Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Protokół ten dotyczy dwóch ważnych aspektów: charakterystyki niezbędnej integralnej błony, acylotransferazy apolipoproteinowej bakterii oraz opracowania testu w formacie HDS do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów enzymu. Metoda jest bardzo czuła i nadaje się do celów przesiewowych. Może przyczynić się do opracowania potencjalnych nowych antybiotyków.

Ten film pomoże podkreślić kluczowe etapy tego protokołu, takie jak mieszanie, wirowanie, sonikacja, podczas pracy z niejednorodnymi zawiesinami zawierającymi lipidy i detergenty. Procedurę zademonstrują Karine Nozeret, Aurelia Pernin, obie są koleżankami w mojej grupie. Rozpocznij od przygotowania mieszaniny odczynników do testu apolipoproteiny i acylotransferazy lub LNT.

Wymieszaj alkin, POPE i FSL-1-biotynę z buforem reakcyjnym LNT w 1,5 mililitrowych probówkach o końcowej objętości 18 mikrolitrów. Przygotować trzykrotne mieszaniny odczynników dla wszystkich badanych warunków. Sonikować mieszaniny odczynników przez trzy minuty w ultradźwiękowej łaźni wodnej i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie dodaj aktywny lub nieaktywny LNT do końcowego stężenia jednego nanograma na mikrolitr i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Inkubować reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin w mieszalniku termicznym z podgrzewaną pokrywką. W międzyczasie przygotuj roztwór podstawowy dwóch miligramów na mililitr streptawidyny.

I rozcieńczyć go do 10 mikrogramów na mililitr, aby uzyskać działający roztwór. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Następnie wysusz studzienki na powietrzu przez noc, inkubując płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez pokrywki.

Następnego dnia przygotuj roztwory podstawowe pięciu milimolowych Azido-FAM, 50 milimolowych TCEP, dwóch milimolowych TBTA i 50-milimolowych pięciowodnych siarczanów miedzi. Wykonaj chemię kliknięć, dodając 0,2 mikrolitra zapasowego Azido-FAM, 0,4 mikrolitra standardowego TCEP i 0,2 mikrolitra podstawowego TBTA do 1,5 mililitra probówek reakcyjnych LNT. Wiruj roztwór przez pięć sekund.

Następnie dodaj 0,4 mikrolitra wywaru siarczanowego miedzi. Wiruj przez kolejne pięć sekund i inkubuj reakcję przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Podczas inkubacji mieszaniny chemicznej typu click, umyj dołki płytek pokrytych streptawidyną trzykrotnie 200 mikrolitrami PBST1.

Przenieś 18 mikrolitrów mieszaniny chemicznej do studzienki pokrytej streptawidyną i dodaj 100 mikrolitrów PBST1, aby związać produkt FAM N-acylo-FSL-1-biotyny z płytką. Dodać biotynę, fluoresceinę, do płytki jako pozytywną kontrolę wiązania streptawidyny i odczytu fluorescencji. Następnie inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę w ciemności, wstrząsając z prędkością 300 obr./min.

Po inkubacji za pomocą wielokanałowej pipety elektronicznej ręcznie umyć płytkę sześciokrotnie 200 mikrolitrami PBST2. Przepłucz go trzykrotnie pipetą. Umyj go trzy razy 200 mikrolitrami PBS i przepłucz jeszcze trzy razy.

Dodaj 200 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i wykryj fluorescencję przy 520 nanometrach w czytniku mikropłytek. Zapisz wszystkie wyniki w arkuszu kalkulacyjnym, a następnie oblicz odchylenie standardowe dla każdej reakcji, a także wartości P dla kontroli ujemnych i próbek dodatnich za pomocą niesparowanego testu T. Opisany tutaj test LNT in vitro wykorzystuje fosfolipidy zawierające alkinowy kwas tłuszczowy i FSL-1-biotynę jako substraty do wytworzenia alkiny FSL-1-biotyny.

Po reakcji chemicznej z Azido-FAM, produkt ten staje się znakowany fluorescencyjnie i wykrywalny przez spektrometrię fluorescencyjną. Warunki reakcji zoptymalizowano pod kątem maksymalnego odczytu fluorescencji przy 520 nanometrach. Kontrole ujemne obejmowały reakcje bez enzymu, z nieaktywnym wariantem enzymu lub z inhibitorem specyficznym dla tiolu, MTSES.

Biotyna fluoresceina została użyta jako wewnętrzna kontrola maksymalnego sygnału fluorescencji. W celu opracowania wysokoprzepustowego testu przesiewowego, reakcje przeprowadzono bezpośrednio na 384 płytkach dołkowych. Etapy mycia zostały zautomatyzowane, a ilość odczynników została zmniejszona.

Reakcja była czuła i powtarzalna, ze znaczną różnicą w sygnale fluorescencyjnym między kontrolą ujemną a enzymem aktywnym. W przypadku wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynnik pierwszy Z określa, czy odpowiedź w teście jest wystarczająco duża, aby można było przeprowadzić badania przesiewowe. Średni czynnik pierwszy Z był większy niż 0,6 dla testu LNT wykonanego w formacie 384 dołków, co sugeruje, że był on znakomity.

Test probówkowy w tym filmie został opracowany w formacie wielopłytkowym, który jest kompatybilny z HDS. Może być stosowany do badania innych acyltransferaz z różnych organizmów.