Name: System gnotobiotyczny do badania składania mikrobiomu w filosferze i fermentacji warzywnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj metodę uprawy bez zarodnikowej kapusty Napa do badania interakcji mikrobiologicznych w filosferze i fermentacji warzywnej. Technika umożliwia powiązanie struktury społeczności mikrobowych z ich funkcją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport i Claire Fogan zapewniły wsparcie techniczne, a Ruby Ye i Casey Cosetta dostarczyły pomocnych komentarzy na temat wczesnych wersji tego manuskryptu.

1. Uprawa kapusty wolnej od zarazków
<ol>
	<li>Przygotowanie sprzętu do uprawy kapusty wolnej od zarazków
	<ol>
		<li>Czyszczenie kalcynowanej gliny w celu usunięcia drobnych cząstek pyłu
		<ol>
			<li>Glinę kalcynowaną (Tabela Materiałów) spłucz co najmniej 3x wodą z kranu; odcedź wodę. 
			UWAGA: Glinka kalcynowana wytwarza bardzo drobny pył i zaleca się noszenie maski ochronnej (Tabela materiałów) podczas prania.</li>
			<li>Rozprowadź kalcynowaną glinę cienką warstwą (~4 cm) na tacce autoklawu i autoklaw w suchym cyklu (ogrzewanie w temperaturze 121 °C przez 20 minut i 20 minut schnięcia) w celu sterylizacji.</li>
			<li>Pozostaw kalcynowaną glinę do całkowitego wyschnięcia przed użyciem, rozkładając ją na tacach i umieszczając w ciepłym inkubatorze (30−37 °C) na co najmniej tydzień. Mieszać co 3 dni, aby całkowicie wysuszyć kalcynowaną glinę, tak aby wchłonęła równomierną ilość bulionu odżywczego Murashige i Skoog (MS) (sekcja 1.2). 
			UWAGA: Suszenie pomaga również utrzymać objętość kalcynowanej gliny nawet po jej zważeniu do probówek. Odpowiednie byłoby również suszenie w inny sposób, taki jak suszarka w piecu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Czyszczenie szkła do uprawy kapusty wolnej od zarazków
		<ol>
			<li>Dokładnie wyczyść i wysterylizuj szklane probówki (tabela materiałów) między każdym użyciem. Namocz probówki przez 30 minut w 30% roztworze wybielacza i dobrze spłucz wodą z kranu przed czyszczeniem w kwaśnym płynie na ustawieniu bakteriologicznym. Dwukierunkowe nakrętki do probówek z kwasem (tabela materiałów) między użyciami.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sterylizacja powierzchniowa nasion kapusty
		<ol>
			<li>Umieść do 100 nasion kapusty pekińskiej (B. rapa var pekinensis) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
			UWAGA: Dodanie więcej niż 100 nasion do jednej probówki mikrowirówki lub zmiana rozmiaru probówki może wpłynąć na szybkość kiełkowania nasion z powodu braku usuwania okrywy nasiennej.</li>
			<li>Dodaj 1 ml 70% etanolu do nasion i wiruj przez 5 minut. Wyrzuć etanol za pomocą pipety.</li>
			<li>Dodaj 1 ml 50% wybielacza i wiruj przez 5 minut. Wylej roztwór wybielacza za pomocą pipety.</li>
			<li>Dodaj 1 ml autoklawowanej wody dejonizowanej i wiruj przez 5 minut. Wylej wodę dejonizowaną za pomocą pipety.</li>
			<li>Powtórz krok 1.1.3.4 3x, aby spłukać cały wybielacz. Namocz nasiona w sterylnej wodzie dejonizowanej przez 2-8 godzin przed sadzeniem, aby zmiękczyć okrywę nasienną.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawa kapusty wolnej od zarazków 
	UWAGA: Kapusta pekińska (B. rapa var pekinensis) jest uprawiana w szklanych tubach (15 cm x 2,5 cm) zawierających kalcynowaną glinę nasączoną bulionem odżywczym Murashige and Skoog (MS) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Odważyć 10 g czystej kalcynowanej gliny do czystej szklanej rurki (15 cm x 2,5 cm).</li>
		<li>Przygotuj bulion odżywczy MS, rozpuszczając 4,4 g pożywki MS w 1 l wody dejonizowanej. Dodaj bulion odżywczy MS (~ 9 ml) do każdej szklanej probówki, aby przykryć kalcynowaną glinę za pomocą pipety. 
		UWAGA: Stojący płyn w tubie zapobiegnie kiełkowaniu nasion, więc może być konieczne dodanie nieco mniej bulionu MS do niektórych probówek.</li>
		<li>Luźno zakręć szklane probówki dwukierunkowymi nakrętkami probówek 22 mm i autoklaw (121 °C przez 60 min). Wyjmując je z autoklawu, wciśnij nakrętki na szklane rurki, aby je uszczelnić. Przed użyciem schłodzić rurki do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Delikatnie umieść jedno sterylne nasiono kapusty na środku każdej probówki za pomocą sterylnych, bardzo długich (25,4 cm) kleszczyków. Umieść probówki w 7-kierunkowej tacy, a następnie umieść pod stojakami na światło (żarówki fluorescencyjne T5 o pełnym spektrum lub inny zestaw oświetleniowy do wzrostu roślin) z 16-godzinnym cyklem świetlnym w temperaturze 24 °C. 
		UWAGA: Nasiona kiełkują w ciągu nocy i rozwijają swój pierwszy prawdziwy liść po 5 dniach. Prawdziwy liść to pierwszy liść naczyniowy po uformowaniu się liścieni. Ma bardziej pomarszczoną krawędź, a u Brassica rapa jest pokryta włoskami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie sterylności kapusty wolnej od zarazków 
	UWAGA: Aby sprawdzić, czy kapusta jest wolna od zarazków, wybierz kilka (5-10) kapusty z każdej partii i rozłóż na talerzu, aby ustalić, czy obecne są jakiekolwiek kolonie hodowlane.
	<ol>
