Name: Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Odkryj interakcje opiekuńcze specyficzne dla tkanek w Caenorhabditis elegans przy użyciu syntetycznych ekranów interakcyjnych i RNAi. Ta metoda pozwala identyfikować nowe powiązania białkowe na poziomie organizmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Centrum Genetyki Caenorhabditis, finansowanemu przez NIH National Center for Research Resources (NCRR), za niektóre szczepy nicieni. Przeciwciała monoklonalne opracowane przez H.F. Epsteina uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank opracowanego pod auspicjami NICHD i utrzymywanego przez Wydział Biologii Uniwersytetu Iowa. Badania te były wspierane przez grant Izraelskiej Fundacji Naukowej (grant nr 278/18) oraz przez grant z izraelskiego Ministerstwa Nauki i Technologii oraz Ministerstwa Spraw Zagranicznych i Współpracy Międzynarodowej, Generalnej Dyrekcji ds. Promocji Kraju, Republiki Włoskiej (grant nr 3-14337). Dziękujemy członkom laboratorium Ben-Zvi za pomoc w przygotowaniu tego manuskryptu.

1. Przygotowanie płytek z pożywką dla nicieni dla RNAi
<ol>
	<li>Do butelki o pojemności 1 l dodać 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptonu, 17 g agaru i wody destylowanej do 1 l i autoklaw.</li>
	<li>Schłodzić butelkę do 55 °C.</li>
	<li>Dodać 25 ml 1 M KH2PO4 o pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 i 1 ml roztworu cholesterolu (Tabela 1), aby uzyskać pożywkę wzrostową nicieni (NGM).</li>
	<li>Dodać 1 ml ampicyliny (100 mg/ml) i 0,5 ml 1 M IPTG (Tabela 1), aby uzyskać roztwór NGM-RNAi. 
	UWAGA: Powszechnie stosowane bakterie E. coli HT115(DE3) zawierają indukowaną przez IPTG polimerazę DNA T7, używaną do ekspresji plazmidów kodujących dsRNA. Plazmidy te kodują również oporność na ampicylinę.</li>
	<li>Wymieszaj ciepły roztwór, obracając butelkę.</li>
	<li>W kapturze lub stosując sterylne procedury, wlać roztwór NGM do płytek lub za pomocą pompy perystaltycznej dozować roztwór do płytek. Do tego ekranu użyj płytek 6-dołkowych, 12-dołkowych, 40 mm lub 60 mm. Agar powinien wypełniać około 2/3 głębokości płytki.</li>
	<li>Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc na stole w temperaturze pokojowej, trzymając talerze przykryte. Płytki NGM do RNAi można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do miesiąca.</li>
</ol>
2. Hodowla bakterii RNAi i wysiewanie płytek
<ol>
	<li>W kapturze lub stosując sterylne procedury, dodać 1 ml ampicyliny (100 mg/ml) i 2,5 ml tetracykliny (5 mg/ml) (Tabela 1) do wstępnie autoklawowanego 1 litra roztworu LB i wymieszać. 
	UWAGA: Powszechnie stosowane bakterie E. coli HT115(DE3) są odporne na tetracykliny.</li>
	<li>W kapturze lub przy użyciu sterylnych procedur dodać 600 μl roztworu LB do każdej studzienki w 96-dołkowych płytkach sterylnych o głębokości 2 ml. Do dozowania pożywki najlepiej jest używać pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Stosując sterylne procedury, zaszczepić studzienki bakteriami E. coli HT115(DE3) przekształconymi plazmidem kodującym dsRNA ukierunkowanym na gen zainteresowania lub pusty plazmid, jako kontrolę. Przykryć płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Biblioteki, które składają się z klonów bakteryjnych eksprymujących dsRNA, odpowiadających ~94% przewidywanych genów C. elegans, zostały wcześniej skonstruowane22,23 i są dostępne na rynku. Biblioteka opiekuńcza została skonstruowana przez Dr. Richarda Morimoto laboratory26.</li>
	<li>Stosując sterylne procedury, wysiewa się 75, 150 lub 250 μl bakterii na płytki 12-dołkowe, 40 mm i 6-dołkowe lub 60 mm RNAi NGM. Wyraźnie zaznacz nazwę docelowego genu na tabliczce. Bakterie powinny pokrywać 30-50% powierzchni agaru i nie powinny dotykać krawędzi płytki.</li>
	<li>Pozostaw talerze do wyschnięcia na stole przez co najmniej 2 dni w temperaturze pokojowej, trzymając talerze pod przykryciem. 
