Name: Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj fluorometryczny test click-chemistry do badania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie inhibitorów enzymu i odkrywanie nowych antybiotyków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Fabrice'owi Agou i Alix Boucharlat z Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) w Instytucie Pasteura w Paryżu za pomocne sugestie dotyczące protokołu, wszystkim członkom BGPB Unit za wsparcie i dyskusje naukowe, oraz Simonowi Legoodowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace zostały sfinansowane przez Globalne Inicjatywy Opiekuńcze Instytutu Chorób Zakaźnych Carnota oraz Instytutu Carnot, Mikrobów i Zdrowia (15 CARN 0017-01 i 16 CARN 0023-01).

1. Przygotowanie enzymów i substratów
<ol>
	<li>Oczyszczanie enzymu
	<ol>
		<li>Wyprodukuj i oczyść enzym Lnt z membran rozpuszczonych w detergentach, jak opisano wcześniej4,8. Krótko mówiąc, indukuj ekspresję genu lnt-strep, kodując Lnt z C-końcowym znacznikiem paciorkowca, przy OD600 0,6 za pomocą bezwodnej tetracykliny (200 ng / ml) w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
		<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w buforze WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) do 100 OD600 jednostek na ml.</li>
		<li>Rozbij komórki dwoma przejściami przez francuską prasę ciśnieniową pod ciśnieniem 10 000 psi.</li>
		<li>Usunąć nieuszkodzone komórki i zanieczyszczenia przez odwirowanie przy 13 000 x g przez 20 min. Zachować supernatant i wyrzucić osad.</li>
		<li>Odwirować supernatant o stężeniu 120 000 x g przez 60 minut i zebrać pęcherzyki błonowe (półprzezroczyste brązowe osadki). Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Rozpuścić integralne białka błonowe z osadu błonowego z 1% (w/v) n-dodecylu β-D-maltozydu (DDM) w buforze WA przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odwirować i usunąć nierozpuszczalny materiał w ilości 120 000 x g przez 30 minut. Do oczyszczania należy użyć frakcji supernatantu.</li>
		<li>Oczyść Lnt-strep na kolumnie chromatograficznej o powinowactwie (patrz Tabela materiałów) i kolumnie do filtracji żelu S400 (patrz Tabela materiałów) zgodnie z opisem Nozeret et al.8.</li>
		<li>Oczyszczony enzym należy przechowywać w buforze WA zawierającym 0,05% DDM i 10% glicerolu w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Enzym jest stabilny przez ponad 5 lat.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymywanie alkinofosfolipidów i biotynylowanych substratów ligandów stymulujących fibroblasty (FSL-1-biotyna)
	<ol>
		<li>Podwielokrotność 100 μl specjalnie syntetyzowanego alkinu-POPE (1-heksadek-15-ynoylo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy, patrz tabela materiałów) rozpuszczonego w chloroformie do probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Przekłuć probówki strzykawką i odparować chloroform w temperaturze obrotowej w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Przechowywać suche próbki fosfolipidów w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przed użyciem rozpuścić alkino-POPE w 0,1% Triton X-100 w temperaturze 500 μM. Dodaj 3-minutowy etap sonikacji w ultradźwiękowej łaźni wodnej w temperaturze pokojowej, aby w razie potrzeby rozpuścić alkino-POPE.</li>
		<li>Zawiesić FSL-1-biotynę w wodzie o stężeniu 445 μM. 
		UWAGA: Oba roztwory można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 miesiące.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test probówkowy
UWAGA: W dniu 1 ustaw reakcję Lnt w probówkach o pojemności 1,5 ml (krok 2.1) i pokryj 96-dołkowe płytki streptawidyną (krok 2.2).
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszaniny odczynników i reakcja enzymatyczna
	<ol>
		<li>W przypadku standardowego testu Lnt należy zmieszać alkino-POPE (końcowe 50 μM z 500 μM zapasu) i FSL-1-biotynę (końcowe stężenie 50 μM z 445 μM zapasu) w buforze reakcyjnym Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 zawierający 1% BSA) w końcowej objętości 18 μL w probówkach 1,5 ml. Wykonaj wszystkie warunki w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>Sonikować mieszaninę substratów (przygotowaną w kroku 2.1.1) przez 3 minuty w ultradźwiękowej łaźni wodnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut przed dodaniem enzymu Lnt (etap 2.1.3). 
		UWAGA: MTSES ((2-sulfoniatoetylo)metanetiosiulfonian sodu), odczynnik specyficzny dla tiolu, hamuje Lnt8. Dodać 10 mM MTSES (100 mM roztwór podstawowy w 100% DMSO) do probówek reakcyjnych (krok 2.1.1), które mają być użyte jako ujemne próbki kontrolne. Dostosuj objętość buforu reakcyjnego Lnt tak, aby całkowita objętość wynosiła 18 μl.</li>
		<li>Dodać aktywny (1 ng/μl, co odpowiada 17,2 nM) lub nieaktywny Lnt (C387S) (2 μl z 10 ng/μL zapasu w buforze WA zawierającym 0,05% DDM) i wymieszać z substratami (krok 2.1.2), pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 16 godzin w termomikserze z podgrzewaną pokrywą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powłoka streptawidyny na 96-dołkowych płytkach
