System gnotobiotyczny do badania składania mikrobiomu w filosferze i fermentacji warzywnej

Korzystając z tego protokołu, możemy odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób drobnoustroje gromadzą się i oddziałują w filosferze. Dodatkową zaletą jest to, że stosując sterylny ekstrakt roślinny, możemy powiązać strukturę zbiorowisk sfery filo z ich funkcją podczas fermentacji warzywnej. Techniki te umożliwiają naukowcom przetestowanie, w jaki sposób mikroorganizmy oddziałują w sferze filosfery, a następnie śledzenie, w jaki sposób te społeczności sfery filosfery mogą wpływać na fermentację.

Aby wysterylizować nasiona kapusty na powierzchni, zacznij od umieszczenia 100 nasion w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Dodaj jeden mililitr 70% etanolu do probówki i wiruj przez pięć minut. Następnie użyj pipety, aby wyrzucić etanol.

Dodaj jeden mililitr 50% wybielacza i wiruj tubkę przez pięć minut, a następnie wyrzuć wybielacz. Opłucz nasiona cztery razy, dodając jeden mililitr autoklawowanej wody dejonizowanej, wirując probówkę, a następnie wylewając wodę. Po ostatnim płukaniu namocz nasiona w wysterylizowanej wodzie dejonizowanej przez dwie do ośmiu godzin, aby zmiękczyć okrywę nasienną przed sadzeniem.

Zważ 10 gramów czystej glinki wapniowej do szklanej rurki o wymiarach 15 na 2,5 centymetra. Dodaj około dziewięciu mililitrów przygotowanego bulionu MS do każdej tuby, aby przykryć glinkę z wapniem. Luźno przykryj szklane probówki 22-milimetrowymi dwukierunkowymi nasadkami probówek.

Autoklaw probówek w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 60 minut. Wyjmując probówki z autoklawu, wciśnij nakrętki na szklane probówki, aby je uszczelnić, a następnie schłodzić probówki do temperatury pokojowej przed użyciem. Gdy probówki ostygną, użyj bardzo długich kleszczy, aby delikatnie umieścić jedno sterylne nasiono kapusty na środku każdej probówki.

Zasznuruj rurki w siedmiokierunkowej tacy i umieść tacę pod lekkimi stojakami z 16-godzinnym cyklem światła w temperaturze 24 stopni Celsjusza. Nasiona rozwiną swój pierwszy prawdziwy liść po pięciu dniach, który jest pierwszym liściem naczyniowym po uformowaniu się liścieni. Ma pomarszczoną krawędź i jest pokryty trójgrzebieniami.

Aby przetestować bezpłodność kapusty wolnej od zarodków, delikatnie chwyć podstawę rośliny wysterylizowanymi kleszczami i wyciągnij ją. Przed całkowitym wyjęciem kapusty z rurki ostrożnie odetnij korzenie wysterylizowanymi nożyczkami do preparowania. Następnie zagęść liście kapusty w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej.

Dodaj 400 mikrolitrów PBS do każdej mikroprobówki wirówki i użyj sterylnego mikrotłuczka do homogenizacji kapusty. Nanieś 100 mikrolitrów kapusty na homogenację na płytki agarowe, upewniając się, że używasz końcówki pipety z szerokim otworem. Aby przygotować zapasy glicerolu ze szczepów inokulacyjnych, delikatnie rozprowadź poszczególne kolonie na dwóch lub trzech nowych płytkach z tego samego podłoża.

Rzędź kolonie przez dwa do pięciu dni, a następnie zeskrob je z talerzy do 15-mililitrowej stożkowej rurki z 15 mililitrami 15% glicerolu. Dokładnie wymieszaj rurkę, aby wymieszać. Porcję jednego mililitra zmieszanego bulionu glicerolowego do mikroprobówki wirówkowej i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do użycia wraz z pozostałymi 14 mililitrami bulionu glicerynowego.

