Wstępne oczyszczanie płynu z kultur komórkowych pobranych w CHO za pomocą separatora akustycznego
14 maja 2020
Prezentowany tutaj jest protokół do pierwotnego oczyszczania hodowli komórek CHO za pomocą separatora akustycznego. Protokół ten może być stosowany do wstępnego klarowania kultur kolb wstrząsowych lub zbiorów z bioreaktorów i ma potencjalne zastosowanie do ciągłego klarowania materiału krwawienia z komórek podczas pracy bioreaktora perfuzyjnego.
Nasz protokół pokazuje, jak używać laboratoryjnego separatora fal akustycznych do pierwotnego oddzielania komórek CHO od pobranego płynu hodowlanego zawierającego modelowe przeciwciało monoklonalne. Separacja fal akustycznych zapewnia pewne korzyści w porównaniu z tradycyjnymi metodami pierwotnego klarowania, takimi jak wirowanie i filtracja, takimi jak niewielka powierzchnia, niskie ryzyko zanieczyszczenia i zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia filtra. Ponieważ separacja fal akustycznych zapewnia ciągły przepływ materiału bezkomórkowego do późniejszych procesów filtracji i chromatografii, istnieje potencjał jej zastosowania w ciągłym bioprzetwarzaniu.
Aby przygotować separator fal akustycznych, podłącz zmętnienia do odpowiednich portów i podłącz BNC zasilające komorę z tyłu systemu separatora fal akustycznych. Włóż sondy zmętnienia do miernika zmętnienia i obudowy termometru i dokręć. Podłączyć rurkę zasilającą do wejścia portu zmętnienia zasilania za pośrednictwem pompy zasilającej.
I podłącz rurkę y od wyjścia portu zmętnienia zasilania do portu wlotowego komory akustycznej. Podłączyć rurkę etapu 1 z króćca odpływowego komory akustoforetycznej do naczynia do pobierania komórek za pomocą pompy stopnia 1 i podłączyć rurkę z portu permeatu komory akustoforetycznej do wejścia portu zmętnienia sondy 1. Następnie podłącz rurkę do zbierania z portu zmętnienia sondy 1 do naczynia do zbierania produktu.
Aby napełnić system płynem z zebranych kultur komórkowych, włącz separator fal akustycznych i otwórz powiązane oprogramowanie. W panelu Odczyty kliknij przycisk Rozpocznij test, aby rozpocząć rejestrowanie danych. I podłącz końcówkę rurki zasilającej do mieszanego naczynia na płyn do hodowli komórkowych.
Aby uruchomić pompę zasilającą, wprowadź szybkość pompy i naciśnij Enter. Upewnij się, że strzałka kierunku pompy jest prawidłowo zorientowana, aby upewnić się, że płyn komórkowy jest pompowany z naczynia do komory akustycznej, a następnie kliknij ikonę trójkąta, aby rozpocząć. Monitoruj pomiary zmętnienia paszy w panelu redukcji procentowej podczas napełniania komory akustycznej.
Jeśli pobrany płyn z hodowli komórkowych jest wystarczająco mieszany w zbiorniku płynu komórkowego, wartości zmętnienia będą stałe podczas załadunku komory. Gdy ciecz znajdzie się nad przetwornikiem piezoelektrycznym z tyłu komory akustycznej, kliknij przycisk Wyłącz, aby zatrzymać pompę. I podłącz drugi koniec zasilającego BNC do komory akustycznej.
Po napełnieniu i włączeniu komory akustycznej zmień prędkość pompy zasilającej na żądaną prędkość roboczą. Aby włączyć moc piezoelektryczną stage 1, przesuń pasek w module zasilania do 10 watów i kliknij Turn On.Gdy komórki zaczną osiadać na dnie komory akustycznej, uruchom pompę stage 1 z odpowiednią szybkością w oparciu o gęstość komórek i szybkość pompy zasilającej, uważnie obserwując komory separatora fal akustycznych i dostosowując szybkość pompy w razie potrzeby. Aby obliczyć masę upakowanych komórek, wytaruj wagę pustą 15-mililitrową probówką i napełnij probówkę materiałem wsadowym.
Po zarejestrowaniu całkowitej masy probówki z paszą, odwirować probówkę i zdekantować supernatant do nowego pojemnika. Zmierz wagę rurki z osadem komórkowym. Następnie monitoruj profil zmętnienia stopnia 1, gdy przelew z komory akustoforetycznej wchodzi do sondy zmętnienia 1.