	UWAGA: Płytki można inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Upewnij się, że wewnętrzne dołki są suche przed użyciem lub przechowywaniem płytek. W przypadku wszystkich celów długoterminowych (np. suszenia lub przechowywania) należy przechowywać talerze w ciemności. Wysuszone talerze z nasionami można przechowywać w temperaturze 4 °C do miesiąca.</li>
</ol>
3. Bezstresowa synchronizacja zarodków
<ol>
	<li>Użyj kilofa, aby przenieść około 100 jaj z niezsynchronizowanej płytki robaka na nowo zasianą płytkę NGM.</li>
	<li>Hodować zwierzęta przez 5 dni w temperaturze 15 °C, 3,5 dnia w temperaturze 20 °C lub 2,5 dnia w temperaturze 25 °C. Zwierzęta powinny osiągnąć pierwszy dzień składania jaj. 
	UWAGA: Robaki są powszechnie uprawiane w temperaturze 20 °C. Jednak różne zmutowane szczepy chaperonów mogą wymagać określonych temperatur uprawy. Na przykład wiele szczepów wrażliwych na temperaturę jest uprawianych w temperaturze 15 °C, ale zmienia się je na 25 °C, aby uwidocznić ich fenotyp.</li>
	<li>Dodawać 1 ml buforu M9 (Tabela 1) powoli i z dala od trawnika bakteryjnego. Obróć płytkę tak, aby zderzak całkowicie zakrył płytkę. Następnie przechyl go na bok i usuń płyn z talerza, a następnie zmyj zwierzęta z talerza. 
	UWAGA: W przypadku stosowania zwierząt wrażliwych na temperaturę lub mutantów opiekuńczych, najlepiej jest utrzymywać stosowane w protokole w temperaturze hodowli zwierząt.</li>
	<li>Powtórz krok 3.3 trzy razy lub do momentu, gdy wszystkie zwierzęta zostaną zmyte z talerza.</li>
	<li>Za pomocą standardowej plastikowej końcówki wytnij kwadrat agaru z umytego talerza, na którym skoncentrowane są jajka i umieść kawałek agaru na nowo wysianej płytce NGM. 
	UWAGA: ~ 200 jaj jest potrzebnych do wyprodukowania wystarczającej ilości zwierząt składających jaja; Zbyt wiele zwierząt zjada bakterie zbyt szybko. Niski poziom pożywienia może mieć wpływ na proteostazę27.</li>
	<li>Hodować zwierzęta przez 5 dni w temperaturze 15 °C, 3,5 dnia w temperaturze 20 °C lub 2,5 dnia w temperaturze 25 °C. W tym momencie talerze należy przykryć zsynchronizowanymi jajkami. 
	UWAGA: Zwierzęta można przenieść na nową płytę na krótki czas, aby uzyskać bardziej rygorystyczną synchronizację. Jednak ważne jest, aby używać tylko dorosłych na wczesnych etapach składania jaj, ponieważ zwierzęta mogą zatrzymać jaja w macicy, wpływając na synchronizację.</li>
	<li>Powoli dodawaj 1 ml buforu M9 z dala od trawnika bakteryjnego.</li>
	<li>Obróć płytkę tak, aby zderzak całkowicie zakrył płytkę. Następnie przechyl go na bok i usuń płyn z talerza i zmyj zwierzęta z talerza.</li>
	<li>Powtórz krok 3.7 trzy razy lub do momentu, gdy wszystkie zwierzęta zostaną zmyte z płytki.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu M9 i użyć skrobaka do komórek, aby uwolnić jaja z płytki.</li>
	<li>Zebrać bufor M9 zawierający jaja z płytek.</li>
	<li>Odwirować bufor M9 zawierający jaja o masie 3 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać bufor M9 do uzyskania objętości 1 ml.</li>
	<li>Ponownie zawieś jaja, aby rozbić wszelkie kawałki jaj i bakterie.</li>
	<li>Powtórz procedurę prania opisaną w krokach 3.11-3.13 pięć razy. Granulki jaj powinny być białe. Jeśli nadal jest żółty/brązowy, powtarzaj pranie, aż do uzyskania białej granulki. 
