Wytwarzanie falowodów w trybie zerowym do mikroskopii pojedynczych cząsteczek o wysokim stężeniu
12 maja 2020
Opisana tutaj jest metoda litografii nanosferycznej do równoległego wytwarzania falowodów w trybie zerowym, które są układami nanoapertur w pokrytym metalem szkiełku nakrywkowym do mikroskopii szklanej do obrazowania pojedynczych cząsteczek przy stężeniach fluoroforów od nano do mikromolowych. Metoda wykorzystuje samoorganizację kryształów koloidalnych w celu stworzenia szablonu falowodu.
Przedstawiony tutaj protokół litografii nanosferycznej do wytwarzania falowodów w trybie zerowym jest dostępną, tanią metodą, która nie wymaga żadnych specjalistycznych narzędzi ani urządzeń produkcyjnych. Metoda ta będzie przydatna w biofizyce pojedynczych cząsteczek i pozwoli większej liczbie badaczy na przeprowadzanie eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami przy biologicznie istotnych stężeniach odczynników fluorescencyjnych. Aby stworzyć czystą powierzchnię do osadzania parnego cząstek koloidalnych, umieść optyczne szkiełka nakrywkowe ze szkła borokrzemianowego w rowkowanych wkładkach słoika do barwienia ze szkła Coplin.
Napełnij słoik do barwienia wystarczającą ilością acetonu, aby przykryć szkiełka nakrywkowe i przykryć słoik. Sonikuj słoik przez 10 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Wylej aceton i trzykrotnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną.
Po powtórzeniu sonikacji i acetonu, napełnij słoik wystarczającą ilością wodorotlenku potasu, aby przykryć szkiełka nakrywkowe. Ponownie sonikuj słoik pod przykryciem przez 20 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Opłucz szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną sześć razy, a następnie poddaj je sonikacji w etanolu przez 10 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Po trzykrotnym umyciu szkiełek nakrywkowych wodą destylowaną, delikatnie podnieś każde szkiełko nakrywkowe na krawędzi za pomocą kleszków. Osusz każde szkiełko nakrywkowe azotem i umieść każde czyste, suche szkiełko nakrywkowe na osobnej szalce Petriego. Odwirować 50 mikrolitrów jednomikronowych niefunkcjonalizowanych kulek polistyrenowych.
Wyrzuć supernatant, pozostawiając jak najmniej wody. Zawiesić kulki w 50 mikrolitrach rozpuszczalnika, a następnie dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Aby ustawić komorę wilgotnościową do osadzania, ułóż sześć szalek Petriego w rzędzie.
Umieść po jednym szkiełku nakrywkowym na każdej szalce Petriego i pozostaw pokrywki lekko uchylone, tak aby szkiełka nakrywkowe były wystawione na działanie środowiska. Wyśrodkuj higrometr i mały wentylator elektryczny za szalkami Petriego, a następnie zapisz wilgotność względną w laboratorium. Napełnij zlewkę o pojemności 200 mililitrów 150 do 200 mililitrami wody o temperaturze około 75 stopni Celsjusza i umieść zlewkę za wentylatorem.
Włącz wentylator, a następnie przykryj szalki Petriego, wentylator, zlewkę i higrometr przewróconym, przezroczystym plastikowym pojemnikiem do przechowywania. Gdy wilgotność względna osiągnie 70 do 75%, lekko podnieś plastikowy pojemnik do przechowywania i szybko zamknij pokrywki szalek Petriego, aby zapobiec nadmiernemu zwilżeniu szkiełek nakrywkowych. Gdy wilgotność względna w komorze osiągnie 85%, odpipetuj pięć mikrolitrów zawiesiny kulek na środek każdego szkiełka nakrywkowego.
Przykryj każdą szalkę Petriego natychmiast po złożeniu i trzymaj wszystko przykryte pojemnikiem do przechowywania między osadzaniami. Osadzanie ściegu należy zakończyć tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować utratę wilgoci. Jeśli osadzanie jest zbyt suche lub mokre, wilgotność w komorze jest najważniejszą zmienną, którą należy zoptymalizować.
Po zakończeniu wszystkich sześciu osadzania zapisz wilgotność względną w komorze i pozwól kropelkom kulek rozprzestrzenić się i wyschnąć przez pięć minut. Aby zapewnić jednolitą powierzchnię temperaturową do wyżarzania kulek polistyrenu, umieść płaską, frezowaną aluminiową płytę na standardowej ceramicznej płycie grzejnej i ustaw temperaturę płyty grzejnej na 107 stopni Celsjusza, temperaturę zeszklenia polistyrenu. Umieść szkiełko nakrywkowe zawierające szablon koralików na gorącej aluminiowej płycie.
