Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)
May 8th, 2020
Przedstawiono protokół do śledzenia linii i funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki za pomocą analizy mozaikowej z podwójnymi markerami (MADM). Analiza klonalna MADM zapewnia ilościowe ramy do pomiaru zachowania proliferacyjnego, produkcji komórkowej i pokrewieństwa liniowego poszczególnych komórek progenitorowych i ich komórek potomnych.
Analiza mozaiki z technologią podwójnych markerów to potężna metoda, która może dostarczyć wysoce ilościowych informacji na temat zachowań proliferacyjnych i wyników piwnicznych poszczególnych komórek macierzystych. Unikalną cechą tej techniki jest to, że pozwala ona na śledzenie linii i funkcjonalną analizę genetyczną genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki. Do procedury przystąpią Carmen Streicher, technik, Nicole Amberge, doktorantka, Gisselle Cheung, doktorant i Andy Hansen, doktorant z mojego laboratorium. Aby wywołać zdarzenia rekombinacji MADM u myszy eksperymentalnych, należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, aby podać pojedyncze wstrzyknięcie tamoksyfenu dootrzewnowego do matki w ciąży. Od analizy klonalnej MADM do postnatalnych punktów czasowych. W dniu embrionalnym od 18 do 19 umieść ciężarną mysz w pozycji leżącej na plecach i zdezynfekuj sierść 70% etanolem. Wykonaj małe nacięcie w skórze w dolnej części brzucha nad macicą i wykonaj drugie nacięcie przez mięśnie i ścianę mięśni brzucha, aby odsłonić otrzewną. Użyj nożyczek, aby oddzielić macicę od otaczających tkanek i umieść nienaruszoną macicę w rękawiczce z ciepłą wodą. Następnie użyj nożyczek i palców z cienką końcówką, aby ostrożnie otworzyć ściany macicy, aby uwolnić zarodki. Oczyść młode, delikatnie naciskając od czasu do czasu klatkę piersiową, aby zainicjować oddychanie przed przekazaniem zwierząt prenatalnych matce zastępczej. Aby pobrać neuronalną tkankę klona MADM, umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na tacce do operacji perfuzji i zdezynfekuj sierść 70% etanolem. Użyj nożyczek i kleszczy, aby wykonać jedno nacięcie przez skórę i jedno nacięcie przez warstwę mięśni. Gdy jama klatki piersiowej jest widoczna, powąchaj i podnieś membranę, aby odsłonić serce, a następnie ostrożnie przytnij i przypnij klatkę piersiową do tacy chirurgicznej. włóż igłę podłączoną do rurki pompy perystaltycznej wypełnionej PBS do dolnej lewej komory serca i użyj małych nożyczek Iris, aby wykonać nacięcie w tylnym końcu prawego przedsionka. Perfuzja układu sercowo-naczyniowego za pomocą PBS, a następnie natychmiastowa perfuzja ze świeżo przygotowanym lodowatym 4% paraformaldehydem w PBS. Po zakończeniu perfuzji należy usunąć mózg poprzez staranną sekcję i umieścić pobrany narząd w co najmniej pięciokrotnie większej objętości mózgu niż świeży 4% paraformaldehyd przez noc w temperaturze 4
Przegląd
To badanie przedstawia protokół śledzenia linii i funkcjonalnej analizy genetycznej kandydatowych genów na poziomie pojedynczych komórek z wykorzystaniem Analizy Mozaiki z Podwójnymi Markerami (MADM). Analiza klonalna MADM pozwala na ilościowe pomiary zachowania proliferacyjnego i wyjścia komórkowego pojedynczych przodków i ich potomnych komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Śledzenie linii
- Analiza genetyczna
- Biologia komórek macierzystych
Tło
- Technologia MADM jest niezbędna do zrozumienia proliferacji komórek.
- Metoda pozwala na śledzenie na poziomie pojedynczej komórki.
- Zastosowania obejmują ocenę wyjścia komórkowego i relacji liniowych.
Zastosowane metody
- Analiza Mozaiki z Podwójnymi Markerami (MADM)
- Model eksperymentalny: Myszy
- Techniki obejmują iniekcje dootrzewnowe i perfuzję tkanek.
Główne wyniki
- Umożliwiło szczegółowe zbadanie zachowania przodków.
- Dostarczyło wglądu w relacje liniowe komórek potomnych.
- Przedstawiło niezawodną metodę funkcjonalnej analizy genetycznej.
Wnioski
- To badanie dostarcza kompleksowego protokołu wykorzystania MADM w analizie genetycznej.
- Wyniki znacząco przyczyniają się do rozwoju biologii rozwojowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) enables unprecedented single-cell resolution lineage tracing and clonal analysis in the developing cerebral cortex, directly addressing the challenge of mapping neural stem cell fate and division patterns. This capability enhances predictive confidence in early neurodevelopmental target validation and supports mechanistic de-risking for CNS portfolio decisions. MADM's quantitative and qualitative outputs position it as a critical tool for functional genetic interrogation in neurobiology-focused R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of neural stem cell lineage transitions and division modes.
- Supports functional validation of candidate genes in neurodevelopmental pathways.
- Provides mechanistic de-risking by distinguishing control and mutant subclones in vivo.
- Facilitates high-confidence target selection for CNS therapeutic programs.
Screening & Assay Development
- Generates validated single-cell lineage maps for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of progenitor proliferation and fate specification.
- Supports assay standardization by enabling comparative analysis within the same tissue environment.
- Prepares robust biological systems for compound evaluation in neurodevelopmental contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lineage tracing outputs with disease-relevant neural circuit formation.
- Enables continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement of CNS targets based on in vivo functional evidence.
- Provides translational biomarker insights through clonal analysis of neural progenitors.
Pipeline & Workflow Integration
MADM-based lineage tracing integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in CNS-focused pipelines.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution hypothesis testing of neural stem cell fate and division patterns.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible lineage data for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides optical and statistical outputs for comparing control and mutant progenitor behaviors.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by mapping lineage outcomes in vivo.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any murine stem cell niche with appropriate CreERT2 drivers, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural lineage studies.
- Operational Value: Standardizes lineage tracing and clonal analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on in vivo functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic manipulation, in vivo lineage tracing, and neuroanatomical dissection.
- Demands access to murine models with CreERT2 drivers and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible clonal analysis and data interpretation.
- Adaptable to various stem cell niches with appropriate genetic drivers and tissue handling protocols.
- Limited to murine systems where genetic tools and tissue access are feasible.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