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy streptawidyny w stężeniu 2 mg/ml w H2O. 
		UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy.</li>
		<li>Z roztworu podstawowego przygotować 10 μg/ml streptawidyny w wodzie jako roztwór roboczy. Dodać 100 μl roztworu do każdego dołka na płytce 96-dołkowej. Związać streptawidynę z płytką przez inkubację w temperaturze 37 °C przez noc bez pokrywki, aby wysuszyć studzienki na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
UWAGA: W dniu 2 wykonaj chemię kliknięć (krok 2.3), zwiąż mieszaninę reakcyjną Lnt z płytkami pokrytymi streptawidyną (krok 2.4), a następnie wykryj fluorescencję i przeanalizuj wyniki (krok 2.5).
<ol start="3">
	<li>Reakcja chemiczna kliknięcia
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe Azido-FAM (5 mM w DMSO), TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny; 50 mM przygotowany w wodzie), TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metylo]amina; 2 mM w tert-butanolu:DMSO (4:1)) i CuSO4∙5H2O (50 mM świeżo przygotowany w H2O).</li>
		<li>W probówkach o pojemności 1,5 ml zawierających mieszaninę reakcyjną Lnt przygotowaną w kroku 2.1.4 należy przeprowadzić chemię typu click, dodając odczynniki w następującej kolejności: 0,2 μl podstawowego Azido-FAM (stężenie końcowe 50 μM), 0,4 μl podstawowego TCEP (stężenie końcowe 1 mM), 0,2 μl podstawowego TBTA (stężenie końcowe 0,02 mM).</li>
		<li>Wiruj roztwór przez 5 sekund. Następnie dodać 0,4 μl bulionu CuSO4 (stężenie końcowe 1 mM). Wiruj ponownie przez 5 s. Próbki należy inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiązanie mieszaniny reakcyjnej Lnt z płytkami pokrytymi streptawidyną
	<ol>
		<li>Po całonocnej inkubacji z etapu 2.2.2 przemyć studzienki płytek pokrytych streptawidyną 3x 200 μl PBS-T1 (PBS zawierający 0,05% Tween-20). 
		UWAGA: Płytki ze streptawidyną można zużyć natychmiast lub przechowywać w suchym miejscu w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść 18 μl z mieszaniny chemicznej z etapu 2.3.3 do studzienki na 96-dołkowej płytce pokrytej streptawidyną i dodać 100 μl PBS-T1 w celu związania produktu N-acyl-FSL-1-biotyny-FAM z płytkami streptawidyny.</li>
		<li>Użyj biotyny-fluoresceiny (0,26 μM z 3,1 mM zapasu w DMSO) jako kontroli pozytywnej dla wiązania streptawidyny i odczytu fluorescencji.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności w termomikserze, wstrząsając z prędkością 300 obr./min.</li>
		<li>Wykonać ręczne płukanie 96-dołkowych płytek za pomocą wielokanałowej pipety elektronicznej w następujący sposób: sześć płukań 200 μL PBS-T2 (PBS zawierający 1% Tween-20), trzy płukania pipetą, trzy płukania 200 μL PBS, trzy płukania pipetą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja i analiza fluorescencji
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl PBS i zarejestrować fluorescencję przy długości fali 520 nm w czytniku mikropłytek fluorescencyjnych. Zapisz wyniki w oprogramowaniu do arkuszy kalkulacyjnych. 
		UWAGA: Biotyna-fluoresceina jest stosowana jako kontrola pozytywna do wiązania streptawidyny i wykrywania fluorescencji przy 520 nm. Oczekuje się powtarzalnego odczytu 30 000–40 000 j.a. z 0,26 μM biotyny-fluoresceiny. Wszystkie próbki są analizowane w trzech egzemplarzach, łącznie z próbkami kontrolnymi.</li>
		<li>Obliczyć odchylenie standardowe dla każdej reakcji i obliczyć wartości P dla kontroli ujemnych i próbek dodatnich przy użyciu niesparowanego testu t przy użyciu oprogramowania statystycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test płytkowy wielodołkowy
UWAGA: W dniu 1 ustaw reakcję Lnt na płytkach 384 dołkowych (krok 3.1) i pokryj płytki 384 dołków streptawidyną (krok 3.2).
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszaniny odczynników i reakcja enzymatyczna 
	UWAGA: Ilość odczynników i enzymu jest zmniejszona w porównaniu z testem probówkowym, a reakcja Lnt jest przeprowadzana bezpośrednio w płytkach 384-dołkowych. Pozwala to na użycie mniejszej ilości materiału i zmniejszenie liczby kroków, które można jeszcze bardziej zautomatyzować.
	<ol>
		<li>Wymieszać substraty w następujący sposób: alkine-POPE (końcowe stężenie 50 μM z 500 μM zapasu) i FSL-1-biotyna (końcowe 50 μM z 500 μM zapasu) w buforze reakcyjnym Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 zawierający 1% BSA) w objętości 13,5 μl na reakcję na dołek w formacie płytki 384-dołkowej. Wykonaj wszystkie warunki w trzech egzemplarzach. Obliczyć całkowitą ilość odczynników wymaganych do przeprowadzenia liczby reakcji (tj. 5,184 μl na jedną płytkę 384-dołkową).</li>
		<li>Sonikować mieszaninę substratów przez 3 minuty w ultradźwiękowej łaźni wodnej.</li>
		<li>Podwielokrotność 13,5 μl mieszaniny substratów na studzienkę w płytce 384-dołkowej. 
		UWAGA: Jako kontrolę ujemną można dodać 10 mM MTSES (625 mM roztworu podstawowego w 100% DMSO) do studzienki. Dostosuj objętość buforu Lnt (krok 3.1.1), aby osiągnąć końcową objętość reakcji 13,5 μl.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut przed dodaniem enzymu Lnt (etap 3.1.5).</li>
