Name: Wstępne oczyszczanie płynu z kultur komórkowych pobranych w CHO za pomocą separatora akustycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Naucz się wstępnego oczyszczania płynu z kultur komórek CHO za pomocą separatora akustycznego. Ta metoda oferuje ciągły przepływ materiału pozbawionego komórek dla procesów biotechnologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować Nilou Sarah Arden i Zhong Zhao za konstruktywną recenzję tego manuskryptu. Autorzy chcieliby również podziękować Lindsey Brown za istotny wkład w ten projekt. Częściowe wewnętrzne finansowanie i wsparcie dla tych prac zostało zapewnione przez CDER Critical Path Program (CA #1-13) oraz CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence Program (Berilla-CoE-19-49). Projekt ten był częściowo wspierany przez Program Staży/Uczestnictwa w Badaniach w Biurze Produktów Biotechnologicznych Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków, zarządzany przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy umowy międzyagencyjnej między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a FDA.
Ta publikacja odzwierciedla poglądy autora i nie powinna być interpretowana jako reprezentująca poglądy lub politykę FDA.

1. Przygotowanie AWS
UWAGA: Protokół ten został opracowany przy użyciu jednej komory akustoforetycznej. Jednakże AWS w skali laboratoryjnej posiada pięć sond mętności, które w razie potrzeby mogą obsługiwać 4 komory akustoforetyczne szeregowo.
<ol>
	<li>Podłącz kable mętności do odpowiednich portów oznaczonych jako F, 1, 2, 3, 4 (np. sondę mętności 1 na Rysunku 1c i port 1 na Rysunku 2a), a kable BNC zasilania komory do tylnego panelu systemu AWS oznaczonego jako 1, 2, 3, 4 (Rysunek 2b). 
	UWAGA: Nie podłączaj drugiego końca kabla BNC zasilania komory (Rysunek 3c) do tylnej części komory akustoforetycznej (Rysunek 3d) aż do kroku 2.6, gdy komora zostanie wypełniona cieczą. Włączenie zasilania komory bez obecności cieczy spowoduje uszkodzenie przetwornika piezoelektrycznego w komorze i utratę jego funkcjonalności.</li>
	<li>Włóż sondy mętności do obudowy miernika mętności i termometru, a następnie dokręć śruby (Rysunek 1c oraz Rysunek 3).</li>
	<li>Podłącz przewód zasilający do wejścia portu mętności zasilania (Rysunek 4a) poprzez pompę zasilającą (Rysunek 1b do 1c).</li>
	<li>Podłącz przewód w kształcie litery Y z wyjścia portu mętności zasilania (Rysunek 4b) do portów wlotowych komory akustoforetycznej (Rysunek 4c).</li>
	<li>Podłącz przewód etapu 1 z portu odpływowego komory akustoforetycznej (Rysunek 4d) poprzez pompę etapu 1 do naczynia do zbierania komórek (Rysunek 1d przez 1e do 1f).</li>
	<li>Podłącz przewód z portu permeatu komory akustoforetycznej (Rysunek 4e) do wejścia portu mętności sondy 1 (Rysunek 4f).</li>
	<li>Podłącz przewód zbiorczy z wyjścia portu mętności sondy 1 (Rysunek 4g) do naczynia do zbierania produktu (Rysunek 1c do 1g).</li>
</ol>
2. Przygotowanie systemu za pomocą HCCF
UWAGA: Protokół ten opracowano z wykorzystaniem komórek CHO-K1 hodowanych w medium chemicznie zdefiniowanym (ActiCHO P z 6 mM L-glutaminy) produkujących modelowe przeciwciało monoklonalne IgG1 VRC0113 i może on wymagać dostosowania dla innych linii komórkowych i produktów. HCCF użyte w tym protokole uzyskano po 7–8 dniach hodowli CHO-K1 w kolbie wytrząsowej lub procesie w bioreaktorze.
<ol>
	<li>Włącz AWS, uruchamiając przełączniki zasilania z tyłu i z przodu urządzenia AWS.</li>
	<li>Włącz komputer i dwukrotnie kliknij ikonę na pulpicie powiązanego oprogramowania (patrz Tabela materiałów). W panelu „Readings” naciśnij przycisk „Start Test”, aby rozpocząć rejestrację danych (Rysunek 5). Po rozpoczęciu rejestracji wszystkie zebrane dane będą zapisywane w arkuszu kalkulacyjnym możliwym do eksportu aż do momentu zatrzymania testu.</li>
	<li>Podłącz końcówkę rurki doprowadzającej do mieszanego naczynia z HCCF.</li>
	<li>Uruchom pompę zasilającą, wprowadzając prędkość pompowania na ekranie „Controls” w polu „Feed Pump Image”, a następnie naciśnij klawisz „Enter” na klawiaturze. Upewnij się, że w szarym polu po prawej stronie obrazu pompy zasilającej (Feed Pump Image) prawidłowo wybrano „Pump Direction Arrow Icon” (zgodnie lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara), aby pompować HCCF z naczynia do komory akustoforetycznej. Kliknij „Triangle Icon” obok słów „Turn ON” w szarym polu pod obrazem pompy zasilającej, aby „Uruchomić” pompę (Rysunek 6a). 
	UWAGA: Maksymalna prędkość pompowania wynosi 10 L/h (167 mL/min), jednak w tym kroku zaleca się stosowanie nominalnego natężenia przepływu 60 mL/min, aby szybko wypełnić rurki i komorę, nie ryzykując jej przepełnienia przed rozpoczęciem separacji.</li>
	<li>Monitoruj pomiary mętności dopływu, obserwując „Percent Reduction Panel” (Rysunek 5c) podczas napełniania komory akustoforetycznej. Wartości mętności pozostaną stałe podczas ładowania komory, jeśli HCCF jest wystarczająco mieszany w naczyniu z HCCF.</li>
	<li>Gdy ciecz znajdzie się powyżej przetwornika piezoelektrycznego z tyłu komory akustoforetycznej, naciśnij „Turn OFF” w szarym polu pod obrazem pompy zasilającej, aby zatrzymać pompę. Podłącz kabel zasilający BNC (Rysunek 3c) do komory akustoforetycznej (Rysunek 3d). 