	UWAGA: Bakterie, które pozostają na jajach, mogą zanieczyścić bakterie wykazujące ekspresję dsRNA.</li>
	<li>Usuń większość supernatantu, pozostawiając około 200 μl. Zsynchronizowane jaja można wykorzystać do badań przesiewowych RNAi.</li>
</ol>
4. Typowe testy fenotypowe
<ol>
	<li>Hodowla zwierząt podczas eksperymentów
	<ol>
		<li>Umieść kroplę ~30 jaj w pobliżu trawnika bakteryjnego na każdej talerzu wysiewanej przez RNAi. Dla porównania, umieść również ~30 jaj na talerzach wysianych pustymi bakteriami zawierającymi wektory (L4440).</li>
		<li>Hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem na płytkach nasiennych RNAi NGM. Czas trwania doświadczenia będzie zależał od etapu, na którym zwierzęta mają być monitorowane, oraz od temperatury hodowli. Dostosuj temperaturę uprawy, gdy używasz zmutowanych zwierząt wrażliwych na temperaturę. Dostosuj czas trwania uprawy w przypadku stosowania zmutowanych zwierząt opóźnionych w rozwoju. 
		UWAGA: Chociaż czas może się różnić, gdy zwierzęta osiągną dorosłość, składanie jaj (i wynikające z tego szybkie spożycie pokarmu), a także zależne od wieku załamanie proteosty28, mogą mieć wpływ na wyniki. Dlatego zaleca się ocenianie zwierząt przed rozpoczęciem składania jaj (1. dzień dorosłości). Zwierzęta w typie dzikim osiągają ten etap po 4,5 dniu w temperaturze 15 °C, po 3 dniach w temperaturze 20 °C lub po 2 dniach w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Liczba użytych powtórzeń będzie zależała od wielkości badanego zestawu genów. W przypadku biblioteki opiekuńczej (97 genów) powtórz eksperymenty co najmniej cztery razy. Wielkość populacji zależy od zastosowanego testu. W omówionych tutaj testach behawioralnych uzyskaj wynik >15 zwierząt na warunek eksperymentalny w każdym powtórzeniu. Dane i analizy statystyczne również w dużym stopniu zależą od rodzaju zastosowanego testu. Dane w omawianych tutaj testach można przedstawić jako średnie ± SEM.</li>
		<li>Porównaj zwierzęta kontrolowane RNAi i puste wektory jako niezależne populacje. Wartości P można obliczyć za pomocą jedno- lub dwukierunkowej ANOVA, w zależności od badanych zmian, a mianowicie samego pogorszenia lub złagodzenia lub obu. Badając pojedynczą obróbkę RNAi w porównaniu z kontrolą, wartości P można obliczyć za pomocą jednokierunkowego lub dwukierunkowego testu sumy rang Manna-Whitneya. Oprócz istotności statystycznej należy wziąć pod uwagę próg dla trafień oparty na stopniu wpływu na fenotyp.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zahamowanie/opóźnienie rozwoju
	<ol>
		<li>Hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem, jak w kroku 4.1, dopóki zwierzęta hodowane na pustych bakteriach kontrolnych zawierających wektory nie osiągną dorosłości, ale przed rozpoczęciem składania jaj.</li>
		<li>Monitoruj zwierzęta za pomocą mikroskopu stereoskopowego i policz liczbę larw i dorosłych, aby ocenić procent zwierząt opóźnionych w rozwoju. Dla porównania, porównaj ze zmutowanymi zwierzętami hodowanymi na pustych bakteriach kontrolnych zawierających wektory. Leczenie RNAi hsp-1 lub hsp-90 powoduje zatrzymanie rozwoju zwierząt typu dzikiego i może być stosowane jako kontrola pozytywna.</li>
		<li>Aby ocenić procent zwierząt opóźnionych w rozwoju w czasie, powtórz krok 4.2.2. 
