Name: Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Poznaj wielopleksowy test elektrochemiluminescencyjny do jednoczesnego badania przesiewowego cukrzycy typu 1 i chorób autoimmunologicznych. Ta metoda łączy siedem oznaczeń przeciwciał w jednej próbce, zwiększając efektywność diagnostyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez DK32083 grantów NIH, JDRF Grants 2--2015-51-Q-R i 2--2018-533-S-B.

Protokół badawczy został zatwierdzony przez Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Przygotowanie bufora
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do etykietowania (2x PBS, pH 7,9). Używając 400 ml destylowanej wody dejonizowanej (DD), dodaj 100 ml 10x PBS. Aby dostosować pH roztworu, dodawaj NaOH, aż osiągnie 7,9.</li>
	<li>Stworzyć 3 mM biotyny, rozpuszczając 1 mg biotyny w 588 μl wcześniej utworzonego buforu znakującego. Wykonać 3 mM Ru Sulfo-NHS, rozpuszczając 150 nmol Ru Sulfo-NHS w 50 μl buforu do znakowania.</li>
	<li>Przygotować bufor antygenowy (1% BSA), biorąc 500 ml 1x PBS i dodając 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do roztworu. Przygotować 0,5 M roztworu kwasu octowego. Przygotować 1 M bufor Tris-HCl za pomocą Trizma Base i dostosować pH do 9,0.</li>
	<li>Do buforu powlekającego (3% Bloker A) weź 500 ml 1x PBS i dodaj 15 g Blockera A. Przygotuj bufor do przemywania (0,05 % Tween 20, PBST), mieszając 5000 ml 1x PBS z 2,5 ml Tween 20. Utwórz bufor odczytu (2x bufor do odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym), dodając 500 ml wody DD i 500 ml 4 ml buforu odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym. 
	UWAGA: Aby zachować spójność między testami, ważne jest, aby zarówno roztwory biotyny, jak i Ru Sulfo-NHS były tworzone tuż przed procedurą etykietowania i nie były tworzone i przechowywane do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
2. Znakowanie każdego białka antygenowego biotyną i Ru Sulfo-NHS osobno
UWAGA: Aby uzyskać bardziej efektywną reakcję znakowania, użyj stężenia białka antygenowego ≥0,5 mg/ml.
<ol>
	<li>Obliczyć liczbę molową każdego białka antygenowego oraz liczbę molową biotyny i Ru Sulfo-NHS. Dodać odpowiednią ilość biotyny lub Ru Sulfo-NHS do białka antygenowego w celu znakowania reakcji zgodnie ze stosunkiem molowym białka antygenu do biotyny lub Ru Sulfo-NHS.
	<ol>
		<li>W przypadku antygenu o mniejszej masie cząsteczkowej (≤10 kDa), takiego jak białko proinsuliny, należy zastosować stosunek molowy 1:5 (antygen: biotyna i Ru Sulfo-NHS). W przypadku antygenu o większej masie cząsteczkowej (>50 kDa), takiego jak białko, należy użyć stosunku molowego 1:20. W przypadku antygenu o średniej masie cząsteczkowej (10-50 kDa) należy zastosować stosunek molowy dostosowany w zakresie 1:5-1:20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zarówno w przypadku biotyny, jak i Ru Sulfo-NHS należy podzielić masę każdego antygenu przez odpowiadającą mu masę cząsteczkową, aby uzyskać liczbę molową antygenu dla każdego z nich. Podziel liczbę molową przez stężenie, aby uzyskać objętość biotyny. Powtórz to dla Ru Sulfo-NHS.</li>
	<li>Wymieszać białko antygenu z biotyną przy użyciu odpowiedniego stosunku molowego, określonego w kroku 2.2. Następnie zrób to samo dla Ru Sulfo-NHS. 
	UWAGA: Aby zapewnić skuteczność reakcji znakowania, wszelkie redukujące chemikalia, takie jak Tris lub glicyna w systemie buforowym, muszą zostać zamienione na bufor 2x PBS o pH 7,9 przez kolumnę wirującą do zaklejania. Protokoły etykietowania biotyny i Ru Sulfo-NHS są identyczne.</li>
	<li>Przykryj probówki reakcyjne folią aluminiową i inkubuj je w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę. Powodem przykrywania probówek reakcyjnych folią jest to, że zarówno biotyna, jak i odczynniki Ru Sulfo-NHS są wrażliwe na światło.</li>
	<li>Zalać kolumnę wirową o pojemności 2 ml lub 5 ml podczas inkubacji probówek reakcyjnych (wielkość kolumny wirowej zależy od objętości wprowadzonej do kolumny). Napełnij kolumnę wirową buforem 2x PBS, a następnie odwiruj ją przy 1 000 x g przez 2 minuty za każdym razem, w sumie trzy razy.</li>
	<li>Przerwać reakcję znakowania po zakończeniu inkubacji probówek reakcyjnych. Aby zatrzymać reakcję, należy oczyścić znakowane białko antygenowe, przepuszczając je raz przez kolumnę wirową. Następnie odwirować kolumnę o sile 1 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Obliczyć całkowite stężenie znakowanego antygenu, dzieląc ilość obecnego białka antygenowego przez objętość końcową. Podwielokrotność 50 μl oczyszczonego, znakowanego białka antygenowego na probówkę i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C do długotrwałego stosowania. 