	UWAGA: Objętość robocza każdej komory akustoforetycznej wynosi około 190 mL.</li>
</ol>
3. Obsługa AWS
<ol>
	<li>Po napełnieniu komory akustoforetycznej i podłączeniu kabla zasilającego BNC do tylnej części komory, należy zmienić szybkość pompy zasilającej na pożądaną szybkość roboczą (Rycina 6a i Tabela 1Należy przetestować kilka prędkości pompowania wsadu, aby zidentyfikować optymalne parametry pracy dla danego procesu.</li>
	<li>Włącz zasilanie piezo stage1, przesuwając suwak w module zasilania do wartości 10 W (Rysunek 6d) i naciśnięcie „WŁĄCZikona ” po prawej stronie pola Etap 1 (Rycina 6c). Zgodnie z sugestią producenta, należy użyć mocy 10 W, która jest zalecanym ustawieniem dla komórek CHO. Pozwoli to na uzyskanie stałej częstotliwości pracy wynoszącej 2 MHz. Po kilku sekundach komórki zaczną widocznie skupiać się w węzłach fali w komorze akustoforetycznej (Rysunek 7a).</li>
	<li>Gdy komórki zaczną osiadać na dnie komory akustoforetycznej (Rycina 7b), uruchomić pompę pierwszego stopnia (stage1) z odpowiednią prędkością, zależną od gęstości komórek oraz prędkości pompy podającej (Rycina 6b). Na podstawie arkusza optymalizacji i pracy w stanie ustalonym dostarczonego przez producenta, szybkość pompowania w pierwszym etapie (stage 1) można obliczyć na podstawie masy upakowanych komórek oraz szybkości przepływu pożywki, stosując następujący wzór 
	<img alt="Równanie do obliczenia szybkości pompowania w etapie 1 z wykorzystaniem szybkości pompy zasilającej i procentowej masy upakowanych komórek." src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">
	<ol>
		<li>Aby obliczyć masę spakowanych komórek, należy wytarować wagę z pustą probówką o pojemności 15 ml (lub inną probówką kompatybilną z wirowaniem). Napełnić probówkę materiałem zasilającym i zapisać całkowitą masę probówki wraz z materiałem. Wirować probówkę przez 10 min przy 370 x gZlej supernatant do osobnego naczynia. Zważ probówkę z osadem komórkowym. Procentowa zawartość upakowanej masy komórkowej w materiale wsadowym = (masa probówki po zlaniu supernatantu/masa probówki wypełnionej) x 100%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitoruj profil mętności etapu 1 w momencie, gdy przelew z komory akustoforetycznej wpływa do sondy mętności 1 (Rycina 8).</li>
	<li>W miarę trwania procesu separacji komórek, efektywność usuwania komórek <img alt="Redukcja mętności, formuła, równanie, uzdatnianie wody, obliczanie wydajności, analiza naukowa." src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> wzrośnie.</li>
	<li>Ponadto należy monitorować różnicę temperatur między dopływem a stopniem 1, ponieważ będzie ona rosnąć w miarę postępującej separacji komórek (Rysunek 9). Temperatura może wzrosnąć przy zastosowaniu pożywki o wyższej gęstości komórkowej, lecz zazwyczaj można ją obniżyć poprzez zmianę szybkości przepływu pożywki. 
	UWAGA: Przy użyciu wielu komór akustoforetycznych można sekwencyjnie łączyć przewody z poprzedniej komory akustoforetycznej poprzez sondy mętności z wejściem do bieżącej komory akustoforetycznej. Dodatkowo można połączyć przewody etapowe z dna komór akustoforetycznych poprzez pompy etapowe z naczyniami do zbierania komórek. W razie potrzeby, dla uzyskania optymalnej wydajności usuwania komórek, szeregowo można połączyć łącznie cztery komory akustoforetyczne.</li>
</ol>
4. Zakończenie AWS
<ol>
	<li>Po zakończeniu procesu zatrzymaj pompę zasilającą oraz pompę stopnia 1, naciskając przycisk Turn OFF w szarym polu pod obrazami pompy zasilającej i pompy stopnia 1 odpowiednio, aby wyłączyć pompy.</li>
	<li>Wyłącz zasilanie komory, naciskając przycisk Turn OFF po prawej stronie pola Stage 1, a następnie odłącz kabel zasilający BNC.</li>
	<li>Pobierz zebrany materiał z produktem w celu przeprowadzenia dalszych procedur klarowania i oczyszczania, takich jak filtracja głębinowa i metody chromatograficzne. Materiał z zebranymi komórkami należy usunąć.</li>
	<li>Opróżnij pozostałą ciecz z komory akustoforetycznej, umieszczając dren w pustym naczyniu, odłączając dren od portów wlotowego i permeatu komory akustoforetycznej oraz zdejmując dren z głowicy pompy.</li>
	<li>Podłącz ponownie dren, umieść go w głowicy pompy i przepłucz układ wodą DI z końca drenu zasilającego, stosując natężenie przepływu pompy zasilającej 60 mL/min oraz pompy stopnia 1 60 mL/min. Kontynuuj przez 15–20 min. Płukankę należy usunąć.</li>
	<li>Przepompuj 70% alkohol izopropylowy (IPA) przez dren i komorę za pomocą pompy zasilającej przez 15–20 min. Płukankę należy usunąć.</li>
	<li>Powtórz procedurę czyszczenia wodą DI, aby oczyścić dreny i komorę, używając pompy zasilającej przez 15–20 min. Płukankę należy usunąć.</li>
	<li>Odłącz dreny od sond mętności i komór akustoforetycznych, a następnie oczyść obszar 70% IPA.</li>
	<li>Zdemontuj sondy mętności i oczyść ich wnętrze 70% IPA. Pozostaw wszystkie części do wyschnięcia na powietrzu, a następnie złóż je przed kolejnym użyciem. 
	UWAGA: Komory akustoforetyczne są przeznaczone do jednorazowego użytku, ale mogą być użyte ponownie, jeśli będą odpowiednio obsługiwane i czyszczone zgodnie z opisem w niniejszym protokole.</li>
</ol>