		<li>Delikatnie wyjmij kapustę ze szklanych rurek, chwytając podstawę rośliny wysterylizowanymi kleszczami i wyciągając ją. Przed całkowitym wyjęciem kapusty z rurki ostrożnie odetnij korzenie za pomocą wysterylizowanych nożyczek do preparowania. Zagęścić liście kapusty w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Większa kapusta może wymagać usunięcia jednego lub dwóch większych liści, gdy kapusta jest jeszcze w probówce, aby ułatwić włożenie kapusty do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Te większe liście można dodać do probówki o pojemności 1,5 ml po umieszczeniu reszty kapusty w probówce, jeśli wymagana jest cała kapusta.</li>
		<li>Dodać 400 μl 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) do każdej 1,5 ml probówki mikrowirówkowej. Za pomocą sterylnego mikrotłuczka homogenizuj kapustę, tłucząc 30 razy.</li>
		<li>Umieść 100 μl homogenacji kapusty na płytkach agarowych w celu ustalenia, czy w próbce znajdują się jakiekolwiek zanieczyszczenia. Większość bakterii znajdujących się w filosferze będzie rosła na płytkach agarowych z soi tryptycznej (TS). Podczas powlekania homogenatu kapusty należy używać końcówek do pipet z szerokim otworem, ponieważ homogenat do kapusty jest gęsty i może zatkać zwykłe końcówki pipet.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Inokulacja filosfery roztworami mikrobiologicznymi
<ol>
	<li>Wytwarzanie zapasów glicerolu szczepów inokulacyjnych 
	UWAGA: W tabeli 1 wymieniono izolaty drobnoustrojów, które można zastosować na tym etapie. Można tu również zastosować inne izolaty filosfery.
	<ol>
		<li>Gęsto rozprowadź pojedyncze kolonie ze świeżej smugi na dwóch/trzech nowych płytkach tego samego podłoża, aby uzyskać wiele kolonii.</li>
		<li>Pozwól smugom rosnąć przez 2-5 dni, a następnie zeskrob kolonie ze wszystkich płytek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 15 ml 15% glicerolu i dokładnie wymieszaj.</li>
		<li>Przenieść podwielokrotność 1 ml dobrze wymieszanego bulionu glicerolowego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać zapasy glicerolu w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Zachowaj pozostałe 14 ml glicerolu w temperaturze -80 °C, ponieważ do zaszczepiania kapusty wymagane są stosunkowo duże objętości roztworu inokulacyjnego.</li>
		<li>Na tydzień przed użyciem rozmrozić 1,5 ml probówkę zawierającą 1 ml bulionu glicerolu (z kroku 2.1.3) na lodzie, rozcieńczyć i rozcieńczyć w kilku różnych rozcieńczeniach (np. 10-4, 10-5 i 10-6) w celu określenia stężenia (jednostka tworząca kolonię [CFU] na μl) w 14 ml roztworu do inokulacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterylizacja butelek z rozpylaczem do inokulacji
	<ol>
		<li>Zdemontuj bursztynowe okrągłe butelki z pompką Boston (59 ml) i namocz wszystkie elementy (pompkę, rurkę, nakrętkę i butelkę) w 30% roztworze wybielacza na 30 minut w dużym plastikowym pojemniku z ciasno przylegającą pokrywką.</li>
		<li>Po namoczeniu ostrożnie wylej cały wybielacz z pojemnika, podnosząc tylko jeden róg pokrywy pojemnika.</li>
		<li>Wypłucz butelki, napełniając plastikowy pojemnik autoklawowaną wodą dejonizowaną (~1 l w zależności od wielkości pojemnika) i ostrożnie wylej wodę dejonizowaną, ponownie podnosząc pokrywkę w jednym rogu.</li>
		<li>Wysterylizuj komorę bezpieczeństwa biologicznego, spryskując ją 70% roztworem etanolu i włączając światło UV na 30 min. 
		UWAGA: Kontynuuj tę pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby nie było ryzyka zanieczyszczenia mikrobiologicznego butelek podczas suszenia na powietrzu.</li>
		<li>Wyjmij butelki z dużego plastikowego pojemnika i napełnij każdą butelkę autoklawowaną wodą dejonizowaną za pomocą pipety. Zmontuj pompki i umieść po jednej w każdej butelce. Przepompuj wodę dejonizowaną przez każdą butelkę (10 rozpyleń na butelkę), aby usunąć wybielacz z elementu pompy butelki.</li>
		<li>Powtórz krok 2.2.5, aby upewnić się, że cały wybielacz został usunięty ze szklanych butelek.</li>
		<li>Przetestuj, czy butelki są sterylne, umieszczając numer na każdej butelce (przyklejając taśmę laboratoryjną z boku butelki, gdy jest całkowicie sucha), a następnie dodaj 10 ml 1x PBS do każdej z butelek i przepompuj 3 spraye na płytkę agarową TS. Po rozpyleniu inkubować płytki przez tydzień w temperaturze pokojowej. Jeśli na talerzu wyrosną jakieś kolonie, oznacza to, że odpowiednia butelka nie była sterylna i nie powinna być używana do eksperymentów.</li>
		<li>Przed przechowywaniem sterylnych butelek należy usunąć wszystkie pozostałe PBS i pozostawić butelki do całkowitego wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Sterylne butelki należy przechowywać w sterylnym plastikowym pojemniku (zwykle pojemniku używanym do wybielania butelek) do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie inokulum mikrobiologicznego i opryskiwanie kapusty wolnej od zarazków 
	UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego, ponieważ rozpylanie aerozoluje roztwory mikrobiologiczne, które mogą zanieczyścić powierzchnie robocze lub stanowić zagrożenie dla zdrowia, jeśli są przeprowadzane na stole laboratoryjnym. 
	UWAGA: Kapusta utworzy prawdziwe liście po 5 dniach, dlatego zaleca się odczekanie tygodnia po posadzeniu kapusty przed zaszczepieniem jakimikolwiek roztworami mikrobiologicznymi. Ponieważ rurki są uszczelnione, nie ma potrzeby podlewania kapusty. Eksperymenty najlepiej przeprowadzać w ciągu miesiąca od posadzenia, ponieważ małe rurki ograniczają wzrost kapusty.
	<ol>