	UWAGA: Ważne jest, aby mieć świadomość, że za każdym razem, gdy kolumna wirowa przechodzi przez białko antygenowe, nastąpi około 90-95% wskaźnik retencji.</li>
</ol>
3. Zdefiniuj najlepsze stężenie i proporcje dla dwóch znakowanych antygenów do testu (test szachownicy)
UWAGA: Ponieważ test ECL-IAA w tym teście 7-Plex wymaga kwasowego traktowania próbek surowicy, test szachownicy dla każdego antygenu musi przejść przez ten etap przed inkubacją z oznakowaną mieszaniną antygenów.
<ol>
	<li>Zastosuj test szachownicy dla każdego antygenu osobno przed uruchomieniem testu multipleksowego. W krokach 3.2-3.6 jako przykładu zostanie użyty GAD65.</li>
	<li>Obliczać Rozcieńczenie znakowanego białka GAD65. Zalecane stężenie docelowe pierwszego roztworu mieszaniny biotynylowanego GAD65 wynosi 2000 ng/ml, a Ru Sulfo-NHS oznaczonego GAD65 wynosi 1000 ng/ml. Jeśli stężenie zarówno biotynylowanego, jak i znakowanego Ru Sulfo-NHS GAD65 w roztworze podstawowym wynosi 1,0 μg/μL, objętość potrzebna do biotynylowania GAD65 w 560 μl roztworu roboczego wyniesie 1,12 μL, a objętość potrzebna do uzyskania GAD65 znakowanego Ru Sulfo-NHS w 700 μl roztworu roboczego wyniesie 0,7 μL.</li>
	<li>Wymieszaj 1,12 μl biotynylowanego białka GAD65 z 240 μl łącznika sprzężonego ze streptawidyną 1 w jednej probówce i 160 μl 1% BSA. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodać 160 μl roztworu zatrzymującego do probówki i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut.</li>
	<li>Wykonaj seryjne rozcieńczenie. Pobrać 280 μl mieszaniny do nowej probówki i dodać 280 μl roztworu zatrzymującego w celu uzyskania rozcieńczenia w stosunku 1:2. Przygotuj kilka nowych probówek. Powtórz ten krok, aby uruchomić poziome seryjne rozcieńczanie antygenu GAD65 znakowanego biotyną (patrz poprzednia publikacja12).</li>
	<li>Wymieszaj 0,7 μl białka GAD65 znakowanego Ru Sulfo-NHS (1 μg/μL) z 700 μl roztworu zatrzymującego. Następnie pobrać 350 μl mieszaniny do nowej probówki i dodać 350 μl roztworu zatrzymującego, aby uzyskać rozcieńczenie 1:2. Przygotuj kilka nowych probówek, powtórz ten krok, aby uruchomić pionowe seryjne rozcieńczanie antygenu GAD65 znakowanego Ru Sulfo-NHS.</li>
	<li>Przygotować dwie próbki surowicy, jedną próbkę wysoce dodatnią na obecność i jedną próbkę ujemną na obecność, każda o objętości 0,75 ml. Podwielokrotność 15 μl dodatniej surowicy do każdego dołka w lewej połowie 96-dołkowej płytki PCR. Podwielokrotność 15 μl ujemnej surowicy do każdego dołka w prawej połowie 96-dołkowej płytki PCR.</li>
	<li>Dodać 18 μl 0,5 M kwasu octowego do każdej studzienki i wymieszać. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować nową 96-dołkową płytkę do PCR. Dodać 17,5 μl antygenu znakowanego biotyną i 17,5 μl antygenu znakowanego Ru Sulfo-NHS do każdej studzienki zgodnie z seryjnymi rozcieńczeniami (patrz poprzednia publikacja12).</li>
	<li>Kontynuuj pozostałe etapy oznaczania opisane w krokach od 5.2 do 9.1.</li>
	<li>Określić stosunek sygnału z próbek o wysokim poziomie dodatnim do odpowiadających im ujemnych sygnałów próbki. Wybierz najlepsze stężenie dla antygenu znakowanego biotyną i antygenu znakowanego Ru Sulfo-NHS, identyfikując punkt, który ma najwyższy lub bliski najwyższego stosunek sygnału dodatniego do ujemnego. W tym obliczeniu współczynnika należy wziąć pod uwagę niski sygnał tła uzyskany z próbek ujemnych. 
	UWAGA: Optymalne stężenia Ru Sulfo-NHS i białek antygenowych znakowanych biotyną z testów szachownicowych przedstawiono poniżej: 30 ng/ml i 200 ng/ml dla GAD65, 120 ng/ml i 120 ng/ml dla proinsuliny, 10 ng/ml i 42 ng/ml dla IA-2, 80 ng/ml i 80 ng/ml dla TG, 8 ng/ml i 16 ng/ml dla TPO, 31 ng/ml i 31 ng/ml dla ThG oraz 12 ng/ml i 12 ng/ml dla IFNα.</li>
</ol>
4. Utwórz mieszane rozwiązanie antygenowe sprzężone z łącznikiem
<ol>
	<li>Wybierz optymalne stężenie dla każdego antygenu na podstawie testu szachownicy. Rozcieńczyć biotynę i antygen znakowany Ru Sulfo-NHS do racjonalnego stężenia roboczego.</li>
