Name: Zaawansowane modele 3D wątroby do badań genotoksyczności in vitro po długotrwałym narażeniu na nanomateriały (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj zaawansowane modele 3D wątroby Hep G2 do badań genotoksyczności nanomateriałów in vitro. Ta metoda pozwala ocenić uszkodzenia DNA przy długotrwałym narażeniu, zmniejszając potrzebę testowania na zwierzętach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną potwierdzić, że te badania otrzymały finansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji dla projektu PATROLS, na podstawie umowy o grant nr 760813

<ol><li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2(2010).</li>
<li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Kgs.+Lyngby%2C+Denmark%3A+Technical+University+of+Denmark%22%5BJournal%5D)">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li>
<li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li>
<li>Shah, U. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li>
<li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li>
<li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li>
<li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines.+Test+489%3A+In+vivo+Mammalian+Alkaline+Comet+Assay%22">OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay</a>. , (2016).</li>
<li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocytes%2C+HepG2+cells%2C+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li>
<li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li>
<li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019).</li>
<li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG%5BTitle%5D)+AND+%22European+Union+Grant+Agreement+n%C2%B0+2009%22%5BJournal%5D)">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n° 2009. 21, 01(2014).</li>
<li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1+and+M1%3A+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214(2018).</li>
<li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1%3A+A+review+on+metabolism%2C+toxicity%2C+occurrence+in+food%2C+occupational+exposure%2C+and+detoxification+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li>
<li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295(2019).</li>
<li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443(2016).</li>
<li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li>
<li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li>
<li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li>
<li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability%2C+spheroid+size%2C+and+hepatocellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li>
<li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li>
<li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li>
<li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li>
<li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDD%3A+A+computational+model+of+particle+sedimentation%2C+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fiber+Toxicology%22%5BJournal%5D)">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36(2010).</li>
<li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowania modeli 3D wątroby różnią się znacznie w zależności od konkretnego biochemicznego punktu końcowego lub szlaku działań niepożądanych, na który jest celowany. Każdy model ma swoje zalety i ograniczenia, od zmienności między dawcami w pierwotnych modelach ludzkich hepatocytów (PHH) po zmniejszoną aktywność cytochromu p450 w modelach opartych na liniach komórkowych, ale wszystkie są cenne same w sobie 6,12,18,19. Podczas oceny genotoksyczności istnieją ograniczenia w zgodności modeli z zatwierdzonymi przez organy regulacyjnymi punktami końcowymi, takimi jak test mikrojądrowy in vitro, ponieważ wymagana jest aktywna proliferacja. Jest to konieczne, ponieważ ocena genotoksyczności wymaga ilościowego określenia utrwalonych uszkodzeń DNA, które mają być oceniane po podziale komórki, gdy istnieje możliwość naprawy DNA w celu skorygowania przejściowych zmian. Niestety, wysoce zróżnicowane sferoidy lub mikrotkanki PHH oparte na hepatocytach (tj. HepaRG), które uważa się za wykazujące najbardziej fizjologicznie istotne cechy podobne do wątroby, tworzą modele statyczne (nieproliferacyjne) 12,19,20. W rezultacie, przedstawiony tutaj model sferoidalny 3D HepG2 stanowi odpowiedni, alternatywny model, który może wspierać badania genotoksyczności. Sferoidy oparte na linii komórkowej HepG2 mają wystarczającą ilość aktywnie dzielących się komórek na zewnętrznej powierzchni sferoid, zachowując jednocześnie podstawowe cechy podobne do wątroby, takie jak produkcja albuminy i mocznika oraz pewną aktywność CYP450 5,12,19. Zasadniczo ten model wątroby in vitro został opracowany w celu uzupełnienia testu mikrojądrowego, ponieważ jest to jeden z dwóch testów in vitro zalecanych w zestawie do badań genotoksyczności 8,10,11,21. Jednak model ten może być z łatwością zastosowany do analizy sekwencjonowania DNA i technologii ekspresji genów (RNA), a jednocześnie ma potencjał do dalszej adaptacji i wykorzystania do innych punktów końcowych uszkodzeń DNA, takich jak test komety. Niemniej jednak ważne jest, aby wziąć pod uwagę rolę, jaką interferencja ENM odgrywa w niektórych analizach punktów końcowych. Na przykład analizy oparte na cytometrii przepływowej mogą nie być odpowiednie do oceny genotoksyczności ENM, w szczególności ze względu na interferencję cząstekstałych 22.
