CellProfiler do okna z napisem upuść tutaj pliki i foldery. Jeśli istnieje lista obrazów z poprzedniej analizy, najpierw usuń je, klikając prawym przyciskiem myszy w oknie i wybierając opcję wyczyść listę plików.Kliknij moduł wprowadzania metadanych i drugą metodę ekstrakcji, kliknij żółty folder i przejdź do podfolderu CellProfiler w folderze wyjściowym Worm-align. Wybierz plik ustawień, a następnie kliknij przycisk Aktualizuj. Następnie kliknij moduł wejściowy nazw i typów i upewnij się, że wszystkie obrazy wymagane dla potoku są obecne.Przed uruchomieniem potoku wybierz miejsce docelowe dla wyników wyjściowych w module wyjściowym. Użyj trybu testowego, aby zobaczyć, jak działa potok, klikając przycisk rozpocznij tryb testowy i zezwól mu na uruchomienie pierwszego obrazu w folderze. Jeśli wydajność potoku jest zadowalająca, kliknij pozycję Wyjdź z trybu testu i przeanalizuj obrazy.Przed rozpoczęciem analizy upewnij się, że wszystkie oczy przed modułem analizy są zamknięte. Po zakończeniu analizy otwórz folder wyjściowy Worm_CP, który składa się z dwóch plików CSV, robaków CSV i wierszy CSV. Hodowla i obrazowanie C. elegans zgodnie z metodą opisaną w tym protokole daje duże obrazy przeglądowe populacji robaków.Wynik potoku w dużej mierze zależy od jakości linii narysowanych na obrazach. Pokazano tutaj kilka przykładów linii i ich dane wyjściowe z Worm-align. Podczas korzystania ze skryptu Worm-align możliwa jest wizualna identyfikacja przecinających się robaków na podstawie obrazów nakładki znajdujących się w podfolderze danych, a także z paneli poszczególnych robaków w montażu.Tabela kontroli jakości może być również używana do identyfikowania nakładających się robaków. Jednak przecinające się linie są problematyczne dla Worm_CP rurociągu. Dzieje się tak, ponieważ Worm_CP używa maski linii, a nie obszarów zainteresowania, aby pomóc w identyfikacji poszczególnych robaków.W związku z tym CellProfiler podzieli jeden z robaków na dwa obiekty. Rurociąg Worm_CP został wykorzystany do ilościowego określenia intensywności fluorescencji od utrwalonych zwierząt znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym, który włącza się do kropelek lipidów. Zawartość lipidów w kropelkach zmniejsza się o 17% między zwierzętami typu dzikiego i zmutowanymi DBL1 przy użyciu ręcznej kwantyfikacji oraz o 12% przy użyciu Worm_CP rurociągu.Worm_CP wykorzystano również do ilościowego określenia reakcji na szok cieplny u żywych robaków wykazujących ekspresję GFP pod kontrolą genu indukowanego szokiem cieplnym. Przy braku stresu cieplnego robaki nie indukowały ekspresji GFP. Kiedy robaki są wystawione na krótki szok cieplny, indukowana jest ekspresja GFP.Wynik Worm_CP zależy w dużej mierze od jakości linii rysowanych za pomocą Worm-align. Upewnij się, że linie się nie stykają ani nie nakładają na siebie i narysuj wszystkie linie w tym samym kierunku. Sprawdzenie tabeli kontroli jakości może pomóc w zidentyfikowaniu linii, które stykają się lub nakładają na siebie, dzięki czemu można wykluczyć te przypadki z analizy.Dane wyjściowe Worm-align mogą być wykorzystane do późniejszej kwantyfikacji na Fidżi lub w innych pakietach oprogramowania do analizy obrazu. Pokazaliśmy tutaj bardzo podstawowy potok CellProfiler, do którego można bardzo łatwo włączyć inne moduły analityczne, na przykład w celu zliczenia liczby kropelek lipidów lub ilościowego określenia intensywności pojedynczych kropelek w robaku. Jedną z zalet tej techniki jest możliwość szybkiego ilościowego określenia fluorescencji pojedynczych robaków.W naszym laboratorium jesteśmy zainteresowani indywidualną żywotnością przy użyciu reporterów fluorescencyjnych i rutynowo używamy do tego celu Worm-align i Worm_CP.

worm-align-wormcp-two-open-source-pipelines-for-straightening

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Poznaj Worm-align i Worm_CP, otwarte potoki do prostowania i kwantyfikacji fluorescencji w Caenorhabditis elegans. Uprość analizę obrazów mikroskopowych i uzyskaj precyzyjne wyniki.

Worm-align i Worm_CP, dwa potoki typu open source do prostowania i kwantyfikacji danych obrazu fluorescencji uzyskanych z Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal

Worm-align i Worm_CP, dwa potoki typu open source do prostowania i kwantyfikacji danych obrazu fluorescencji uzyskanych z Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów