Name: Obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez CCL5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Poznaj metodę obrazowania w czasie rzeczywistym migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy z użyciem CCL5. Technika ta umożliwia śledzenie pojedynczych komórek w odpowiedzi na uraz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Bone Disease Program of Texas Award, Caroline Wiess Law Fund Award oraz NIAMS of the National Institutes of Health pod numerami nagród R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 do D.P. Dziękujemy M.E. Dickinsonowi i T.J. Vadakkanowi z BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core oraz BCM Advanced Technology Cores z dofinansowaniem z NIH (AI036211, CA125123, and DK056338).
.

Wszystkie myszy były utrzymywane w warunkach wolnych od patogenów, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Baylor College of Medicine.
1. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Skrzyżowanie myszy Mx1-Cre17 i Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 myszy (zakupione w Jackson Laboratory) z myszami αSMA-GFP (dostarczonymi tutaj przez dr Ivo Kalajzica i Henry'ego Kronenberga), aby wygenerować myszy reporterowe Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+αSMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). </li>
	<li>W przypadku indukcji Mx1-Cre należy wstrzykiwać myszom 25 mg/kg pIpC co drugi dzień przez 10 dni. </li>
	<li>Napromienij myszy 9,5 Gy na 1 dzień przed dożylnym przeszczepem 1 x 106 komórek jednojądrzastych szpiku kostnego całego szpiku kostnego od myszy C57BL / 6 typu dzikiego (WT-BMT)19. </li>
	<li>Po 6 do 8 tygodniach rekonwalescencji poddaj myszy obrazowaniu in vivo protokołu migracji komórek okostnej opisanego poniżej. 
	UWAGA: Napromienianie i WT-BMT myszy Mx1-Cre są niezbędne do wyeliminowania endogennych komórek krwiotwórczych znakowanych Mx1, które mogą reagować na uraz. Sześć do ośmiu tygodni po napromieniowaniu liczba komórek krwiotwórczych gospodarza wynosi <5%, a zatem jest gotowa do obrazowania19.</li>
</ol>
2. Mocowanie myszy i montaż obrazowania
<ol>
	<li>Stwórz urządzenie przytrzymujące dla myszy za pomocą stożkowej rurki o pojemności 50 ml (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Za pomocą spiczastych nożyczek przebij dziurę w dolnej części stożka. Wytnij od dolnego otworu do górnej części stożka (strona cięcia będzie górną częścią ogranicznika). </li>
		<li>Wykonaj cięcie o długości około 4–5 cm równolegle do poprzedniego cięcia i w połowie wysokości (~2 cm) od górnej części utwierdzenia. Usuń tę część stożka i wygładź krawędzie, które były konieczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbuduj stożkowy uchwyt do obrazowania rury, używając regulowanej płytki kątowej, słupka optycznego 0,5" i zacisku kątowego dla słupka 0,5", sześciokątnego 0,1875" (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B i tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Ustaw płytkę kątową pod kątem 35°. Po lewej stronie płytki kątowej wkręć słupek optyczny w drugi otwór z tyłu płytki.</li>
		<li>Po prawej stronie regulowanej płyty włóż sprężynową skrzydełkową 0.1875" z blokadą sześciokątną 0.25" do drugiego otworu od przodu i ostatnich otworów w płycie. Zacisk pod kątem prostym będzie używany ze słupkiem optycznym, aby zabezpieczyć stożkowe ograniczniki myszy na miejscu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przedoperacyjny zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy
	<ol>
		<li>W celu złagodzenia bólu należy wstrzyknąć myszu podskórnie buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu (1 mg/kg masy ciała) 30–60 minut przed zabiegiem.</li>
		<li>Znieczulenie myszy za pomocą znieczulenia kombinacją CCM gryzonia III (combo III) zawierającą 37,5 mg/ml ketaminy, 1,9 mg/ml ksylazyny i 0,37 mg/ml acepromazyny. Odpowiednia dawka dla myszy to 0,75–1,50 ml na 1 kg masy ciała. Dawka trwa 30–45 minut.</li>
		<li>Po znieczuleniu myszy nałóż maść okulistyczną na oczy za pomocą sterylnego wacika, aby zapobiec odwodnieniu oczu.</li>
		<li>W przypadku obrazowania długotrwałego (>45 min) należy ponownie podać znieczulenie, aby utrzymać odpowiednią głębokość znieczulenia w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z wystarczającą ilością combo III, aby utrzymać znieczulenie przez planowany czas obrazowania (0,75 ml/kg masy ciała na 30 minut dodatkowej sedacji). Podłącz zestaw do infuzji igłami motylkowymi o pojemności 25 g z rurką 12" do strzykawki i przepchnij środek znieczulający przez rurkę i igłę.</li>
			<li>Wprowadzić igłę motylkową dootrzewnowo, a następnie przykleić igłę taśmą na miejscu. 