Jednym z czynników ograniczających modele sferoidalne, które aktywnie ulegają podziałowi komórkowemu, jest ich rozmiar. Optymalizacja gęstości wysiewu ma kluczowe znaczenie, ponieważ musi być wystarczająca liczba komórek, które pozwolą modelowi na dalsze rozprzestrzenianie się; ale niezbyt duża liczba komórek, co powoduje, że sferoida staje się nadmiernie zwarta, co prowadzi do zwiększonego rdzenia nekrotycznego. Uważa się, że przyczyną tej martwicy jest ograniczona dyfuzja tlenu i składników odżywczych, ponieważ uważa się, że granica tej dyfuzji wynosi około 100 – 150 μm tkanki23,24. Zależy to jednak od typu komórki, liczby komórek, interakcji na rusztowaniu i warunków hodowli25. Ponieważ wykazano, że średnica około 700 μm jest granicą pozwalającą uniknąć przedwczesnego wystąpienia nekrozy w centrum sferoid C3A, wysiewanie 4000 komórek HepG2 na sferoidę zapewnia, że średnica modelu w momencie ekspozycji wynosi ≤500 μm26. Ponadto Shah i in. ustalili, że komórki HepG2 wysiane powyżej 5000 komórek na sferoidę wykazywały 25% zmniejszenie żywotności po 7 dniach hodowli, co może odnosić się do średniej średnicy 680 μm i ograniczonej dostępności składników odżywczych w wiszącej kropli o pojemności 20 μl5. Aby temu zaradzić, model opracowany w niniejszym protokole przechodzi krytyczny etap, w którym zwisająca kropla jest przenoszona do studzienek pokrytych agarozą po początkowym uformowaniu się sferoidy. Zapewnia to większą objętość pożywki hodowlanej, aby utrzymać stale rosnącą liczbę komórek w sferoidach. W rezultacie, model sferoidalny HepG2 pozostaje w ponad 70% żywotny po 10 dniach hodowli i może być wykorzystany do długoterminowej oceny zagrożeń in vitro. 
Podczas gdy model sferoidalny HepG2 może obsługiwać zarówno ostre, jak i długotrwałe reżimy ekspozycji, odświeżanie pożywki do hodowli komórkowej podczas dłuższych okresów hodowli jest ograniczone w przypadku tego modelu, ponieważ całkowita wymiana pożywki nie jest zalecana ze względu na potencjalną utratę sferoid. Przypuszcza się, że przy ekspozycjach na ENM tendencja do aglomeracji i osadów jednorodnych dyspersji ENM jest wysoka. Warto jednak zauważyć, że szybkość, z jaką osady ENM mogą się zmieniać w zależności od parametrów cząstek (np. rozmiaru, kształtu i gęstości) i może być określona teoretycznie przy użyciu modelu sedymentacji, dyfuzji i dozymetrii in vitro (ISDD) lub jego najnowszych pochodnych, często przywoływanych w odniesieniu do podejść do ekspozycji na ENM (zawiesinę)27,28. Mając to na uwadze, zakłada się, że jeśli tylko 50% pożywki do hodowli komórkowej zostanie ostrożnie usunięte z powierzchni hodowli komórkowej, zakłócenie i późniejsze usunięcie dawki ENM powinno być teoretycznie minimalne. Biorąc jednak pod uwagę ruchy Browna, może to nie być ściśle prawdą i należy podjąć dalsze prace nad osadzaniem i sedymentacją każdego konkretnego ENM, który ma być badany, w celu zapewnienia utrzymania prawidłowej dozymetrii przez cały okres długotrwałego narażenia27. Zasadniczo jest to potencjalne ograniczenie, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania powtarzających się schematów dawkowania, ponieważ może to mieć kluczowe znaczenie dla końcowego, skumulowanego stężenia. Z drugiej strony, narażenie na działanie substancji chemicznych, choć nie jest pozbawione własnych ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę, oferuje bardziej uproszczone podejście, ponieważ substancje chemiczne mają tendencję do pozostawania w roztworze, a zatem bezpośrednia zamiana pierwotnego stężenia chemicznego oprócz nowo dodanego stężenia gwarantuje, że wszelkie substancje chemiczne utracone podczas odświeżania pożywki zostaną odpowiednio zastąpione29. Przyszłe zastosowania obejmowałyby ocenę przydatności modelu do powtarzających się reżimów narażenia w długotrwałych okresach hodowli, ponieważ strategie wielokrotnego dawkowania mają kluczowe znaczenie dla oceny zdolności określonego układu narządów do łagodzenia lub przezwyciężania ewentualnych niekorzystnych skutków wywołanych bioakumulacją substancji ksenobiotycznej.
Podsumowując, ten trójwymiarowy model wątroby in vitro może być wykorzystany do oceny szeregu realistycznych scenariuszy narażenia, zapewniając w ten sposób przyszłe podejście in vitro, które lepiej wspiera zarówno ENM, jak i ocenę zagrożeń chemicznych w rutynowy i łatwo dostępny sposób.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Cell culture analysis; graph of cell viability and bar charts of albumin, urea over time in days." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
to:
<img alt="Cell viability, albumin, and urea levels over 14 days in culture; graphs of cell culture analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥0.06 mg/mL whilst urea production should be ≥0.4 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥50.0 ng/μL whilst urea production should be ≥0.25 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Ze względu na szybki rozwój i implementację różnorodnego zestawu nanomateriałów inżynieryjnych (ENM) w wielu zastosowaniach opartych na ludziach (np. żywność, kosmetyki, odzież, sprzęt sportowy, elektronika, transport i medycyna), nieuniknione jest, że ludzie będą regularnie narażeni na działanie ENM. W związku z tym rosną obawy, że nowatorskie, specyficzne dla wielkości właściwości fizykochemiczne, które sprawiają, że materiały te są korzystne w wielu zastosowaniach, mogą jednocześnie powodować niekorzystne skutki dla zdrowia ludzkiego i środowiska. Obecnie prowadzonych jest wiele międzynarodowych działań mających na celu aktywne odzwierciedlenie bardziej fizjologicznie istotnych ekspozycji na te ENM i ocenę potencjalnej toksyczności tych materiałów w porównaniu z ostrymi, długoterminowymi i powtarzającymi się scenariuszami narażenia na niskie dawki.
Toksykologia wątroby jest kluczowa przy rozważaniu ekspozycji na ENM, ponieważ powszechnie wiadomo, że wątroba jest głównym miejscem akumulacji ENM po ekspozycji1,2. Co więcej, wątroba jest głównym układem narządowym odpowiedzialnym za metabolizm i detoksykację substancji, które wchodzą do krążenia ogólnoustrojowego3. Opierając się na przyjętym zrozumieniu, że modele hepatocytów 2D nie naśladują dokładnie złożoności skomplikowanych interakcji wielokomórkowych ani odpowiednio nie reprezentują aktywności metabolicznej obserwowanej in vivo, położono większy nacisk na opracowanie solidnych i fizjologicznie istotnych modeli wątroby 3D in vitro dla technologii zastępczych in vivo4,5. Wykorzystanie zaawansowanych technologii hodowli 3D poprawia trwałość modeli wątroby in vitro, umożliwiając badanie długoterminowych, powtarzających się reżimów ekspozycji. Dodatkowo, ten zaawansowany format hodowli sprzyja tworzeniu ulepszonych fizjologicznych, organotypowych cech, takich jak kanaliki żółciowe, aktywne procesy transportowe i ulepszone zdolności metabolizowania leków CYP450, poprawiając w ten sposób przewidywalność modeli6. Obecne modele wątroby 3D in vitro składające się z monokultur (tylko hepatocyty) lub kokultur (hepatocyty z komórkami niemiąższowymi) istnieją w kilku formatach, począwszy od mikrotkanek lub sferoid w płytkach o bardzo niskiej przyczepności, sferoid wiszących kropli, komórek osadzonych w matrycach i/lub rusztowaniach oraz mikroprzepływowych platform do hodowli komórek, z których wszystkie są uważane za skuteczne zaawansowane modele in vitro do oceny toksyczności wątrobowej6, 7. Jednak większość tych modeli systemów wymaga dużej konserwacji, wymaga specjalistycznego sprzętu i jest droga. Ponadto modele te są często statyczne (tj. niedzielące się modele komórek), co uniemożliwia ich wykorzystanie w ocenie punktów końcowych zagrożenia, takich jak badania genotoksyczności z wykorzystaniem metod określających ilościowo utrwalone uszkodzenia DNA. Genotoksyczność jest podstawowym warunkiem wstępnym w toksykologii regulacyjnej i jest istotnym elementem oceny ryzyka każdego produktu toksycznego8. Nie ma jednego testu, który można by zastosować do ilościowego określenia wszystkich form uszkodzeń DNA, które mogą powstać po ekspozycji na czynnik egzogenny. Jednak kluczowym elementem zestawu testów genotoksyczności in vitro jest test mikrojądrowy, który jest wiarygodną i wieloaspektową techniką pomiaru poważnych uszkodzeń chromosomów9. Jest to złoty standard techniki opisanej w Wytycznej OECD dotyczącej badań 487, służącej do oceny uszkodzeń DNA i genotoksyczności in vitro i jest częścią wymogu dotyczącego baterii testowej do oceny zagrożeń regulacyjnych10,11.
Linia komórkowa ludzkiego raka wątrobowokomórkowego, HepG2, jest szeroko stosowana do wstępnej oceny ryzyka, ponieważ komórki są łatwo dostępne, stosunkowo tanie w pozyskiwaniu, proste do hodowli i podatne na wysokoprzepustowe badania przesiewowe12,13. Wykazano, że po wyhodowaniu w sferycznych strukturach 3D dobrze podsumowują mikrośrodowisko wątroby i oferują model wątroby o wystarczających zdolnościach proliferacyjnych, aby wesprzeć test mikrojądrowy3. Dalsze prace nad modelami sferoidalnymi HepG2 miały na celu poprawę trwałości i funkcjonalności podobnej do wątroby modelu, aby ułatwić ocenę zagrożenia genotoksycznością w długotrwałych, powtarzających się reżimach narażenia (≤14 dni). W związku z tym, zgodnie z zasadami zasady 3R w celu zastąpienia, ograniczenia i udoskonalenia doświadczeń na zwierzętach, niniejszy protokół został ustanowiony w celu zapewnienia zaawansowanego modelu 3D wątroby in vitro, zdolnego do wiarygodnej oceny wielu toksykologicznych punktów końcowych (np. funkcjonalności wątroby, markerów (pro)zapalnych, cytotoksyczności i genotoksyczności) po ostrym, długotrwałym i powtarzającym się narażeniu na chemikalia i ENM w rutynowy i łatwo dostępny sposób.
Tutaj prezentujemy metodę tworzenia fizjologicznie istotnego systemu modelowego 3D hepatocytów opartego na modelu in vitro do oceny zagrożenia genotoksyczności po ostrych lub długotrwałych, powtarzających się ekspozycjach na ENM. Protokół można podzielić na 6 kluczowych etapów: hodowla kriokonserwowanych komórek HepG2; Preparat sferoidalny HepG2; Przeniesienie sferoidu HepG2 z wiszącej kropli do zawiesiny agarozy; Zbiór sferoidów HepG2; oznaczanie i punktowanie mikrojądrowe; i analiza danych.

<table><tbody><tr><td>Aflotoksyna B1</td><td>Sigma Aldrich, Wielka Brytania</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma Aldrich, Wielka Brytania</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Taśma</td><td></td><td></td><td></td>autoklawu</tr><tr><td>BCG Test albuminy</td><td>Sigma Aldrich, Wielka Brytania</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>Albumina w surowicy bydlęcej</td><td>w proszku Sigma Aldrich, Wielka Brytania</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Środek wspomagający zamrażanie komórek</td><td>Thermo Fisher Naukowy, Wielka Brytania</td><td>5100-0001 - Wirówka Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna B</td><td>Merck, Wielka Brytania</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Cytologia Metalowe klipsy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Cytospin 4</td><td>ThermoFisher Scientific, Wielka Brytania</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z 4,5 g / L D-glukozy, L-glutamina</td><td>GIBCO, Paisley, Wielka Brytania</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, bez czerwieni fenolowej z 4,5 g / L D-glukozy, L-glutamina z Hepes</td><td>GIBCO, Paisley, Wielka Brytania</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe DPX</td><td>FisherScientific, Wielka Brytania</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>FisherScientific, Wielka Brytania</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, Wielka Brytania</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Karty filtracyjne do Shandon Cytospin</td><td>FisherScientific, Wielka Brytania</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka z matowego szkła</td><td>ThermoFisher Scientific, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór R66 do poprawy plam Giemsa, Gurr</td><td>VWR Chemicals, Wielka Brytania</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (24 x 60)</td><td>Deckglaser, VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr i olejek immersyjny do szkiełek nakrywkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop</td><td>Zeiss, Wielka Brytania</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>Laminarny kaptur do hodowli tkanek klasy II</td><td>Scanlaf Mars</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Zeiss, Wielka Brytania</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Metanol z ciekłym azotem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FisherScientific, Wielka Brytania</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niefiltrowane, sterylne 200 i mikro; L oraz 1000&Micro; l Końcówki do pipet</td><td>Greiner-Bio-One, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-dołkowe mikropłytki</td><td>ThermoFisher Scientific, Dania</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety P1000 i P200 Pipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>wielokanałowe P300 i P50</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 1X, MgCl2 i CaCl2 Free</td><td>GIBCO, Paisley, Wielka Brytania</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Długopis/paciorkowiec</td><td>GIBCO, Paisley, Wielka Brytania</td><td>15140-122, Penicylina/Strepmyocyna 100X lub 10 000U/ml</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki buforowe fosfatazy</td><td>GIBCO, Paisley, Wielka Brytania</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Chłopiec</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Lejki do wirówek Shandon Cytospin 4</td><td>FisherScientific, Wielka Brytania</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" - Sonda</td><td>Branson, USA</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych T-25 i T-75</td><td>Greiner-Bio-One, Wielka Brytania</td><td>T-25 (690175) i T-75 (660175)</td><td></td></tr> <tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma Aldrich, Wielka Brytania</td> Zestaw do oznaczania mocznika <td>T8154-100 ml</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich, Wielka Brytania</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Środek dezynfekujący Virkon</td><td>DuPont, Wielka Brytania</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna (37?) C)</td> <td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td></td><td></td><td></td>wagowa</tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, Wielka Brytania</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0,05% trypsyna-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, Wielka Brytania</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml i 1,0 ml Probówki Eppendorf</td><td>Greiner-Bio-One, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 i mikro; m Jednostka filtrująca</td><td>Millex HA, MF-Millipore, Wielka Brytania</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1,0 ml</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, Wielka Brytania</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki ze szkła scyntylacyjnego LS 20 mL, 22-400 Nasadki PP wyłożone folią</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Niemcy</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37? C i 5% CO2 Inkubator z filtrem Hepa klasy ISO 5</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 ml Pipeta Pasteura</td><td>Greiner-Bio-One, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Stożkowe probówki Falcon</td><td>Greiner-Bio-One, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml lub 100 ml Butelki</td><td></td><td></td><td></td>szklane</tr><tr><td>50 ml Rurki Falcon z listwą podłogową</td><td>Greiner-Bio-One, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml, 10 ml i Pipety 25 ml</td><td>Greiner-Bio-One, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9,4 cm kwadratowy, szalka Petriego</td><td>Greiner-Bio-One, Wielka Brytania</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