Po zakończeniu biegu zatrzymaj pompy zasilające i stage 1 i wyłącz zasilanie komory. Odłącz zasilający BNC i zbierz materiał z zebranego produktu do dalszej analizy. Aby spuścić pozostały płyn z komory akustyczno-forowej, umieść rurkę odpływową w pustym naczyniu.
Odłączyć rurkę od wlotu komory akustycznej i portów permeatu, a następnie odłączyć rurkę odpływową od głowicy pompy. Gdy komora jest pusta, ponownie podłącz rurkę, umieść rurkę odpływową z powrotem w głowicy pompy i użyj zasilania i pompy stage 1 z wydajnością 60 mililitrów na minutę, aby przepłukać wodę dejonizowaną z końca przewodu zasilającego przez 15 do 20 minut. Pod koniec płukania wodą przepompuj 70% alkoholu izopropylowego przez rurkę i komorę przez 15 do 20 minut, a następnie dodatkowe 15 do 20 minut płukanie wodą dejonizowaną.
W tej reprezentatywnej analizie, gdy pobrany płyn komórkowy wchodził do komory separatora fal akustycznych, pomiary zmętnienia z sondy mętności zasilania pozostały spójne, około 1000 do 1100 NTU. Pomiary z sondy 1 zmętnienia utrzymywały się na poziomie od 40 do 50 NTU. Przetrzymywanie pobranego płynu komórkowego w komorze przez dłuższy czas powoduje wzrost temperatury, jak w tym przykładzie różnicy temperatur pobranego płynu komórkowego większej niż sześć stopni Celsjusza przed wejściem do komory akustoforetycznej i po separacji akustycznej.
Inną ważną kwestią podczas pozyskiwania dużych gęstości komórek jest nasycenie sond mętności, ponieważ pomiary zmętnienia sondy mętności paszy stają się nasycone powyżej 4600 NTU, co prawdopodobnie skutkuje niedoszacowaniem w obliczeniach skuteczności usuwania komórek. Ponadto skuteczność usuwania komórek znacznie spada z około 100% do 57% wraz ze wzrostem wydajności pompy zasilającej, przy czym wolniejsza szybkość pompy zasilającej zwykle bezpośrednio koreluje z lepszym klarowaniem komórek. W miarę jak producenci produktów biotechnologicznych przestawiają się na produkcję ciągłą, zastosowanie technologii fal akustycznych może mieć dodatkowe zastosowania w ciągłym bioprzetwarzaniu i operacjach bioreaktorów profuzyjnych.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie separatora fal akustycznych do wstępnego klarowania kultur komórek CHO. Przedstawiono w nim zalety tej metody w porównaniu z technikami tradycyjnymi, w tym jej potencjał w zakresie ciągłego bioprocesowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hodowla komórkowa
- Bioprzetwarzanie
- Technologie separacji
Wstęp
- Komórki CHO są szeroko stosowane w produkcji biofarmaceutycznej.
- Tradycyjne metody klarowania mogą być nieefektywne i wiązać się z ryzykiem kontaminacji.
- Separacja falami akustycznymi stanowi kompaktową i skuteczną alternatywę.
- Metoda ta umożliwia przepływ ciągły, co usprawnia procesy downstream.
Cel badania
- Zaprezentowanie konfiguracji i działania separatora fal akustycznych.
- Ocena wydajności oddzielania komórek od płynu hodowlanego.
- Zbadanie potencjału do ciągłego klarowania w bioprocesach.
Zastosowane metody
- Konfiguracja separatora fal akustycznych z podłączeniami do pomiaru mętności i zasilania.
- Monitorowanie poziomu mętności podczas procesu separacji.
- Regulacja wydajności pompy na podstawie pomiarów gęstości komórek i mętności.
- Przepłukanie i czyszczenie systemu po zakończeniu pracy.
Główne wyniki
- Spójne pomiary mętności wskazują na skuteczne oddzielenie.
- Podczas przedłużonego przetwarzania zaobserwowano wzrost temperatury.
- Wydajność usuwania komórek zmienia się w zależności od szybkości pompy zasilającej.
- Podkreślono potencjał zastosowania w ciągłym bioprocesowaniu.
Wnioski
- Separacja falami akustycznymi stanowiy wiarygodną alternatywę dla metod tradycyjnych.
