Name: Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę MADM do śledzenia linii komórkowych i analizy genetycznej na poziomie pojedynczych komórek u myszy. Ta technika umożliwia ilościowe badanie zachowań progenitorów w rozwoju kory mózgowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Hippenmeyer za dyskusję, Ośrodku Bioobrazowania, Ośrodku Nauk Przyrodniczych i Ośrodku Przedklinicznym IST Austria za wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez fundusze instytucjonalne IST Austria; R.B. otrzymał wsparcie z programu Lise-Meitner z Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF) (M 2416); N.A. otrzymała wsparcie z Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC otrzymała wsparcie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy grantowej nr 754411 w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie" jako stypendysta podoktorski ISTplus; A.H. otrzymał wsparcie od ÖAW DOC (Doctoral Fellowship Austriackiej Akademii Nauk). Badanie to było również wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa o udzielenie dotacji nr 725780 LinPro) dla S.H.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano metodę wykorzystania MADM do śledzenia linii komórkowej poszczególnych RGP in vivo w rozwijającej się korze nowej. W połączeniu z indukowanym TM CreERT2, zdarzenia MADM mogą być precyzyjnie mierzone w czasie, zapewniając wysoce jakościowy i ilościowy wizualny odczyt wzorców podziałów komórek macierzystych na poziomie pojedynczej komórki. Poprzez miareczkowanie dawki dostarczonej TM, w idealnej sytuacji można uzyskać średnio mniej niż jeden klon na półkulę korową, zapewniając odpowiednią separację przestrzenną w celu jednoznacznego rozróżnienia poszczególnych klonów. Zachowując integralność tkanki, metoda ta przechwytuje również istotne informacje dotyczące położenia, morfologii i bezwzględnej liczby komórek. Kasety MADM na Chr. 11 7,11,12,46,56,57, na Chr. 751 i oryginalne MADM na Rosa26 47,53,59 były używane w badaniach analizy klonalnej MADM. Wysoka rozdzielczość pojedynczych komórek zapewnia bezprecedensowy wgląd zarówno w morfologię, jak i pokrewieństwo klonalne komórek potomnych oraz umożliwia obrazowanie na żywo proliferujących komórek macierzystych i pojawiających się klonów46,52.
Cesarskie cięcie i opieka nad młodymi w celu analizy klonów w postnatalnych punktach czasowych jest koniecznym i krytycznym krokiem w protokole. W zależności od stanu zdrowia ciężarnej matki leczonej TM, wykonanie cesarskiego cięcia może nie być konieczne. Jednak wychowywanie szczeniąt z matką zastępczą jest nadal wymagane, ponieważ matka leczona TM może mieć problemy z laktacją. Nie zaobserwowano różnic w potrzebie wspierania z różnymi sterownikami CreERT2 . Zarówno linie MADM, jak i matki zastępcze są utrzymywane na tle niekrewniaczym CD-1. Jeżeli cesarskie cięcie nie jest konieczne, ciężarna matka poddana TM wykorzystana do uzyskania doświadczalnych młodych może być ponownie wykorzystana do dodatkowych hodowli doświadczalnych zgodnie z zasadami 3R (należy zauważyć, że można to zrobić tylko wtedy, gdy licencje doświadczalne na zwierzętach zatwierdzają tę praktykę). Matki zastępcze mogą być wykorzystywane do wychowywania szczeniąt w ciągu 2 dni po porodzie, ale wyższe wskaźniki sukcesu zaobserwowano, gdy matki zastępcze rodzą tego samego dnia, co myszy eksperymentalne, które muszą być przygarnięte. Dlatego ważne jest, aby ustalić krycie w określonym czasie dla matek zastępczych równolegle z kryciami eksperymentalnymi w kroku 1.1. Utrzymanie podobnej liczby miotu, jak w miocie pierwotnej matki zastępczej, może poprawić przeżywalność przybranych szczeniąt, dlatego może być konieczne usunięcie części z całego oryginalnego miotu. Dodatkowe kroki, które mogą poprawić wychowanie, obejmują pocieranie rękawiczek eksperymentatora ściółką i jedzeniem (w celu usunięcia zapachu rękawiczek); delikatne pocieranie szczeniąt po cesarskim cięciu fragmentami zabrudzonego miotu i gniazda matki zastępczej; oraz umieszczanie szczeniąt w bliskim kontakcie ze szczeniętami matki zastępczej przed umieszczeniem ich w klatce dla myszy zastępczych.