		<li>Rozmrozić zapasy glicerolu na lodzie i rozcieńczyć w 1x PBS do pożądanego stężenia inokulacji (stężenie określone przez rozmrożenie i posiew 1 ml podwielokrotności w kroku 2.1.4). 
		UWAGA: Można stosować różne poziomy inokulacji, ale izolaty filosfery mogą wzrosnąć z 104 do 108 CFU/ml gnojowicy kapusty w ciągu 10 dni.</li>
		<li>Dodać 10 ml rozcieńczonego bulionu glicerolowego do sterylnej butelki z pompką i przepompować 5 aerozoli do dużej zlewki do zbierania odpadów, aby usunąć wszelkie pozostałości PBS z elementu pompy do butelki.</li>
		<li>Zdejmij pokrywkę z rurki do kapusty, przechyl kapustę w kierunku butelki z rozpylaczem i spryskaj każdą kapustę 3 pompkami roztworu do zaszczepiania, który zapewnia ~600 μL inokulum.</li>
		<li>Po zaszczepieniu zbierz podzbiór kapusty, aby ocenić rzeczywiste stężenie inokulacji wejściowej. Wyjmij kapustę z rurki za pomocą wysterylizowanych kleszczy. Odetnij korzenie sterylnymi nożyczkami do preparowania, a następnie ostrożnie umieść kapustę w zważonej sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Należy zapisać masę kapusty do przyszłych obliczeń, jeżeli do obliczeń wymagane są jtk/g kapusty.</li>
		<li>Dodaj 400 μl 1x PBS do każdej 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej kapustę i użyj sterylnego mikrotłuczka do homogenizacji kapusty do 1x PBS, mieląc ją 30x.</li>
		<li>Rozcieńczyć homogenat kapusty (jeśli jest to wymagane) i wyłożyć mieszankę z kapustą z pocierakiem. Do pipetowania gnojowicy z kapusty używaj końcówek z szerokimi otworami, ponieważ będzie ona gęsta i pełna kawałków tkanki roślinnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie sterylnego ekstraktu warzywnego
UWAGA: Ta metoda jest zmodyfikowaną wersją produkcji sterylnych pożywek z kapusty18,19.
<ol>
	<li>Kup kapustę w supermarkecie. W laboratorium usuń i wyrzuć najbardziej zewnętrzne liście kapusty. Posiekaj całą pozostałą kapustę, aby zmieściła się w blenderze i zhomogenizuj kapustę na drobny miąższ, tj. kapusta nie stanie się drobniejsza przy dalszym miksowaniu. 
	UWAGA: Każdy blender, który może posiekać kapustę na gładką, jednorodną miazgę, powinien być odpowiedni do tej metody.</li>
	<li>Zważ homogenat zmiksowanej kapusty i dodaj 2 ml wody destylowanej na gram kapusty. Przefiltruj zmiksowaną gnojowicę z kapusty przez 2 warstwy filtrów do kawy w koszu (niebielony papier).</li>
	<li>Wlej gnojowicę z kapusty do probówek wirówkowych (wielkość zależy od wirówki). Odwirować przefiltrowaną gnojowicę kapusty o sile 20 000 x g przez 20 minut, aż duże cząstki opadną z roztworu. 
	UWAGA: Konieczne jest odwirowywanie gnojowicy kapusty przez długi czas, ponieważ cząstki kapusty szybko zatykają sterylizator z filtrem.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej usunąć supernatant z resztek kapusty ogranulowanej, uważając, aby nie naruszyć kapusty ogranulowanej. Jeśli chcesz odtworzyć warunki fermentacji, w których stosuje się standardowe stężenia soli, dodaj 2% w/v NaCl na tym etapie (tj. przed sterylizacją filtra).</li>
	<li>Filtr Wysterylizuj ekstrakt warzywny za pomocą filtra 0,2 μm (500 ml lub 1 l) podłączonego do próżni. Dozować do sterylnych probówek (probówek wirówkowych o pojemności 50 ml lub probówek wirówkowych o pojemności 15 ml) i zamrażać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
4. Inokulacja sterylnego ekstraktu roślinnego
<ol>
	<li>Rozmrozić SVE i rozlać 490 μl do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Należy użyć wystarczającej liczby probówek, aby uzyskać co najmniej pięć powtórzeń na zabieg na punkt czasowy, ponieważ każdy pomiar punktu czasowego jest destrukcyjny.</li>
	<li>Rozmrozić zapasy glicerolu izolatów mikrobiologicznych na lodzie i rozcieńczyć 1x PBS do pożądanego stężenia. Stężenie bakterii kwasu mlekowego może wynosić zaledwie 5 000 CFU na ml SVE. Aby osiągnąć to stężenie, należy rozcieńczyć zapasy do 250 jtk/μl, ponieważ 10 μl zostanie użyte do zaszczepienia o całkowitej objętości 500 μl.</li>
	<li>Zaszczepić SVE 10 μl rozcieńczonego izolatu drobnoustrojów. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Inkubować w żądanej temperaturze (14 °C dla temperatury produkcji kimchi lub 24 °C dla najcieplejszej fermentacji kiszonej kapusty).</li>
	<li>Zmierz tempo wzrostu izolatu drobnoustrojów w SVE, zbierając probówki z replikami w dniu 1, dniu 2, dniu 4, dniu 7 i dniu 14, 
	UWAGA: Fermentacja przebiega szybko na początku i zwalnia z czasem. W związku z tym posiadanie większej liczby początkowych punktów czasowych daje większą rozdzielczość dynamiki przebiegu fermentacji.</li>
	<li>W każdym punkcie czasowym dobrze wymieszaj zaszczepiony SVE, pipetując kilka razy w górę i w dół. Seryjnie rozcieńczyć zaszczepiony SVE w 1x PBS i umieścić na płytkach agarowych. Inkubuj płytki agarowe przez 4−7 dni przed zliczeniem kolonii. 
	UWAGA: Agar Man, Rogosa i Sharpe (MRS) powinien być używany do wyliczania wszystkich bakterii kwasu mlekowego, dekstroza peptonu drożdżowego (YPD) powinna być używana do drożdży, a agar TS do większości innych izolatów bakterii z filosfery.</li>
	<li>Rejestruj pH próbek w każdym punkcie czasowym za pomocą mikrosondy pH. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać po posiewaniu, ponieważ sonda pH będzie przenosić komórki między probówkami/zabiegami.</li>
</ol>