		UWAGA: Jeśli na talerzu znajdują się dorosłe osobniki składające jaja, przenieś opóźnione w rozwoju zwierzęta na nową płytkę NGM-RNAi znakowaną dla tego samego genu docelowego, aby uniknąć pomylenia z potomstwem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wady bezpłodności lub nieśności jaj
	<ol>
		<li>Hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem, jak w kroku 4.1, aż zwierzęta wyhodowane na pustych bakteriach kontrolujących wektory zaczną składać jaja.</li>
		<li>Monitoruj zwierzęta za pomocą mikroskopu stereoskopowego i oceń procent zwierząt, które nie mają widocznych jaj w macicy. Dla porównania, porównaj ze zmutowanymi zwierzętami hodowanymi na pustych bakteriach kontrolujących wektory.</li>
		<li>Alternatywnie, monitoruj zwierzęta za pomocą mikroskopu stereoskopowego i oceń procent zwierząt z macicą pełną jaj, zdefiniowaną jako fenotyp wadliwego składania EGg (Egl-d)29.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śmiertelność zarodków
	<ol>
		<li>Hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem, jak w kroku 4.1, aż zwierzęta zaczną składać jaja.</li>
		<li>Przełóż ~100 jajek na pusty talerz. Rozłóż jajka w rzędach, aby uprościć liczenie.</li>
		<li>Oceń procent niewyklutych jaj na talerzu po 24-48 godzinach. Dla porównania, porównaj z jajami zwierząt leczonych pustymi bakteriami kontrolującymi wektory.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test paraliżu
	<ol>
		<li>W przypadku osobników dorosłych w dniu 1 należy hodować zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem, jak w kroku 4.1, aż zwierzęta hodowane na pustych bakteriach kontrolujących wektory osiągną dorosłość, ale przed rozpoczęciem składania jaj.</li>
		<li>Narysuj linię na odwrocie zwykłej płytki agarowej NGM za pomocą cienkiego markera.</li>
		<li>Umieść 5-10 zwierząt na zaznaczonej linii.</li>
		<li>Ustaw minutnik i poczekaj 10 minut.</li>
		<li>Oceń procent zwierząt pozostałych na linii jako sparaliżowane robaki. Dla porównania, porównaj ze zmutowanymi zwierzętami hodowanymi na pustych bakteriach kontrolujących wektory. Zwierzęta typu dzikiego leczone unc-45 RNAi wykazują fenotyp ciężkiego paraliżu i mogą być stosowane jako kontrola pozytywna. 
		UWAGA: Ten test wyróżnia zwierzęta wykazujące średni lub ciężki paraliż. Takie zwierzęta zwykle leżą prosto na talerzu, a nie mają zwykłego zakrzywionego kształtu. Co więcej, wokół głów sparaliżowanych robaków widoczna jest plama oczyszczona z bakterii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test młócenia
	<ol>
		<li>Hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem, jak w kroku 4.1, dopóki zwierzęta wyhodowane na pustych bakteriach kontrolujących wektory nie osiągną dorosłości, ale przed rozpoczęciem składania jaj.</li>
		<li>Odpipetować 100 μl buforu M9 w temperaturze hodowli zwierząt na 96-dołkową płytkę.</li>
		<li>Umieść ~15 robaków, po jednym na studzienkę, w studniach zawierających bufor M9.</li>
		<li>Pozwól zwierzętom dostosować się przez 5 minut.</li>
		<li>Zbadaj każde zwierzę pod mikroskopem stereoskopowym, uruchom minutnik odliczający 15 s i policz liczbę zgięć ciała, które każde zwierzę wykonuje w tym czasie. Zliczane wartości można znormalizować do zgięć ciała na minutę. Dla porównania, porównaj ze zmutowanymi zwierzętami hodowanymi na pustych bakteriach kontrolujących wektory. 
		UWAGA: Ten test ruchliwości jest bardzo czuły i może wykryć bardzo łagodne różnice między zabiegami. Jednak ruchliwość cieczy i ruchliwość na agarze mogą się różnić.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Walidacja knockdownu białka
<ol>
	<li>Umieść 250-300 zsynchronizowanych jaj na 60-milimetrowej płytce NGM-RNAi wysianej odpowiednimi bakteriami wykazującymi ekspresję dsRNA lub bakteriami zawierającymi pusty wektor (L4440). 
	UWAGA: Knockdown RNAi może spowodować nieprawidłową akumulację zarodków, brak zarodków lub zatrzymanie rozwoju, które może wpływać na ekspresję genów. Należy to wziąć pod uwagę przy określaniu wieku zwierząt, które mają być badane.</li>
	<li>W przypadku dorosłych osobników w dniu 1 hodować zwierzęta przez 4,5 dnia w temperaturze 15 °C, 3 dni w temperaturze 20 °C lub 2 dni w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Zbierz i przenieś łącznie 200 młodych dorosłych zwierząt do nakrętki probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 200 μl PBS-T. 