			UWAGA: W ten sposób dodatkowa kombinacja III będzie podawana podczas obrazowania, tak aby nie było potrzeby poruszania zwierzęciem ani zakłócania płaszczyzny widzenia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapewnij wsparcie termiczne za pomocą poduszki grzewczej utrzymywanej w temperaturze 37°C przez cały czas trwania zabiegu. W przypadku przedłużonego obrazowania (>1 godzina) konieczne będzie dodatkowe wspomaganie płynami. Dodatkowe płyny można podać I.P. z dodatkowym Combo III podczas obrazowania lub 33 ml/kg soli fizjologicznej (0,9 NaCl) podskórnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchomienie myszy i przygotowanie pola operacyjnego
	<ol>
		<li>Użyj maszynki do strzyżenia, aby usunąć jak najwięcej włosów z czubka głowy. Nałóż krem do depilacji na ogolony obszar, aby usunąć wszelkie pozostałe włosy w miejscu operacji. </li>
		<li>Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona przez brak reakcji na szczypanie palców. Po 15 minutach, jeśli mysz nie jest w pełni znieczulona, podaj drugą mniejszą dawkę combo III (<0,75 ml/kg m.c.).</li>
		<li>Umieść mysz w unieruchomieniu ogonem do przodu, przesuwając ją wystarczająco daleko do tyłu, tak aby nos lekko zwisał z krawędzi stożka. </li>
		<li>Przyklej przednie łapy do dolnej części stożkowej rurki za pomocą taśmy medycznej.</li>
		<li>Umieść rurkę stożkową z myszą na uchwycie obrazowym ustawionym pod kątem 35° i zabezpiecz za pomocą kąta prostego clamp (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
		<li>Gdy mysz zostanie zabezpieczona w uchwycie do obrazowania, oczyść miejsce operacyjne 3 razy naprzemiennie peelingiem betadynowym i 70% alkoholem izopropylowym. Ponownie sprawdź, czy zwierzę jest w pełni uspokojone.</li>
		<li>Przenieś mysz do czystej podkładki chłonnej i umieść zasłonę na myszy, aby stworzyć duże sterylne pole. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Nacięcie otwierające
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy z cienką końcówką podnieś skórę bezpośrednio przyśrodkowo do prawego ucha. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji przeciąć skórę trzymaną przez kleszcze. 
		UWAGA: Zainicjowanie nacięcia metodą opisaną powyżej tworzy zaokrąglone nacięcie, które jest bardziej odpowiednie do szycia po zabiegu.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie poprzeczne, zaczynając od początkowego nacięcia w kierunku lewego ucha (<1 cm). Wykonaj kolejne nacięcie, zaczynając od początkowego nacięcia, w kierunku nosa zwierzęcia (~2–3 mm za prawym okiem).</li>
		<li>Oddziel skórę od okostnej za pomocą kleszczy i nożyczek, aby delikatnie przeciąć tkankę łączną oddzielającą skórę od okostnej kalwarii. </li>
		<li>Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nałóż trochę maści okulistycznej na górną część płata skóry. Delikatnie podnieś płatek skóry i zawiń go nad lewym okiem. Przecięcie szwów strzałkowych i koronalnych powinno być wyraźnie odsłonięte (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). 
		UWAGA: Maść okulistyczna służy do utrzymywania płata skórnego na miejscu.</li>
		<li>Spłucz otwartą powierzchnię sterylnym PBS, aby oczyścić obszar z krwi i resztek włosów. 