		<li>Dodać 0,5 ng/μL (co odpowiada 8,6 nM) aktywnego enzymu Lnt lub nieaktywnego wariantu (C387S) (1,5 μl z 5 ng/μL zapasu w buforze WA zawierającym 0,05% DDM) do buforu reakcyjnego Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) do każdej studzienki zawierającej mieszaninę reakcyjną z kroku 3.1.3. Mieszać odczynniki, pipetując w górę i w dół. Całkowita objętość reakcji wynosi 15 μl.</li>
		<li>Uszczelnij płytkę folią z tworzywa sztucznego w przypadku płytek wielodołkowych.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin w termomikserze z podgrzewaną pokrywą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Streptawidyna powlekająca płytki 384-dołkowe
	<ol>
		<li>Użyj 75 μl streptawidyny (10 μg/ml w H2O) z kroku 2.2.2 do pokrycia studzienek płytki 384-dołkowej. Pozostawić streptawidynę do związania się z płytką przez inkubację w temperaturze 37 °C przez noc bez pokrywki, aby wysuszyć studzienki na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
UWAGA: W dniu 2 wykonaj chemię kliknięć (krok 3.3), zwiąż mieszaninę reakcyjną Lnt z płytkami pokrytymi streptawidyną (krok 3.4), wykryj fluorescencję i przeanalizuj wyniki (krok 3.5).
<ol start="3">
	<li>Reakcja chemiczna kliknięcia
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe Azido-FAM (1,2 mM w DMSO), TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny; 24 mM przygotowany wH2O), TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]amina; 0,48 mM w tert-butanolu:DMSO (4:1)) i CuSO4∙5H2O(24 mM świeżo przygotowany wH2O).</li>
		<li>Połącz trzy odczynniki do chemii metodą click: mieszaninę Azido-FAM (stężenie końcowe 50 μM), TCEP (1 mM wersja końcowa) i TBTA (0,02 mM wersja końcowa), każdy w ilości 0,75 μl w końcowej objętości 2,25 μl na studzienkę. Obliczyć wymaganą objętość na płytkę 384-dołkową (tj. użyć 864 μl, gdy używane są wszystkie studzienki płytki 384-dołkowej). Mieszaj energicznie.</li>
		<li>Dodać 2,25 μl roztworu odczynnika na basenik bezpośrednio do zakończonej reakcji Lnt na płytce 384-dołkowej z kroku 3.1.7.</li>
		<li>Mieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą wielokanałowej pipety elektronicznej.</li>
		<li>Dodać CuSO4 (0,75 μl z 24 mM zapasu, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM) i mieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą wielokanałowej pipety elektronicznej.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiązanie mieszaniny reakcyjnej Lnt z płytkami 384-dołkowymi pokrytymi streptawidyną
	<ol>
		<li>Po całonocnej inkubacji przemyć dołki płytek pokrytych streptawidyną z kroku 3.2.1 1x 85 μl PBS-T1.</li>
		<li>Przenieść 11 μl reakcji chemicznej typu click-chemistry z każdego dołka płytki inkubacyjnej z etapu 3.3.6 na płytkę pokrytą streptawidyną z etapu 3.4.1 w celu związania produktu N-acylo-FSL-1-biotyny-FAM z płytkami streptawidyny.</li>
		<li>Dodać 64 μl buforu PBS-T1.</li>
		<li>Włączyć biotynę-fluoresceinę (0,19 μM z 3,1 mM zapasów w DMSO) jako kontrolę wiązania ze studzienkami pokrytymi streptawidyną.</li>
		<li>Inkubować 384 płytki dołkowe w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności w termomikserze, wstrząsając z prędkością 300 obr./min.</li>
		<li>Umyj płytki za pomocą automatycznej myjki do płyt w następujący sposób: 10 prań z 85 μl PBS-T2, płytki są wstrząsane między praniami; 5 prań z 85 μl PBS, płytki są wstrząsane między praniami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja i analiza fluorescencji
	<ol>
		<li>Dodać PBS (85 μl) i zarejestrować fluorescencję w czytniku mikropłytek fluorescencyjnych przy długości fali 535 nm.</li>
		<li>Przeanalizuj dane zgodnie z opisem (krok 2.5.2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how%2C+when+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li>
<li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li>
<li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li>
<li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li>
<li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li>
<li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147(2017).</li>
<li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+%28Lnt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978(2019).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecules+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198(2016).</li>
<li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li>
<li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952(2017).</li>
<li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół testu Lnt, oparty na wykrywaniu fluorescencji produktu triacylowanego, jest czuły i powtarzalny. Specyficzne i skuteczne wiązanie biotyny ze streptawidyną jest kluczowym elementem testu. Substrat Alkine-POPE pozostały po zakończeniu reakcji Lnt jest również znakowany fluorescencyjnie FAM, ale jest skutecznie usuwany po związaniu z płytkami streptawidyny przez wiele etapów mycia. Ponadto dodanie DMSO nie wpływa na aktywność Lnt i nie ma wpływu na test. Zarówno substrat, jak i enzym są wysoce lipofil...