Po wyżarzaniu przez 20 sekund usuń szkiełko nakrywkowe z aluminiowej płyty i natychmiast umieść je na aluminiowej powierzchni o temperaturze pokojowej do ostygnięcia. Stosując osadzanie termiczne przez parowanie, osadź 300 nanometrów miedzi z prędkością dwóch angstremów na sekundę na szkiełkach nakrywkowych zawierających szablony kulek. Spowoduje to wygenerowanie słupków w szczelinach między koralikami.
Aby usunąć nadmiar miedzi z koralików, delikatnie dociśnij kawałek taśmy do powierzchni, a następnie powoli odklej taśmę. Rozpuść kulki polistyrenu, umieszczając szkiełka nakrywkowe w toleune i pozostawiając je na noc. Ostrożnie obchodząc się z szkiełkami nakrywkowymi, spłucz je raz chloroformem i dwa razy etanolem.
Wysuszyć szablony azotem. Umieść je w tlenowym urządzeniu do czyszczenia plazmą plazmową na 30 minut, aby usunąć resztki polimeru i zanieczyszczeń. Za pomocą osadzania termicznego przez parowanie osadź trzy nanometry warstwy adhezyjnej tytanu z prędkością jednego angstrema na sekundę, a następnie umieść 100 do 150 nanometrów aluminium z prędkością czterech angstremów na sekundę wokół i na górze miedzianych słupków.
Upewnij się, że próbki nie obracają się podczas osadzania, jak to ma miejsce automatycznie w niektórych jednostkach osadzania. Aby rozpuścić miedziane wkładki, namocz szkiełka nakrywkowe w miedzianym wytrawiaczu na dwie godziny. Po spłukaniu szkiełek nakrywkowych w wodzie destylowanej osusz je azotem, a następnie delikatnie wypoleruj powierzchnię papierem do soczewek, aby odsłonić wszelkie słupki, które są nadal pokryte okładziną.
Namocz szkiełka nakrywkowe w miedzianym wytrawiaczu przez kolejne dwie godziny, a następnie ponownie spłucz je wodą destylowaną i wysusz azotem. Po pasywacji powierzchni, szkiełka nakrywkowe falowodu w trybie zerowym można sparować ze szkiełkami kwarcowymi za pomocą dwustronnej taśmy klejącej, aby utworzyć mikroprzepływowe komory przepływowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek. Powodzenie samoorganizacji szablonu koloidalnego zależy w decydującym stopniu od wilgotności względnej.
W dobrze uformowanym szablonie obszar koralików jest okrągły z obramowaniami wyznaczonymi przez nieprzezroczysty wielowarstwowy pierścień. W dobrze uformowanych szablonach większość szablonów powinna zawierać sześciokątne, ciasno upakowane koraliki. Między ziarnami wystąpią pewne defekty spowodowane zakleszczeniem podczas sedymentacji parowej.
Po osadzeniu miedzi i rozpuszczeniu kulek polistyrenowych słupki miedziane powinny mieć średnicę poniżej 150 nanometrów. Przy głębokości osadzania miedzi 300 nanometrów słupki mają około 250 nanometrów wysokości. Po osadzeniu okładziny aluminiowej, a następnie rozpuszczeniu miedzianych słupków, falowody powinny być widoczne pod mikroskopią sił atomowych i powinny być oddalone od siebie o około 550 nanometrów.
Wyżarzanie szablonów polistyrenowych przez 20 sekund dało aluminiowe falowody o średnicy 118 nanometrów, wystarczająco małe, aby odciąć propagację światła widzialnego. Typowe pole ZMW do obrazowania zawiera 3 000 falowodów w polu widzenia 40 na 80 mikronów. Jednocząsteczkowy FRET przeprowadzono w celu przetestowania funkcjonalności ZMW.
Ślady pojedynczej cząsteczki FRET były wykrywalne we wszystkich stężeniach badanego fluorforu Cy5 w otoczeniu. Dla porównania, pojedyncze cząsteczki byłyby wykrywalne tylko w oświetleniu TERF przy niskich stężeniach nanomolowych pikomolarnych. Po wytworzeniu falowodu w trybie zerowym urządzenia mogą być pasywowane polimerami w celu zmniejszenia niespecyficznych oddziaływań podczas obrazowania pojedynczych cząsteczek.
Szklane dna falowodów w trybie zerowym mogą być również lekko wytrawione, aby zwiększyć emisję pojedynczych cząsteczek. Ogólnie rzecz biorąc, ta nowa metoda wytwarzania falowodów w trybie zerowym pozwoli naukowcom łatwiej badać dynamiczne procesy biochemiczne, takie jak transkrypcja lub translacja, przy stężeniach i szybkościach bliższych tym w komórce.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę litografii nanosfer do równoległego wytwarzania przewodników falowych zerowego trybu, umożliwiającą obrazowanie pojedynczych cząsteczek przy niskich stężeniach fluoroforów. Metoda wykorzystuje samouzbrajace się kryształy koloidalne do stworzenia szablonu przewodnika na szklanej pokrywce.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofizyka
- Nanotechnologia
- Obrazowanie pojedynczych cząsteczek
Tło
- Przewodniki falowe zerowego trybu są niezbędne do badania pojedynczych cząsteczek.
