Zaawansowane modele 3D wątroby do badań genotoksyczności in vitro po długotrwałym narażeniu na nanomateriały

Ta procedura została ustanowiona do wykorzystania do rozwoju zaawansowanych hodowli wątroby 3D in vitro, które mogą dostarczyć bardziej fizjologicznie istotną ocenę zagrożeń genotoksycznych związanych z ekspozycją na nanomateriały zarówno w ostrym, jak i długotrwałym, powtarzanym dawce.

Ten model Hep G2 stanowi odpowiedni alternatywny system badań in vitro w celu bardziej wiarygodnej oceny potencjalnej indukcji utrwalonych uszkodzeń DNA po długotrwałym narażeniu na nanomateriał w celu zminimalizowania potrzeby przeprowadzania testów na zwierzętach. Model sferoidalny WZW G2 ma zdolność do pozostawania żywotnym i funkcjonalnym przez okres 14 dni, a także do utrzymywania odpowiedniego poziomu proliferacji. Wspiera to testowanie szeregu punktów końcowych biochemicznych i genotoksyczności, w tym testu mikrojądrowego.

Przed wypróbowaniem tego protokołu sugeruję, abyś najpierw wykonał kilka ćwiczeń. Zachowaj ostrożność podczas wysiewu komórek lub zmiany pożywki, ponieważ wymaga to delikatnego podejścia. Zacznij od dodania 100 mikrolitrów sterylnego PBS o temperaturze pokojowej do studzienek 96-dołkowej płytki hodowlanej.

Odwróć pokrywkę płytki i ostrożnie odpipetuj 20 mikrolitrów kropli zawiesiny komórek do środka każdego rowka dołka pokrywki. Użyj pipety wielokanałowej, dodając od dwóch do czterech kropli na raz, aby zapewnić dokładność umieszczenia. Wysiewaj tylko cztery sterydy na raz i upewnij się, że końcówki pipet są wyrównane przed rozpoczęciem.

Kąt, pod jakim trzymasz wielokanałowość, będzie miał wpływ na sposób, w jaki powstają sferoidy. Upewnij się, że krople są wyśrodkowane w rowkach dołków na pokrywie, a następnie delikatnie odwróć pokrywkę na górze płytki, tak aby krople zwisały nad studzienkami z PBS. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni przed przeniesieniem sferoidu na agarozę.

Po inkubacji wyjmij płytkę z inkubatora i ostrożnie zdejmij pokrywę z płytki, wyrzuć PBS, postukaj w płytkę, aby usunąć resztki płynu i pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu przez dwie do trzech minut. Po stopieniu agarozy delikatnie ją zamieszaj, aby usunąć wszelkie pęcherzyki i dodaj 50 mikrolitrów do podstawy każdej studzienki. Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na dwie minuty, a następnie dodaj 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanego DMEM na wierzch stałej warstwy agarozy w każdym dołku.

Umieść pokrywkę z tymi sferoidalnymi kropelkami z powrotem na wierzchu płytki, tak aby sferoidy ponownie zwisały, a następnie odwiruj płytkę przez trzy minuty przy 200 razy G, aby przenieść sferoidy do poszczególnych dołków płytki. Inkubuj płytkę przez kolejne 24 godziny, aby sferoidy mogły się uspokoić. Po dyspersji zmodyfikowanych nanomateriałów lub ENM należy je rozcieńczyć do ostatecznego pożądanego stężenia za pomocą wstępnie podgrzanego DMEM.

Odessać 50 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki za pomocą sferoid i zastąpić ją 50 mikrolitrami pożywki z ENM. Aby zebrać sferoidy, użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby zassać 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych z tkanką sferoidalną z każdej studzienki, uważając, aby uniknąć kontaktu z agarozą. Zbierz sferoidy w sterylnej 15-mililitrowej probówce wirówkowej.

Odwirować zawiesinę sferoidalną o temperaturze 230 razy G przez pięć minut, następnie usunąć supernatant i przechowywać go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Umyj osad sferoidów w jednym mililitrze sterylnego PBS o temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj go w temperaturze 230 razy G przez trzy minuty i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić sferoidy w 500 mikrolitrach 0,05% roztworu trypsyny-EDTA i inkubować je przez sześć do ośmiu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po inkubacji delikatnie pipetować trypsynizowane komórki WZW G2 w górę iw dół, aby całkowicie je zdysocjować i ponownie zawiesić przed neutralizacją jednym mililitrem DMEM. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 230 razy G przez pięć minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach PBS. Aby utworzyć zestaw lejka kuwetowego, umieść przygotowane szkiełko mikroskopowe w metalowym wsporniku, umieść kartę filtracyjną na szkiełku, a następnie zabezpiecz lejek kuwety na górze.

Ułóż lejki kuwetowe w cytowirówce z lejkiem skierowanym do góry, tak aby można było bezpośrednio dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego z nich. Następnie przystąp do mocowania szkiełek zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Przygotować 20% roztwór barwiący Giemsa rozcieńczony w buforze fosfatazy.

Delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aby go wymieszać, a następnie przefiltruj go złożoną bibułą filtracyjną w lejku. Za pomocą pipety Pasteura dodaj trzy do pięciu kropli przefiltrowanego roztworu Giemsy do cytodoty na każdym szkiełku i pozostaw na osiem do 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyć szkiełka w dwóch kolejnych płukaniach buforem fosfatazy.

Następnie krótko spłucz je pod zimną wodą, aby usunąć nadmiar plamy i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Przed jakąkolwiek oceną toksykologiczną in vitro ważne jest, aby sprawdzić, czy sferoidy 3D HepG2 uformowały się prawidłowo. Cztery dni po wysiewie powinny powstać zwarte sferoidy o kulistym kształcie o gładkiej powierzchni i braku wizualnych wypustek.

Wykazano tutaj sferoidy dobrej jakości i słabej jakości cztery dni po wysiewie. Zazwyczaj 90 do 95% sferoid utworzonych na płytkę uformuje się prawidłowo i będzie nadawało się do dalszych eksperymentów. Żywotność i funkcjonalność podobną do wątroby oceniano w ciągu 14-dniowego okresu hodowli w celu określenia długowieczności modelu sferoidów wątroby i ustalenia, czy może on wspierać długoterminową ENM lub ocenę zagrożeń opartą na chemikaliach.

Stężenie albuminy pozostawało stałe przez cały okres hodowli, podczas gdy produkcja mocznika na sferoidę wzrastała przed rozpoczęciem spadku w 14 dniu. Do oceny genotoksyczności wykorzystano test mikrojądrowy w celu określenia obecności mikrojąder po ostrym i długotrwałym narażeniu na ENM. Sferoidy wystawiono na działanie dwóch ENM, dwutlenku tytanu i srebra.

Podobną tendencję do genotoksyczności zaobserwowano po ostrym narażeniu na oba ENM, ale podwyższona odpowiedź genotoksyczna nie była widoczna po długotrwałym, pięciodniowym narażeniu. Zgodnie z tą metodą, zarówno supernatant, jak i sferoidy mogą być zbierane w celu uzyskania wielu biochemicznych punktów końcowych. Należą do nich żywotność komórek, testy czynności wątroby, analiza SID 450, słabe markery stanu zapalnego i ekspresja genów.

Technika ta jest obecnie testowana w wielu laboratoriach badawczych na zlecenie, które chcą ją zastosować do rutynowych testów geotoksyczności zarówno chemikaliów, jak i nanomateriałów. Może to przyczynić się do zmniejszenia zależności od metod badań in vivo.