<ol><li>Roush, D. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+primary+recovery%3A+centrifugation+and+membrane+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology.</a> Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).</li>
<li>Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+analysis+of+mammalian+cell+suspensions+for+prediction+of+industrial+centrifugation+and+its+verification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).</li>
<li>Shukla, A. A., Suda, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShukla%2C+AA+%22Harvest+and+recovery+of+monoclonal+antibodies%3A+cell+removal+and+clarification.+Second+ed%22">Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed</a>. 2, Wiley. 55-79 (2017).</li>
<li>Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+cost+and+facility+considerations+in+the+selection+of+primary+cell+culture+clarification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology.</a> Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).</li>
<li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarification+of+recombinant+proteins+from+high+cell+density+mammalian+cell+culture+systems+using+new+improved+depth+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).</li>
<li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).</li>
<li>Ryll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+small-scale+CHO+perfusion+cultures+using+an+acoustic+cell+filtration+device+for+cell+retention%3A+characterization+of+separation+efficiency+and+impact+of+perfusion+on+product+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality.</a> Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).</li>
<li>Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-up+and+optimization+of+an+acoustic+filter+for+200+L%2Fday+perfusion+of+a+CHO+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).</li>
<li>Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+fluid+dynamics+associated+with+macro+scale+ultrasonic+separtors%5BTitle%5D)+AND+%22169th+Meeting+of+the+Acoustical+Society+in+America%22%5BJournal%5D)">Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors.</a> 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).</li>
<li>Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+flow+rate+acoustophoretic+phase+separator+for+oil+water+emulsion+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237(2013).</li>
<li>Dutra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Macroscale+Acoustic+Device+for+Blood+Filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Device%22%5BJournal%5D)">A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration.</a> Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).</li>
<li>Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. Acoustic perfusion devices. US patent. , 9738866 (2017).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+envelope+identifies+broadly+neutralizing+human+monoclonal+antibodies+to+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1.</a> Science. 329 (5993), 856-861 (2010).</li>
<li>Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+cell+filter%3A+a+proven+cell+retention+technology+for+perfusion+of+animal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures.</a> Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).</li>
<li>Wolf, M. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Performance+in+Mammalian+Cell+Perfusion+Cultures+by+Growth+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition.</a> Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722(2019).</li>
<li>Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+approach+to+developing+mammalian+cell+culture+media+for+high+cell+density+perfusion+process+leveraging+established+fed-batch+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media.</a> Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).</li>
<li>Emily, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+clarification+of+very+high+cell+density+cell+culture+harvest+by+enhanced+cell+settling%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling.</a> BioProcess International. 8, 32-39 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych w produktach opisanych w tym manuskrypcie i nie mają nic więcej do ujawnienia.

Opisano krok po kroku protokół implementacji AWS w skali laboratoryjnej w pierwotnym klarowaniu modelowego przeciwciała monoklonalnego z HCCF linii komórkowej CHO. Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, zastosowanie AWS w pierwotnym klarowaniu skutkowało skutecznym klarowaniem komórek i odzyskiwaniem produktu. Co więcej, niski poziom wymagań w zakresie konserwacji i eksploatacji oraz możliwość zwiększenia skali pozwalają na szerszy potencjał zastosowania w pierwotnym klarowaniu.
Co ważne, reprezentatywne wyniki sugerują, że szybkość pompy zasilającej ma kluczowe znaczenie dla separacji ogniw. Ponadto, ze względu na ograniczenia w wykrywaniu dużej gęstości komórek w pomiarze zmętnienia, gęstość robocza komórek jest kolejnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę podczas korzystania z systemu AWS. Ponieważ sonda zmętnienia będzie nasycona podczas pracy z materiałem wsadowym o dużej gęstości komórek, najlepszym rozwiązaniem może być obliczenie wydajności separacji komórek, mierząc gęstość komórek materiału wsadowego i oczyszczonego płynu do hodowli komórkowych w trybie offline. Dzięki dokładnemu pomiarowi klarowania w trybie offline, jedną ze strategii procesowych, którą można wziąć pod uwagę przy rozwiązywaniu tych problemów, jest użycie wielu komór połączonych szeregowo. Chociaż protokół ten koncentruje się przede wszystkim na użyciu pojedynczej komory, system ten może obsługiwać trzy dodatkowe komory do sekwencyjnego klarowania komórek, co może minimalnie wpłynąć na stan komórek i skutkować wysokim odzyskiem produktu. Ponadto inne parametry, takie jak moc dla AWS i natężenie przepływu usuwania komórek, mogą być dodatkowo zoptymalizowane dla określonych typów ogniw lub trybu pracy. Ogólnie rzecz biorąc, przed wdrożeniem AWS zaleca się optymalizację parametrów operacyjnych i strategii przy użyciu tych rozważań.
Wśród wielu potencjałów aplikacyjnych obiecujące jest zastosowanie AWS w ciągłym bioprzetwarzaniu. Ponieważ AWS może zastąpić wirowanie i drastycznie zmniejszyć powierzchnię filtra14, zastosowanie AWS umożliwiłoby stały przepływ materiału bezkomórkowego do późniejszych procesów filtracji i chromatografii, które są kompatybilne z ciągłą bioprodukcją. Ze względu na tę kompatybilność i dostępność technologii perfuzyjnej dla dużej gęstości komórek (np. >50 x 106 komórek/ml) i dłuższego czasu trwania hodowli (np. >14 dni), AWS ma potencjał do opracowania nowatorskiej strategii ciągłego krwawienia z komórek oprócz pierwotnego klarowania.
W niektórych przypadkach do 30% wytworzonego białka terapeutycznego jest usuwane podczas operacji w stanie ustalonym w materiale krwawienia komórkowego15,16. Ponadto, aby usunięte przeciwciała monoklonalne mogły zostać połączone ze standardowym pobranym materiałem, muszą być spełnione określone cechy jakościowe. Jeśli te specyfikacje nie są spełnione, może to skutkować odrzuceniem materiału, co może mieć wpływ na wydajność produktu. Aby skompensować takie straty produktu, można przeprowadzić ciągłe oczyszczanie materiału wycieku komórek za pomocą AWS w stanie ustalonym podczas długotrwałego procesu perfuzji17. Ta strategia może zmniejszyć straty produktu w materiale odpowietrzającym i wykorzystać więcej wyprodukowanego białka. Ponadto komórki po ciągłym klarowaniu za pomocą AWS mogą być potencjalnie dodawane z powrotem do bioreaktora, jeśli jest to pożądane, w celu uzyskania większej gęstości komórek i wydajności. W związku z tym ciągłe klarowanie materiału krwawiącego z komórek za pomocą AWS może dać możliwość zwiększenia wydajności i/lub zmniejszenia powierzchni filtra wtórnego w danym procesie.
Podsumowując, użyteczność AWS nie ogranicza się do prostego pierwotnego wyjaśnienia, ale może być użyteczna dla zastosowań w ciągłym przetwarzaniu biologicznym, które mogą poprawić tempo produkcji i elastyczność operacyjną.

Kluczowym krokiem w procesie bioprodukcji z udziałem wydzielanych białek terapeutycznych jest usunięcie biomasy z pobranego płynu do hodowli komórkowych (HCCF). Tradycyjnie, bioproducenci przyjęli wirowanie, a następnie filtrację wgłębną jako podstawowe metody klarowania w produkcji przeciwciał monoklonalnych1. Jednak wirowanie może prowadzić do dużego naprężenia ścinającego komórek, co skutkuje zwiększonym zanieczyszczeniem komórkowym w HCCF. Może to potencjalnie prowadzić do zanieczyszczenia filtra podczas filtracji i powodować dodatkowe zanieczyszczenia po filtracji, które mogą następnie zmniejszyć wydajność chromatografii końcowej1,2,3. Co więcej, dostosowanie wirówek do określonego procesu może być kosztowne i może wymagać dodatkowych połączeń z systemami czyszczenia na miejscu i sterylizacji na miejscu, co może również stanowić czynnik ograniczający skalowalność. Zastosowanie filtrów wgłębnych może zrekompensować ograniczenia wirowania, a także wykorzystać technologię jednorazowego użytku4. Jednak filtry wgłębne są używane przede wszystkim jako wtórne oczyszczanie, ponieważ nie są w stanie wytrzymać wysokiej gęstości hodowli komórkowych5. Alternatywnie, urządzenia do zatrzymywania komórek z filtracją przepływu stycznego (TFF) zostały zastosowane w celu złagodzenia naprężeń ścinających, ale mogą napotkać wyzwania, takie jak polaryzacja membrany i słabe plony6. Powyższe zagadnienia wynikające ze stosowania wirowania plus filtracji wgłębnej lub TFF stwarzają szansę na usprawnienie procesu pierwotnego klarowania HCCF.
Separacja akustyczna została wprowadzona jako technologia, która może być wykorzystana do zbierania wydzielanych białek z kultur komórkowych za pomocą wysokiej jakości produktów białkowych7,8. Separacja akustyczna jest osiągana poprzez rozchodzenie się i odbijanie wielowymiarowych fal stojących, które oddziałują z zawieszonymi płynami i zatrzymanymi cząstkami9,10. Cząstki te doświadczają trzech sił: oporu płynu, grawitacji i promieniowania akustycznego. Gdy każda z sił jest równo przeciwstawna do siebie, osiągając równowagę, cząstki są zawieszone i uwięzione w ultradźwiękowej fali stojącej10. W zawiesinie hodowli komórkowej komórki są utrzymywane w tej płaszczyźnie węzła ciśnieniowego fal stojących, węzeł rośnie w miarę łączenia się komórek, a ostatecznie te skupiska węzłów komórkowych spadają z siły grawitacyjnej9. Te osadzone komórki są następnie usuwane z pożywki, co pozwala na wypompowanie oczyszczonych pożywek w celu dalszego przetwarzania. Wykorzystanie fal ultradźwiękowych jako metody separacji zaczęło przekładać się na zastosowania biologiczne, począwszy od separacji cząsteczek lipidów i czerwonych krwinek11 do hodowli komórek perfuzyjnych ssaków12. Dzięki jego względnym możliwościom obniżania kosztów, pracy i stresu komórkowego poprzez unikanie wirowania, filtracji wgłębnej lub TFF, bioproducenci badają potencjalne zastosowania separacji akustycznej.
To badanie dostarcza ogólnego protokołu działania laboratoryjnego separatora fal akustycznych (AWS) do klarowania hodowli komórek CHO, przedstawia reprezentatywne dane i pokazuje, jak osiągnąć skuteczne oczyszczanie komórek i odzyskiwanie produktu.

