Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych
29 maja 2020
Modelujemy prosty multipleksowany test ECL, który łączy ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Test jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu innych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i autoimmunologicznego zespołu wielogruczołowego 1.
Test elektrochemiluminescencji może jednocześnie badać cukrzycę typu 1 i inne istotne choroby autoimmunologiczne, w tym autoimmunologiczną chorobę kriogeniczną, celiakię i autoimmunologiczny zespół wielogruczołowy-1. Bardzo złożony test ECR łączy do 10 testów z wieloma przeciwciałami w jednym dołku, co skutkuje wysoką przepustowością, mniejszą liczbą bibliotek i tańszym testem, który wymaga mniejszej objętości. Procedurę zademonstruje Xiaofan Jia, post z mojego laboratorium.
Aby przygotować mieszany roztwór antygenu sprzężonego z łącznikiem, najpierw wybierz optymalne stężenie dla każdego antygenu w oparciu o test szachownicy i rozcieńczyć antygen znakowany biotyną i rutenem do racjonalnego stężenia roboczego. Aby związać różne łączniki z każdym z unikalnie biotynylowanych antygenów, dla jednego 96-dołkowego testu zmieszano 240 mikrolitrów odpowiedniego sprzężonego łącznika STREPTAWIDYNY z 4 mikrolitrami biotynylowanych białek będących przedmiotem zainteresowania. Następnie dodaj 156 mikrolitrów 1% BSA na probówkę i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Pod koniec inkubacji dodać 160 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej probówki i inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 30 minut. Pod koniec inkubacji usuń 400 mikrolitrów antygenu sprzężonego z łącznikiem z każdej probówki i wyciągnij wszystkie siedem zawiesin antygenu do jednej probówki. Następnie dodaj do mieszaniny 1,2 mililitra roztworu zatrzymującego i 4 mikrolitry GAD65, TPO, tTg, ThG, interferonu alfa proinsuliny i antygenu IA-2 znakowanego sulfo-NHS.
Przed inkubacją próbek surowicy z oznakowaną mieszaniną antygenów dodać 15 mikrolitrów surowicy na dołek 96-dołkowej płytki PCR i wymieszać 18 mikrolitrów 0,5 molowego kwasu kwasowego z każdym dołkiem surowicy przez 45-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji dodać 35 mikrolitrów antygenu i 13 mikrolitrów jednego molowego buforu Tris na dołek nowej 96-dołkowej płytki PCR. Pod koniec inkubacji natychmiast przenieść 25 mikrolitrów surowicy potraktowanej kwasem do każdej studzienki płytki antygenowej.
Przykryj płytkę folią sufitową PCR i umieść płytkę na wytrząsarce na niskich obrotach w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji umieść płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza na 18 do 24 godzin. Wyjmij talerz z lodówki i pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową.
Następnie dodaj 150 mikrolitrów 3% buforu A blokującego do każdej studzienki. Gdy wszystkie studzienki zostaną poddane obróbce, przykryj płytkę folią sufitową i umieść płytkę w lodówce o temperaturze 4 stopni Celsjusza na noc. Następnego ranka odwróć płytkę do góry nogami i umyj próbki trzy razy 150 mikrolitrami PBS-T na studzienkę na mycie.
Poklep płytkę, aż w żadnym z dołków nie pozostanie bufor. Dodać 30 mikrolitrów inkubacji antygenu surowicy do każdej studzienki. Po dodaniu wszystkich inkubatów przykryć płytkę folią i umieścić płytkę na wytrząsarce z małą prędkością na jedną godzinę, w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji usunąć inkubaty przez strzepnięcie i umyć studzienki trzykrotnie 150 mikrolitrami PBS-T na studzienkę, jak pokazano. Po ostatnim myciu dodaj 150 mikrolitrów buforu odczytowego do każdej studzienki i odczytaj płytkę na czytniku płytek, w zliczeniach na sekundę. W tej analizie dużej kohorty próbek od 1026 nowo zdiagnozowanych pacjentów z cukrzycą typu 1, poziomy przeciwciał automatycznych z testu siedmiu plus elektroluminescencji porównano z poziomami z każdego odpowiedniego ustalonego pojedynczego testu elektroluminescencji oraz z każdego odpowiadającego mu pojedynczego standardowego testu wiązania radiowego i ELISA.