Lipoproteiny bakteryjne charakteryzują się kowalencyjnie związanymi kwasami tłuszczowymi na ich końcach aminowych, przez które są zakotwiczone w błonach1,2. Dojrzała część białka jest bardzo zróżnicowana pod względem budowy i funkcji, co wyjaśnia rolę lipoprotein w różnych procesach biologicznych w otoczce komórki bakteryjnej.
Lipoproteiny są modyfikowane przez kwasy tłuszczowe pochodzące z fosfolipidów po wprowadzeniu do błony cytoplazmatycznej. Prolipoproteiny zawierają charakterystyczny motyw, lipobox, który zawiera niezmienną resztę cysteiny, która ulega acylacji i jest pierwszym aminokwasem w dojrzałym białku. Pierwszy etap tego szlaku jest katalizowany przez prolipoproteinę fosfatydyloglicerol::d transferazę iacyloglicerylu (Lgt), która przenosi grupę diacyloglicerynową z fosfatydyloglicerolu na prolipoproteinę za pośrednictwem wiązania tioeterowego między diacyloglicerolem a cysteiną. Peptydaza sygnałowa II (Lsp) rozszczepia peptyd sygnałowy od prolipoproteiny diacyloglicerylu, w wyniku czego powstaje apolipoproteina, która jest zakotwiczona w błonie poprzez ugrupowanie diacyloglicerolu. Trzeci i ostatni etap jest katalizowany przez N-acylotransferazę apolipoproteiny (Lnt), która dodaje kwas tłuszczowy z pozycji sn-1 fosfolipidu do apolipoproteiny, w wyniku czego powstaje triacylozacyjna dojrzała lipoproteina (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) 3. Reakcja Lnt to dwuetapowa reakcja pingpongowa, w której powstaje stabilny półprodukt tioestrowego enzymu acylowego. Produkt uboczny lizofosfolipidów jest uwalniany przed acylacją substratu apolipoproteiny w drugim etapie reakcji.
Specyficzność substratu fosfolipidowego jest określana w teście Lnt na podstawie przesunięcia ruchliwości peptydu N-acyl-diacyloglicerylu na wysokim procencie mocznika tris-tricine SDS-PAGE4. Preferowanymi substratami były fosfolipidy z małymi polarnymi grupami głowy, nasycone [sn-1] i nienasycone [sn-2], 4. Test przesunięcia żelu nie jest odpowiedni do rozległych badań kinetycznych N-acylotransferazy apolipoproteiny ani do HTS do identyfikacji cząsteczek hamujących. Click-chemistry z wykorzystaniem alkinowych kwasów tłuszczowych została z powodzeniem wykorzystana do badania modyfikacji lipoprotein u bakterii5 oraz metabolizmu kwasów tłuszczowych u eukariontów6. Niedawno doniesiono, że test in vitro palmitoilacji Ras ma na celu zidentyfikowanie inhibitorów7.
W opisanej tutaj metodzie, oczyszczony aktywny Lnt w detergentach jest inkubowany z substratami w mieszanych micelach, tworząc peptyd triacylowany alkinem, który jest następnie wykrywany przez spektrometrię fluorescencyjną.