- Zapewnia ona korzyści w zakresie wydajności oraz ryzyka kontaminacji.
- Wskazane jest dalsze badanie możliwości jej zastosowania w produkcji ciągłej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pierwotne klarowanie jest krytycznym wąskim gardłem w bioprodukcji, w którym tradycyjne metody, takie jak wirowanie i filtracja, niosą ze sobą ryzyko kontaminacji, wymagają dużej powierzchni roboczej i utrudniają prowadzenie procesów w sposób ciągły. Separacja falą akustyczną stanowi kompaktową alternatywę o niskim stopniu zanieczyszczenia, która umożliwia ciągły przepływ klarowanego płynu, wspierając integrację z ciągłymi procesami biotechnologicznymi. Podejście to zwiększa pewność przewidywań w pierwszych etapach oczyszczania, zapewniając powtarzalne usuwanie komórek przy jednoczesnym zmniejszeniu złożoności operacyjnej oraz ryzyka zapychania filtrów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia szybkie klarowanie zbiorów komórek CHO w celu dalszej analizy białek terapeutycznych, takich jak monoklonalne IgG1.
- Wartość operacyjna: Skraca czas pracy manualnej i zmniejsza ryzyko kontaminacji w porównaniu z wirowaniem, co pozwala na szybszą obróbkę próbek.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie jednorodnego nadfiltru wolnego od komórek o niskiej mętności (40–50 NTU), odpowiedniego do niezawodnego wykrywania anality w procesie opracowywania testów.
- Wartość operacyjna: Minimalizuje zanieczyszczanie i zapychanie filtrów, co poprawia powtarzalność testów i ogranicza marnotrawstwo odczynników.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia skalowalne klarowanie płynów hodowlanych do generowania materiałów przedklinicznych bez naruszania integralności produktu.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przejście z przetwarzania okresowego na ciągłe, zgodnie z celami technologii platformowej w rozwoju produktów biologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Separacja falami akustycznymi wpisuje się w początkowy etap procesu oczyszczania, po zbiorze a przed filtracją głębinową lub chromatografią, co umożliwia płynną integrację z liniami produkcji ciągłej.
- Biologia odkrywcza: Oczyszcza złożone płyny hodowlane, umożliwiając dokładną kwantyfikację i charakterystykę produktów wydzielniczych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalny wynik o niskiej mętności, co jest kluczowe dla spójnego działania analiz w ramach kampanii przesiewowych.
- Analityka: Dostarcza mierzalne wskaźniki redukcji mętności, które korelują z wydajnością usuwania komórek i powtarzalnością procesu.
- Badania translacyjne: Utrzymuje wydajność i integralność produktu, wspierając ciągłość dostaw materiałów do przedklinicznych badań toksykologicznych i skuteczności.
- Zastosowania przemysłowe: Stanowi modułową, skalowalną operację jednostkową, możliwą do adaptacji dla wielu linii komórkowych i rodzajów produktów w zakładach wieloproduktowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Poprawia pewność prognostyczną w zakresie wydajności klarowania dzięki monitorowaniu mętności w czasie rzeczywistym i spójnemu odzyskiwaniu produktu.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza powierzchnię zajmowaną przez urządzenia, eliminuje zagrożenia związane z wirowaniem i minimalizuje zapychanie filtrów, co obniża koszty operacyjne.
- Wartość strategiczna: Umożliwia zastosowanie procesów ciągłych, co redukuje zmienność między partiami i przyspiesza transfer technologii.
- Wpływ na portfolio: Wspiera podejmowanie decyzji w oparciu o analizę ryzyka, zapewniając niezawodne i skalowalne klarowanie, które ogranicza ryzyko w początkowych etapach oczyszczania.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie dynamiki płynów oraz konfiguracji i kalibracji systemów akustoforetycznych.
- Wymaga integracji z monitorowaniem mętności, pompami perystaltycznymi i systemami kontroli temperatury.
- Wymaga standaryzacji przepływów i ustawień mocy pomiędzy zmianami i operatorami w celu zapewnienia powtarzalności wyników.
- Należy uwzględnić nasycenie sondy mętności przy wysokich gęstościach komórek (>4600 NTU), co może prowadzić do niedoszacowania wydajności usuwania.
- Wydajność jest zależna od szybkości przepływu; zbyt wysokie szybkości zasilania obniżają wydajność usuwania komórek, co wymaga optymalizacji w zależności od gęstości zbioru.