<table><tbody><tr><td>Komora akustyczna</td><td>Pall</td><td>CAS-AC-K1 Zestaw</td><td></td>studzienki akustycznej</tr><tr><td>kadencji ActiCHO P</td><td>GE</td><td>SH31025.01</td><td>medium proszkowe</td></tr><tr><td>AWS</td><td>Pall</td><td>CAS-SYS (60500101-SP)</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do separatora akustycznego</td><td>kadencji Pall</td><td>Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa CHO-K1</td><td>VRC</td><td>VRC01</td><td></td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Dell</td><td>Latitude 3470</td><td>Windows 7, 64-bitowy system operacyjny</td></tr><tr><td>Izopropanol (70%)</td><td>LabChem</td><td>LC157605</td><td>20L przygotowany 70%</td></tr><tr><td>IPA L-glutamina</td><td>Corning</td><td>25-005-CV</td><td>200 mM roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Rurki Masterflex L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-14</td><td>utwardzane nadtlenkiem, 25ft</td></tr><tr><td>Rurki Masterflex L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-16</td><td>rurki silikonowe utwardzane nadtlenkami,</td></tr><tr><td>zestaw rurek</td> 25ft <td>Pall</td><td>CAS-FP-K1 Zestaw</td><td></td>węży</tr><tr><td>Sonda zmętnienia</td><td>Pall</td><td>CAS-TS-S1 (60500106)</td><td></td></tr></tbody></table>

wstępne oczyszczanie płynu z kultur komórkowych pobranych w cho za pomocą separatora akustycznego

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Pierwotne wyjaśnienie jest niezbędnym krokiem w procesie bioprodukcji dla początkowego usuwania komórek z produktów terapeutycznych w pobranym płynie do hodowli komórek. Podczas gdy tradycyjne metody, takie jak wirowanie lub filtracja, są szeroko stosowane do usuwania komórek, urządzenia do tych procesów zajmują duże rozmiary, a ich eksploatacja może wiązać się z ryzykiem zanieczyszczenia i zanieczyszczenia filtra. Ponadto tradycyjne metody mogą nie być idealne dla schematów ciągłego przetwarzania biologicznego w celu wstępnego wyjaśnienia. W związku z tym zbadano alternatywne zastosowanie z wykorzystaniem fal akustycznych (dźwiękowych) w celu ciągłego oddzielania komórek od płynu do hodowli komórkowych. W pracy przedstawiono szczegółowy protokół użycia laboratoryjnego separatora fal akustycznych (AWS) do pierwotnego oddzielania płynu hodowlanego zawierającego przeciwciało monoklonalne IgG1 z bioreaktora komórkowego CHO. Przedstawiono reprezentatywne dane z AWS i pokazano, w jaki sposób osiągnąć skuteczne oczyszczanie komórek i odzyskiwanie produktu. Na koniec omówiono potencjalne zastosowania AWS w ciągłym bioprzetwarzaniu. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to zapewnia praktyczny i ogólny protokół wdrażania AWS w pierwotnym klarowaniu kultur komórkowych CHO i dalej opisuje jego potencjał zastosowania w ciągłym bioprzetwarzaniu.