	<li>Zwiąż różne łączniki z każdym z unikalnie biotynylowanych białek antygenowych. W jednym teście na płytce 96-dołkowej wymieszaj 4 μl biotynylowanego białka GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsuliny, IFN-α i IA-2 z 240 μl łącznika 1, 2, 3, 4, 8, 9 i 10 sprzężonego ze streptawidyną w oddzielnej probówce (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Następnie dodać 156 μl PBS/1% BSA na probówkę. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 160 μl roztworu zatrzymującego i inkubować je w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut. Weź 400 μl antygenu sprzężonego z łącznikiem z każdej probówki i połącz ze sobą wszystkie 7 antygenów. Dodać 1,2 ml roztworu zatrzymującego, a następnie dodać 4 μl Ru Sulfo-NHS znakowanego GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsuliny, IFN-α i antygenu IA-2 do mieszaniny. Teraz roztwór antygenu jest gotowy do użycia w teście.</li>
</ol>
5. Inkubuj próbki surowicy z oznaczonym antygenem
UWAGA: Ponieważ test ECL-IAA w tym teście 7-Plex wymaga kwaśnego traktowania próbek surowicy, każda surowica wymaga etapu obróbki kwasem przed inkubacją z znakowaną mieszaniną antygenów dla tego testu 7-Plex.
<ol>
	<li>Podwielokrotność 15 μl surowicy na dołek na 96-dołkową płytkę PCR. Dodać 18 μl 0,5 M kwasu octowego do każdej studzienki i wymieszać. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować nową 96-dołkową płytkę do PCR i podać porcję 35 μl roztworu antygenu do każdej studzienki.</li>
	<li>Podczas gdy płytka jest nadal w inkubacji, dodaj 13 μl 1 M buforu Tris pH 9,0 do każdej studzienki na płytce antygenowej. Dodaj bufor z boku każdej studzienki, aby ograniczyć mieszanie buforu Tris i antygenu. Po zakończeniu inkubacji pobrać 25 μl surowicy poddanej działaniu kwasu i natychmiast odpipetować ją do każdego dołka na płytce antygenowej. Wymieszać roztwór i przykryć płytkę folią uszczelniającą PCR, aby uniknąć ekspozycji na światło.</li>
	<li>W temperaturze pokojowej umieścić płytkę na wytrząsarce ustawionej na niskich obrotach na 1 godzinę. Następnie przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C i pozostawić płytkę do inkubacji przez 18-24 godziny.</li>
</ol>
6. Przygotuj płytę multipleksową
<ol>
	<li>Wyjmij płytkę multipleksową z lodówki o temperaturze 4 °C i pozwól, aby płyta znalazła się w stanie RT. Gdy płytka multipleksu znajdzie się w temperaturze pokojowej, dodaj 150 μl 3% blokera A do każdej studzienki. Przykryj płytkę multipleksu folią uszczelniającą. Inkubować płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Dzień 1 testu obejmuje kroki od 4 do 6.</li>
</ol>
7. Surowica/antygen transferowy inkubuje się do płytki multipleksowej
<ol>
	<li>Następnego dnia połóż ręczniki papierowe na stole i wyjmij z lodówki płytkę do inkubacji multipleksu. Opróżnij cały bufor z płyty. Aby to zrobić, odwróć talerz do góry nogami i wklep go w przygotowane ręczniki papierowe, aż w żadnym z dołków nie będzie bufora.</li>
	<li>Umyj płytkę multipleksową, dodając 150 μl PBST do każdej studzienki. Odrzuć bufor, jak wspomniano w kroku 7.1, i powtórz ten krok trzy razy. Dodać 30 μl inkubacji surowicy/antygenu do każdego dołka na płytce multipleksowej. Przykryj płytkę folią, aby ograniczyć jej ekspozycję na światło. Umieść płytkę na wytrząsarce do talerzy, ustawionej na niską prędkość, przy temperaturze obrotowej na 1 godzinę.</li>
</ol>
8. Umyj płytkę i dodaj bufor do odczytu.
<ol>
	<li>Wyjąć inkubację surowicy/antygenu z płytki multipleksowej, przytrzymując płytkę do góry nogami i wytrząsając roztwór. Dodać 150 μl PBST do wszystkich studzienek i usunąć bufor z płytki, ponownie przytrzymując płytkę do góry nogami i wytrząsając roztwór. Powtórz ten krok trzy razy. Po zakończeniu trzeciego płukania dodaj 150 μl buforu odczytowego do każdej studzienki. 
	UWAGA: Pęcherzyki powietrza zakłócają zdolność czytnika płyt do dokładnej analizy wyników płyt i należy ich unikać za wszelką cenę.</li>
</ol>
9. Przeczytaj tabliczkę i przeanalizuj dane
<ol>
	<li>Policz przygotowaną płytkę na czytniku płytek, odczytując wszystkie wartości w zliczeniach na sekundę (CPS).</li>
	<li>Obliczyć wskaźnik względny dla testu, używając poziomów przeciwciał uzyskanych z czytnika płytek, za pomocą następującego równania: 
	Wartość indeksu = [CPS (próbka) - CPS (norma ujemna)] / [CPS (norma dodatnia) - CPS (norma ujemna)].</li>
	<li>Określ, które wyniki przeciwciał są ujemne lub dodatnie, korzystając z ustalonych punktów odcięcia. 
	UWAGA: Dzień testu 2 obejmuje kroki od 7 do 9.</li>
</ol>