		UWAGA: W razie potrzeby użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby usunąć włosy, które pozostały po spłukaniu, ale uważaj, aby nie uszkodzić okostnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikrozłamania
	<ol>
		<li>Aby wytworzyć mikropęknięcia na kalwarii, należy zdjąć tłok strzykawki insulinowej 29 G i odciąć tylny koniec strzykawki, wokół znaczników 300–400 μl. 
		UWAGA: Ten krok ułatwia manewrowanie pod lunetą sekcyjną podczas powstawania urazu.</li>
		<li>Umieść końcówkę skosu (od jednej do dwóch szerokości igły) w kierunku nosa od szwu koronalnego i od jednej do dwóch szerokości igły po prawej stronie szwu strzałkowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
		<li>Delikatnie obrócić strzykawkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie kilka razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. 
		UWAGA: U młodych myszy do wytworzenia okrągłego mikropęknięcia potrzebne jest bardzo małe ciśnienie w dół. Należy uważać, aby igła nie przebiła się do mózgu, ponieważ spowoduje to krwawienie i zakłóci obrazowanie.</li>
		<li>Za pomocą igły 27 G poszerzyć mikropęknięcie do ~0,4 mm. Jeśli w mikrozłamaniu pozostaną fragmenty kości, przepłucz ten obszar PBS. Jeśli fragmenty kości nadal pozostają w mikrozłamaniu, użyj igły 29 G, aby delikatnie je zgarnąć. </li>
		<li>Powtórz kroki 4.2.1–4.2.4, aby utworzyć uraz po lewej stronie szwu strzałkowego. 
		UWAGA: W tym momencie istnieją dwie opcje: 1) natychmiast przystąpić do leczenia CCL5 (sekcja 4.3) i obrazowania (sekcja 5); lub 2) zamknąć pole operacyjne po zabiegach pooperacyjnych wymienionych w punkcie 6. Po 24 godzinach należy ponownie znieczulić mysz, ponownie otworzyć wzrok chirurgiczny, opatrzyć uraz za pomocą CCL5 (sekcja 4.3) i wykonać obrazowanie przyżyciowe (sekcja 5) oraz opiekę pooperacyjną (sekcja 6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie CCL5
	<ol>
		<li>Z zapasu RANTES (100 ng/ml) przygotować roztwór 10 ng/ml za pomocą matrycy błony podstawnej (tabela materiałów). Trzymaj ten roztwór na lodzie, aby utrzymać matrycę w postaci płynnej.</li>
		<li>Leczyć każdy uraz za pomocą 2 μl CCL5 (10 ng/μL) za pomocą pipety o pojemności 2-20 μl (ta końcówka do pipety ma większą średnicę, co jest bardziej skuteczne w przypadku stosowania lepkiej cieczy). Pozwól, aby matryca zastygła.</li>
		<li>Gdy matryca zastygnie, delikatnie przykryj kalwarię płatkiem skóry, aby upewnić się, że tkanka nie zostanie odwodniona. Inkubować przez 1 godzinę przed obrazowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Obrazowanie przyżyciowe
<ol>
	<li>Ustawienia mikroskopu
	<ol>
		<li>Włącz laser wielofotonowy (femtosekundowy laser tytanowo-szafirowy). Ustaw długość fali na 880 nm i dostosuj moc do obrazowania drugiej harmonicznej (SHG) (440 nm) kości.</li>
		<li>Włącz lasery na ciele stałym 488 nm i 561 nm do wzbudzenia komórek wykazujących ekspresję GFP i tdTomato.</li>
		<li>Włącz detektory PMT (fotopowielacza) dla sygnałów generacji drugiej harmonicznej (detekcja 405–455 nm) i GFP (detekcja 505–550 nm). Włącz detektor HyD 3 dla sygnału pomidora (detekcja 590–620 nm). </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montażu
	<ol>
		<li>Przed przyłożeniem myszki do lunety należy sprawdzić płaszczyznę wizualną kalwarii, delikatnie naciskając tył głowy myszy. Jeśli płaszczyzna nie jest wypoziomowana, dostosuj pozycję, delikatnie obracając ogranicznik myszy w lewo lub w prawo. 