Jak opisano w protokole, AWS został użyty do klarowania HCCF przy gęstości 12,4 x 106 komórek/mL, jak pokazano na Rysunku 1. Pompa doprowadzająca została ustawiona na 3,5 mL/min (5 L/dzień), co odpowiadało tempu odprowadzania komórek w zakresie uznawanym za odpowiedni dla kultury o objętości 10–20 L. W miarę jak HCCF wpływał do komory AWS, pomiary mętności z sondy pomiarowej na dopływie pozostawały stabilne, na poziomie około 1000–1100 NTU, natomiast pomiary z sondy turbidymetrycznej probe1 utrzymywały się wokół 40–50 NTU (Rysunek 8). Na podstawie tych dwóch pomiarów określono skuteczność usuwania komórek
<img alt="Redukcja mętności, wzór, równanie, oczyszczanie wody, obliczanie sprawności, analiza naukowa." src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">
obliczono i uśredniono na 95%. Stwierdzono, że pomiar mętności w zakresie 40–50 NTU był minimalnym osiągalnym poziomem mętności, a zatem dalsze rozdzielanie przy użyciu dodatkowej komory AWS połączonej szeregowo nie było możliwe.
Chociaż AWS skutecznie oddziela przy niższych natężeniach przepływu, dłuższy czas przebywania HCCF w komorze powoduje wzrost temperatury, co należy wziąć pod uwagę przy doborze niższych natężeń przepływu. Rysunek 9 przedstawia przykład różnicy temperatury HCCF przed wejściem do komory akustoforetycznej i po separacji akustycznej przy natężeniu przepływu 3,5 mL/min, który wykazał wzrost temperatury o &gt;6 °C z powodu dłuższego czasu przebywania w komorze akustycznej.
Innym ważnym aspektem podczas zbierania hodowli o wysokiej gęstości komórek (tj. &gt;20 x 106 komórek/mL) jest nasycenie sond pomiaru mętności. Pomiar mętności przez sondę do medium doprowadzanego uległ nasyceniu powyżej 4400 NTU (Rysunek 10), co może prowadzić do niedoszacowania wydajności usuwania komórek.
Aby przetestować wpływ różnych szybkości dopływu na klarowanie komórek, wydajność usuwania komórek mierzono przy różnych szybkościach dopływu. Jak pokazano na Rysunku 11, wydajność usuwania komórek znacząco zmniejszyła się z około 100% do 57% wraz ze wzrostem szybkości pompy dopływowej. Ogólnie rzecz biorąc, im wolniejsza szybkość pompy dopływowej, tym lepsze klarowanie komórek. Zaleca się jednak optymalizację szybkości dopływu dla każdej konkretnej aplikacji.
<img alt="Schemat systemu chromatograficznego do oczyszczania białek z interfejsem programu oraz fiolkami do zbierania frakcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Konfiguracja systemu AWS. Po włączeniu pomp za pomocą oprogramowania (a) surowy materiał komórkowy (HCCF) był wprowadzany za pomocą pompy doprowadzającej (b) przez sondę do pomiaru mętności strumienia (c) do komory AWS (d). Wewnątrz komory siły akustyczne przechwytywały komórki z przepływającego strumienia w węzłach fal, powodując ich agregację. Zmniejszona pływalność powodowała opadanie komórek siłą grawitacji, a komórki były usuwane przez otwór odpływowy komory akustoforetycznej za pomocą pompy etapu pierwszego (e) do butelki zbiorczej dla biomasy komórkowej (f), podczas gdy oczyszczony materiał odpływał przez otwór permeatu do sondy do pomiaru mętności (sonda1, c) i dalej do butelki zbiorczej produktu (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Sprzęt laboratoryjny z wentylatorami chłodzącymi, połączeniami kablowymi i portem Ethernet do pozyskiwania danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Tył systemu AWS. Sonde do pomiaru mętności i komory są podłączone do odpowiednich portów z tyłu systemu AWS za pomocą kabli Ethernet do sondy do mętności (a) oraz kabla zasilającego BNC do komory (b). Dodatkowo komputer jest podłączony za pomocą kabla Ethernet PC (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="System elektrod jonoselektywnych; schemat układu pomiarowego jonów; matryca elektrod; analiza wody." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3: Sonde do pomiaru mętności i ich obudowa. Każdą sondę do pomiaru mętności (a) należy prawidłowo włożyć do odpowiedniej obudowy miernika mętności i termometru (b) oraz dokręcić śrubami. Kabel BNC zasilania komory (c) powinien być podłączony do tyłu komory akustoforetycznej (d) dopiero po wypełnieniu wnętrza przetwornika piezoelektrycznego cieczą. Sondy oznaczono następująco: F = mętność strumienia doprowadzanego, 1 = mętność sondy 1, a 2, 3 i 4 to niewykorzystane sondy (lub mogą być użyte do seryjnego przeprowadzania procedury). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat systemu ultrafiltracji, pokazujący oznaczone porty i połączenia dla procesu oczyszczania białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Połączenie między obudową turbidymetru a komorą akustoforetyczną. Rurka doprowadzająca jest podłączana do wejścia portu mętności roztworu wejściowego (a) za pośrednictwem pompy zasilającej. Wyjście portu mętności zasilania (b) jest podłączony do portów wlotowych komory akustoforetycznej (c) za pośrednictwem rurki Y. Rurka etapu 1 jest podłączona od portu odpadowego komory akustoforetycznej (d) za pośrednictwem pompy stage1 do naczynia zbiorczego komórek. Port permeatu komory akustoforetycznej (e) jest podłączony do wejścia portu zanieczyszczenia sondy 1 (fRurka do zbierania jest podłączona od zewnętrznej końcówki sondy1 (port mętnicy, g) do naczynia do zbierania produktu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres interfejsu separacji akustycznej, odczyty mętności, rejestrowanie danych, panel sterowania eksperymentem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
Rysunek 5: Panel odczytów w oprogramowaniu Separatora Akustycznego. Program zawiera dwa panele: „Odczyty” i „Sterowanie”. W panelu „Odczyty” monitorowane są: mętność (a), temperatura (b) oraz procentowa redukcja (c). Aby rozpocząć rejestrowanie danych, należy kliknąć przycisk „Rozpocznij test” (d), który zmieni wówczas swój kolor na zielony. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Diagram interfejsu separatora akustycznego; sterowanie pompami i ustawienia mocy dla procesu separacji cieczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
Rysunek 6: Panel sterowania w programie. W panelu „Sterowanie” można włączać lub wyłączać pompy oraz zmieniać szybkość przepływu dla dopływu (a) i innych etapów (b). Dodatkowo można włączać lub wyłączać moc komory na przetworniku piezoelektrycznym (c) oraz regulować ją za pomocą suwaka (d). W eksperymentach zastosowano moc 10 W, ponieważ jest to zalecane ustawienie mocy dla komórek CHO, zgodnie z zaleceniami producenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ bioreaktora do procesu fermentacji, pokazujący naczynie hodowlane z pomarańczowym podłożem i zamkniętą pokrywą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Komora AWS. Gdy komórki znajdowały się już wewnątrz komory, siły akustyczne uwięziały je w węzłach fal, powodując ich agregację (a). Klastry komórkowe zwiększały swoją wielkość, aż straciły nośność i ostatecznie opadły pod wpływem siły grawitacji (b). Następnie osiadłe komórki były usuwane z komory akustoforetycznej przez pompę etapu 1 do butelki zbiorczej (c). Produkt opuszczał komorę przez port permeatu (d), podczas gdy HCCF w sposób ciągły wpływał do komory przez porty wlotowe (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy mętności; dopływ a etap 1; czas a NTU; ocena procesu uzdatniania wody." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 8"> 
Rysunek 8: Pomiar mętności hodowli komórek CHO o stężeniu 12 x 106 komórek/mL przy szybkości dopływu składnika odżywczego wynoszącej 3,5 mL/min. Mętność dopływu (na niebiesko) wynosiła około 1000 NTU, a mętność przewidziana na wyjściu z miernika mętności etapu 1 (na pomarańczowo) – 40–60 NTU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres temperatury w funkcji czasu dla temperatury dopływu i etapu 1 w układzie eksperymentalnym przez 90 minut." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 9"> 
Rysunek 9: Pomiar temperatury dla hodowli komórek CHO o stężeniu 12 x 106 komórek/mL przy szybkości dozowania pożywki wynoszącej 3,5 mL/min. Temperatura pożywki (niebieska linia) wynosiła około 21 °C, a temperatura permeatu opuszczającego miernik mętności etapu 1 (pomarańczowa linia) wynosiła około 27 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy mętności: mętność surowia vs. mętność z etapu 1, NTU w czasie, wykres wyników eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 10"> 
Rysunek 10: Przykład pomiaru mętności dla próbki o wysokiej gęstości komórek. Gdy gęstość komórek wynosiła &gt;20 x 106 komórek/mL, pomiar mętności strumienia wyjściowego był nasycany na maksymalnej wartości 4400 NTU, co skutkowało zaniżeniem oceny efektywności usuwania komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy efektywności usuwania komórek; przepływy 1,5–35 ml/min; efektywność maleje wraz ze wzrostem przepływu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 11"> 
Rysunek 11: Porównanie efektywności usuwania komórek. Wraz ze wzrostem szybkości dopływu zmniejszała się separacja komórek. Zatem wraz ze wzrostem szybkości dopływu spadała efektywność klarifikacji komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr</td>
			<td>Specyfikacja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przepływ</td>
			<td>0 – 10 L/h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zakres ciśnienia</td>
			<td>0 – 2 bar (0 – 30 psi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura cieczy zasilającej</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura pracy</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Warunki pracy. Zalecane warunki pracy producenta AWS dotyczące przepływu, zakresu ciśnienia, cieczy zasilającej i temperatury pracy.