<ol><li>Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+trends+in+the+incidence+of+type+1+diabetes+in+Finnish+children%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study.</a> Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).</li>
<li>Vehik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+incidence+of+type+1+diabetes+in+0-+to+17-year-old+Colorado+youth%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth.</a> Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).</li>
<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li>
<li>Insel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+presymptomatic+type+1+diabetes%3A+a+scientific+statement+of+JDRF%2C+the+Endocrine+Society%2C+and+the+American+Diabetes+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li>
<li>Barker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody+%22subspecificity%22+in+type+1+diabetes%3A+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li>
<li>Triolo, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+Autoimmune+Disease+Found+in+33%25+of+Patients+at+Type+1+Diabetes+Onset%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li>
<li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Netherlands+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinsulin%2FInsulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk%3A+nonradioactive+bivalent+proinsulin%2Finsulin+autoantibody+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li>
<li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li>
<li>Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+%28ECL%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+%26+Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Journal of Clinical & Cellular Immunology. 8 (6), (2017).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemiluminescence+Assays+for+Human+Islet+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57227(2018).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+multiplexed+autoantibody+detection+to+screen+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases+simultaneously%5BTitle%5D)+AND+%22Ebiomedicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously.</a> Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).</li>
<li>Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemiluminescence+Assays+for+Insulin+and+Glutamic+Acid+Decarboxylase+Autoantibodies+Improve+Prediction+of+Type+1+Diabetes+Risk%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).</li>
<li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECL-IAA+and+ECL-GADA+Can+Identify+High-Risk+Single+Autoantibody-Positive+Relatives+in+the+TrialNet+Pathway+to+Prevention+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).</li>
<li>Fouts, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+Electrochemiluminescence+Assays+Improve+Prediction+of+Time+to+Type+1+Diabetes+in+Autoantibody-Positive+TrialNet+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects.</a> Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).</li>
<li>Sosenko, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Electrochemiluminescence+Assays+to+Predict+Autoantibody+and+Glycemic+Progression+Toward+Type+1+Diabetes+in+Individuals+with+Single+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+Sensitivity+and+Earlier+Identification+of+Celiac+Disease+Autoimmunity+by+a+Nonradioactive+Assay+for+Transglutaminase+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 5(2016).</li>
<li>Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmonic+chip+for+biomarker+discovery+and+diagnosis+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes.</a> Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).</li>
<li>Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+Antibody+Detection+by+Agglutination-PCR+%28ADAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP).</a> American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).</li>
<li>Yim, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-color+alternating-laser+excitation+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+for+next-generation+biodetection+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays.</a> Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).</li>
<li>Bale, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+microsphere-based+assay+for+early+detection+of+Type+I+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes.</a> Technology. 02 (03), 200-205 (2014).</li>
<li>Ziegler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+Screen+ELISA+for+High-Throughput+Detection+of+Beta+Cell+Autoantibodies+in+Capillary+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).</li>
<li>Schlosser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+Antibody+Standardization+Program%3A+evaluation+of+assays+for+insulin+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies.</a> Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+assay+combining+insulin%2C+GAD%2C+IA-2+and+transglutaminase+autoantibodies+to+facilitate+screening+for+pre-type+1+diabetes+and+celiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W licznych krajowych i międzynarodowych badaniach klinicznych dotyczących cukrzycy typu 1 skuteczność pojedynczego testu ECL do wykrywania autoprzeciwciał wysp trzustkowych i autoprzeciwciał przeciwko transglutaminazie (TGA) w celiakii została potwierdzona 8,9,10,11. Na wszystkich tych ścieżkach test ten zwiększył czułość i swoistość wykrywania autoantygenu w porównaniu z istniejącym "złotym" standardem RBA. Zwiększoną swoistość choroby można zaobserwować przy rozróżnianiu autoprzeciwciał wysp trzustkowych o wysokim powinowactwie i wysokim ryzyku od sygnałów o niskim ryzyku i niskim powinowactwie, między pojedynczym testem ECL a RBA 14,15,16,17. Opierając się na pojedynczym teście ECL, opracowujemy nowy, wysokoprzepustowy, multipleksowany test autoprzeciwciał ECL, który umożliwia nam badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, a także kilku możliwych do zastosowania chorób autoimmunologicznych w tym samym czasie.
Multipleksowy test ECL wykorzystuje płytkę multipleksową, która może połączyć do 10 testów autoprzeciwciał w jednym dołku. W niniejszym badaniu połączono ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Autoprzeciwciała składają się z 3 IAb (IAA, i IA-2A), 2 autoprzeciwciał autoimmunologicznych przeciwko chorobom tarczycy (TPOA i ThGA), autoprzeciwciał przeciwko celiakii (TGA) i autoprzeciwciał APS-1 przeciwko interferonowi alfa (IFNαA). Mechanizm oznaczania jest zasadniczo oparty na pojedynczym teście ECL, jak wcześniej opublikowano 9,10,12,18 z pewnymi modyfikacjami. Główna różnica między multipleksowym testem ECL a pojedynczym testem ECL polega na tym, że każdy kompleks przeciwciało-antygen utworzony w fazie płynnej jest ograniczony do określonego łącznika (ryc. 1). Antygen znakowany biotyną jest inkubowany ze sprzężoną streptawidyną, łącznikiem używanym do tworzenia specyficznego kompleksu antygen-łącznik. Kompleks immunologiczny przeciwciało-antygen tworzy się po inkubacji z surowicą pacjenta i jest wychwytywany w określonym miejscu przez specyficzny system łączników na każdej studzience płytki multipleksowej. Antygen znakowany Ru Sulfo-NHS wychwycony przez przeciwciała w tym samym czasie dostarcza sygnał z elektrochemiluminescencją. Czytnik płytek może wykryć do 10 różnych sygnałów ze źródeł punktowych znajdujących się w każdej studni. Aby zachować spójność testów autoprzeciwciał między płytkami i podczas prowadzenia długoterminowych badań, sugerujemy stosowanie tego samego łącznika.
