Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)
8 maja 2020
Przedstawiono protokół do śledzenia linii i funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki za pomocą analizy mozaikowej z podwójnymi markerami (MADM). Analiza klonalna MADM zapewnia ilościowe ramy do pomiaru zachowania proliferacyjnego, produkcji komórkowej i pokrewieństwa liniowego poszczególnych komórek progenitorowych i ich komórek potomnych.
Analiza mozaiki z technologią podwójnych markerów to potężna metoda, która może dostarczyć wysoce ilościowych informacji na temat zachowań proliferacyjnych i wyników piwnicznych poszczególnych komórek macierzystych. Unikalną cechą tej techniki jest to, że pozwala ona na śledzenie linii i funkcjonalną analizę genetyczną genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki. Do procedury przystąpią Carmen Streicher, technik, Nicole Amberge, doktorantka, Gisselle Cheung, doktorant i Andy Hansen, doktorant z mojego laboratorium. Aby wywołać zdarzenia rekombinacji MADM u myszy eksperymentalnych, należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, aby podać pojedyncze wstrzyknięcie tamoksyfenu dootrzewnowego do matki w ciąży. Od analizy klonalnej MADM do postnatalnych punktów czasowych. W dniu embrionalnym od 18 do 19 umieść ciężarną mysz w pozycji leżącej na plecach i zdezynfekuj sierść 70% etanolem. Wykonaj małe nacięcie w skórze w dolnej części brzucha nad macicą i wykonaj drugie nacięcie przez mięśnie i ścianę mięśni brzucha, aby odsłonić otrzewną. Użyj nożyczek, aby oddzielić macicę od otaczających tkanek i umieść nienaruszoną macicę w rękawiczce z ciepłą wodą. Następnie użyj nożyczek i palców z cienką końcówką, aby ostrożnie otworzyć ściany macicy, aby uwolnić zarodki. Oczyść młode, delikatnie naciskając od czasu do czasu klatkę piersiową, aby zainicjować oddychanie przed przekazaniem zwierząt prenatalnych matce zastępczej. Aby pobrać neuronalną tkankę klona MADM, umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na tacce do operacji perfuzji i zdezynfekuj sierść 70% etanolem. Użyj nożyczek i kleszczy, aby wykonać jedno nacięcie przez skórę i jedno nacięcie przez warstwę mięśni. Gdy jama klatki piersiowej jest widoczna, powąchaj i podnieś membranę, aby odsłonić serce, a następnie ostrożnie przytnij i przypnij klatkę piersiową do tacy chirurgicznej. włóż igłę podłączoną do rurki pompy perystaltycznej wypełnionej PBS do dolnej lewej komory serca i użyj małych nożyczek Iris, aby wykonać nacięcie w tylnym końcu prawego przedsionka. Perfuzja układu sercowo-naczyniowego za pomocą PBS, a następnie natychmiastowa perfuzja ze świeżo przygotowanym lodowatym 4% paraformaldehydem w PBS. Po zakończeniu perfuzji należy usunąć mózg poprzez staranną sekcję i umieścić pobrany narząd w co najmniej pięciokrotnie większej objętości mózgu niż świeży 4% paraformaldehyd przez noc w temperaturze 4
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół śledzenia linii komórkowych oraz funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydackich na poziomie pojedynczych komórek z wykorzystaniem analizy mozaikowej z podwójnymi markerami (MADM). Klonalna analiza MADM umożliwia ilościowy pomiar zachowania proliferacyjnego oraz wydajności komórkowej poszczególnych progenitorów i ich komórek potomnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Śledzenie linii komórkowych
- Analiza genetyczna
- Biologia komórek macierzystych
Wstęp
- Technologia MADM jest kluczowa dla zrozumienia proliferacji komórek.
- Metoda ta umożliwia śledzenie procesów na poziomie pojedynczej komórki.
- Zastosowania obejmują ocenę efektów komórkowych oraz relacji linii komórkowych.
Zastosowane metody
- Analiza mozaikowa z podwójnymi markerami (MADM)
- Model eksperymentalny: Myszy
- Techniki obejmują iniekcje dosytrojnościowe oraz perfuzję tkanek.