zaawansowane modele 3d wątroby do badań genotoksyczności in vitro po długotrwałym narażeniu na nanomateriały

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Ze względu na szybki rozwój i implementację różnorodnych nanomateriałów inżynieryjnych (ENM), narażenie na ENM jest nieuniknione, a rozwój solidnych, predykcyjnych systemów testowych in vitro jest niezbędny. Toksykologia wątroby ma kluczowe znaczenie przy rozważaniu narażenia na ENM, ponieważ wątroba odgrywa istotną rolę w homeostazie metabolicznej i detoksykacji, a także jest głównym miejscem akumulacji ENM po ekspozycji. Opierając się na tym i przyjętym zrozumieniu, że modele hepatocytów 2D nie naśladują dokładnie złożoności skomplikowanych interakcji wielokomórkowych i aktywności metabolicznej obserwowanej in vivo, kładzie się większy nacisk na rozwój fizjologicznie istotnych modeli 3D wątroby dostosowanych do celów oceny zagrożeń ENM in vitro. Zgodnie z zasadami zasady 3R w celu zastąpienia, ograniczenia i udoskonalenia eksperymentów na zwierzętach, opracowano model wątroby oparty na linii komórkowej 3D HepG2, który jest przyjaznym dla użytkownika, opłacalnym systemem, który może obsługiwać zarówno przedłużone, jak i powtarzające się reżimy ekspozycji ENM (≤14 dni). Te sferoidalne modele (o średnicy ≥500 μm) zachowują swoją zdolność proliferacyjną (tj. dzielące się modele komórek), co pozwala na ich sprzężenie ze "złotym standardem" testu mikrojądrowego w celu skutecznej oceny genotoksyczności in vitro. Ich zdolność do informowania o szeregu toksykologicznych punktów końcowych (np. czynność wątroby, odpowiedź (pro)zapalna, cytotoksyczność i genotoksyczność) została scharakteryzowana przy użyciu kilku ENM zarówno w reżimie ostrego (24 godziny), jak i długotrwałego (120 godzin). Ten trójwymiarowy model wątroby in vitro może być wykorzystany do oceny bardziej realistycznych ekspozycji na ENM, zapewniając w ten sposób przyszłe podejście in vitro, które lepiej wspiera ocenę zagrożeń ENM w rutynowy i łatwo dostępny sposób.