<ol><li>Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+seasonality+of+core+phyllosphere+microbiota+on+perennial+biofuel+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops.</a> Nature Communications. 10 (1), 4135(2019).</li>
<li>Pii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+interactions+in+the+rhizosphere%3A+beneficial+influences+of+plant+growth-promoting+rhizobacteria+on+nutrient+acquisition+process.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+and+Fertility+of+Soils%22%5BJournal%5D)">Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review.</a> Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).</li>
<li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).</li>
<li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li>
<li>Dinu, L. D., Bach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+the+phyllosphere+of+lettuce%3A+a+food+safety+risk+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).</li>
<li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).</li>
<li>Bringel, F., Couée, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+roles+of+phyllosphere+microorganisms+at+the+interface+between+plant+functioning+and+atmospheric+trace+gas+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 486(2015).</li>
<li>Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+succession+and+stochastic+variation+in+the+assembly+of+Arabidopsis+thaliana+phyllosphere+communities%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities.</a> mBio. 5 (1), e00682(2014).</li>
<li>Carlström, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbiota+reveal+priority+effects+and+keystone+strains+in+the+Arabidopsis+phyllosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).</li>
<li>Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiology+of+the+phyllosphere%3A+a+playground+for+testing+ecological+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts.</a> Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).</li>
<li>Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+abundance+of+phyllosphere+bacteria+are+linked+to+insect+herbivory%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory.</a> Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).</li>
<li>Williams, T. R., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phyllosphere+microbiota+composition+and+microbial+community+transplantation+on+lettuce+plants+grown+indoors%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors.</a> mBio. 5 (4), e01564(2014).</li>
<li>Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+vegetables+and+fruits+through+lactic+acid+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation.</a> Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Köberl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+microbiome+shift+during+fermentation+of+medicinal+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13461(2019).</li>
<li>Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance%2C+diversity+and+plant-specific+adaptations+of+plant-associated+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria.</a> Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).</li>
<li>Miller, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+limitation+constrains+the+abundance+of+lactic+acid+bacteria+in+the+Napa+cabbage+phyllosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269(2019).</li>
<li>Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rates+and+fermentation+patterns+of+lactic+acid+bacteria+associated+with+sauerkraut+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Milk+and+Food+Technology%22%5BJournal%5D)">Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation.</a> Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).</li>
<li>Yildiz, F., Westhoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+growth+of+lactic+acid+bacteria+in+cabbage+juice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice.</a> Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).</li>
<li>Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+analysis+of+sauerkraut+fermentation+reveals+a+stable+and+rapidly+established+community%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community.</a> Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77(2018).</li>
<li>Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+tracking+and+succession+of+kimchi+lactic+acid+bacteria+during+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation.</a> Journal of Food Science. 80 (8), M1871(2015).</li>
<li>Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiny+Microbes%2C+Big+Yields%3A+enhancing+food+crop+production+with+biological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions.</a> Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).</li>
<li>Knief, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaproteogenomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+phyllosphere+and+rhizosphere+of+rice%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice.</a> The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).</li>
<li>Wuyts, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carrot+Juice+Fermentations+as+Man-Made+Microbial+Ecosystems+Dominated+by+Lactic+Acid+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134(2018).</li>
<li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li>
<li>Steinkraus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+fermentation+in+the+production+of+foods+from+vegetables%2C+cereals+and+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wolne od zarazków rośliny kapusty pekińskiej wykorzystano do badania ograniczenia rozprzestrzeniania się bakterii kwasu mlekowego w filosferze kapusty napa17. Wolna od zarazków kapusta pekińska może być również używana do testowania indywidualnego lub parzystego wzrostu w fyllosferze (ryc. 1). Metody wytwarzania sterylnego ekstraktu warzywnego zostały przetestowane dla trzech różnych odmian kapusty: czerwonej, zielonej i Napa. Każdy z tych SVE działa jako niezawodna p...