Swoistość testu była identyczna w 99. percentylu dla wszystkich testów autoprzeciwciał, z wyjątkiem autoprzeciwciał tarczycy, dla których zastosowano 95. percentyl. Niewielką liczbę niezgodnych próbek dla każdego z siedmiu automatycznych przeciwciał znaleziono wokół granicy punktów odcięcia dla każdego testu. W tym miejscu można zaobserwować odpowiednie dane dla 1022 zdrowych osób z grupy kontrolnej dla każdego testu.
Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest znalezienie innego łącznika z każdym z unikalnie biotynylowanych antygenów i wymieszanie każdego antygenu z właściwościami zapewniającymi sprzężony łącznik. Ta technika testowa pozwoli naukowcom zaplanować badania przesiewowe w kierunku wielu chorób autoimmunologicznych jednocześnie w dużych populacjach i umożliwi klinikom łatwe badania przesiewowe wielu istotnych chorób z cukrzycą typu 1.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia multipleksowy test elektrochemiluminescencyjny (ECL), który umożliwia jednoczesne przesiewowe wykrywanie cukrzycy typu 1 oraz różnych chorób autoimmunologicznych. Test ten łączy wiele oznaczeń autoprzeciwciał w jednej dołku, co zwiększa wydajność i obniża koszty.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Autoiimmunizacja
- Diagnostyka
- Testy elektrochemiluminescencyjne
Wstęp
- Cukrzyca typu 1 (T1D) jest często powiązana z innymi chorobami autoimmunologicznymi.
- Tradycyjne testy mogą wymagać przeprowadzenia wielu analiz, co zwiększa nakłady czasu i kosztów.
- Testy multipleksowe mogą usprawnić proces diagnostyczny.
- Elektrochemiluminescencja zapewnia wysoką czułość i swoistość.
Cel badania
- Opracowanie multipleksowego testu ECL do przesiewowej diagnostyki cukrzycy typu 1 oraz powiązanych chorób autoimmunologicznych.
- Porównanie wydajności testu multipleksowego z uznanymi testami pojedynczymi.
- Ułatwienie prowadzenia przesiewowych badań na dużą skalę w warunkach klinicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów antygenów sprzężonych z mieszanym łącznikiem.
- Inkubacja próbek surowicy z znakowanymi antygenami.
- Zastosowanie formatu płytek 96-dołkowych do przesiewania wysokoprzepustowego.
- Porównanie poziomów autoprzeciwciał u pacjentów z T1D oraz u zdrowych kontroli.
Główne wyniki
- Analiza multipleksowa wykazała swoistość porównywalną z analizami pojedynczymi.
- Zidentyfikowano niewielką liczbę próbek rozbieżnych w pobliżu progów odcięcia.
- Dostarczono danych dla dużej kohorty pacjentów z nowo zdiagnozowanym T1D.
- Umożliwiono efektywny screening w kierunku wielu chorób autoimmunologicznych.
Wnioski
- Multiplexowy test ECL jest skutecznym narzędziem do jednoczesnego przesiewu.
- Metoda ta może zwiększyć efektywność diagnostyczną w praktyce klinicznej.