- Tradcyjne metody produkcji mogą być kosztowne i wymagać specjalistycznych narzędzi.
- Ta metoda ma na celu uproszczenie procesu.
- Samoustawianie się koloidalne jest obiecującą techniką do tworzenia nanostruktur.
Cel badania
- Przedstawienie dostępnej metody wytwarzania przewodników falowych zerowego trybu.
- Możliwość przeprowadzania eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami przez większą liczbę badaczy.
- Ułatwienie badań w biologicznie istotnych stężeniach fluoryzujących odczynników.
Zastosowane metody
- Użycie szklanych pokrywek borokrzemowych.
- Ultradźwiękowe czyszczenie powierzchni w acetonie.
- Ewapostulacyjne osadzanie cząstek koloidalnych.
- Stworzenie szablonu przewodnika do obrazowania.
Główne wyniki
- Metoda jest nisko kosztowa i nie wymaga specjalistycznych narzędzi.
- Produkuje efektywne przewodniki do obrazowania pojedynczych cząsteczek.
- Badaczom pozwala na obrazowanie w stężeniach nano- do mikromolarnych.
- Protokół jest prosty i powtarzalny.
Wnioski
- Ta metoda litografii nanosfer demokratyzuje dostęp do technik obrazowania pojedynczych cząsteczek.
- Otwiera nowe szlaki dla badań w dziedzinie biofizyki pojedynczych cząsteczek.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do różnych zastosowań w biologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables single molecule imaging at micromolar fluorophore concentrations, overcoming a key limitation in biochemical assays where background fluorescence restricts usable concentrations to pico- to nanomolar ranges. By facilitating the study of molecular processes at cellular-relevant concentrations and rates, it supports more physiologically relevant target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The accessibility of this low-cost fabrication approach expands the utility of zero mode waveguides beyond specialized core facilities to broader biopharma R&D laboratories.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses and pathway clarification by allowing single molecule observation at concentrations that reflect physiological ligand levels.
- Operational Value: Reduces reliance on expensive nanofabrication equipment, making single molecule enzymology accessible to more discovery teams.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking through direct visualization of single molecule interactions under near-native conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a platform for preparing validated biological systems that enable reliable compound evaluation at higher, more relevant fluorophore concentrations.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through parallel fabrication of thousands of zero mode waveguides using common lab equipment.
- Scalability: Supports platform reuse and scalability for downstream screening workflows by generating uniform waveguide arrays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates the study of dynamic biochemical processes such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell, improving relevance to disease models.
- Mechanistic De-risking: Enables observation of single molecule FRET signals at micromolar concentrations, which are unattainable with traditional total internal reflection fluorescence (TERF) illumination.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports data-driven decisions by providing quantitative, single molecule readouts that clarify mechanism and reduce ambiguity in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification, enabling biophysical characterization that informs compound selection and optimization prior to preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by allowing direct observation of single molecule behavior in complex environments.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible nanostructures with quantitative outputs that enable comparison of ligand binding or enzymatic activity across conditions.
- Analytics: Provides single molecule fluorescence and FRET readouts that offer high-resolution kinetic and mechanistic insights beyond ensemble averages.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical relevance by enabling studies at near-physiological concentrations and molecular crowding conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable fabrication capability that can be shared across departments, reducing dependency on external nanofabrication services.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct single molecule visualization.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and throughput via parallel fabrication using accessible equipment like thermal evaporators and hot plates.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency and enables better go/no-go decisions by generating reliable biophysical data earlier in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic clarity that reduces late-stage attrition due to unexpected biological behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in colloidal self-assembly, thermal evaporation, and surface cleaning protocols.
- Depends on access to a thermal evaporator, hot plate, sonicator, and basic chemistry lab equipment for metal deposition and etching.
- Necessitates standardization of humidity-controlled bead deposition to ensure consistent waveguide template formation.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different substrate materials or waveguide metals (e.g., aluminum vs. gold).
- Includes practical limitations such as sensitivity to relative humidity during bead self-assembly and the need for careful handling to avoid template defects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:31
Glass Coverslip Cleaning
1:36
Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
3:22
Bead Annealing for Reducing Pore Size
3:55
Nanofabrication of Aluminum Zero Mode Waveguides
5:42
Results: ZMW Fabrication Quality Control
7:19
Conclusion