Podobnie jak w przypadku innych metod śledzenia pochodzenia opartych na reporterach, należy dokładnie rozważyć wybór optymalnego sterownika CreERT2 do eksperymentów klonalnych MADM. Po pierwsze, zastosowany promotor musi wyrażać rekombinazę zarówno czasowo, jak i przestrzennie w populacji progenitorowej będącej przedmiotem zainteresowania. Znalezienie tego promotora może być trudne, ponieważ niektóre promotory mogą zmieniać wzorce ekspresji lub uciszać się na różnych etapach rozwoju. Aby poprawić specyficzność typu komórki, zastosowano wiele rekombinaz specyficznych dla lokalizacji, z których każda jest napędzana przez oddzielne promotory. Kiedy jedna lub obie rekombinazy ulegają ekspresji w tej samej komórce, oznacza to komórkę i jej potomstwo fluorescencyjnym reporterem 74,75,76,77. Podsumowując, ważne jest, aby wybrać sterownik CreERT2, który jest specyficzny dla populacji analizowanych komórek progenitorowych.
Najważniejszym krokiem w tej metodzie jest identyfikacja klonu, ponieważ wszystkie komórki muszą jednoznacznie pochodzić z pojedynczego zdarzenia rekombinacji (krok 8.1). Miareczkowanie stężenia TM zapewnia mniej niż jedno skupisko czerwonych/zielonych komórek na półkulę mózgu i maksymalizuje prawdopodobieństwo analizy pojedynczego klonu (krok 2.2)7,11. Klony należy odrzucić, jeśli sąsiednie skupiska komórek występują w promieniu 500 μm od klonu będącego przedmiotem zainteresowania. Dlatego ważne jest, aby zbadać kilka sekcji przed i po pojawieniu się klonu, aby upewnić się, że w pobliżu nie ma żadnych dodatkowych zdarzeń rekombinacji. Ze względu na słabszy sygnał fluoroforów konieczne jest wykonanie immunohistochemii eGFP i tdT u klonów embrionalnych (patrz punkt 6). Jest to zalecane u dorosłych klonów tylko wtedy, gdy dodatkowe antygeny będą koznakowane. Podczas obrazowania klonów ważne jest, aby uchwycić całą szerokość kory mózgowej, w której znajduje się klon (tj. od powierzchni kości do ciała modzelowatego; patrz krok 8.4), aby nie pominąć żadnej komórki. Ułatwia to również wyrównanie obrazu podczas przetwarzania obrazu (rozdział 9). Sekcja 8 protokołu wymaga odwróconego mikroskopu konfokalnego, ale można go dostosować w zależności od dostępnej konfiguracji mikroskopu. Można zastosować mikroskopię epifluorescencyjną, ale zalecana jest mikroskopia konfokalna, ponieważ prowadzi to do zmniejszenia zanieczyszczenia światłem spoza płaszczyzny ostrości. Ważne jest również, aby intensywność i wzmocnienie lasera były dostosowane tak, aby można było jednoznacznie zidentyfikować krwinki zielone, czerwone i żółte. Niezależnie od konfiguracji, zaleca się użycie obiektywu o powiększeniu co najmniej 20x, aby zapewnić pełną separację przestrzenną blisko rozmieszczonych komórek. Oprócz rejestrowania głębokości kory mózgowej wszystkich komórek (krok 8.6), obszary kory mózgowej, w których znajdują się klony, muszą być zidentyfikowane za pomocą atlasu mózgu, takiego jak atlas mózgu Allena lub inne stereotaktyczne mapy współrzędnych. Należy również przyjąć paradygmat nazewnictwa plików, aby upewnić się, że sklonowane obrazy są łatwe do zidentyfikowania. W nazewnictwie pliku można zawrzeć następujące informacje: unikalny identyfikator obrazu, datę wykonania zdjęcia, genotyp zwierzęcia, wiek indukcji, wiek analizy, numer obrazu w stosunku do pozostałych obrazów z tego samego klonu.
Wprowadzenie mutacji dystalnej do jednej kasety MADM wyraźnie pozwala na generowanie mozaik genetycznych71 i pozwala na rozbiór molekularnych regulatorów różnorodności linii i typów komórek na poziomie klonalnym 7,11,46,62. Aby wygenerować mozaikę genetyczną za pomocą MADM, kasety MADM muszą być meiotycznie połączone z tym samym chromosomem, co gen będący przedmiotem zainteresowania (patrz rysunek 2 dla schematu hodowlanego). Ogranicza to obecną analizę klonalną za pomocą MADM do genów zlokalizowanych na Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251 i Chr. 6 dystalnie do locus Rosa26 47. Przyszłe badania będą wykorzystywać kasety MADM ukierunkowane na dowolny chromosom, co pozwoli na analizę mozaikową praktycznie wszystkich genów genomu myszy na poziomie klonalnym.
Wreszcie, MADM nie ogranicza się do analizy komórek progenitorowych w rozwijającej się korze nowej. Badanie wielu nisz komórek macierzystych może skorzystać z możliwości rozróżnienia czasoprzestrzennych układów komórek spokrewnionych klonalnie. Stosując MADM do innych obszarów mózgu, stanów chorobowych (np. raka) lub w innych tkankach 47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59, badania ujawniły pokrewieństwo linii w klonach pochodzących z różnych klas komórek progenitorowych i macierzystych (patrz Tabela 1 zawiera aktualny wykaz badań klonalnych MADM). Innym interesującym przyszłym zastosowaniem MADM jest połączenie go z dodatkowymi funkcjonalnymi lub subkomórkowymi reporterami, co zwiększyłoby stopień informacji, które można uzyskać od klonów.