	UWAGA: W przypadku stosowania zwierząt wrażliwych na temperaturę lub mutantów opiekuńczych, najlepiej jest utrzymywać stosowane w protokole w temperaturze hodowli zwierząt.</li>
	<li>Ostrożnie zamknij nakrętkę i odwiruj przy 1 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Dodać 800 μl PBS-T (Tabela 1) i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Ostrożnie usuń górne 900 μl.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.4-5.6 trzy razy.</li>
	<li>Usunąć 900 μl, pozostawiając 100 μl roztworu zawierającego 200 robaków.</li>
	<li>Dodać 25 μl 5-krotnego buforu do pobierania próbek (tabela 1).</li>
	<li>Podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 92°C, wstrząsając z prędkością 1000 obr./min. Próbki można następnie zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Załaduj 20 μl każdej próbki i uruchom na żelu SDS-PAGE.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał w celu określenia względnej stabilności białka.</li>
	<li>Określ intensywność pasm za pomocą oprogramowania densytometrycznego, takiego jak ogólnodostępny moduł żelowy ImageJ. Znormalizować wszystkie wartości do wartości zmierzonych w próbce kontrolnej (próbkach kontrolnych). 
	UWAGA: Celem knockdownu RNAi w naszych badaniach przesiewowych jest obniżenie poziomu białka w określonym chaperonie/ko-chaperonie. Dlatego najlepszym sposobem oceny skuteczności knockdownu RNAi jest analiza western blot. Wymaga to specyficznych przeciwciał. Alternatywnie, qPCR może być stosowany do ilościowego określania poziomów mRNA.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wciąż brakuje zintegrowanego obrazu sieci proteostazy, który odzwierciedlałby, w jaki sposób jest ona zorganizowana i funkcjonuje w różnych komórkach i tkankach metazoan. Aby zaradzić temu brakowi, potrzebne są szczegółowe informacje na temat interakcji różnych składników tej sieci, takich jak molekularne białka opiekuńcze, w określonych tkankach w trakcie rozwoju i starzenia się. Pokazaliśmy tutaj, w jaki sposób zastosowanie perturbacji tkankowo pozwoliło nam zbadać sieć opiekuńczą w danej tkance. Aby zbadać specyficzne...

Komórki radzą sobie z uszkodzeniami białek, stosując mechanizmy kontroli jakości, które naprawiają, sekwestrują lub usuwają wszelkie uszkodzone białka1,2. Składanie i składanie kompleksów białkowych jest wspierane przez molekularne białka opiekuńcze, zróżnicowaną grupę wysoce konserwatywnych białek, które mogą naprawiać lub sekwestrować uszkodzone białka3,4,5,6,7. W usuwaniu uszkodzonych białek pośredniczy układ ubikwityna-proteasom (UPS)8 lub maszyneria autofagii9 we współpracy z opiekunami10,11,12. Homeostaza białek (proteostaza) jest zatem utrzymywana przez sieci kontroli jakości składające się z maszyn do fałdowania i degradacji3,13. Jednak zrozumienie interakcji między różnymi składnikami sieci proteostazy in vivo jest poważnym wyzwaniem. Podczas gdy badania przesiewowe interakcji białko-białko dostarczają ważnych informacji na temat interakcji fizycznych i kompleksów opiekuńczych14,15, brakuje zrozumienia organizacji i mechanizmów kompensacyjnych w tkankowo specyficznych sieciach opiekuńczych in vivo.
Interakcje genetyczne są często używane jako potężne narzędzie do badania relacji między parami genów, które są zaangażowane we wspólne lub kompensacyjne szlaki biologiczne16,17,18. Takie zależności można zmierzyć, łącząc pary mutacji i określając ilościowo wpływ mutacji w jednym genie na nasilenie fenotypowe spowodowane mutacją w drugim genie16. Podczas gdy większość takich kombinacji nie wykazuje żadnego wpływu pod względem fenotypu, niektóre interakcje genetyczne mogą albo pogorszyć, albo złagodzić nasilenie mierzonego fenotypu. Mutacje obciążające obserwuje się, gdy fenotyp mutanta podwójnej delecji jest poważniejszy niż oczekiwany fenotyp obserwowany po połączeniu mutantów z pojedynczą delecją, co oznacza, że te dwa geny funkcjonują w równoległych szlakach, razem wpływając na daną funkcję. W przeciwieństwie do tego, mutacje łagodzące obserwuje się, gdy fenotyp mutanta podwójnej delecji jest mniej dotkliwy niż fenotyp obserwowany w przypadku mutantów z pojedynczą delecją, co oznacza, że te dwa geny działają razem jako kompleks lub uczestniczą w tym samym szlaku16,18. W związku z tym do identyfikacji interakcji genetycznych wykorzystano różne fenotypy, które można określić ilościowo, w tym szerokie fenotypy, takie jak śmiertelność, tempo wzrostu i wielkość lęgu, a także określone fenotypy, takie jak reportery transkrypcyjne. Na przykład Jonikas i in. polegali na reporterze stresu ER, aby zbadać interakcje sieci proteostazy niesfałdowanej odpowiedzi białkowej Saccharomyces cerevisiae ER za pomocą analiz delecji genów parami19.