Przed skonfigurowaniem multipleksowego testu ECL, pojedyncze testy ECL dla każdego autoprzeciwciała muszą zostać zoptymalizowane odpowiednio na płytce multipleksowej i zweryfikowane zarówno pod kątem RBA, jak i pojedynczych testów ECL na zwykłej płytce ECL. Aby ulepszyć test szachownicy, do powiązanego testu autoprzeciwciał na płytce multipleksowej, użyto pacjenta o wysokim dodatnim wyniku i ujemnej próbki pacjenta. Po przeprowadzeniu testu szachownicy obliczono najbardziej idealne stężenia dla Ru Sulfo-NHS i antygenu znakowanego biotyną dla każdego z 7 testów autoprzeciwciał. Następujące stężenia są następujące: 30 ng/ml i 200 ng/ml dla GAD65, 120 ng/ml i 120 ng/ml dla proinsuliny, 10 ng/ml i 42 ng/ml dla IA-2, 80 ng/ml i 80 ng/ml dla TG, 8 ng/ml i 16 ng/ml dla TPO, 31 ng/ml i 31 ng/ml dla ThG, oraz odpowiednio 12 ng/ml i 12 ng/ml dla IFNα13. Stężenia niektórych antygenów z testu szachownicy mogą wymagać dalszego dostosowania zgodnie z wynikami rzeczywistego testu multipleksowego po połączeniu wszystkich testów razem.
Ponieważ IAA jest uwzględniony w niniejszym multipleksowym teście ECL, obowiązkowa obróbka kwasem próbek surowicy przed inkubacją surowicy z antygenem, jak podano w poprzednim badaniu12. Ogólnie rzecz biorąc, gdy dodatkowe autoprzeciwciało jest dodawane do testu multipleksowego, wpływa to na tło testu, a bardzo wysoki sygnał z jednego miejsca, w studzience, może utrudniać wyniki pobliskich plam poprzez przesłuchy. W związku z tym maksymalna liczba CPS musi być ograniczona do 20 000 zliczeń dla każdego autoprzeciwciała lub niższa dla próbek o najwyższej liczbie dodatnich. Z naszej wiedzy wynika, że w celu zmniejszenia ilości przesłuchów, autoprzeciwciała, które mają niższe tło, powinny być oddzielane, podczas projektowania mapy punktowej, z dala od miejsc o większej częstotliwości zliczeń.
W każdym teście stosowano wewnętrznie wysokie wyniki dodatnie i ujemne w celu obliczenia dokładnego indeksu dla nieznanych badanych próbek. Aby dokładnie ocenić i monitorować czułość testu, zastosowano niskie kontrole dodatnie, ustawione w pobliżu górnej granicy testu. Te standardowe kontrole dodatnie i ujemne zostały utworzone luzem i podwielokrotnością do długotrwałego stosowania i przechowywane w temperaturze -20 °C lub niższej, w celu zachowania spójności między testami. W celu zapewnienia jakości próbki badano dwukrotnie w każdym teście, a każdy pozytywny wynik był ponownie badany i potwierdzany poprzez umieszczenie próbki w nowym teście ECL następnego dnia. W przypadku jakichkolwiek rozbieżności co do pierwszego i drugiego testu potwierdzającego, konieczne było przeprowadzenie trzeciego testu. Spośród trzech przeprowadzonych testów, wyniki dwóch testów, które są zgodne (np. +, + lub -,-), określiły ostateczny wynik (dodatni lub negatywny) próbki.
W ciągu ostatniej dekady wiele grup badawczych poszukuje wysokoprzepustowego testu wykorzystującego metodę multipleksową do łączenia wielu testów autoprzeciwciał w jednym dołku w celu przeprowadzenia badań przesiewowych dużych populacji. Istnieje kilka badań, które wykorzystują różne rodzaje technologii do przeprowadzania testów autoprzeciwciał multipleksowych 19,20,21,22, ale nie ma porównania dla żadnego z tych testów pod względem czułości i swoistości w porównaniu z obecnym "złotym" standardem RBA, podczas badania cukrzycy typu 1. Te różne typy stosowanych platform nie są walidowane podczas międzynarodowych warsztatów Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) ani poprzez testowanie dużych kohort w badaniach klinicznych. W niedawnym badaniu przesiewowym opartym na populacji ogólnej w Niemczech, wysokoprzepustowy test łączony, 3 Screen ICATM ELISA dystrybuowany przez firmę Kronus, jest używany jako narzędzie do badań przesiewowych pierwszego rzutu w celu wykrycia trzech IAb,, IA-2A i ZnT8A, w celu uzyskania wczesnej diagnozy dziecięcej cukrzycytypu 1 23. 3-ekranowy test ELISA mierzy 3 autoprzeciwciała w 3 oddzielnych studzienkach, zużywając dużą objętość surowicy, lub w jednym dołku z wymieszanymi wszystkimi 3 testami. Jeśli jeden dołek w 3-ekranowym teście ELISA jest pozytywny, nie jest w stanie odróżnić, które z trzech autoprzeciwciał są obecne. Największą wadą tego testu jest brak możliwości uwzględnienia pomiaru IAA. Wszystkie wyniki IAA przeprowadzone metodą ELISA, jak udowodniono podczas warsztatów IASP, nie mają akceptowalnej czułości i swoistości24. IAA jest zwykle pierwszym IAb, który się pojawia i ma wysoką częstość występowania wśród małych dzieci. Badania przesiewowe IAb, z IAA, są konieczne dla dzieci i nie uważa się za dopuszczalne przeprowadzanie tych badań przesiewowych bez IAA w celu oceny ryzyka cukrzycy typu 1 w społeczności. Ponadto nie ma opublikowanych badań ani danych, które wskazywałyby, że test Kronus IAb kit jest bardziej specyficzny dla choroby T1D i jest w stanie odróżnić IAb wysokiego ryzyka od IAb niskiego ryzyka. Test ECL 7-Plex w niniejszym badaniu został zwalidowany przy użyciu dużej kohorty nowo zdiagnozowanych pacjentów z cukrzycą typu13. W porównaniu z obecnym standardowym testem RBA i ugruntowanym pojedynczym testem ECL, test 7-Plex jest w stanie zachować 100% dodatni wynik przy tej samej swoistości testu (Tabela 4). Obecnie test 4-Plex ECL, równoległy do standardowego RBA, jest stosowany w trwającym dużym badaniu klinicznym: badaniu Autoimmunity Screening for Kids (ASK). Badanie to obejmuje badania przesiewowe dzieci z populacji ogólnej z obszaru metropolitalnego Denver pod kątem cukrzycy typu 1 i celiakii. W porównaniu ze standardowym RBA zastosowanym w badaniu ASK, multipleksowy test ECL wykazuje doskonałą czułość i wyższą swoistość choroby, identyczną z naszymi poprzednimi raportami z wykorzystaniem pojedynczego badania ECL25. Co więcej, nasz test ECL 4-Plex wykazał wyraźne zmniejszenie nakładu pracy, kosztów i objętości surowicy o 70% w porównaniu z odpowiadającymi im 4 pojedynczymi testami ECL i RBA. Korzystając z multipleksowanego testu ECL, możemy dostosować każdą studzienkę za pomocą różnych liczb, reprezentujących różne autoprzeciwciała (do 10), aby przetestować różne choroby autoimmunologiczne, które są specyficzne dla potrzeb określonej lokalizacji klinicznej.
W niniejszym badaniu zaobserwowano pewne ograniczenia dotyczące multipleksowanego testu ECL przy użyciu płytki multipleksowej. Końcowe rozcieńczenie surowicy, inkubowanej z antygenem, nie może być dostosowane w celu uzyskania najbardziej optymalnych warunków dla każdego pojedynczego testu autoprzeciwciał, który jest połączony w jednym dołku. W dziewięciu próbkach (9/1026) od pacjentów z cukrzycą typu 1 zaobserwowano, że wynik jest fałszywie ujemny dla określonych autoprzeciwciał. 7 wyników fałszywie ujemnych dotyczyło TPOA, a 2 ThGA, w teście ECL 7-Plex, ale wysokie wyniki dodatnie wykazano zarówno w teście pojedynczego ECL, jak i RBA (Figura 2 i 3). Po dalszym rozcieńczeniu wszystkich 9 próbek, na płytce multipleksowej uzyskały one wynik dodatni. Wynik ten jest spowodowany tym, co nazywamy zjawiskiem "prozone". Zjawisko to powoduje, że próbka wykazuje fałszywie ujemny wynik, ponieważ wysokie miana przeciwciał wpływają na tworzenie sieci antygen-przeciwciało. Podczas ustawiania testu multipleksowego zaleca się, aby próbki o bardzo wysokich mianach, dla każdego z połączonych autoprzeciwciał, przeprowadziły testy wstępne w celu zidentyfikowania opcjonalnego rozcieńczenia surowicy do inkubacji antygenu. Alternatywnie, testy autoprzeciwciał o podobnie zoptymalizowanych warunkach powinny być wybrane w celu utworzenia testu połączonego, z którego uzyskuje się najlepszą czułość i swoistość testu dla każdego autoprzeciwciała. W niniejszym badaniu 7 próbek (7/1022) od zdrowych, normalnych osób z grupy kontrolnej dało fałszywie dodatnie wyniki dla wielu autoprzeciwciał w teście 7-Plex, ale po przeprowadzeniu pojedynczego testu ECL i RBA (Figura 2 i 3) stwierdzono, że te autoprzeciwciała są ujemne w obu testach. Przyczyny tych fałszywie dodatnich wyników występujących na płytce multipleksowej dla tych małych podzbiorów próbek są obecnie nieznane. W przypadku obecnego zastosowania multipleksowego testu ECL wszystkie dodatnie próbki są powtarzane z odpowiadającym im pojedynczym testem ECL w celu potwierdzenia dodatniego wyniku, co usuwa ten fałszywie dodatni błąd z multipleksowego testu ECL.