Główne wyniki
- Umożliwiono szczegółową analizę zachowania komórek progenitorowych.
- Uzyskano wgląd w relacje lineage komórek potomnych.
- Wykazano niezawodną metodę funkcjonalnej analizy genetycznej.
Wnioski
- Niniejsza praca przedstawia kompleksowy protokół wykorzystania MADM w analizie genetycznej.
- Uzyskane wyniki wnoszą znaczący wkład w dziedzinę biologii rozwoju.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza mozaikowa z podwójnymi markerami (Mosaic Analysis with Double Markers, MADM) umożliwia niespotykaną dotąd rozdzielczość na poziomie pojedynczych komórek w śledzeniu linii komórkowych i analizie klonalnej w rozwijającej się korze mózgu, bezpośrednio odpowiadając na wyzwanie związane z mapowaniem losów i wzorców podziałów neuralnych komórek macierzystych. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną w walidacji wczesnych celów neurorozwojowych i wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w decyzjach dotyczących portfolio CNS. Ilościowe i jakościowe wyniki MADM pozycjonują tę metodę jako krytyczne narzędzie do funkcjonalnych badań genetycznych w potokach R&D skoncentrowanych na neurobiologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę przejść linii komórkowych oraz trybów podziału neuralnych komórek macierzystych.
- Wspiera walidację funkcjonalną genów kandydackich w szlakach neurorozwojowych.
- Zmniejsza ryzyko mechanistyczne poprzez rozróżnienie subklonów kontrolnych i mutantów in vivo.
- Ułatwia wysokopoziomowy wybór celów dla programów terapeutycznych ukierunkowanych na OUN.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Generuje zwalidowane mapy linii komórkowych w rozdzielczości pojedynczych komórek do późniejszego przesiewania fenotypowego.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki dotyczące proliferacji progenitorów i specyfikacji ich losów.
- Wspiera standaryzację testów poprzez umożliwienie analizy porównawczej w obrębie tego samego środowiska tkankowego.
- Przygotowuje stabilne systemy biologiczne do oceny związków w kontekście rozwoju układu nerwowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki śledzenia linii komórkowych z formowaniem obwodów neuronalnych istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania manipulacji genetycznych po walidację w modelach przedklinicznych.
- Wspiera optymalizację rozwoju celów terapeutycznych w OUN w oparciu o funkcjonalne dowody in vivo.
- Dostarcza translacyjnych informacji o biomarkerach poprzez analizę klonalną progenitorów neuronalnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Śledzenie linii komórkowych w oparciu o metodę MADM integruje etapy od wczesnego odkrycia, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną w projektach badawczych skoncentrowanych na OUN.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia wysokorozdzielcze testowanie hipotez dotyczących losów i wzorców podziału neuralnych komórek macierzystych.
- Screening: Dostarcza ilościowe, powtarzalne dane o liniach komórkowych do rozwoju testów i screeningu związków.
- Analityka: Zapewnia wyniki optyczne i statystyczne do porównywania zachowań progenitorów kontrolnych i mutantów.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z modelami przedklinicznymi poprzez mapowanie wyników linii komórkowych in vivo.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Możliwość adaptacji do każdej niszy komórek macierzystych myszy z odpowiednimi sterownikami CreERT2, co wspiera skalowalność platformy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad liniami komórkowymi neuronów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy śledzenia linii komórkowych i analizy klonalnej w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfelach projektów dotyczących OUN.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów neurorozwojowych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalne dane in vivo.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu manipulacji genetycznych, śledzenia linii komórkowych in vivo oraz sekcji neuroanatomicznej.
- Wymagany jest dostęp do modeli mysich z driverami CreERT2 oraz zaawansowana infrastruktura obrazowania.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności analiz klonalnych i interpretacji danych.
- Metoda jest adaptowalna do różnych nisz komórek macierzystych przy zastosowaniu odpowiednich driverów genetycznych i protokołów obchodzenia się z tkankami.
- Metoda jest ograniczona do systemów mysich, w których możliwe jest zastosowanie narzędzi genetycznych i uzyskanie dostępu do tkanek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