Genetyczne analizy interakcji polegają na systematycznym krzyżowaniu mutacji delecji parami w celu wygenerowania obszernego zestawu podwójnych mutantów20. Jednak w modelach zwierzęcych, a w szczególności u C. elegans, to podejście na dużą skalę nie jest wykonalne. Zamiast tego zmutowane szczepy mogą być testowane pod kątem ich genetycznych wzorców interakcji poprzez regulację w dół ekspresji genów za pomocą interferencji RNA (RNAi)21. C. elegans to potężny system dla ekranów oparty na RNAi22,23. U C. elegans dostarczanie dwuniciowego RNA (dsRNA) odbywa się poprzez odżywianie bakteryjne, co prowadzi do rozprzestrzeniania się cząsteczek dsRNA do wielu tkanek. W ten sposób wprowadzone cząsteczki dsRNA wpływają na zwierzę za pomocą szybkiej i prostej procedury21. Badanie przesiewowe interakcji genetycznych przy użyciu RNAi może zatem ujawnić wpływ regulacji w dół zestawu genów lub większości genów kodujących C. elegans za pomocą bibliotek RNAi24. Na takim ekranie trafienia, które wpływają na zachowanie interesującego mutanta, ale nie szczepu dzikiego, są potencjalnymi modyfikatorami monitorowanego fenotypu25. Tutaj stosujemy kombinację mutacji i badań przesiewowych RNAi, aby systematycznie mapować specyficzne tkankowo interakcje opiekuńcze u C. elegans.

<table><tbody><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>SPL</td><td>BA3D16B</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 40 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 60 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Thermo Scientific 140675</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 mL 128,0/85mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>780278</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGA03</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Formedium</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>niebieski bromofenol</td><td>Sigma</td><td>BO126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td>fotograficzny Qimaging</td><td>q30548</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Amresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny</td><td>Leica</td><td>DM5500</td><td></td></tr><tr><td>Filtr (0,22 &mikro; m)</td><td>Sigma</td><td>SCGPUO2RE</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ165FC</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Frutarom</td><td>2355519000024</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Bio-Lab</td><td>001649029100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>22189-08-8</td><td>Prezent od laboratorium Morimoto</td></tr><tr><td>Przeciwciało Myosin MHC A (MYO-3)</td><td>Hybridoma Bank</td><td>5-6</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>s-0751</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>001903029100</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck</td><td>61930705001730</td><td></td></tr><tr><td>Pompa do nalewania płyt</td><td>Integra</td><td>robi to p920</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka RNAi Chaperone</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR Life Science</td><td>0837-500</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;- merkaptoetanol</td><td>Bio world</td><td>41300000-1</td><td></td></tr><tr><td>stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>64-75-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Lab</td><td>002009239100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Prawidłowe składanie i składanie białek i kompleksów białkowych jest niezbędne dla funkcjonowania komórki. Komórki wykorzystują szlaki kontroli jakości, które korygują, sekwestrują lub eliminują uszkodzone białka w celu utrzymania zdrowego proteomu, zapewniając w ten sposób proteostazę komórkową i zapobiegając dalszym uszkodzeniom białek. Ze względu na nadmiarowość funkcji w sieci proteostazy, badania przesiewowe w kierunku wykrywalnych fenotypów za pomocą knockdownu lub mutacji w genach kodujących białka opiekuńcze w organizmie wielokomórkowym Caenorhabditis elegans skutkują w większości przypadków wykryciem drobnych fenotypów lub ich braku. Opracowaliśmy ukierunkowaną strategię badań przesiewowych, aby zidentyfikować białka opiekuńcze wymagane do określonej funkcji, a tym samym wypełnić lukę między fenotypem a funkcją. W szczególności monitorujemy nowe interakcje opiekuńcze za pomocą syntetycznych ekranów interakcji RNAi, zmniejszając ekspresję białka opiekuńczego, jeden opiekun na raz, u zwierząt z mutacją w genie kodującym białka opiekuńczego lub z nadmierną ekspresją białka opiekuńczego. Rozbijając dwa białka opiekuńcze, które indywidualnie nie prezentują żadnego ogólnego fenotypu, możemy zidentyfikować białka opiekuńcze, które pogarszają lub ujawniają określony fenotyp, gdy oba są zaburzone. Pokazujemy, że to podejście może zidentyfikować określone zestawy białek opiekuńczych, które działają razem w celu modulowania fałdowania białka lub kompleksów białkowych związanych z danym fenotypem.