Na tydzień przed użyciem rozmrozić jedną mililitrową porcję na lodzie i umieścić ją w kilku różnych rozcieńczeniach w celu określenia stężenia wywaru inokulacyjnego. Gdy kapusta będzie gotowa do zaszczepienia, rozmrozić bulion glicerolu na lodzie i rozcieńczyć go do pożądanego stężenia. Dodać 10 mililitrów rozcieńczonego bulionu do sterylnej butelki z pompką i przepompować pięć aerozoli do dużej zlewki do zbierania odpadów.

Zdejmij pokrywkę z rurki do kapusty i przechyl kapustę w kierunku butelki z rozpylaczem. Spryskaj każdą kapustę trzema pompkami roztworu do inokulacji, a następnie zbierz podzbiór kapusty, aby ocenić rzeczywiste stężenie inokulacji wejściowej. Aby zebrać kapustę, wyjmij ją z rurki za pomocą wysterylizowanych kleszczy.

Odetnij korzenie sterylnymi nożyczkami do preparowania i ostrożnie umieść je w wstępnie zważonej sterylnej probówce do mikrowirówki. Zapisz wagę kapusty do przyszłych obliczeń. Dodaj 400 mikrolitrów PBS do każdej probówki z kapustą i zmiel ją 30 razy mikrotłuczkiem, a następnie połóż homogenat kapusty za pomocą końcówek pipet z szerokim otworem.

Usuń i wyrzuć najbardziej zewnętrzne liście kapusty i posiekaj całą pozostałą kapustę, aby zmieściła się w blenderze. Zmiksuj na drobną miazgę i zważ jednorodną kapustę. Dodaj dwa mililitry wody destylowanej na gram kapusty.

Następnie przefiltruj gnojowicę kapusty przez dwie warstwy filtrów do kawy w koszu. Dozować gnojowicę do probówek wirówkowych i odwirowywać ją z prędkością 20 000 razy G przez 20 minut lub do momentu, gdy duże cząstki osiądą z roztworu. Usuń supernatant, uważając, aby nie naruszyć granulowanych resztek kapusty.

Aby odtworzyć warunki fermentacji przy standardowych stężeniach soli, dodaj 2% wagowo do objętości chlorku sodu do ekstraktu. Ubij ekstrakt warzywny za pomocą filtra 0,2 mikrometra podłączonego do próżni, dozuj go do sterylnych probówek i zamroź w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Metoda sterylizacji nasion została przetestowana na kilku kapustach pekińskich i wszystkie wykazały podobne tempo wzrostu.

Jednak inne gatunki kapustnych odniosły ograniczony sukces, ponieważ rośliny albo miały niską zdolność kiełkowania po sterylizacji, albo łodyga szybko się wydłużała, tworząc wrzecionowato, niezdrową roślinę. Izolaty mikrobiologiczne inokulowano albo jako izolaty pojedynczego szczepu, albo w połączeniu z innym izolatem. W sumie 15 kapusty wolnej od zarodków zostało przetestowanych dla każdego zabiegu i zebranych natychmiast, po czterech dniach lub po 10 dniach od inokulacji.

Izolaty wykazały szybki wzrost w filosferze kapusty pekińskiej. Dwa drożdże i trzy bakterie zaszczepiono w trzech różnych rodzajach sterylnego ekstraktu roślinnego lub SVE z kapusty czerwonej, zielonej i pekinowej. Wzrost inokulatów rejestrowano w ciągu 14 dni poprzez punktowe posiewanie pięciu mikrolitrów każdego zabiegu na płytkach agarowych MRS lub YPD.

Pomiary pH podczas fermentacji wykazały, że bakterie kwasu mlekowego były zdolne do zakwaszania SVE do poziomu poniżej pH czterech, co wskazuje na ferment, który jest bezpieczny do spożycia. Metody te mają szczególne zastosowanie do mikrobiomu kapusty, ale mogą być przydatne w innych systemach roślinnych. Utrzymanie sterylności systemu może być trudne, nasze protokoły ramowe są szczegółowe, ale uważamy, że każdy krok jest ważny.