Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu z genetycznie śledzonym projektem Caenorhabditis elegans jest identyfikacja interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanki. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy w sobie łatwe w użyciu testy, takie jak dopasowanie sztucznej inteligencji Golan i odczyty behawioralne w celu ujawnienia nowych interakcji specyficznych dla tkanki. Aby zapewnić bezstresową synchronizację zarodków, użyj kilofa do robaków, aby przenieść około 100 jaj z niezsynchronizowanej płytki robaka na nowo osadzoną płytkę NGM i hoduj zwierzęta zgodnie z odpowiednim harmonogramem eksperymentalnym.

Gdy zwierzęta osiągną pierwszy dzień składania jaj, powoli dodaj jeden mililitr bufora M9 do płytki, w odległości od trawnika bakteryjnego i obróć płytkę tak, aby bufor całkowicie zakrył płytkę. Przechyl talerz na bok, aby usunąć płyn i umyć zwierzęta z talerza. Gdy wszystkie robaki zostaną umyte z płytki, użyj standardowej plastikowej końcówki pipety, aby wyciąć kwadrat agaru wokół miejsca, w którym skoncentrowane są jaja i umieść kawałek agaru na nowo osadzonej płytce NGM.

Hoduj jaja w tych samych warunkach hodowli. Pod koniec inkubacji płytkę należy przykryć zsynchronizowanymi jajami. Po umyciu wszystkich zwierząt z płytki, jak właśnie pokazano, dodaj jeden mililitr świeżego buforu M9 i użyj skrobaka do komórek, aby uwolnić jaja z talerza.

Gdy wszystkie jaja zostaną odłączone, przenieś całą objętość buforu z płytki do stożkowej probówki w celu odwirowania. Odwirować probówkę i wyrzucić supernatant. Po usunięciu supernatantu dodać do jednego mililitra świeżego buforu M9 do płytki i pipety w celu ponownego zawieszenia jaj.

Umyj jajka jeszcze pięć razy, jak pokazano. Po ostatnim umyciu granulki jaj powinny wydawać się białe, a wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów supernatantu można usunąć. Aby wyhodować zsynchronizowane nicienie do eksperymentu, umieść kroplę około 30 jaj w pobliżu trawnika bakteryjnego i każdej płytki osadzonej w interferencyjnym RNA oraz około 30 jaj na płytce osadzonej z pustym wektorem zawierającym bakterie.

Następnie hoduj zwierzęta w odpowiednich warunkach hodowlanych zgodnie z protokołem doświadczalnym. Aby ocenić śmiertelność embrionalną zsynchronizowanych zwierząt, gdy zwierzęta zaczną składać jaja, przenieś około 100 jaj na pustą płytkę i rozłóż jaja w rzędach, aby uprościć liczenie. Po 24 do 48 godzinach oceń procent niewyklutych jaj.

Dla porównania, porównaj jaja zwierząt doświadczalnych z jajami zwierząt leczonych pustymi bakteriami kontrolnymi wektorów. Aby skonfigurować test paraliżu, hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem na pustych bakteriach kontrolnych wektorów, aż zwierzęta osiągną dorosłość, ale przed rozpoczęciem składania jaj. Użyj cienkiego markera, aby narysować linię na odwrocie zwykłej płytki agarowej NGM i umieść od pięciu do dziesięciu zwierząt na zaznaczonej linii.

Ustaw minutnik na 10 minut i oceń procent zwierząt pozostałych na linii jako sparaliżowane robaki. Dla porównania, porównaj te dane z odsetkiem zmutowanych zwierząt hodowanych na pustych bakteriach kontrolnych wektorów. W celu walidacji knockdown białka umieść od 250 do 300 zsynchronizowanych jaj na 60-milimetrowej płytce interferencyjnego RNA NGM, osadzonej z odpowiednim dwuniciowym RNA eksprymującym lub pustym wektorem zawierającym bakterie i hoduj jaja przez odpowiedni okres doświadczalny.

Pod koniec inkubacji przenieś łącznie 200 młodych dorosłych zwierząt do nakrętki 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 200 mikrolitrów PBST utrzymywanej w temperaturze hodowli zwierząt. Ostrożnie zamknij nakrętkę i odwiruj zwierzęta w temperaturze 1000 razy G przez 1 minutę. Pod koniec wirowania dodaj 800 mikrolitrów świeżego PBST do probówki i ponownie odwiruj robaki.

Ostrożnie usunąć górne 900 mikrolitrów supernatantu i umyć nicienie w świeżym PBST jeszcze 3 razy, jak właśnie pokazano. Po ostatnim przemyciu usunąć wszystkie oprócz ostatnich 100 mikrolitrów supernatantu i dodać zwierzętom 25 mikrolitrów 5-krotnego buforu do próbki. Podgrzewaj próbki przez 10 minut w temperaturze 92 stopni Celsjusza i 1000 obrotów na minutę, a następnie załaduj 20 mikrolitrów każdej próbki na żel stronicowy SDS.

Następnie należy przeprowadzić analizę Western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał, aby określić względną stabilność białka będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie użyć oprogramowania densytometrycznego do określenia intensywności zakazów. HSP6 powalony podczas rozwoju powoduje silne zatrzymanie rozwoju u zwierząt typu dzikiego. W tym samym czasie HSP6 powalony w specyficznym dla mięśni szczepie RNA interferencyjnym eksprymującym RDE1 typu dzikiego w tkance mięśniowej nie powoduje zatrzymania rozwoju.

Podczas gdy HSP6 powalił specyficzny dla jelit szczep RNAI wykazujący ekspresję dzikiego typu RDE1 w komórkach jelitowych, co skutkuje silnym zatrzymaniem rozwoju i fenotypem. Mutacja w HSP6 MG585, która powoduje łagodne opóźnienie wzrostu, może być zatem wykorzystana do badań przesiewowych pod kątem pogarszających lub łagodzących interakcji opiekuńczych poprzez skrzyżowanie szczepu przenoszącego ten zmutowany gen ze szczepem RNA specyficznym dla jelit i badanie przesiewowe biblioteki RNA interferencji opiekuńczej. Organizacja miozyny i zmutowane zwierzęta UNC45 leczone interferencyjnym RNA STI1 AHSA1 lub DAF41 są podobne do robaków typu dzikiego w czwartym stadium larwalnym.

Chociaż mutanty wykazują zaburzone sarkomery po osiągnięciu dorosłości. W przeciwieństwie do tego, zarówno zwierzęta z mutacją UNC45 leczone kontrolą pustego wektora, jak i zwierzęta typu dzikiego pozostają nienaruszone. Interakcje genetyczne nie wskazują na interakcję fizyczną.

W związku z tym należy przeprowadzić dalsze eksperymenty z wykorzystaniem badań przesiewowych interakcji genetycznych w celu walidacji i bezpośredniego zbadania charakteru zidentyfikowanych interakcji.