Kora mózgowa to wysoce zorganizowana struktura złożona z sześciu odrębnych warstw. Kora zawiera różnorodny wachlarz typów komórek, w tym neurony i komórki glejowe, które oddziałują na siebie, tworząc funkcjonalne obwody neuronowe. Większość, jeśli nie wszystkie, korowe neurony projekcyjne i glej pochodzą ze wspólnej puli nerwowych komórek macierzystych (NSC) znanych jako promieniste komórki progenitorowe gleju (RGPs)1,2,3. Same RGP pochodzą z neuroepitelialnych komórek macierzystych (NESC) tworzących wczesny embrionalny nabłonek nerwowy. Do 9 dnia embrionalnego (E9) u myszy, NESC zaczynają przechodzić w RGPs4. Progresja linii RGP wymaga precyzyjnej regulacji czasowej i przestrzennej, a gdy proces ten jest utrudniony, mogą wystąpić poważne zaburzenia neurologiczne, takie jak megalencefalia, małogłowie, lizencefalia lub upośledzenia, takie jak schizofrenia i autyzm5,6. W E10 większość RGP ulega symetrycznym podziałom proliferacyjnym, co skutkuje rozszerzeniem puli neuronalnych progenitorów4,7. RGP w końcu zaczynają dzielić się asymetrycznie, wytwarzając neurony projekcyjne kory mózgowej w określony czasowo sposób. Poprzez kolejne fale neurogenezy nowonarodzone neurony migrują do płytki korowej, tworząc blaszki korowe, przy czym wcześnie urodzone neurony zajmują głębokie warstwy, a późno urodzone neurony znajdują się w warstwach powierzchownych8,9,10. Ponieważ klonalnie spokrewnione neurony piramidowe migrują promieniście do kory z bardzo małą dyspersją styczną, komórki potomne mają tendencję do tworzenia struktury w kształcie kolumny lub stożka, określanej jako neuronalna jednostka promieniowa4,11,12,13. Przez E17 embrionalna ekspansja neurogenna jest zakończona u myszy14. RGP mogą również wytwarzać komórki wyściółki i niektóre klasy gleju, w tym astrocyty i oligodendrocyty1,15,16,17,18,19. Potencjał RGP do powstawania zarówno neuronów, jak i astrocytów wydaje się być spójny we wszystkich regionach kory mózgowej18, przy czym około 1/6 neurogennych RGP wytwarza również glej11.
Obecnie, czynniki genetyczne i epigenetyczne regulujące postęp czasowy komórki macierzystej wzdłuż jej linii są w większości nieznane. Czasowe wzorce ekspresji genów mogą mieć znaczący wpływ na decyzje dotyczące linii w RGPs20,21,22,23,24. Nie wiadomo, w jaki sposób ten ściśle powiązany związek między wzorcami czasowymi i przestrzennymi prowadzi do różnorodności molekularnej typów neuronów dorosłych w obszarach kory mózgowej. Podobnie, w jaki sposób potencjał poszczególnych komórek macierzystych i ich produkcja komórkowa są modulowane na poziomie komórkowym i molekularnym, jest ważnym pytaniem bez odpowiedzi. Miejmy nadzieję, że przyszłe badania odpowiedzą na niektóre z tych pytań, ostatecznie poszerzając naszą wiedzę na temat tworzenia funkcjonalnych obwodów korowych.
Neurobiologia rozwojowa stara się zrozumieć relacje między komórkami w mózgu. Początkowo dostępnych było bardzo niewiele narzędzi badawczych w tym zakresie, a wiele wczesnych badań opierało się na wizualnych obserwacjach wzorców podziałów w przezroczystych organizmach, takich jak Caenorhabditis elegans25. W ostatnich dziesięcioleciach nastąpił dramatyczny wzrost liczby i wyrafinowania dostępnych technik13,26,27,28,29. Pojawienie się systemu edycji genomu CRISPR-Cas9 pozwala na syntetyczną rekonstrukcję powiązań między liniami komórkowymi poprzez wprowadzenie ewoluujących kodów kreskowych DNA27,30. Dwa ostatnie przykłady strategii kodowania kreskowego obejmują użycie przewodnika naprowadzającego