Różnorodność mikrobiologiczna fyllosfery odgrywa ważną rolę w utrzymaniu zdrowia roślin i może również wpływać na zdolność roślin do wytrzymywania stresu środowiskowego1,2,3,4,5. Z kolei zdrowotność upraw ma bezpośredni wpływ na bezpieczeństwo i jakość żywności6,7. Rośliny odgrywają rolę w funkcjonowaniu ekosystemu, a związane z nimi mikrobiomy wpływają zarówno na zdolność roślin do wykonywania tych czynności, jak i bezpośrednio wpływają na samo środowisko8. Podczas gdy naukowcy zaczęli rozszyfrowywać funkcję i skład filosfery, procesy ekologiczne, które wpływają na gromadzenie się społeczności mikroorganizmów w filosferze, nie są w pełni zrozumiałe9,10. Mikrobiom filosfery jest doskonałym systemem eksperymentalnym do badania ekologii mikrobiomów11. Społeczności te są stosunkowo proste, a wielu członków społeczności można rozwijać na standardowych nośnikach laboratoryjnych10,12,13.
Fermentowane warzywa to system, w którym struktura społeczności filosfery ma ważne konsekwencje. Zarówno w kiszonej kapuście, jak i kimchi, drobnoustroje, które naturalnie występują na liściach warzyw (fyllosfera gatunków Brassica) służą jako inokulum do fermentacji14,15. Bakterie kwasu mlekowego (LAB) są uważane za wszechobecnych członków mikrobiomów roślinnych, jednak mogą występować w niskiej liczebności w filosferze16. Silna selekcja abiotyczna podczas fermentacji powoduje zmianę składu społeczności mikrobiologicznej, umożliwiając wzrost liczebności bakterii kwasu mlekowego. W miarę wzrostu LAB wytwarzają kwas mlekowy, który tworzy kwaśne środowisko fermentowanych produktów roślinnych17. Związek między filosferą a fermentem daje możliwość wykorzystania warzyw jako modelu do zrozumienia, jak zbudowane są mikrobiomy.
Opracowaliśmy metody uprawy wolnej od zarazków kapusty pekińskiej i zaszczepienia jej specyficznymi zbiorowiskami mikroorganizmów za pomocą butelek z rozpylaczem. Jest to niedroga i niezawodna metoda równomiernego zaszczepiania kapusty pojedynczymi drobnoustrojami lub mieszanymi zbiorowiskami. Opracowano również sterylny ekstrakt roślinny (SVE) z trzech różnych rodzajów/odmian kapusty: czerwonej i zielonej kapusty (Brassica oleracea) oraz kapusty pekińskiej (B. rapa). Dodanie soli do tych SVE odwzorowuje środowisko fermentacji i pozwala na przeprowadzenie na małą skalę i stosunkowo wysokoprzepustowych badań eksperymentalnych nad tworzeniem mikrobiomu fermentacyjnego. Metody te można wykorzystać do badania gromadzenia się zbiorowisk drobnoustrojów w filosferze oraz tego, w jaki sposób dynamika społeczności drobnoustrojów w filosferze może być powiązana z sukcesem fermentacji warzywnej.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>20170-650</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>7-kierunkowa taca</td><td>półkowa Sigma Magenta</td><td>T8654</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynowa okrągła szklana butelka</td><td></td> Boston <td>GPS 712OZSPPK12BR</td><td>Zamawiane na Amazon.com od różnych dostawców</td></tr><tr><td>Filtry do kawy z koszem</td><td>Jeśli Ci zależy</td><td></td><td>(papier niebielony) Zakupiony od Wholefoods</td></tr><tr><td>Bleach (bez rtęci)</td> <td>Rurki</td> ze szkła borokrzemianowego Austin <td>50-010-45</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>47729-586</td><td></td></tr><tr><td>Calcined clay</td><td>Turface</td><td>MVP</td><td>Zamówione Amazon.com w Root Naturally 6 Quart Bags. Wielkość cząstek około 3-5 mm</td></tr><tr><td>Blender Cuisinart</td><td>Cuisinart Robot kuchenny Cuisinart Mini-Prep Plus, nożyczki</td><td></td> do rozwarstwiania na 3 filiżanki 7-389-A Amerykańskie produkty edukacyjne zamówione na Amazon.com Etanol VWR 89125-172 Kleszcze Aven 18434 Zamówione na Amazon.com Glycerol Fisher <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>KleenGuard M10</td><td>Kimberley-Clark</td><td>64240</td><td></td></tr><tr><td>Duży plastikowy pojemnik</td><td>Rubbermaid</td><td></td><td>Zamówione na</td></tr><tr><td>Amazon.com Stojaki na światła</td><td>Gardner's Supply</td><td>39-357</td><td>Żarówki fluorescencyjne T5 o pełnym spektrum</td></tr><tr><td>Magenta tm 2-drożne nasadki</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1934</td><td></td></tr><tr><td>Mężczyzna, Rogosa i Sharpe</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0881-17-5</td><td>To podłoże jest przeznaczone do bulionu i dodaje się 15 g agaru w celu przygotowania talerzy Sonda</td></tr><tr><td>Micro pH</td><td>Thermo Scientific</td><td>8220BNWP</td><td></td></tr><tr><td>Mikropestle</td><td>Carolina</td><td>215828</td><td>Nazywana również tłuczkiem do peletów</td></tr><tr><td>Bulion odżywczy MS</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5519</td><td>Murashige and Skoog Basal Medium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Nasiona kapusty pekińskiej</td><td>Johnny's Select Seeds</td><td>2814G</td><td>B. rapa var pekinensis (Bilko)</td></tr><tr><td>Petri szalka 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Służy do produkcji płytek agarowych</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-842-941</td><td>Teknova</td></tr><tr><td>Pudełko do hodowli tkanek roślinnych</td><td>Sigma</td><td>Magenta GA-7</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny kołek</td><td>Puritan</td><td>10805-018</td><td>Autoklaw przed użyciem do sterylizacji</td></tr><tr><td>Sterylizacja 0,2 i mikro; m filtr</td><td>Nalgene</td><td>974103</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny agar sojowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-17-3</td><td>To podłoże jest przeznaczone do bulionu i dodaje się 15 g agaru do przygotowania talerzy</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z szerokim otworem</td><td>Rainin</td><td>17007102</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże, pepton i dekstroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td>Ta pożywka jest odpowiednia, ale pożywki można również przygotować przy użyciu drożdży, peptonu i dekstrozy, podczas robienia talerzy dodaj 15 g agaru</td></tr></tbody></table>