- Zaleca się dalszą walidację na większych populacjach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Jednoczesna detekcja wielu autoprzeciwciał w jednej studzience eliminuje krytyczne wąskie gardło w wielkoskalowym przesiewaniu pod kątem chorób autoimmunologicznych, zmniejszając złożoność analizy oraz zużycie zasobów. To multipleksowe podejście z wykorzystaniem elektrochemiluminescencji zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej identyfikacji choroby, dostarczając skorelowanych odczytów biomarkerów w cukrzycy typu 1 oraz współistniejących schorzeniach autoimmunologicznych. Analiza ta wspiera triage portfolio oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w rozwoju immunoterapii, umożliwiając efektywną stratyfikację pacjentów na podstawie profili wielokrotnych autoprzeciwciał.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez korelację klastrów autoprzeciwciał z endotypami chorób w modelach przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną walidację swoistych dla antygenu odpowiedzi immunologicznych w systemach istotnych dla danej choroby.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w wyborze celu terapeutycznego poprzez identyfikację podgrup pacjentów o zbieżnych sygnaturach autoprzeciwciał.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie ustandaryzowanych, ilościowych paneli biomarkerów do późniejszych kampanii przesiewowych wymagających wysokiej powtarzalności.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie gotowości do analizy dzięki unieruchomionym kompleksom antygen- łącznik, które gwarantują spójne wiązanie w fazie ciekłej we wszystkich dołkach.
- Skalowalność: Umożliwienie ponownego wykorzystania platformy do przesiewania do 10 autoprzeciwciał na dołek, co zwiększa przepustowość bez konieczności zmiany formatu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia spójność z układami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez wykrywanie autoprzeciwciał powiązanych z progresją kliniczną w cukrzycy typu 1 oraz współistniejących zaburzeniach autoimmunologicznych.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez identyfikację pacjentów z profilami autoprzeciwciał o wysokiej penetracji, które pozwalają przewidzieć autoimmunizację wielonarządową.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Zmniejsza niejednoznaczność w interpretacji mechanizmów immunologicznych dzięki jednoczesnemu oznaczaniu autoprzeciwciał przeciwko wyspom trzustkowym, tarczycy, jelitom oraz przeciwko ścieżce interferonowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test ten pełni funkcję pomostu między fazą odkryć a translacją, umożliwiając wczesne fenotypowanie immunologiczne, które dzięki multipleksowemu profilowaniu autoprzeciwciał dostarcza informacji istotnych dla etapów identyfikacji wiodących związków i walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie wzorców koekspresji autoprzeciwciał ze szlakami patogenicznymi w patogenezie autoimmune.
- Przesiew: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników, które umożliwiają porównanie odpowiedzi immunologicznych w różnych warunkach leczenia lub w zależności od tła genetycznego.
- Analityka: Zapewnia znormalizowane odczyty liczby zliczeń na sekundę, co umożliwia statystyczne porównanie poziomów autoprzeciwciał między kohortą pacjentów a grupą kontrolną.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez walidację paneli biomarkerów w próbkach ludzkich, które odzwierciedlają dysregulację immunologiczną związaną z chorobą.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do analiz immunoenzymatycznych z możliwością ponownego wykorzystania, którą można dostosować do innych paneli chorób autoimmunologicznych lub zapalnych poza początkową konfiguracją 7-plex.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych dzięki jednoczesnemu pomiarowi autoprzeciwciał.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność poprzez eliminację zmienności między dołkami dzięki zastosowaniu unieruchomionego antygenu.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową poprzez konsolidację siedmiu testów diagnostycznych w jednym etapie procesu roboczego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów terapeutycznych z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o populacje pacjentów zdefiniowane za pomocą biomarkerów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie projektowania testów immunoenzymatycznych oraz chemii łączników do immobilizacji antygenów.
- Zależność od czytnika płytek umożliwiającego detekcję elektrochemiluminescencyjną w formacie 96-dołkowym.
- Konieczność standaryzacji protokołów blokowania i płukania we wszystkich ośrodkach w przypadku badań wieloośrodkowych.
- Wymaga dostosowania stężeń antygenów przy rozszerzaniu zakresu o nowe cele autoprzeciwciał poza pierwotną siódemkę.
- Ograniczenie wynikające z potrzeby optymalizacji par łącznik-antygen w celu zapobiegania reaktywności krzyżowej w formacie multipleksowym.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:50
Mixed Linker-Coupled Antigen Solution
2:26
Serum Sample Incubation with Labeled Antigen
3:30
Multiplex Plate Preparation
3:57
Serum/Antigen Incubate Transfer
4:58
Results: Representative Autoantibody Level Evaluation
6:03
Conclusion