Przydatność tego opartego na liniach komórkowych 3D modelu sferoidów wątrobowych do długotrwałej hodowli i oceny zagrożeń genotoksycznych została oceniona poprzez przeprowadzenie charakterystyki podstawowej w celu określenia żywotności i funkcji wątrobowych modelu w ciągu 14 dni hodowli, a także jego przydatności do testu mikrojąder.
Charakterystyka bazowa 3D modelu sferoidów wątroby HepG2 
Przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek oceny toksykologicznej in vitro ważne jest sprawdzenie, czy sferoidy 3D HepG2 uformowały się prawidłowo, przed wykonaniem transferu do agarozy lub traktowaniem substancjami chemicznymi/ENM. Sferoidy HepG2 wytworzone metodą wiszącej kropli zazwyczaj potrzebują 2–3 dni od wysiania (4000 komórek/sferoid), aby uformować zwarte sferoidy o kształcie kulistym o średnicy wynoszącej średnio 495,52 µm W x 482,69 µm H, co pokazano na Ryc. 5A-5C. Sferoidy HepG2, które uformowały się prawidłowo i nadają się do oceny toksykologicznej in vitro, muszą mieć zwartą, kulistą strukturę z gładką powierzchnią i bez widocznych wypustek. Rycyna 5 przedstawia przykłady sferoidów wysokiej jakości (Ryc. 5D-F) oraz niskiej jakości (Ryc. 5G-I). Te ostatnie powinny zostać odrzucone. Zazwyczaj 90–95% sferoidów utworzonych na płytce formuje się prawidłowo i nadaje się do dalszych eksperymentów.
<img alt="Proces agregacji komórek, obrazy z mikroskopu, 9 próbek przedstawiających morfologie, badania naukowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Obrazy z mikroskopii świetlnej przedstawiające naturalną morfologię sferoidów HepG2 uformowanych metodą wiszącej kropli. (A-C) przedstawiają sferoidy wątroby HepG2 w 2. dniu, a (D-I) w 4. dniu po wysiewaniu. (D-F) to przykłady wysokiej jakości sferoidów HepG2, natomiast (G-I) przedstawiają sferoidy słabo uformowane. Wszystkie obrazy zostały wykonane za pomocą mikroskopu z obiektywem X20. Pasek skali reprezentuje 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Aby dodatkowo potwierdzić żywotność sferoidów HepG2, można przeprowadzić podstawowy kolorymetryczny test albuminy z użyciem zieleni bromokreolowej (BCG) lub test mocznika w celu oceny ich funkcji przypominających funkcje wątroby. Funkcjonalność wątrobową oceniano równolegle z żywotnością, stosując test wykluczania błękitu trypanu w ciągu 14-dniowego okresu hodowli, aby określić trwałość modelu sferoidów wątrobowych i ustalić, czy może on wspierać długoterminową lub powtarzalną ocenę zagrożeń opartych na ENM/substancjach chemicznych (Rysunek 6). Stężenie albuminy pozostawało stałe przez cały okres hodowli. Produkcja mocznika wykazuje wzrost stężenia mocznika produkowanego przez sferoid w ciągu tygodnia hodowli, osiągając plateau do 7. dnia. Należy zauważyć, że poziomy albuminy i mocznika produkowane w 3D sferoidach HepG2 są znacznie wyższe niż te obserwowane w tej samej linii komórkowej hodowanej w formacie 2D. W przypadku hodowli 2D komórek HepG2 szczytowe poziomy albuminy i mocznika wynosiły odpowiednio 0,001 mg/mL i 0,010 ng/µL. Ponadto, w poprzednich badaniach opublikowanych przez Shah i wsp. z wykorzystaniem niemal identycznego systemu sferoidów HepG2, autorzy wskazali na znaczną poprawę aktywności metabolicznej (CYP1A1 i CYP1A2) w modelach in vitro 3D HepG2 w porównaniu do komórek HepG2 hodowanych w 2D5.
<img alt="Wykresy żywotności komórek i wydajności białek: spadek żywotności (%), poziomy albuminy/mocznika w dniach hodowli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: 14-dniowe bazowe dane charakterystyki sferoidów wątrobowych HepG2. Po przeniesieniu z kropli wiszącej, panel (A) przedstawia żywotność modelu sferoidów HepG2 w okresie 14 dni, natomiast panele (B) i (C) obrazują odpowiednio funkcjonalność wątrobową w zakresie albuminy i mocznika. Przedstawiono wartości średnie ± SEM, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Ze względu na nieunikniony rozwój rdzenia nekrotycznego, będący znanym ograniczeniem hodowli 3D sferoidów wątrobowych, należało ustalić żywotność tego modelu opartego na liniach HepG2, aby wykazać, że jest on w stanie wytrzymać długotrwałe (5–10 dniowe) reżimy ekspozycji, zachowując jednocześnie zdolność do proliferacji niezbędną do przeprowadzenia testu mikronukleusowego5. Rzeczywiście wykazano, że ten model 3D sferoidów wątrobowych zachowuje żywotność &gt;70% przez 10 dni hodowli. Na tej podstawie, a także w połączeniu z utrzymującą się funkcjonalnością typową dla wątroby, obserwowaną w okresie hodowli ≥14 dni, model 3D sferoidów wątrobowych może zatem wspierać długotrwałe, powtarzalne reżimy ekspozycji na ENM trwające do 10 dni (tj. zanim żywotność sferoidów spadnie poniżej 70%). Jako punkt odniesienia zaleca się, aby poziomy albuminy dla sferoidów HepG2 wysianych w zagęszczeniu 4000 komórek/sferoid wynosiły ≥20,0 ng/µL, natomiast produkcja mocznika powinna wynosić ≥0,25 ng/µL przed przeprowadzeniem in vitro oceny toksykologicznej z wykorzystaniem tego modelu.
Ocena genotoksyczności inżynieryjnych nanomateriałów 
Do oceny genotoksyczności wykorzystano test mikrojądrowy w celu określenia obecności mikrojąder po ekspozycjach na ENM zarówno krótkotrwałej (24 h), jak i długotrwałej (120 h). Aflatoksyna B1 jest znanym kancerogenem wątroby16,17 i jest zalecaną kontrolą pozytywną dla testu mikrojądrowego. Eksperymenty optymalizacyjne wykazały, że 0,1 µM Aflatoksyny B1 indukuje istotną pozytywną reakcję genotoksyczną (wzrost ≥2,0-krotny) w 3D sferoidach wątroby HepG2, w związku z czym jest ona stosowana w każdym teście mikrojądrowym przeprowadzonym z wykorzystaniem tego modelu. Aby zapewnić poprawność wyników testu mikrojądrowego z użyciem modelu sferoidów HepG2, tło częstości występowania mikrojąder dla komórek HepG2 stosowanych w tym modelu 3D in vitro powinno mieścić się w zakresie 0,6% – 1,2%. W rezultacie Aflatoksyna B1 powinna indukować reakcję genotoksyczną co najmniej dwukrotnie wyższą niż ta zaobserwowana w kontroli negatywnej; zatem 0,1 µM Aflatoksyny B1 powinna indukować częstość mikrojąder w zakresie 1,5% – 3,0%. Wykorzystując te parametry kontrolne, można następnie wiarygodnie ocenić genotoksyczność in vitro związaną z ENM. Zgodnie z Wytyczną Badawczą OECD 487 należy zauważyć, że podczas testowania ENM lub substancji chemicznej wybrane stężenia nie powinny indukować cytotoksyczności przekraczającej 55% ± 5% (wskazanej przez redukcję wartości CPBI lub RVCC w stosunku do kontroli negatywnej)11. Rycina 7 przedstawia dane uzyskane podczas oceny Aflatoksyny B1 oraz dwóch ENM (dwutlenku tytanu (TiO2) i srebra (Ag)) po ekspozycjach krótkotrwałej i długotrwałej w sferoidach HepG2, a następnie analizy potencjału genotoksycznego za pomocą testu mikrojądrowego. Oba oceniane ENM testowano w nietoksycznej, niskiej dawce 5,00 µg/mL w reżimie ekspozycji krótkotrwałej (24 h) i długotrwałej (120 h). Podobny trend genotoksyczności można zaobserwować dla obu ENM (TiO2 oraz Ag), gdzie podwyższona reakcja genotoksyczna wynikająca z ekspozycji przez 24 h nie była widoczna po długotrwałej ekspozycji trwającej 5 dni. Działo się tak pomimo utrzymującej się genotoksyczności indukowanej przez kontrolę pozytywną Aflatoksyną B1 w obu punktach czasowych.
<img alt="Wykres słupkowy analizujący częstotliwość MN (%) w ekspozycji ostrej i długotrwałej, przedstawiający grupy kontrolne i badawcze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Ocena genotoksyczności po ekspozycji sferoidów wątrobowych HepG2 na TiO2 i Ag ENM. Ocena genotoksyczności (częstotliwość mikron jąder) z wykorzystaniem testu mikron jąder po (A) ostrej (24 godziny) i (B) długotrwałej (120 godzin) ekspozycji na 5.00 µg/mL TiO2 oraz Ag ENM. Kontrolą negatywną jest samo medium, natomiast kontrolą pozytywną jest 0.1 µM aflatoksyny B1. Przedstawiono wartości średnie (n=2) ± SD. Istotność wskazana w odniesieniu do kontroli negatywnej: * = p≤ 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ta procedura została ustanowiona do wykorzystania do rozwoju zaawansowanych hodowli wątroby 3D in vitro, które mogą dostarczyć bardziej fizjologicznie istotną ocenę zagrożeń genotoksycznych związanych z ekspozycją na nanomateriały zarówno w ostrym, jak i długotrwałym, powtarzanym dawce.