Cukrzyca typu 1 (T1D) jest poważną chorobą przewlekłą, która najczęściej występuje w dzieciństwie. Obecnie około 1,4 miliona osób w Stanach Zjednoczonych ma cukrzycę typu 1; Uderzające jest to, że częstość występowania cukrzycy typu 1 stale rośnie w tempie 3-5% każdego roku na całym świecie i podwoiła się w ciągu ostatnich dwóch dekad, zwłaszcza u małych dzieci1,2. Autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym (IAb) w krążeniu krwi są obecnie najbardziej wiarygodnym biomarkerem. IAb mogą pojawić się na wiele lat przed rozwojem klinicznej cukrzycy typu 13. Obecnie cztery główne IAb są szeroko stosowane w diagnostyce cukrzycy typu 1 i badaniach przesiewowych ryzyka, w tym autoprzeciwciała przeciwko insulinie (IAA), dekarboksylazie glutaminianu-65 (), antygenowi insulinoma-2 (IA-2A) i transporterowi-8 (ZnT8A). Te cztery IAb są równie ważne w przewidywaniu rozwoju cukrzycy typu 1. Klasyfikacja cukrzycy typu 1 została niedawno ponownie zdefiniowana jako obecność ≥2 dowolnych 4 IAb z prawidłowym metabolizmem glukozy jako stadium choroby 14.
W badaniu Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) ujawniono, że jedno na czworo dzieci zagrożonych T1D prawdopodobnie rozwinie się w stan autoimmunizacji wysp trzustkowych, celiakii, tarczycy lub reumatoidalnej, a co bardziej uderzające, około 40% pacjentów, u których zdiagnozowano cukrzycę typu 1, ostatecznie rozwija dodatkową chorobę autoimmunologiczną5,6,7. Identyfikacja autoprzeciwciał ma zasadnicze znaczenie dla przewidywania i diagnozowania tych chorób autoimmunologicznych i powinna zapewnić lepszą opiekę kliniczną pacjentom. Obecnie nie ma łatwego i niedrogiego sposobu na badania przesiewowe w kierunku tych wielu chorób autoimmunologicznych. Obecne metody badań przesiewowych wykorzystujące standardowy test wiązania promieniotwórczego (RBA), z pojedynczym pomiarem autoprzeciwciał, są pracochłonne i nieefektywne w przypadku badań przesiewowych na dużą skalę.
Tutaj będziemy opisywać nowo opracowany prosty multipleksowany test ECL, który uwierzytelniliśmy za pomocą pojedynczej platformy testowej ECL8,9,10,11. Multipleksowy test ECL łączy 7 testów autoprzeciwciał w jednym dołku, przy użyciu tylko 15 μl surowicy, i jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu istotnych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i APS-1. Test ZnT8A ECL nie został jeszcze opracowany w tym czasie i nie został włączony do testu multipleksowego. Multipleksowy test ECL stanowi doskonałe narzędzie do wysokowydajnych badań przesiewowych w populacji ogólnej w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych.