system gnotobiotyczny do badania składania mikrobiomu w filosferze i fermentacji warzywnej

A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

Filosfera, nadziemna część rośliny, która może być skolonizowana przez mikroby, jest użytecznym systemem modelowym do identyfikacji procesów tworzenia się społeczności mikroorganizmów. Protokół ten przedstawia system badania dynamiki zbiorowisk drobnoustrojów w fyllosferze roślin kapusty pekińskiej. Opisuje, jak uprawiać rośliny wolne od zarazków w probówkach z kalcynowaną gliną i podłożem z bulionu odżywczego. Inokulacja roślin wolnych od zarazków określonymi kulturami mikrobiologicznymi daje możliwość pomiaru wzrostu drobnoustrojów i dynamiki zbiorowisk w filosferze. Dzięki zastosowaniu sterylnego ekstraktu roślinnego wytwarzanego z kapusty można również ocenić zmiany w zbiorowiskach drobnoustrojów, które zachodzą podczas fermentacji. System ten jest stosunkowo prosty i niedrogi do skonfigurowania w laboratorium i może być używany do rozwiązywania kluczowych problemów ekologicznych w tworzeniu społeczności mikrobiologicznych. Daje również możliwość zrozumienia, w jaki sposób skład zbiorowiska filosfery może wpływać na różnorodność mikrobiologiczną i jakość fermentacji warzyw. To podejście do rozwoju gnotobiotycznych zbiorowisk filosfery kapusty może być zastosowane do innych dzikich i rolniczych gatunków roślin.

Tempo wzrostu kapusty pekińskiej 
Metoda sterylizacji nasion została przetestowana na kilku różnych odmianach kapusty pekińskiej (B. rapa var pekinese; Rysunek uzupełniający 1) pochodzących od wielu różnych dostawców i wszystkie rosły spójnie, wykazując podobne tempo wzrostu. Jednakże testowanie tych metod na różnych gatunkach Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B...

Opracowano metodę uprawy kapusty pekińskiej wolnej od zarazków, która umożliwia badaczom ocenę, jak pojedyncze gatunki mikroorganizmów lub wielogatunkowe społeczności mikroorganizmów oddziałują na powierzchnię liści kapusty. Przedstawiono również sterylny ekstrakt roślinny, który można wykorzystać do pomiaru zmian w składzie zbiorowiska podczas fermentacji warzyw.