Zaawansowane modele 3D wątroby do badań genotoksyczności in vitro po długotrwałym narażeniu na nanomateriały

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Ten model Hep G2 stanowi odpowiedni alternatywny system badań in vitro w celu bardziej wiarygodnej oceny potencjalnej indukcji utrwalonych uszkodzeń DNA po długotrwałym narażeniu na nanomateriał w celu zminimalizowania potrzeby przeprowadzania testów na zwierzętach. Model sferoidalny WZW G2 ma zdolność do pozostawania żywotnym i funkcjonalnym przez okres 14 dni, a także do utrzymywania odpowiedniego poziomu proliferacji. Wspiera to testowanie szeregu punktów końcowych biochemicznych i genotoksyczności, w tym testu mikrojądrowego.Przed wypróbowaniem tego protokołu sugeruję, abyś najpierw wykonał kilka ćwiczeń. Zachowaj ostrożność podczas wysiewu komórek lub zmiany pożywki, ponieważ wymaga to delikatnego podejścia. Zacznij od dodania 100 mikrolitrów sterylnego PBS o temperaturze pokojowej do studzienek 96-dołkowej płytki hodowlanej.Odwróć pokrywkę płytki i ostrożnie odpipetuj 20 mikrolitrów kropli zawiesiny komórek do środka każdego rowka dołka pokrywki. Użyj pipety wielokanałowej, dodając od dwóch do czterech kropli na raz, aby zapewnić dokładność umieszczenia. Wysiewaj tylko cztery sterydy na raz i upewnij się, że końcówki pipet są wyrównane przed rozpoczęciem.Kąt, pod jakim trzymasz wielokanałowość, będzie miał wpływ na sposób, w jaki powstają sferoidy. Upewnij się, że krople są wyśrodkowane w rowkach dołków na pokrywie, a następnie delikatnie odwróć pokrywkę na górze płytki, tak aby krople zwisały nad studzienkami z PBS. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni przed przeniesieniem sferoidu na agarozę.Po inkubacji wyjmij płytkę z inkubatora i ostrożnie zdejmij pokrywę z płytki, wyrzuć PBS, postukaj w płytkę, aby usunąć resztki płynu i pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu przez dwie do trzech minut. Po stopieniu agarozy delikatnie ją zamieszaj, aby usunąć wszelkie pęcherzyki i dodaj 50 mikrolitrów do podstawy każdej studzienki. Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na dwie minuty, a następnie dodaj 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanego DMEM na wierzch stałej warstwy agarozy w każdym dołku.Umieść pokrywkę z tymi sferoidalnymi kropelkami z powrotem na wierzchu płytki, tak aby sferoidy ponownie zwisały, a następnie odwiruj płytkę przez trzy minuty przy 200 razy G, aby przenieść sferoidy do poszczególnych dołków płytki. Inkubuj płytkę przez kolejne 24 godziny, aby sferoidy mogły się uspokoić. Po dyspersji zmodyfikowanych nanomateriałów lub ENM należy je rozcieńczyć do ostatecznego pożądanego stężenia za pomocą wstępnie podgrzanego DMEM.Odessać 50 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki za pomocą sferoid i zastąpić ją 50 mikrolitrami pożywki z ENM. Aby zebrać sferoidy, użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby zassać 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych z tkanką sferoidalną z każdej studzienki, uważając, aby uniknąć kontaktu z agarozą. Zbierz sferoidy w sterylnej 15-mililitrowej probówce wirówkowej.Odwirować zawiesinę sferoidalną o temperaturze 230 razy G przez pięć minut, następnie usunąć supernatant i przechowywać go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Umyj osad sferoidów w jednym mililitrze sterylnego PBS o temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj go w temperaturze 230 razy G przez trzy minuty i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić sferoidy w 500 mikrolitrach 0,05% roztworu trypsyny-EDTA i inkubować je przez sześć do ośmiu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po inkubacji delikatnie pipetować trypsynizowane komórki WZW G2 w górę iw dół, aby całkowicie je zdysocjować i ponownie zawiesić przed neutralizacją jednym mililitrem DMEM. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 230 razy G przez pięć minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach PBS. Aby utworzyć zestaw lejka kuwetowego, umieść przygotowane szkiełko mikroskopowe w metalowym wsporniku, umieść kartę filtracyjną na szkiełku, a następnie zabezpiecz lejek kuwety na górze.Ułóż lejki kuwetowe w cytowirówce z lejkiem skierowanym do góry, tak aby można było bezpośrednio dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego z nich. Następnie przystąp do mocowania szkiełek zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Przygotować 20% roztwór barwiący Giemsa rozcieńczony w buforze fosfatazy.Delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aby go wymieszać, a następnie przefiltruj go złożoną bibułą filtracyjną w lejku. Za pomocą pipety Pasteura dodaj trzy do pięciu kropli przefiltrowanego roztworu Giemsy do cytodoty na każdym szkiełku i pozostaw na osiem do 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyć szkiełka w dwóch kolejnych płukaniach buforem fosfatazy.Następnie krótko spłucz je pod zimną wodą, aby usunąć nadmiar plamy i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Przed jakąkolwiek oceną toksykologiczną in vitro ważne jest, aby sprawdzić, czy sferoidy 3D HepG2 uformowały się prawidłowo. Cztery dni po wysiewie powinny powstać zwarte sferoidy o kulistym kształcie o gładkiej powierzchni i braku wizualnych wypustek.Wykazano tutaj sferoidy dobrej jakości i słabej jakości cztery dni po wysiewie. Zazwyczaj 90 do 95% sferoid utworzonych na płytkę uformuje się prawidłowo i będzie nadawało się do dalszych eksperymentów. Żywotność i funkcjonalność podobną do wątroby oceniano w ciągu 14-dniowego okresu hodowli w celu określenia długowieczności modelu sferoidów wątroby i ustalenia, czy może on wspierać długoterminową ENM lub ocenę zagrożeń opartą na chemikaliach.Stężenie albuminy pozostawało stałe przez cały okres hodowli, podczas gdy produkcja mocznika na sferoidę wzrastała przed rozpoczęciem spadku w 14 dniu. Do oceny genotoksyczności wykorzystano test mikrojądrowy w celu określenia obecności mikrojąder po ostrym i długotrwałym narażeniu na ENM. Sferoidy wystawiono na działanie dwóch ENM, dwutlenku tytanu i srebra.Podobną tendencję do genotoksyczności zaobserwowano po ostrym narażeniu na oba ENM, ale podwyższona odpowiedź genotoksyczna nie była widoczna po długotrwałym, pięciodniowym narażeniu. Zgodnie z tą metodą, zarówno supernatant, jak i sferoidy mogą być zbierane w celu uzyskania wielu biochemicznych punktów końcowych. Należą do nich żywotność komórek, testy czynności wątroby, analiza SID 450, słabe markery stanu zapalnego i ekspresja genów.Technika ta jest obecnie testowana w wielu laboratoriach badawczych na zlecenie, które chcą ją zastosować do rutynowych testów geotoksyczności zarówno chemikaliów, jak i nanomateriałów. Może to przyczynić się do zmniejszenia zależności od metod badań in vivo.

advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) model raka płuc oparty na biologicznym rusztowaniu kolagenowym do badania wrażliwości na terapie ukierunkowane na niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Pokazujemy różne techniki odczytu w celu określenia wskaźnika proliferacji, apoptozy i stanu przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT). Zebrane dane są integrowane z modelem in silico w celu przewidywania wrażliwości leków.

Połączony model tkankowy 3D guza płuca wykonany in vitro/in silico do przewidywania skuteczności leków w określonych tłach mutacyjnych

Opisujemy metodę tworzenia zwierzęcego modelu zwłóknienia wątroby u szczura i oceniamy stopień zwłóknienia poprzez badanie histologiczne wątroby. Model może być wykorzystany do badania rozwoju chorób wątroby, a także do testowania skuteczności potencjalnych środków przeciwzwłóknieniowych.

Model zwłóknienia wątroby wywołanego dimetylonitrozoaminą u szczura

Recellularna macierz zewnątrzkomórkowa zdecelularizowanej wątroby szczura może być używana jako humanizowany, trójwymiarowy model ex vivo do badania dystrybucji i ekspresji transgenu wirusa lub wektora wirusowego.

Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Ten protokół zapewnia prostą i niezawodną metodę produkcji żywotnych, precyzyjnie wyciętych plastrów wątroby od myszy. Próbki tkanek ex vivo mogą być utrzymywane w laboratoryjnych warunkach hodowli tkankowej przez wiele dni, zapewniając elastyczny model do badania patobiologii wątroby.

Precyzyjnie wycięte plastry wątroby jako model biologii wątroby ex vivo

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Mikrotomografia komputerowa z podwójnym odlewem z żywicy, czyli DUCT, umożliwia wizualizację, digitalizację i segmentację dwóch systemów rurowych jednocześnie, co ułatwia analizę 3D architektury organów. DUCT łączy wstrzyknięcie ex vivo dwóch żywic nieprzepuszczających promieni rentgenowskich, a następnie skanowanie mikrotomografii komputerowej i segmentację danych tomograficznych.

DUCT: Podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3D

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Indukowane lekami uszkodzenie wątroby (DILI) jest główną przyczyną niepowodzenia leku. Opracowano protokół umożliwiający dokładne przewidywanie odpowiedzialności związku za DILI za pomocą systemu mikrofizjologicznego wątroby (MPS). Model wątroby wykorzystuje kokulturę pierwotnych komórek wątroby i punktów końcowych istotnych translacyjnie do oceny odpowiedzi komórkowych na leczenie.

Mikrofizjologiczny układ wątroby człowieka do oceny toksyczności wątroby indukowanej lekami in vitro

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Poznaj zaawansowane modele 3D wątroby Hep G2 do badań genotoksyczności nanomateriałów in vitro. Ta metoda pozwala ocenić uszkodzenia DNA przy długotrwałym narażeniu, zmniejszając potrzebę testowania na zwierzętach.

Zaawansowane modele 3D wątroby do badań genotoksyczności in vitro po długotrwałym narażeniu na nanomateriały

Przeglądaj więcej filmów