<table><tbody><tr><td>&Auml; kta Purifier System FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>NA</td><td>Czystość: NA Lnt oczyszczanie</td></tr><tr><td>alkinowo-POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>900414P</td><td>Czystość: >99% Lnt Podłoże</td></tr><tr><td>Azido-FAM</td><td>Lumiprobe</td><td>A4130</td><td>Czystość: 100% (czysta) Odczynnik Click</td></tr><tr><td>BioPhotometer Plus</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Czystość: NA OD 600 nm</td></tr><tr><td>BioTek ELX 405 Wybierz podkładkę do płyt</td><td>BioTek</td><td>N&deg; seria 115800, n&deg; materiel 405 Select</td><td>Czystość: NA Etapy mycia</td></tr><tr><td>biotyna-fluoresceina</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td>Czystość: &ge; 90% Kontrola fluorescencji</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II) pentahydrat</td><td>Sigma</td><td>C3036</td><td>Czystość: &ge; 98% Odczynnik Click</td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td>Czystość: &ge; 99% &beta;+&alpha;; < 15% &alpha; Detergent do oczyszczania Lnt</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>D12435</td><td>Czystość: bezwodny Odczynnik do solbilizacji Kliknij</td></tr><tr><td>Pipeta elektroniczna Voyager 8 kanałów 0,5-12,5 uL</td><td>INTEGRA</td><td>4721</td><td>Czystość: NA Postępowanie z odczynnikami</td></tr><tr><td>Francuska komórka ciśnieniowa</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>Czystość: NA Rozbijanie komórek</td></tr><tr><td>FSL-1-biotyna</td><td>Mikrokolekcje EMC</td><td>L7030</td><td>Czystość: NA Podłoże Lnt</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR mikropłytka polistyrenowa</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>Czystość: NA z przezroczystym dnem (odczyt górny lub dolny)</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 96-dołkowa sterylna płytka polistyrenowa, wysoka wiązanie</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>Czystość: NA z przezroczystym dnem (odczyt górny lub dolny)</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Czystość: NA Detekcja fluorescencji</td></tr><tr><td>MTSES (2-sulfonianoetylo)metanoethiosulfonian sodu)</td> <td>Anatrace</td><td>S110MT</td><td>Czystość: ~100% Inhibitor specyficzny dla tiolu</td></tr><tr><td>Optycznie przezroczyste arkusze uszczelniające z kleju</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td>Czystość: NA Folia do uszczelniania płytki wielodołkowej</td></tr><tr><td>Sephacryl S400 HR 16/60 żel kolumna filtracyjna</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9356-04</td><td>Czystość: NA Oczyszczanie Lnt</td></tr><tr><td>StrepTactin Sepharose 50</td>% <td>IBA Biotechnology</td><td>2-1201-010</td><td>Czystość: NA Lnt oczyszczanie</td></tr><tr><td>streptawidyna</td><td>Sigma</td><td>S4762-1MG</td><td>Czystość: &ge; 13 jednostek/mg białko Wiązanie biotyny</td></tr><tr><td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]amina</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td>Czystość: 97% Odczynnik Click</td></tr><tr><td>TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny</td><td>Sigma</td><td>75259</td><td>Czystość: &ge; 98% Odczynnik Click</td></tr><tr><td>TECAN Infinite F500</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Czystość: NA Detekcja fluorescencji</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Czystość: NA Detekcja fluorescencji</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Czystość: NA Podgrzewana pokrywa</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Czystość: 10% w H2O Bufor reakcyjny Lnt</td></tr><tr><td>Ultra wirówka</td><td>Beckman LC</td><td>N/A</td><td>Czystość: NA Frakcjonowanie komórek</td></tr></tbody></table>

