Obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez CCL5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy

Ten protokół opisuje wykrywanie migracji komórek macierzystych okostnej szkieletu za pośrednictwem CCL5 w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii intravital żywych zwierząt.

Ustandaryzowany protokół może być stosowany do oceny endogennej migracji komórek i może być stosowany do kilku typów komórek, a także fenotypów szkieletu. Zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na śledzenie migracji komórek in vivo dla pojedynczych komórek, a nie populacji komórek w odpowiedzi na uraz i/lub leczenie cytokinami. Przed rozpoczęciem zabiegu należy potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy i nałożyć maść na oczy zwierzęcia.

Następnie wykonaj poprzeczne, mniej niż jednocentymetrowe nacięcie od bezpośrednio przyśrodkowego do prawego ucha w kierunku lewego ucha i wykonaj drugie nacięcie od początkowego nacięcia, około dwóch do trzech milimetrów za prawym okiem w kierunku nosa. Użyj kleszczy, aby oddzielić skórę od okostnej i użyj nożyczek, aby delikatnie przeciąć tkankę łączną, aby oddzielić skórę od okostnej kalwarii. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nałóż maść okulistyczną na górną część płata skóry i delikatnie zawiń płatek nad lewym okiem.

Przecięcie szwów strzałkowych i koronalnych powinno być wyraźnie odsłonięte. Przepłucz otwartą powierzchnię sterylnym PBS, aby oczyścić obszar z krwi i resztek włosów, a następnie umieść końcówkę skosu o szerokości jednej do dwóch igieł w kierunku nosa od szwu koronalnego i jednej do dwóch szerokości igły po prawej stronie szwu strzałkowego. Używając bardzo małego nacisku w dół, ostrożnie obrócić strzykawkę jeden raz w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara i kilka razy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.

Następnie użyj igły o rozmiarze 27, aby poszerzyć mikropęknięcie do około 40 mikrometrów. Jeśli pozostaną fragmenty kości, przepłucz mikrozłamanie PBS. Jeśli fragmenty kości nadal pozostają, użyj igły o rozmiarze 29, aby delikatnie zgarnąć fragmenty.

Do leczenia CCL5 użyj podstawowego roztworu CCL5 o stężeniu 100 nanogramów na mililitr i matrycy błony podstawnej, aby uzyskać działający roztwór chemoatraktantu o stężeniu 10 nanogramów na mililitr. Aby wyleczyć ranę, należy załadować pipetę o pojemności 220 mikrolitrów pięcioma mikrolitrami roztworu i nałożyć dwa mikrolitry chemokiny na szew. Następnie pozwól matrycy zestalić się i delikatnie przykryj kalwarię płatem skóry, aby upewnić się, że tkanka nie zostanie odwodniona podczas godzinnej kuracji chemokiną.

W celu przyżyciowego obrazowania migracji komórek macierzystych okostnej w czasie rzeczywistym, przed przeniesieniem myszy do mikroskopu, należy delikatnie docisnąć tył głowy myszy, aby sprawdzić wizualną płaszczyznę kalwarii. Jeśli płaszczyzna nie jest wypoziomowana, delikatnie obróć ogranicznik myszy w lewo lub w prawo, aby wyregulować pozycję. Następnie przykryj całą kalwarię w płatze skóry sterylną 2% metylocelulozą w wodzie i umieść mysz na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu z osią XYZ.

Używając światła epifluorescencyjnego, ustaw mysz tak, aby była skierowana w stronę mikroskopu, a przecięcie szwów koronalnych i strzałkowych było wyśrodkowanym punktem odniesienia stolika. Następnie umieść szklaną osłonę w obszarze obrazowania i dokładnie sprawdź wyrównanie. Aby uzyskać obrazowanie poklatkowe migracji do i z szwu, wybierz soczewkę zanurzeniową w wodzie o małym powiększeniu, aby zeskanować kalwarię.

Uzyskaj obraz referencyjny przecięcia szwu strzałkowego i koronalnego i wykorzystując SHG i sygnały fluorescencyjne z komórek, zlokalizuj każde miejsce urazu i zapisz współrzędne XYZ, a także odległości od szwów strzałkowych i koronalnych. Wybierz miejsce na szwach koronalnych lub strzałkowych do długotrwałego obrazowania i uzyskaj szczegółowy obraz ZStack tego obszaru z odniesienia podczas obrazowania. Użyj ustawień oprogramowania poklatkowego, aby rejestrować obraz co minutę przez co najmniej godzinę, porównując bieżące pole view z początkowym polem widzenia w czasie między migawkami.

Jeśli pola widzenia są różne, użyj obrazu ZStack, aby określić, w którym kierunku należy dostosować pole widzenia. Ostatnio wygenerowano myszy reporterowe Mx1 alfa-SMA GFP, w których komórki macierzyste szkieletu okostnego są oznaczone podwójnym znakowaniem Mx1 dodatnim alfa-SMA. W ciągu jednej godziny obrazowania, 24 godziny po założeniu szwów, obserwuje się niewielką lub żadną migrację okostnych komórek macierzystych okostnej alfa-SMA z dodatnim wynikiem Mx1.

Leczenie chemokiną CCL5 ubytku kalwarii 24 godziny po urazie indukuje kierunkowo wyraźną migrację od szwu koronalnego w kierunku miejsca urazu. W tej reprezentatywnej analizie, w ciągu godziny od obrazowania, jedna z komórek macierzystych okostnej okostnej omega dodatnich alfa-SMA Mx1 migrowała około 50 mikrometrów w kierunku urazu. Najważniejszym aspektem tego protokołu, o którym należy pamiętać, jest ograniczenie leczenia CCL5 do miejsca urazu w celu stymulacji migracji specyficznej dla komórek.

Po zakończeniu tej procedury leczenie miejscowe można kontynuować przez tydzień. Mikrotomografia komputerowa może być wykorzystana do oceny gojenia się urazów kalwarii i osadzania minerałów.