RNA, który kieruje CRISPR-Cas9 do określonych loci kodu kreskowego DNA lub deaminazy cytydyny połączonej z nickazą Cas9 w celu celowania w endogenne przeplatane regiony powtórzeń31,32. Technologie te zapewniają wysoce zmultipleksowane podejścia poprzez wprowadzenie kodów kreskowych, które stopniowo i stabilnie gromadzą unikalne mutacje w czasie. Metody edycji genomu są bardzo cenne, ponieważ umożliwiają retroaktywną analizę relacji między dowolnymi dwiema komórkami w oparciu o wspólne dziedziczenie tych kodów kreskowych. Jednak, aby odczytać kody kreskowe w poszczególnych komórkach, tkanka zwykle musi zostać rozerwana, a zatem informacje dotyczące położenia, morfologii i bezwzględnej liczby komórek od pojedynczego przodka są tracone.
Kombinatoryczne paradygmaty etykietowania zachowują informacje przestrzenne i w zasadzie pozwalają również na rozróżnienie między blisko zlokalizowanymi lub nawet nakładającymi się klonami33,34. Aby metoda śledzenia linii była pouczająca, musi oznaczać poszczególnych przodków i ich potomstwo w rzadki i nieusuwalny sposób. Warto zauważyć, że podejścia Brainbow35 i Confetti36,37 wykorzystują stochastyczne, wielokolorowe reportery oparte na rekombinazie Cre, które wyrażają kombinację białek fluorescencyjnych z pojedynczego locus. Ogromna liczba jednoczesnych kombinacji kolorów, które można uzyskać in vivo, sprawia, że jest to potężne narzędzie do śledzenia korowych klonów RGP i astrocytów34. Opracowano również systemy oparte na transpozonach, zapewniające stabilną integrację genomową transgenów, kodujące reportery fluorescencyjne i umożliwiające śledzenie linii przodków kory mózgowej33,38,39,40,41. Systemy oparte na transpozonach mają dodatkową zaletę polegającą na tym, że konstrukty reporterowe stabilnie integrują się z genomem, a tym samym niezawodnie znakują komórki potomne spokrewnione liniowo. Aby prześledzić konkretne linie astrocytów, opracowano szereg metod, które obejmują elektroporację transpozaz piggyBac, w tym Star Track, która wykorzystuje kombinację konstruktów kodujących różne białka fluorescencyjne40,42. Inne podejście, markery MAGIC, wprowadza wektory Brainbow jako transgeny transponowalne. Zostało to z powodzeniem wykorzystane do śledzenia embrionalnych progenitorów neuronalnych i astrocytów34,43. Niedawno odkryto, że analiza mozaiki za pomocą podwójnej wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy (MADR) stabilnie oznacza zmutowane komórki wyrażające elementy transgeniczne z precyzyjnie zdefiniowanych loci chromosomowych44. Te potężne techniki znakowania kombinatorycznego in vivo dostarczyły wielu informacji na temat dynamiki linii komórek progenitorowych. Jednak analizy te są wykonywane na utrwalonej tkance, zapewniając migawkę poszczególnych klonów na określonym etapie rozwoju. Aby zaobserwować zmiany w dynamice linii pojedynczych klonów w czasie, należy zastosować metody przewlekłego obrazowania in vivo podobne do tych wykonywanych w zakręcie zębatym dorosłego osobnika45.