Prezentowany tutaj jest protokół do pierwotnego oczyszczania hodowli komórek CHO za pomocą separatora akustycznego. Protokół ten może być stosowany do wstępnego klarowania kultur kolb wstrząsowych lub zbiorów z bioreaktorów i ma potencjalne zastosowanie do ciągłego klarowania materiału krwawienia z komórek podczas pracy bioreaktora perfuzyjnego.

Wstępne oczyszczanie płynu z kultur komórkowych pobranych w CHO za pomocą separatora akustycznego

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Nasz protokół pokazuje, jak używać laboratoryjnego separatora fal akustycznych do pierwotnego oddzielania komórek CHO od pobranego płynu hodowlanego zawierającego modelowe przeciwciało monoklonalne. Separacja fal akustycznych zapewnia pewne korzyści w porównaniu z tradycyjnymi metodami pierwotnego klarowania, takimi jak wirowanie i filtracja, takimi jak niewielka powierzchnia, niskie ryzyko zanieczyszczenia i zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia filtra. Ponieważ separacja fal akustycznych zapewnia ciągły przepływ materiału bezkomórkowego do późniejszych procesów filtracji i chromatografii, istnieje potencjał jej zastosowania w ciągłym bioprzetwarzaniu.Aby przygotować separator fal akustycznych, podłącz zmętnienia do odpowiednich portów i podłącz BNC zasilające komorę z tyłu systemu separatora fal akustycznych. Włóż sondy zmętnienia do miernika zmętnienia i obudowy termometru i dokręć. Podłączyć rurkę zasilającą do wejścia portu zmętnienia zasilania za pośrednictwem pompy zasilającej.I podłącz rurkę y od wyjścia portu zmętnienia zasilania do portu wlotowego komory akustycznej. Podłączyć rurkę etapu 1 z króćca odpływowego komory akustoforetycznej do naczynia do pobierania komórek za pomocą pompy stopnia 1 i podłączyć rurkę z portu permeatu komory akustoforetycznej do wejścia portu zmętnienia sondy 1. Następnie podłącz rurkę do zbierania z portu zmętnienia sondy 1 do naczynia do zbierania produktu.Aby napełnić system płynem z zebranych kultur komórkowych, włącz separator fal akustycznych i otwórz powiązane oprogramowanie. W panelu Odczyty kliknij przycisk Rozpocznij test, aby rozpocząć rejestrowanie danych. I podłącz końcówkę rurki zasilającej do mieszanego naczynia na płyn do hodowli komórkowych.Aby uruchomić pompę zasilającą, wprowadź szybkość pompy i naciśnij Enter. Upewnij się, że strzałka kierunku pompy jest prawidłowo zorientowana, aby upewnić się, że płyn komórkowy jest pompowany z naczynia do komory akustycznej, a następnie kliknij ikonę trójkąta, aby rozpocząć. Monitoruj pomiary zmętnienia paszy w panelu redukcji procentowej podczas napełniania komory akustycznej.Jeśli pobrany płyn z hodowli komórkowych jest wystarczająco mieszany w zbiorniku płynu komórkowego, wartości zmętnienia będą stałe podczas załadunku komory. Gdy ciecz znajdzie się nad przetwornikiem piezoelektrycznym z tyłu komory akustycznej, kliknij przycisk Wyłącz, aby zatrzymać pompę. I podłącz drugi koniec zasilającego BNC do komory akustycznej.Po napełnieniu i włączeniu komory akustycznej zmień prędkość pompy zasilającej na żądaną prędkość roboczą. Aby włączyć moc piezoelektryczną stage 1, przesuń pasek w module zasilania do 10 watów i kliknij Turn On.Gdy komórki zaczną osiadać na dnie komory akustycznej, uruchom pompę stage 1 z odpowiednią szybkością w oparciu o gęstość komórek i szybkość pompy zasilającej, uważnie obserwując komory separatora fal akustycznych i dostosowując szybkość pompy w razie potrzeby. Aby obliczyć masę upakowanych komórek, wytaruj wagę pustą 15-mililitrową probówką i napełnij probówkę materiałem wsadowym.Po zarejestrowaniu całkowitej masy probówki z paszą, odwirować probówkę i zdekantować supernatant do nowego pojemnika. Zmierz wagę rurki z osadem komórkowym. Następnie monitoruj profil zmętnienia stopnia 1, gdy przelew z komory akustoforetycznej wchodzi do sondy zmętnienia 1.Po zakończeniu biegu zatrzymaj pompy zasilające i stage 1 i wyłącz zasilanie komory. Odłącz zasilający BNC i zbierz materiał z zebranego produktu do dalszej analizy. Aby spuścić pozostały płyn z komory akustyczno-forowej, umieść rurkę odpływową w pustym naczyniu.Odłączyć rurkę od wlotu komory akustycznej i portów permeatu, a następnie odłączyć rurkę odpływową od głowicy pompy. Gdy komora jest pusta, ponownie podłącz rurkę, umieść rurkę odpływową z powrotem w głowicy pompy i użyj zasilania i pompy stage 1 z wydajnością 60 mililitrów na minutę, aby przepłukać wodę dejonizowaną z końca przewodu zasilającego przez 15 do 20 minut. Pod koniec płukania wodą przepompuj 70% alkoholu izopropylowego przez rurkę i komorę przez 15 do 20 minut, a następnie dodatkowe 15 do 20 minut płukanie wodą dejonizowaną.W tej reprezentatywnej analizie, gdy pobrany płyn komórkowy wchodził do komory separatora fal akustycznych, pomiary zmętnienia z sondy mętności zasilania pozostały spójne, około 1000 do 1100 NTU. Pomiary z sondy 1 zmętnienia utrzymywały się na poziomie od 40 do 50 NTU. Przetrzymywanie pobranego płynu komórkowego w komorze przez dłuższy czas powoduje wzrost temperatury, jak w tym przykładzie różnicy temperatur pobranego płynu komórkowego większej niż sześć stopni Celsjusza przed wejściem do komory akustoforetycznej i po separacji akustycznej.Inną ważną kwestią podczas pozyskiwania dużych gęstości komórek jest nasycenie sond mętności, ponieważ pomiary zmętnienia sondy mętności paszy stają się nasycone powyżej 4600 NTU, co prawdopodobnie skutkuje niedoszacowaniem w obliczeniach skuteczności usuwania komórek. Ponadto skuteczność usuwania komórek znacznie spada z około 100% do 57% wraz ze wzrostem wydajności pompy zasilającej, przy czym wolniejsza szybkość pompy zasilającej zwykle bezpośrednio koreluje z lepszym klarowaniem komórek. W miarę jak producenci produktów biotechnologicznych przestawiają się na produkcję ciągłą, zastosowanie technologii fal akustycznych może mieć dodatkowe zastosowania w ciągłym bioprzetwarzaniu i operacjach bioreaktorów profuzyjnych.