test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla n-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteiny z proteobakterii są modyfikowane potranslacyjnie przez kwasy tłuszczowe pochodzące z fosfolipidów błonowych przez działanie trzech integralnych enzymów błonowych, w wyniku czego powstają triacylowane białka. Pierwszy etap szlaku modyfikacji lipoprotein polega na przeniesieniu grupy diacyloglicerylowej z fosfatydyloglicerolu do prolipoproteiny, w wyniku czego powstaje prolipoproteina diacyloglicerolu. W drugim etapie peptyd sygnałowy prolipoproteiny jest rozszczepiany, tworząc apolipoproteinę, która z kolei jest modyfikowana przez trzeci kwas tłuszczowy pochodzący z fosfolipidu. Ten ostatni etap jest katalizowany przez N-acylotransferazę apolipoproteiny (Lnt). Szlak modyfikacji lipoprotein jest niezbędny w większości γ-proteobakterii, co czyni go potencjalnym celem dla rozwoju nowych środków przeciwbakteryjnych. Opisano tutaj czuły test na Lnt, który jest zgodny z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi małych cząsteczek hamujących. Enzym i substraty są cząsteczkami osadzonymi w błonie; W związku z tym opracowanie testu in vitro nie jest proste. Obejmuje to oczyszczanie aktywnego enzymu w obecności detergentu, dostępność alkinofosfolipidów i substratów peptydu diacyloglicerylu oraz warunki reakcji w mieszanych miceli. Ponadto, aby można było wykorzystać test aktywności w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym (HTS), preferowany jest bezpośredni odczyt produktu reakcji w stosunku do sprzężonych reakcji enzymatycznych. W tym fluorometrycznym teście enzymatycznym produkt peptydowy triacylowany alkiny jest przekształcany w fluorescencyjny proces reakcji chemicznej i wykrywany w formacie płytki wielodołkowej. Metoda ta ma zastosowanie do innych acylotransferaz, które wykorzystują substraty zawierające kwasy tłuszczowe, w tym fosfolipidy i acylo-CoA.