<table><tbody><tr><td>4 & stopnie; C lodówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ndash; 80 stopni Celsjusza; C oraz -20 &deg; C zamrażarki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa Wytrząsarka</td><td>do płyt Wallac - Delfi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa okrągła płyta dolna</td><td>Fisher</td><td>8408220</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu octowego</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td></td>aluminiowa</tr><tr><td>Białka antygenowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko GAD65 pełnej długości</td><td>Diamyd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko ThG o pełnej długości</td><td>BioMart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko TPO o pełnej długości</td><td>BioMart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IA-2 białko wewnątrzkomórkowe</td><td>BioMart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IFN-&alpha; białko</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Białko proinsuliny</td><td>AmideBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tTG białko</td><td>DiaRect</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelka 500 ml, Jednostki filtrujące</td><td>Fisher</td><td>0974064A lub B</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Destylowana woda</td><td></td><td></td><td></td>dejonizowana (DD</tr><tr><td>) HCl</td><td>Kostkarka</td> do lodu Fisher <td></td><td></td></tr> Tacki <tr><td></td> na lód <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sektor MSD</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>wielokanałowa</tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wieża</td><td></td><td></td><td></td>papierowa</tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety/końcówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ru Sulfo-NHS</td><td>MSD (R91AN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw rozwojowy Uplex</td><td>MSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka UPlex</td> Bloker <td>MSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A</td><td>MSD</td><td>R93AA</td><td></td></tr><tr><td>Linker-Streptawidyna</td><td>MSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor odczytu</td><td>MSD</td><td>R92TC</td><td></td></tr><tr><td>Stop Solution MSD</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZeBa Column</td><td>Pierce</td><td>89892</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym (IAbs) są szeroko stosowane w diagnostyce i przewidywaniu cukrzycy typu 1 (T1D). Cztery główne IAb do insuliny (IAA), dekarboksylaza glutaminianu-65 (), antygen insulinomy-2 (IA-2A) i transporter-8 (ZnT8A) są równie ważne w przewidywaniu choroby. Obecnie u 40% pacjentów, u których zdiagnozowano cukrzycę typu 1, rozwijają się inne zaburzenia autoimmunologiczne. Niestety, obecne metody badań przesiewowych wykorzystujące pojedyncze autoprzeciwciało do pomiaru są pracochłonne i nieefektywne w przypadku badań przesiewowych na dużą skalę. Niedawno opracowaliśmy prosty test elektrochemiluminescencji multipleksowej (ECL), aby rozwiązać te aktualne problemy. Test łączy wszystkie 7 testów autoprzeciwciał w jednym dołku. Każda studzienka zawiera trzy IAb (IAA, i IA-2A), autoprzeciwciała przeciwko peroksydazie tarczycowej (TPOA) i globuliny tarczycy (ThGA) do wykrywania autoimmunologicznej choroby tarczycy, autoprzeciwciała przeciwko transglutaminazie tkankowej (TGA) w celiakii oraz autoprzeciwciała przeciwko interferonowi alfa (IFNαA) w autoimmunologicznym zespole wielogruczołowym-1 (APS-1); wszystkie z nich prowadzą badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i innych istotnych chorób autoimmunologicznych jednocześnie. Multipleksowy test ECL jest oparty na pojedynczej platformie testowej ECL, ale zamiast tego wykorzystuje płytkę multipleksową łączącą wiele testów autoprzeciwciał, do 10, w jednym dołku. Główna różnica w stosunku do pojedynczego testu ECL polega na tym, że każdy kompleks przeciwciało-antygen utworzony w fazie płynnej jest ograniczony w określonym miejscu na każdym dołku za pomocą systemu łącznikowego na płytce multipleksowej. Test 7-Plex ECL w niniejszym badaniu jest walidowany w porównaniu ze standardowymi testami wiązania promieniotwórczego (RBA) i pojedynczymi testami ECL, przy użyciu dużej kohorty nowo zdiagnozowanych pacjentów z cukrzycą typu 1 i zdrowych osób kontrolnych w tym samym wieku, co skutkuje doskonałą czułością i swoistością testu.