Analiza mozaiki z podwójnymi markerami (MADM) to potężna metoda dwukolorowego znakowania, która umożliwia śledzenie in vivo linii poszczególnych komórek progenitorowych u myszy46,47. Dwa składniki są niezbędne do zaistnienia zdarzeń znakowania MADM: Po pierwsze, kasety MADM muszą być ukierunkowane na identyczne loci na chromosomach homologicznych. Kasety składają się z dwóch chimerycznych fluorescencyjnych genów reporterowych, eGFP (zielony, [G]) i tandemowy dimer pomidora (czerwony, tdT[T]). Kaseta GT zawiera N-koniec eGFP i C-koniec tdT, oddzielone intronem zawierającym miejsce loxP. Kaseta TG jest skonstruowana odwrotnie, z N-końcem tdT i C-końcem eGFP. Po drugie, niezbędna jest ekspresja rekombinazy Cre w tej samej komórce, w której znajdują się docelowe kasety MADM. Pod nieobecność Cre kasety chimeryczne nie wyrażają funkcjonalnego eGFP lub tdT, ponieważ ich sekwencje kodujące są zakłócone. Miejsca loxP służą jako cel rekombinacji międzychromosomowej za pośrednictwem Cre, w wyniku której obie kasety ekspresyjne są odtwarzane jednocześnie. Jeśli rekombinacja nastąpi podczas fazy G2 cyklu komórkowego, po której następuje segregacja X (G2-X), każda z dwóch komórek potomnych będzie wyrażać jedno z dwóch białek fluorescencyjnych. Czasowa regulacja aktywności CreERT2 za pomocą tamoksyfenu (TM) dostarcza precyzyjnych informacji na temat daty urodzenia klonów MADM i wzorców podziału ich potomstwa (Figura 1A)29,46,47.
MADM może potencjalnie systematycznie oznaczać pojedyncze klony o wysokiej rozdzielczości pojedynczej komórki w mózgu myszy, podobnie jak tradycyjne, ale niespecyficzne i pracochłonne metody, takie jak barwienie metodą Golgiego48 lub wypełnianie barwnikiem49. Ponieważ tylko promotor napędzający CreERT2 określa specyficzność typu komórki klonalnego znakowania MADM, MADM może być w zasadzie stosowany do śledzenia linii klonalnej w dowolnym narządzie i tkance myszy47,50,51,52. Rzeczywiście, w badaniach wykorzystano już MADM do ujawnienia powiązań linii w klonach pochodzących z różnych tkanek47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. Eksperymentalne paradygmaty MADM zostały zastosowane do badania linii w neuronach projekcyjnych kory mózgowej, gleju i pourodzeniowych komórkach macierzystych w rozwijającej się korze nowej7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM został również wykorzystany do badania linii komórkowej w dorosłym zakręcie zębatym, wzgórzu, komórkach ziarnistych móżdżku i interneuronach na poziomie klonalnym (zobacz Tabelę 1, aby uzyskać pełną listę)47,53,54,56,57,66.
Unikalną cechą MADM jest możliwość genetycznego powiązania mutacji dystalnych z jedną kasetą MADM, tworząc w ten sposób mozaikę genetyczną (Rysunek 1B i Rysunek 2). Powoduje to powstanie komórek potomnych typu dzikiego znakowanych jednym markerem fluorescencyjnym (tdT na rysunku 1B) i homozygotycznego zmutowanego rodzeństwa drugim (eGFP na rysunku 1B) w nieznakowanym heterozygotycznym środowisku. Wyjątkowość MADM polega na tym, że analiza porównawcza subklonów kontrolnych i zmutowanych może być przeprowadzana w tym samym środowisku tkankowym in vivo. Pierwotnie, kasety MADM były ukierunkowane na locus47, ale analiza funkcji genów MADM była ograniczona do genów dystalnych do locus. Aby przezwyciężyć (przynajmniej częściowo) to ograniczenie i rozszerzyć możliwości analiz genów opartych na MADM, kasety MADM zostały wbite w pobliże centromerów Chr. 751, Chr. 1146 i Chr. 1251. Celowanie we wszystkie 19 mysich autosomów za pomocą kaset MADM jest w toku i pozwoli na badanie praktycznie każdego genu w przyszłości, zapewniając niezrównaną platformę do badania powiązań między liniami rozwojowymi w połączeniu z funkcjonalną analizą genetyczną.