W reakcji Lnt kwas tłuszczowy z pozycji sn-1 fosfolipidów jest przenoszony na peptyd diacyloglicerylowy, co prowadzi do powstania dojrzałego peptydu triacylowanego8. Opisany tutaj test Lnt in vitro został zaprojektowany tak, aby wykorzystywać jako substraty fosfolipidy zawierające alkinowy kwas tłuszczowy (alkyne-POPE) oraz FSL-1-biotynę, co skutkuje utworzeniem alkinowej FSL-1-biotyny. W wyniku reakcji chemii klik z azydą FAM produkt ten zostaje znakowany fluorescencyjnie i wykrywany za ...

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Protokół ten dotyczy dwóch ważnych aspektów: charakterystyki niezbędnej integralnej błony, acylotransferazy apolipoproteinowej bakterii oraz opracowania testu w formacie HDS do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów enzymu. Metoda jest bardzo czuła i nadaje się do celów przesiewowych. Może przyczynić się do opracowania potencjalnych nowych antybiotyków.Ten film pomoże podkreślić kluczowe etapy tego protokołu, takie jak mieszanie, wirowanie, sonikacja, podczas pracy z niejednorodnymi zawiesinami zawierającymi lipidy i detergenty. Procedurę zademonstrują Karine Nozeret, Aurelia Pernin, obie są koleżankami w mojej grupie. Rozpocznij od przygotowania mieszaniny odczynników do testu apolipoproteiny i acylotransferazy lub LNT.Wymieszaj alkin, POPE i FSL-1-biotynę z buforem reakcyjnym LNT w 1,5 mililitrowych probówkach o końcowej objętości 18 mikrolitrów. Przygotować trzykrotne mieszaniny odczynników dla wszystkich badanych warunków. Sonikować mieszaniny odczynników przez trzy minuty w ultradźwiękowej łaźni wodnej i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie dodaj aktywny lub nieaktywny LNT do końcowego stężenia jednego nanograma na mikrolitr i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Inkubować reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin w mieszalniku termicznym z podgrzewaną pokrywką. W międzyczasie przygotuj roztwór podstawowy dwóch miligramów na mililitr streptawidyny.I rozcieńczyć go do 10 mikrogramów na mililitr, aby uzyskać działający roztwór. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Następnie wysusz studzienki na powietrzu przez noc, inkubując płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez pokrywki.Następnego dnia przygotuj roztwory podstawowe pięciu milimolowych Azido-FAM, 50 milimolowych TCEP, dwóch milimolowych TBTA i 50-milimolowych pięciowodnych siarczanów miedzi. Wykonaj chemię kliknięć, dodając 0,2 mikrolitra zapasowego Azido-FAM, 0,4 mikrolitra standardowego TCEP i 0,2 mikrolitra podstawowego TBTA do 1,5 mililitra probówek reakcyjnych LNT. Wiruj roztwór przez pięć sekund.Następnie dodaj 0,4 mikrolitra wywaru siarczanowego miedzi. Wiruj przez kolejne pięć sekund i inkubuj reakcję przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Podczas inkubacji mieszaniny chemicznej typu click, umyj dołki płytek pokrytych streptawidyną trzykrotnie 200 mikrolitrami PBST1.Przenieś 18 mikrolitrów mieszaniny chemicznej do studzienki pokrytej streptawidyną i dodaj 100 mikrolitrów PBST1, aby związać produkt FAM N-acylo-FSL-1-biotyny z płytką. Dodać biotynę, fluoresceinę, do płytki jako pozytywną kontrolę wiązania streptawidyny i odczytu fluorescencji. Następnie inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę w ciemności, wstrząsając z prędkością 300 obr./min.Po inkubacji za pomocą wielokanałowej pipety elektronicznej ręcznie umyć płytkę sześciokrotnie 200 mikrolitrami PBST2. Przepłucz go trzykrotnie pipetą. Umyj go trzy razy 200 mikrolitrami PBS i przepłucz jeszcze trzy razy.Dodaj 200 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i wykryj fluorescencję przy 520 nanometrach w czytniku mikropłytek. Zapisz wszystkie wyniki w arkuszu kalkulacyjnym, a następnie oblicz odchylenie standardowe dla każdej reakcji, a także wartości P dla kontroli ujemnych i próbek dodatnich za pomocą niesparowanego testu T. Opisany tutaj test LNT in vitro wykorzystuje fosfolipidy zawierające alkinowy kwas tłuszczowy i FSL-1-biotynę jako substraty do wytworzenia alkiny FSL-1-biotyny.Po reakcji chemicznej z Azido-FAM, produkt ten staje się znakowany fluorescencyjnie i wykrywalny przez spektrometrię fluorescencyjną. Warunki reakcji zoptymalizowano pod kątem maksymalnego odczytu fluorescencji przy 520 nanometrach. Kontrole ujemne obejmowały reakcje bez enzymu, z nieaktywnym wariantem enzymu lub z inhibitorem specyficznym dla tiolu, MTSES.Biotyna fluoresceina została użyta jako wewnętrzna kontrola maksymalnego sygnału fluorescencji. W celu opracowania wysokoprzepustowego testu przesiewowego, reakcje przeprowadzono bezpośrednio na 384 płytkach dołkowych. Etapy mycia zostały zautomatyzowane, a ilość odczynników została zmniejszona.Reakcja była czuła i powtarzalna, ze znaczną różnicą w sygnale fluorescencyjnym między kontrolą ujemną a enzymem aktywnym. W przypadku wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynnik pierwszy Z określa, czy odpowiedź w teście jest wystarczająco duża, aby można było przeprowadzić badania przesiewowe. Średni czynnik pierwszy Z był większy niż 0,6 dla testu LNT wykonanego w formacie 384 dołków, co sugeruje, że był on znakomity.Test probówkowy w tym filmie został opracowany w formacie wielopłytkowym, który jest kompatybilny z HDS. Może być stosowany do badania innych acyltransferaz z różnych organizmów.