Wykorzystanie mutacji UNC-45 wrażliwych na temperaturę do badania interakcji pogarszających lub łagodzących w warunkach odpowiednio dopuszczalnych lub restrykcyjnych 
Montaż i utrzymanie mięśni stanowią skuteczny system badania specyficznych dla tkanek interakcji chaperonów. Jednostka funkcjonalna mięśni kurczliwych, sarkomer, wykazuje krystalopodobną strukturę białek strukturalnych i regulacyjnych. Stabilność białka motorycznego miozyny oraz jej wbudowywanie w grube filamenty sarkomerów mięśni kurczl...

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu z genetycznie śledzonym projektem Caenorhabditis elegans jest identyfikacja interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanki. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy w sobie łatwe w użyciu testy, takie jak dopasowanie sztucznej inteligencji Golan i odczyty behawioralne w celu ujawnienia nowych interakcji specyficznych dla tkanki. Aby zapewnić bezstresową synchronizację zarodków, użyj kilofa do robaków, aby przenieść około 100 jaj z niezsynchronizowanej płytki robaka na nowo osadzoną płytkę NGM i hoduj zwierzęta zgodnie z odpowiednim harmonogramem eksperymentalnym.Gdy zwierzęta osiągną pierwszy dzień składania jaj, powoli dodaj jeden mililitr bufora M9 do płytki, w odległości od trawnika bakteryjnego i obróć płytkę tak, aby bufor całkowicie zakrył płytkę. Przechyl talerz na bok, aby usunąć płyn i umyć zwierzęta z talerza. Gdy wszystkie robaki zostaną umyte z płytki, użyj standardowej plastikowej końcówki pipety, aby wyciąć kwadrat agaru wokół miejsca, w którym skoncentrowane są jaja i umieść kawałek agaru na nowo osadzonej płytce NGM.Hoduj jaja w tych samych warunkach hodowli. Pod koniec inkubacji płytkę należy przykryć zsynchronizowanymi jajami. Po umyciu wszystkich zwierząt z płytki, jak właśnie pokazano, dodaj jeden mililitr świeżego buforu M9 i użyj skrobaka do komórek, aby uwolnić jaja z talerza.Gdy wszystkie jaja zostaną odłączone, przenieś całą objętość buforu z płytki do stożkowej probówki w celu odwirowania. Odwirować probówkę i wyrzucić supernatant. Po usunięciu supernatantu dodać do jednego mililitra świeżego buforu M9 do płytki i pipety w celu ponownego zawieszenia jaj.Umyj jajka jeszcze pięć razy, jak pokazano. Po ostatnim umyciu granulki jaj powinny wydawać się białe, a wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów supernatantu można usunąć. Aby wyhodować zsynchronizowane nicienie do eksperymentu, umieść kroplę około 30 jaj w pobliżu trawnika bakteryjnego i każdej płytki osadzonej w interferencyjnym RNA oraz około 30 jaj na płytce osadzonej z pustym wektorem zawierającym bakterie.Następnie hoduj zwierzęta w odpowiednich warunkach hodowlanych zgodnie z protokołem doświadczalnym. Aby ocenić śmiertelność embrionalną zsynchronizowanych zwierząt, gdy zwierzęta zaczną składać jaja, przenieś około 100 jaj na pustą płytkę i rozłóż jaja w rzędach, aby uprościć liczenie. Po 24 do 48 godzinach oceń procent niewyklutych jaj.Dla porównania, porównaj jaja zwierząt doświadczalnych z jajami zwierząt leczonych pustymi bakteriami kontrolnymi wektorów. Aby skonfigurować test paraliżu, hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem na pustych bakteriach kontrolnych wektorów, aż zwierzęta osiągną dorosłość, ale przed rozpoczęciem składania jaj. Użyj cienkiego markera, aby narysować linię na odwrocie zwykłej płytki agarowej NGM i umieść od pięciu do dziesięciu zwierząt na zaznaczonej linii.Ustaw minutnik na 10 minut i oceń procent zwierząt pozostałych na linii jako sparaliżowane robaki. Dla porównania, porównaj te dane z odsetkiem zmutowanych zwierząt hodowanych na pustych bakteriach kontrolnych wektorów. W celu walidacji knockdown białka umieść od 250 do 300 zsynchronizowanych jaj na 60-milimetrowej płytce interferencyjnego RNA NGM, osadzonej z odpowiednim dwuniciowym