System gnotobiotyczny do badania składania mikrobiomu w filosferze i fermentacji warzywnej

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

Korzystając z tego protokołu, możemy odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób drobnoustroje gromadzą się i oddziałują w filosferze. Dodatkową zaletą jest to, że stosując sterylny ekstrakt roślinny, możemy powiązać strukturę zbiorowisk sfery filo z ich funkcją podczas fermentacji warzywnej. Techniki te umożliwiają naukowcom przetestowanie, w jaki sposób mikroorganizmy oddziałują w sferze filosfery, a następnie śledzenie, w jaki sposób te społeczności sfery filosfery mogą wpływać na fermentację.Aby wysterylizować nasiona kapusty na powierzchni, zacznij od umieszczenia 100 nasion w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Dodaj jeden mililitr 70% etanolu do probówki i wiruj przez pięć minut. Następnie użyj pipety, aby wyrzucić etanol.Dodaj jeden mililitr 50% wybielacza i wiruj tubkę przez pięć minut, a następnie wyrzuć wybielacz. Opłucz nasiona cztery razy, dodając jeden mililitr autoklawowanej wody dejonizowanej, wirując probówkę, a następnie wylewając wodę. Po ostatnim płukaniu namocz nasiona w wysterylizowanej wodzie dejonizowanej przez dwie do ośmiu godzin, aby zmiękczyć okrywę nasienną przed sadzeniem.Zważ 10 gramów czystej glinki wapniowej do szklanej rurki o wymiarach 15 na 2,5 centymetra. Dodaj około dziewięciu mililitrów przygotowanego bulionu MS do każdej tuby, aby przykryć glinkę z wapniem. Luźno przykryj szklane probówki 22-milimetrowymi dwukierunkowymi nasadkami probówek.Autoklaw probówek w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 60 minut. Wyjmując probówki z autoklawu, wciśnij nakrętki na szklane probówki, aby je uszczelnić, a następnie schłodzić probówki do temperatury pokojowej przed użyciem. Gdy probówki ostygną, użyj bardzo długich kleszczy, aby delikatnie umieścić jedno sterylne nasiono kapusty na środku każdej probówki.Zasznuruj rurki w siedmiokierunkowej tacy i umieść tacę pod lekkimi stojakami z 16-godzinnym cyklem światła w temperaturze 24 stopni Celsjusza. Nasiona rozwiną swój pierwszy prawdziwy liść po pięciu dniach, który jest pierwszym liściem naczyniowym po uformowaniu się liścieni. Ma pomarszczoną krawędź i jest pokryty trójgrzebieniami.Aby przetestować bezpłodność kapusty wolnej od zarodków, delikatnie chwyć podstawę rośliny wysterylizowanymi kleszczami i wyciągnij ją. Przed całkowitym wyjęciem kapusty z rurki ostrożnie odetnij korzenie wysterylizowanymi nożyczkami do preparowania. Następnie zagęść liście kapusty w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej.Dodaj 400 mikrolitrów PBS do każdej mikroprobówki wirówki i użyj sterylnego mikrotłuczka do homogenizacji kapusty. Nanieś 100 mikrolitrów kapusty na homogenację na płytki agarowe, upewniając się, że używasz końcówki pipety z szerokim otworem. Aby przygotować zapasy glicerolu ze szczepów inokulacyjnych, delikatnie rozprowadź poszczególne kolonie na dwóch lub trzech nowych płytkach z tego samego podłoża.Rzędź kolonie przez dwa do pięciu dni, a następnie zeskrob je z talerzy do 15-mililitrowej stożkowej rurki z 15 mililitrami 15% glicerolu. Dokładnie wymieszaj rurkę, aby wymieszać. Porcję jednego mililitra zmieszanego bulionu glicerolowego do mikroprobówki wirówkowej i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do użycia wraz z pozostałymi 14 mililitrami bulionu glicerynowego.Na tydzień przed użyciem rozmrozić jedną mililitrową porcję na lodzie i umieścić ją w kilku różnych rozcieńczeniach w celu określenia stężenia wywaru inokulacyjnego. Gdy kapusta będzie gotowa do zaszczepienia, rozmrozić bulion glicerolu na lodzie i rozcieńczyć go do pożądanego stężenia. Dodać 10 mililitrów rozcieńczonego bulionu do sterylnej butelki z pompką i przepompować pięć aerozoli do dużej zlewki do zbierania odpadów.Zdejmij pokrywkę z rurki do kapusty i przechyl kapustę w kierunku butelki z rozpylaczem. Spryskaj każdą kapustę trzema pompkami roztworu do inokulacji, a następnie zbierz podzbiór kapusty, aby ocenić rzeczywiste stężenie inokulacji wejściowej. Aby zebrać kapustę, wyjmij ją z rurki za pomocą wysterylizowanych kleszczy.Odetnij korzenie sterylnymi nożyczkami do preparowania i ostrożnie umieść je w wstępnie zważonej sterylnej probówce do mikrowirówki. Zapisz wagę kapusty do przyszłych obliczeń. Dodaj 400 mikrolitrów PBS do każdej probówki z kapustą i zmiel ją 30 razy mikrotłuczkiem, a następnie połóż homogenat kapusty za pomocą końcówek pipet z szerokim otworem.Usuń i wyrzuć najbardziej zewnętrzne liście kapusty i posiekaj całą pozostałą kapustę, aby zmieściła się w blenderze. Zmiksuj na drobną miazgę i zważ jednorodną kapustę. Dodaj dwa mililitry wody destylowanej na gram kapusty.Następnie przefiltruj gnojowicę kapusty przez dwie warstwy filtrów do kawy w koszu. Dozować gnojowicę do probówek wirówkowych i odwirowywać ją z prędkością 20 000 razy G przez 20 minut lub do momentu, gdy duże cząstki osiądą z roztworu. Usuń supernatant, uważając, aby nie naruszyć granulowanych resztek kapusty.Aby odtworzyć warunki fermentacji przy standardowych stężeniach soli, dodaj 2% wagowo do objętości chlorku sodu do ekstraktu. Ubij ekstrakt warzywny za pomocą filtra 0,2 mikrometra podłączonego do próżni, dozuj go do sterylnych probówek i zamroź w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Metoda sterylizacji nasion została przetestowana na kilku kapustach pekińskich i wszystkie wykazały podobne tempo wzrostu.Jednak inne gatunki kapustnych odniosły ograniczony sukces, ponieważ rośliny albo miały niską zdolność kiełkowania po sterylizacji, albo łodyga szybko się wydłużała, tworząc wrzecionowato, niezdrową roślinę. Izolaty mikrobiologiczne inokulowano albo jako izolaty pojedynczego szczepu, albo w połączeniu z innym izolatem. W sumie 15 kapusty wolnej od zarodków zostało przetestowanych dla każdego zabiegu i zebranych natychmiast, po czterech dniach lub po 10 dniach od inokulacji.Izolaty wykazały szybki wzrost w filosferze kapusty pekińskiej. Dwa drożdże i trzy bakterie zaszczepiono w trzech różnych rodzajach sterylnego ekstraktu roślinnego lub SVE z kapusty czerwonej, zielonej i pekinowej. Wzrost inokulatów rejestrowano w ciągu 14 dni poprzez punktowe posiewanie pięciu mikrolitrów każdego zabiegu na płytkach agarowych MRS lub YPD.Pomiary pH podczas fermentacji wykazały, że bakterie kwasu mlekowego były zdolne do zakwaszania SVE do poziomu poniżej pH czterech, co wskazuje na ferment, który jest bezpieczny do spożycia. Metody te mają szczególne zastosowanie do mikrobiomu kapusty, ale mogą być przydatne w innych systemach roślinnych. Utrzymanie sterylności systemu może być trudne, nasze protokoły ramowe są szczegółowe, ale uważamy, że każdy krok jest ważny.