primary-clarification-cho-harvested-cell-culture-fluid-using-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W celu oczyszczenia zygot S. cerevisiae, zmodyfikowano komórki haploidalne o przeciwnych typach matingowych tak, aby wykazywały ekspresję czerwonych lub zielonych białek fluorescencyjnych, a następnie poddano je wspólnej inkubacji w celu umożliwienia tworzenia zygot i frakcjonowania zgodnie z protokołem opartym na cytometrii przepływowej. Wysoce wzbogacona frakcja umożliwia późniejsze badania „omiczne”, odzyskanie początkowego potomstwa oraz systematyczne badanie morfogenezy zygot.

Oczyszczanie zygot S. cerevisiae metodą cytometrii przepływowej

Ten film opisuje metodę przestrzennego rozdzielania trzech subpopulacji komórek białaczkowych: zawieszonych komórek białaczkowych swobodnie unoszących się w pożywce, jasnych komórek białaczkowych przylegających do powierzchni monowarstwy komórek mezenchymalnych zrębu oraz komórek białaczkowych ciemnych fazowo, które wyemigrowały pod monowarstwę mezenchymalnych komórek zrębu z kohodowli 2D.

Żniwa subpopulacji białaczkowej: metoda przestrzennego oddzielania subpopulacji komórek białaczkowych od kokultury 2D

Źródło: Choi, H. J., et al. Akustoforeza mikroprzepływowa do przepływowego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych za pomocą kulek powinowactwa aptamerowego. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia metodę selektywnego oddzielania bakterii Gram-ujemnych od mieszanej próbki bakteryjnej za pomocą mikrogranulek pokrytych aptamerem i sił akustycznych w chipie mikroprzepływowym.

Akustoforeza wspomagana aptamerem do mikroprzepływowej separacji bakterii Gram-ujemnych

Ten film demonstruje metodę oczyszczania opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nadających się do badań charakteryzacyjnych.

Oczyszczanie subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika oczyszczania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirowania w gradimencie gęstości

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Ten protokół opisuje wykorzystanie strategii wymiany opartej na inercyjnej mikroprzepływowości do oczyszczania komórek inżynierii mikro/nanocząsteczkowej z efektywnym usuwaniem niezwiązanych cząstek.

Mikroprzepływowa wymiana buforowa w celu inżynierii komórek mikro/nanocząsteczkowych bez zakłóceń

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Ten protokół opisuje użycie elutriacji odśrodkowej do rozdzielania komórek pierwotnej ostrej białaczki limfoblastycznej na różne fazy cyklu komórkowego.

Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Ten artykuł opisuje wytwarzanie i działanie mikroprzepływowych chipów akustoforetycznych przy użyciu techniki akustoforezy mikroprzepływowej i mikrogranulek modyfikowanych aptamerem, które mogą być używane do szybkiej, efektywnej izolacji bakterii Gram-ujemnych z pożywki.

Akustoforeza mikroprzepływowa do przepływowego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych za pomocą kulek powinowactwa aptamerowego

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Naucz się wstępnego oczyszczania płynu z kultur komórek CHO za pomocą separatora akustycznego. Ta metoda oferuje ciągły przepływ materiału pozbawionego komórek dla procesów biotechnologicznych.

Wstępne oczyszczanie płynu z kultur komórkowych pobranych w CHO za pomocą separatora akustycznego

Przeglądaj więcej filmów