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa 1 ml (Omnifix Luer Lock)</td><td>Braun</td><td>9204512N</td><td></td></tr><tr><td>1,4-diazabicykloktan (DABCO)</td><td>Roth</td><td>0718.2</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml (Omnifix Luer Lock)</td><td>Braun</td><td>8508429N</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stożkowa 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>65.554.502</td><td></td></tr><tr><td>24 naczynia wielodołkowe</td><td>Roth/Greiner Bio-one</td><td>CE56.1</td><td></td></tr><tr><td>Igła 3/4 o rozmiarze 27 (Sterican)</td><td>Braun</td><td>16010256E</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (24 x 60 mm #1)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Cryostar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>957000H</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen (Marker woskowy)</td><td>Agilent</td><td>S200230-2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrze do mikrotomów (MX35 Ultra)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>705830</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Szklana płyta anty-roll-roll</td><td>Histocom</td><td>M 449980</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 Confocal</td><td>Zeiss</td> Pożywka montażowa <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>25 mg/ml DAPCO, 6 g glicerol, 2,4 g Mowiol 4-88, 6 ml dH2O, 12 mL 0,2 M Tris-HCl (pH 8,5)</td>Mowiol 4-88 Roth 0713.2 Normalna surowica osła Innowacyjne badania IGDNSER100ML Paraformaldehyd Sigma 441244-1KG <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna 323E/D 400RPM</td><td>Watson-Marlow</td><td>036.3124.00A</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td></td><td>Sigma S8501-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka Superfrost plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNT</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania tkanek T-12 (kwadrat 22 mm)</td> <td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek Trizma</td><td>Sigma</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Oprogramowanie i wtyczki:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>1.52p</td><td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fidżi</a></td><td></td></tr><tr><td>MultiStackReg</td><td>1.45</td><td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Link do pobrania</a></td><td></td></tr><tr><td>TurboReg</td><td></td><td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue</td><td>2.6</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td><td></td></tr><tr><td>Modele eksperymentalne: Organizmy/Szczepy:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse: Emx1-CreER</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:027784</td><td></td></tr><tr><td>Mysz: MADM-11-GT</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:013749</td><td></td></tr><tr><td>Mysz: MADM-11-TG</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:013751</td>Przeciwciała pierwszorzędowe: <<td></td></tr><tr><td>/strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anty-GFP 1:500</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Goat anty-tdPomidor 1:500</td><td>Przeciwciała</td> <td>SicgenAB8181-200</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-RFP 1:500</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td></td></tr><tr><td><silny>Przeciwciała wtórne:< / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>osioł Anty-kurczak Alexa Fluor 488 1:500</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>715-475-150</td><td></td></tr><tr><td>Osioł Anti-Goat Cy3 1:500</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>Osioł Anty-Królik Cy3 1:500</td><td>Badania immunologiczne Jacksona</td><td>711-165-152</td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (madm)