click-chemistry-based-fluorometric-assay-for-apolipoprotein-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono protokół badań przesiewowych leków małocząsteczkowych oparty na syntezie in-situ ultramałych fluorescencyjnych nanoklastrów złota (Au NCs) przy użyciu białka obciążonego lekiem jako matrycy. Metoda ta jest prosta do określenia powinowactwa wiązania leków z białkiem docelowym za pomocą widzialnego sygnału fluorescencyjnego emitowanego z matrycami białkowymi Au NC.

Szybka i ilościowa metoda fluorymetryczna do badań przesiewowych leków małocząsteczkowych ukierunkowanych na białka

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Opisujemy tutaj fluorometryczny, bezkomórkowy test biochemiczny do oznaczania peroksydacji lipidów HDL. Ten szybki i powtarzalny test może być wykorzystany do określenia funkcji HDL w badaniach na dużą skalę i może przyczynić się do zrozumienia funkcji HDL w chorobach ludzkich.

Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości

Pomiar zdolności in vitro cholesterolu do surowicy lub osocza w modelach komórek makrofagów jest obiecującym narzędziem jako biomarker miażdżycy. W niniejszym badaniu optymalizujemy i standaryzujemy metodę fluorescencyjnego wypływu cholesterolu NBD oraz opracowujemy analizę wysokoprzepustową przy użyciu płytek 96-dołkowych.

Wysokoprzepustowy test wypływu cholesterolu znakowany nitrobenzoksadiazolem

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Monitorowanie zmian temperatury topnienia docelowego białka (np. test przesunięcia termicznego, TSA) jest efektywną metodą badania bibliotek fragmentów kilkuset związków. Przedstawiamy protokół TSA implementujący wspomaganą robotyką nanoróżnicową fluorymetrię skaningową (nano-DSF) do monitorowania wewnętrznej fluorescencji tryptofanu i rozpraszania wstecznego światła w celu badania przesiewowego fragmentów.

Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Szybkie i dokładne testy chemiczne do badań przesiewowych pod kątem określonych inhibitorów są ważnym narzędziem w arsenale rozwoju leków. Tutaj przedstawiamy skalowalny test chemiczny acetylu do pomiaru hamowania aktywności acetylacji HAT1.

Test chemiczny Acetyl-Click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1

Poznaj fluorometryczny test click-chemistry do badania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie inhibitorów enzymu i odkrywanie nowych antybiotyków.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (Wideo) | JoVE Journal

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Przeglądaj więcej filmów