RNA eksprymującym lub pustym wektorem zawierającym bakterie i hoduj jaja przez odpowiedni okres doświadczalny.Pod koniec inkubacji przenieś łącznie 200 młodych dorosłych zwierząt do nakrętki 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 200 mikrolitrów PBST utrzymywanej w temperaturze hodowli zwierząt. Ostrożnie zamknij nakrętkę i odwiruj zwierzęta w temperaturze 1000 razy G przez 1 minutę. Pod koniec wirowania dodaj 800 mikrolitrów świeżego PBST do probówki i ponownie odwiruj robaki.Ostrożnie usunąć górne 900 mikrolitrów supernatantu i umyć nicienie w świeżym PBST jeszcze 3 razy, jak właśnie pokazano. Po ostatnim przemyciu usunąć wszystkie oprócz ostatnich 100 mikrolitrów supernatantu i dodać zwierzętom 25 mikrolitrów 5-krotnego buforu do próbki. Podgrzewaj próbki przez 10 minut w temperaturze 92 stopni Celsjusza i 1000 obrotów na minutę, a następnie załaduj 20 mikrolitrów każdej próbki na żel stronicowy SDS.Następnie należy przeprowadzić analizę Western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał, aby określić względną stabilność białka będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie użyć oprogramowania densytometrycznego do określenia intensywności zakazów. HSP6 powalony podczas rozwoju powoduje silne zatrzymanie rozwoju u zwierząt typu dzikiego. W tym samym czasie HSP6 powalony w specyficznym dla mięśni szczepie RNA interferencyjnym eksprymującym RDE1 typu dzikiego w tkance mięśniowej nie powoduje zatrzymania rozwoju.Podczas gdy HSP6 powalił specyficzny dla jelit szczep RNAI wykazujący ekspresję dzikiego typu RDE1 w komórkach jelitowych, co skutkuje silnym zatrzymaniem rozwoju i fenotypem. Mutacja w HSP6 MG585, która powoduje łagodne opóźnienie wzrostu, może być zatem wykorzystana do badań przesiewowych pod kątem pogarszających lub łagodzących interakcji opiekuńczych poprzez skrzyżowanie szczepu przenoszącego ten zmutowany gen ze szczepem RNA specyficznym dla jelit i badanie przesiewowe biblioteki RNA interferencji opiekuńczej. Organizacja miozyny i zmutowane zwierzęta UNC45 leczone interferencyjnym RNA STI1 AHSA1 lub DAF41 są podobne do robaków typu dzikiego w czwartym stadium larwalnym.Chociaż mutanty wykazują zaburzone sarkomery po osiągnięciu dorosłości. W przeciwieństwie do tego, zarówno zwierzęta z mutacją UNC45 leczone kontrolą pustego wektora, jak i zwierzęta typu dzikiego pozostają nienaruszone. Interakcje genetyczne nie wskazują na interakcję fizyczną.W związku z tym należy przeprowadzić dalsze eksperymenty z wykorzystaniem badań przesiewowych interakcji genetycznych w celu walidacji i bezpośredniego zbadania charakteru zidentyfikowanych interakcji.

using-caenorhabditis-elegans-to-screen-for-tissue-specific-chaperone

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Ta metoda opisuje protokół wysokoprzepustowego przygotowania ekstraktu białkowego z próbek Caenorhabditis elegans i późniejszej koimmunoprecypitacji.

Preparat ekstraktu białkowego i koimmunoprecypitacja z Caenorhabditis elegans

Genetycznie podatny na uszkodzenia nicień Caenorhabditis elegans może być używany jako prosty i tani model do odkrywania leków. Opisano tutaj protokół identyfikacji leków przeciwnowotworowych, które hamują dalszą sygnalizację białek RAS i EGFR.

Identyfikacja inhibitorów EGFR i RAS za pomocą Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Przedstawiamy tutaj szybki i prosty protokół ATAC-seq do zaimplementowania w całym robaku Caenorhabditis elegans na etapie L4, używając tylko 30 µL pelletu z dżdżownic.

Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4

Odkryj interakcje opiekuńcze specyficzne dla tkanek w Caenorhabditis elegans przy użyciu syntetycznych ekranów interakcyjnych i RNAi. Ta metoda pozwala identyfikować nowe powiązania białkowe na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Przeglądaj więcej filmów