a-gnotobiotic-system-for-studying-microbiome-assembly-phyllosphere

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Źródło: Nathoo, N., et al. Hydroponiczny system kouprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych roślina/mikroorganizm oraz sygnalizacji. J. Vis. Exp. (2017).Ten film przedstawia hydroponiczny system wspólnej uprawy do badania interakcji między roślinami a bakteriami w sterylnych warunkach. Sadzonki roślin przenosi się do sterylnego, kwaśnego podłoża wzrostowego, inkubuje i sprawdza pod kątem zanieczyszczenia przed zaszczepieniem Agrobacterium. Aktywowane bakterie...

System wspólnej uprawy do badania reakcji molekularnych gospodarzy roślinnych i bakterii oddziałujących na siebie

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Ten artykuł opisuje szczegółowe protokoły do produkcji urządzeń ekosystemowych (EcoFAB), które umożliwiają badania roślin i interakcji roślina-mikroorganizm w ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Protokoły wytwarzania ekosystemów (EcoFAB) do budowy ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Wydobywanie korzeni roślin z pola, jak również przetwarzanie próbek do endosfery, ryzosfery i gleby są szczegółowo opisane, łącznie z metodami ekstrakcji DNA i analizy danych. Niniejszy artykuł ma na celu umożliwienie innym laboratoriom wykorzystania tych technik do badania mikrobiomów glebowych, endosfery i ryzosfer.

Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami

Tutaj opisujemy hydroponiczny test wzrostu roślin, aby określić ilościowo obecność gatunków i zobrazować przestrzenne rozmieszczenie bakterii podczas początkowej kolonizacji korzeni roślin i po ich przeniesieniu do różnych środowisk wzrostu.

Monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Przedstawiamy protokół dla opartego na szkle, półhydroponicznego systemu eksperymentalnego, wspierającego wzrost różnych filogenetycznie odrębnych roślin z mikrobami lub bez. System jest kompatybilny z różnymi podłożami wzrostowymi i umożliwia nieniszczące pobieranie próbek wysięku korzeniowego do dalszej analizy.

Wszechstronny system szklanych słoików do półhydroponicznego profilowania wysięku korzeniowego

Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Poznaj metodę uprawy bez zarodnikowej kapusty Napa do badania interakcji mikrobiologicznych w filosferze i fermentacji warzywnej. Technika umożliwia powiązanie struktury społeczności mikrobowych z ich funkcją.

System gnotobiotyczny do badania składania mikrobiomu w filosferze i fermentacji warzywnej

Przeglądaj więcej filmów