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

Zaczynając od ograniczonej puli przodków, kora mózgowa ssaków tworzy wysoce zorganizowane funkcjonalne obwody neuronowe. Jednak podstawowe mechanizmy komórkowe i molekularne regulujące przejścia między liniami nerwowych komórek macierzystych (NSC) oraz ostateczną produkcję neuronów i komórek glejowych w rozwijającym się nabłonku nerwowym pozostają niejasne. Metody śledzenia wzorców podziału NSC i mapowania linii komórek spokrewnionych klonalnie znacznie się rozwinęły. Jednak wiele współczesnych technik śledzenia linii genetycznych cierpi z powodu braku komórkowej rozdzielczości losu komórek potomnych, co jest niezbędne do rozszyfrowania wzorców podziału komórek progenitorowych. Przedstawiono protokół wykorzystujący analizę mozaikową z podwójnymi markerami (MADM) do przeprowadzenia analizy klonalnej in vivo. MADM jednocześnie manipuluje pojedynczymi komórkami progenitorowymi i wizualizuje precyzyjne wzorce podziału i progresję linii w niespotykanej dotąd rozdzielczości pojedynczej komórki. Zdarzenia rekombinacji międzychromosomowej oparte na MADM podczas fazy G2-X mitozy, wraz z czasowo indukowanym CreERT2, dostarczają dokładnych informacji na temat dat urodzenia klonów i ich wzorców podziału. W ten sposób śledzenie linii MADM zapewnia bezprecedensowe jakościowe i ilościowe odczyty optyczne sposobu proliferacji komórek progenitorowych komórek macierzystych na poziomie pojedynczej komórki. MADM pozwala również na badanie mechanizmów i wymagań funkcjonalnych genów kandydujących w progresji linii NSC. Wyjątkowość tej metody polega na tym, że analizę porównawczą subklonów kontrolnych i zmutowanych można przeprowadzić w tym samym środowisku tkankowym in vivo. W tym miejscu szczegółowo opisano protokół i zademonstrowano eksperymentalne paradygmaty wykorzystania MADM do analizy klonalnej i śledzenia linii w rozwijającej się korze mózgowej. Co ważne, protokół ten można dostosować do przeprowadzania analizy klonalnej MADM w dowolnej niszy mysich komórek macierzystych, o ile obecny jest sterownik CreERT2.

Przedstawiono protokół do śledzenia linii i funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki za pomocą analizy mozaikowej z podwójnymi markerami (MADM). Analiza klonalna MADM zapewnia ilościowe ramy do pomiaru zachowania proliferacyjnego, produkcji komórkowej i pokrewieństwa liniowego poszczególnych komórek progenitorowych i ich komórek potomnych.

Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

Analiza mozaiki z technologią podwójnych markerów to potężna metoda, która może dostarczyć wysoce ilościowych informacji na temat zachowań proliferacyjnych i wyników piwnicznych poszczególnych komórek macierzystych. Unikalną cechą tej techniki jest to, że pozwala ona na śledzenie linii i funkcjonalną analizę genetyczną genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki. Do procedury przystąpią Carmen Streicher, technik, Nicole Amberge, doktorantka, Gisselle Cheung, doktorant i Andy Hansen, doktorant z mojego laboratorium. Aby wywołać zdarzenia rekombinacji MADM u myszy eksperymentalnych, należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, aby podać pojedyncze wstrzyknięcie tamoksyfenu dootrzewnowego do matki w ciąży. Od analizy klonalnej MADM do postnatalnych punktów czasowych. W dniu embrionalnym od 18 do 19 umieść ciężarną mysz w pozycji leżącej na plecach i zdezynfekuj sierść 70% etanolem. Wykonaj małe nacięcie w skórze w dolnej części brzucha nad macicą i wykonaj drugie nacięcie przez mięśnie i ścianę mięśni brzucha, aby odsłonić otrzewną. Użyj nożyczek, aby oddzielić macicę od otaczających tkanek i umieść nienaruszoną macicę w rękawiczce z ciepłą wodą. Następnie użyj nożyczek i palców z cienką końcówką, aby ostrożnie otworzyć ściany macicy, aby uwolnić zarodki. Oczyść młode, delikatnie naciskając od czasu do czasu klatkę piersiową, aby zainicjować oddychanie przed przekazaniem zwierząt prenatalnych matce zastępczej. Aby pobrać neuronalną tkankę klona MADM, umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na tacce do operacji perfuzji i zdezynfekuj sierść 70% etanolem. Użyj nożyczek i kleszczy, aby wykonać jedno nacięcie przez skórę i jedno nacięcie przez warstwę mięśni. Gdy jama klatki piersiowej jest widoczna, powąchaj i podnieś membranę, aby odsłonić serce, a następnie ostrożnie przytnij i przypnij klatkę piersiową do tacy chirurgicznej. włóż igłę podłączoną do rurki pompy perystaltycznej wypełnionej PBS do dolnej lewej komory serca i użyj małych nożyczek Iris, aby wykonać nacięcie w tylnym końcu prawego przedsionka. Perfuzja układu sercowo-naczyniowego za pomocą PBS, a następnie natychmiastowa perfuzja ze świeżo przygotowanym lodowatym 4% paraformaldehydem w PBS. Po zakończeniu perfuzji należy usunąć mózg poprzez staranną sekcję i umieścić pobrany narząd w co najmniej pięciokrotnie większej objętości mózgu niż świeży 4% paraformaldehyd przez noc w temperaturze 4

lineage-tracing-clonal-analysis-developing-cerebral-cortex-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę in vivo służącą do badania funkcji genów w mózgu po urodzeniu. Rekombinowane AAV wykazujące ekspresję Cre i/lub białka fluorescencyjnego są wstrzykiwane do mózgu noworodka myszy. Uzyskano mozaikową inaktywację genów oraz rzadkie znakowanie neuronów, co umożliwia szybką analizę funkcji genów w procesach kluczowych dla rozwoju obwodów neuronalnych.

Mozaikowa analiza funkcji genów w postnatalnym rozwoju mózgu myszy z wykorzystaniem rekombinacji Cre opartej na wirusach

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Tutaj prezentujemy protokół techniki etykietowania mozaiki, który pozwala na wizualizację neuronów pochodzących ze wspólnej komórki progenitorowej w dwóch różnych kolorach. Ułatwia to analizę linii neuronalnej z możliwością datowania pojedynczych neuronów na narodziny i badania funkcji genów w tych samych neuronach różnych osób.

Analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem MARCM w bliźniaczej plamce

Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie do badania zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym. W tym miejscu opisujemy protokół wideomikroskopii poklatkowej pierwotnych komórek kory mózgowej, który umożliwia szczegółowe badanie faz odgrywanych podczas progresji linii od pierwotnych nerwowych komórek macierzystych do zróżnicowanych neuronów i gleju.

Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej za pomocą systemu hodowli 2D

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Ta metoda opisuje użycie modelu myszy R26R-Confetti (Confetti) do badania zmineralizowanych tkanek, obejmując wszystkie etapy od strategii hodowlanej do pozyskiwania obrazów. Dołączony jest ogólny protokół, który można zastosować do wszystkich tkanek miękkich oraz zmodyfikowany protokół, który można zastosować do tkanek zmineralizowanych.

Klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek

Astrocyty jednolicie układają korę mózgową, co utrudnia analizę ich złożonej morfologii na poziomie komórkowym. Dostarczony tutaj protokół wykorzystuje wielokolorowe znakowanie oparte na elektroporacji in utero w celu wyodrębnienia astrocytów korowych i przeanalizowania ich objętości i morfologii za pomocą przyjaznego dla użytkownika potoku analizy obrazu.

Elektroporacja in utero wieloadresowalnych markerów kolorystycznych integrujących genom (MAGIC) w celu indywidualizacji astrocytów korowych myszy

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Poznaj metodę MADM do śledzenia linii komórkowych i analizy genetycznej na poziomie pojedynczych komórek u myszy. Ta technika umożliwia ilościowe badanie zachowań progenitorów w rozwoju kory mózgowej.

Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)

Przeglądaj więcej filmów