Modelujemy prosty multipleksowany test ECL, który łączy ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Test jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu innych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i autoimmunologicznego zespołu wielogruczołowego 1.

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate ...

Test elektrochemiluminescencji może jednocześnie badać cukrzycę typu 1 i inne istotne choroby autoimmunologiczne, w tym autoimmunologiczną chorobę kriogeniczną, celiakię i autoimmunologiczny zespół wielogruczołowy-1. Bardzo złożony test ECR łączy do 10 testów z wieloma przeciwciałami w jednym dołku, co skutkuje wysoką przepustowością, mniejszą liczbą bibliotek i tańszym testem, który wymaga mniejszej objętości. Procedurę zademonstruje Xiaofan Jia, post z mojego laboratorium.Aby przygotować mieszany roztwór antygenu sprzężonego z łącznikiem, najpierw wybierz optymalne stężenie dla każdego antygenu w oparciu o test szachownicy i rozcieńczyć antygen znakowany biotyną i rutenem do racjonalnego stężenia roboczego. Aby związać różne łączniki z każdym z unikalnie biotynylowanych antygenów, dla jednego 96-dołkowego testu zmieszano 240 mikrolitrów odpowiedniego sprzężonego łącznika STREPTAWIDYNY z 4 mikrolitrami biotynylowanych białek będących przedmiotem zainteresowania. Następnie dodaj 156 mikrolitrów 1% BSA na probówkę i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Pod koniec inkubacji dodać 160 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej probówki i inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 30 minut. Pod koniec inkubacji usuń 400 mikrolitrów antygenu sprzężonego z łącznikiem z każdej probówki i wyciągnij wszystkie siedem zawiesin antygenu do jednej probówki. Następnie dodaj do mieszaniny 1,2 mililitra roztworu zatrzymującego i 4 mikrolitry GAD65, TPO, tTg, ThG, interferonu alfa proinsuliny i antygenu IA-2 znakowanego sulfo-NHS.Przed inkubacją próbek surowicy z oznakowaną mieszaniną antygenów dodać 15 mikrolitrów surowicy na dołek 96-dołkowej płytki PCR i wymieszać 18 mikrolitrów 0,5 molowego kwasu kwasowego z każdym dołkiem surowicy przez 45-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji dodać 35 mikrolitrów antygenu i 13 mikrolitrów jednego molowego buforu Tris na dołek nowej 96-dołkowej płytki PCR. Pod koniec inkubacji natychmiast przenieść 25 mikrolitrów surowicy potraktowanej kwasem do każdej studzienki płytki antygenowej.Przykryj płytkę folią sufitową PCR i umieść płytkę na wytrząsarce na niskich obrotach w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji umieść płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza na 18 do 24 godzin. Wyjmij talerz z lodówki i pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową.Następnie dodaj 150 mikrolitrów 3% buforu A blokującego do każdej studzienki. Gdy wszystkie studzienki zostaną poddane obróbce, przykryj płytkę folią sufitową i umieść płytkę w lodówce o temperaturze 4 stopni Celsjusza na noc. Następnego ranka odwróć płytkę do góry nogami i umyj próbki trzy razy 150 mikrolitrami PBS-T na studzienkę na mycie.Poklep płytkę, aż w żadnym z dołków nie pozostanie bufor. Dodać 30 mikrolitrów inkubacji antygenu surowicy do każdej studzienki. Po dodaniu wszystkich inkubatów przykryć płytkę folią i umieścić płytkę na wytrząsarce z małą prędkością na jedną godzinę, w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji usunąć inkubaty przez strzepnięcie i umyć studzienki trzykrotnie 150 mikrolitrami PBS-T na studzienkę, jak pokazano. Po ostatnim myciu dodaj 150 mikrolitrów buforu odczytowego do każdej studzienki i odczytaj płytkę na czytniku płytek, w zliczeniach na sekundę. W tej analizie dużej kohorty próbek od 1026 nowo zdiagnozowanych pacjentów z cukrzycą typu 1, poziomy przeciwciał automatycznych z testu siedmiu plus elektroluminescencji porównano z poziomami z każdego odpowiedniego ustalonego pojedynczego testu elektroluminescencji oraz z każdego odpowiadającego mu pojedynczego standardowego testu wiązania radiowego i ELISA.Swoistość testu była identyczna w 99. percentylu dla wszystkich testów autoprzeciwciał, z wyjątkiem autoprzeciwciał tarczycy, dla których zastosowano 95. percentyl. Niewielką liczbę niezgodnych próbek dla każdego z siedmiu automatycznych przeciwciał znaleziono wokół granicy punktów odcięcia dla każdego testu. W tym miejscu można zaobserwować odpowiednie dane dla 1022 zdrowych osób z grupy kontrolnej dla każdego testu.Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest znalezienie innego łącznika z każdym z unikalnie biotynylowanych antygenów i wymieszanie każdego antygenu z właściwościami zapewniającymi sprzężony łącznik. Ta technika testowa pozwoli naukowcom zaplanować badania przesiewowe w kierunku wielu chorób autoimmunologicznych jednocześnie w dużych populacjach i umożliwi klinikom łatwe badania przesiewowe wielu istotnych chorób z cukrzycą typu 1.

a-high-throughput-electrochemiluminescence-7-plex-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test ELISA można łatwo przekształcić w analizę Luminex xMAP, a dzięki zaletom multipleksowania można jednocześnie przesiewowo badać kilka przeciwciał w celu zidentyfikowania optymalnej pary przeciwciał, co prowadzi do zwiększenia czułości i zakresu dynamicznego przy jednoczesnym obniżeniu kosztów analizy.

Konwersja testu ELISA typu capture na test Luminex xMAP z wykorzystaniem metody wielipleksowego przesiewania przeciwciał

Wysokoprzepustową walidację wielu potencjalnych biomarkerów można przeprowadzić za pomocą sekwencyjnego testu ELISA, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania oraz zużycie cennych próbek osocza. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak sekwencyjnie wykonać testy ELISA dla sześciu różnych zwalidowanych biomarkerów osocza1-3 w chorobie przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD)4 w tej samej próbce osocza.

Wysokoprzepustowy sekwencyjny test ELISA do walidacji biomarkerów ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi

Ten film prezentuje wykrywanie autoprzeciwciał wysp trzustkowych w ludzkiej surowicy. Przeciwciała w surowicy łączą antygen sprzężony rutenem z biotynylowanym antygenem wychwytującym, tworząc kompleksy, które są wykrywane za pomocą pomiarów elektrochemiluminescencyjnych.

Wykrywanie ludzkich autoprzeciwciał wysp trzustkowych za pomocą testu elektrochemiluminescencyjnego

Pomiar biomarkerów w złożonych próbkach biologicznych coraz częściej pomaga w podejmowaniu decyzji klinicznych. Opisujemy wysoce czułą metodę jednoczesnego pomiaru białka C wiążącego miozynę sercową, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od osób z zawałem mięśnia sercowego i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Tutaj przedstawiliśmy metody wykrywania autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych za pomocą testów elektrochemiluminescencyjnych (ECL). Protokół, stosowany do przewidywania cukrzycy typu 1, może być rozszerzony o wykrywanie autoprzeciwciał przeciwko innym chorobom autoimmunologicznym.

Testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Zgodnie z pilną potrzebą badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i choroby koronawirusowej 2019, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 6-Plex do jednoczesnego wykrywania wszystkich czterech autoprzeciwciał wysp trzustkowych, autoprzeciwciał transglutaminazy tkankowej oraz przeciwciał przeciwko domenie wiążącej receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej.

Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19

Trzykanałowy system analizy przepływu fluorescencji z podwójnym reporterem został wykorzystany do opracowania multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie ocenia próbki surowicy pod kątem IgG i IgM wywołanych przez wiele antygenów różnych gatunków Borrelia, które powodują boreliozę z Lyme w Europie i Ameryce Północnej.

Jednoczesne wykrywanie różnych klas przeciwciał w multipleksowanym teście serologicznym

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Poznaj wielopleksowy test elektrochemiluminescencyjny do jednoczesnego badania przesiewowego cukrzycy typu 1 i chorób autoimmunologicznych. Ta metoda łączy siedem oznaczeń przeciwciał w jednej próbce, zwiększając efektywność diagnostyczną.

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

Przeglądaj więcej filmów