		UWAGA: Jest to krytyczny krok w celu zapewnienia wystarczającej jakości obrazu.</li>
		<li>Nałóż sterylną 2% metylocelulozę w wodzie (w/v), aby pokryć całą kalwarię i płat skóry i zapobiec wysuszeniu tkanki.</li>
		<li>Umieść mysz na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu z osią XYZ (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). Używając światła epifluorescencyjnego, ustaw mysz tak, aby 1) była zwrócona w stronę mikroskopu i 2) przecięcie szwów czołowych i strzałkowych było wyśrodkowanym punktem odniesienia stolika.</li>
		<li>Umieść szklaną osłonę na obszarze obrazowania i dwukrotnie sprawdź wyrównanie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie poklatkowe
	<ol>
		<li>Użyj obiektywu o małym powiększeniu (obiektyw zanurzony w wodzie 25x z NA = 0,95), aby zeskanować kalwarię. Uzyskaj obraz referencyjny przecięcia szwu strzałkowego i koronalnego.</li>
		<li>Korzystając z SHG i sygnałów fluorescencyjnych z komórek, zlokalizuj każdy punkt obserwacyjny urazu i zapisz współrzędne XYZ, a także odległości od szwów strzałkowych i koronalnych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
		<li>Wybierz miejsce na szwach koronalnych lub strzałkowych do długotrwałego obrazowania. Wykonaj szczegółowy obraz stosu Z tego obszaru z punktu odniesienia podczas obrazowania. 
		UWAGA: Ponieważ szwy reprezentują znaną niszę P-SSC, jest to miejsce, z którego komórki będą migrować w odpowiedzi na uraz kalwarii.</li>
		<li>Użyj ustawień oprogramowania poklatkowego, aby nagrywać obraz co 1 minutę przez co najmniej 1 godzinę. W czasie między migawkami porównaj bieżące pole widzenia z początkowym polem widzenia. Jeśli są różne, użyj obrazu stosu Z, aby określić, w którym kierunku należy dostosować pole widzenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami
<ol>
	<li>Po obrazowaniu przepłucz odsłoniętą kalwarię sterylnym PBS, aby usunąć metylocelulozę. </li>
	<li>Aby zamknąć nacięcie, delikatnie umieść płat skóry nad kalwarią. Użyj sterylnych wacików, aby usunąć resztki maści okulistycznej i osuszyć miejsce nacięcia.</li>
	<li>Za pomocą monofilamentowych nylonowych szwów niewchłanialnych w rozmiarze 5-0 z dołączoną igłą do odwrotnego cięcia C-1, zamknij pole operacyjne. Użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby nałożyć potrójną maść z antybiotykiem na zamknięte nacięcie. 
	UWAGA: Blizny są redukowane dzięki wysokiej jakości technikom szycia i minimalnemu krwawieniu.</li>
	<li>Umieść mysz w czystej klatce na ciepłej powierzchni i sprawdzaj co 15 minut, aż do osiągnięcia pozycji mostka.</li>
	<li>Drugą dawkę buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu należy podać 72 godziny po zabiegu.</li>
	<li>Codziennie monitoruj zachowanie związane ze skuleniem, potarganą sierść i/lub brak poruszania się, dopóki szwy nie zostaną usunięte (~1 tydzień). </li>
</ol>

<ol><li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+healing%3A+mechanisms+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li>
<li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li>
<li>Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+periosteum+for+skeletal+regeneration%3A+the+stem+cell+that+lies+beneath%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath.</a> Bone. 70, 10-18 (2015).</li>
<li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9 (1), 773(2018).</li>
<li>Olivos-Meza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+periosteum+with+TGF-beta1+in+situ+enhances+the+quality+of+osteochondral+tissue+regenerated+from+transplanted+periosteal+grafts+in+adult+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).</li>
<li>Debnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+periosteal+stem+cell+mediating+intramembranous+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation.</a> Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).</li>
<li>Ransom, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axin2-expressing+cells+execute+regeneration+after+skeletal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury.</a> Scientific Reports. 6, 36524(2016).</li>
<li>Ouyang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prx1+and+3.2kb+Col1a1+promoters+target+distinct+bone+cell+populations+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice.</a> Bone. 58, 136-145 (2013).</li>
<li>Wilk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Calvarial+Skeletal+Stem+Cells+Expressing+PRX1+Reside+Exclusively+in+the+Calvarial+Sutures+and+Are+Required+for+Bone+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).</li>
<li>Ortinau, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Functionally+Distinct+Mx1%2BalphaSMA%2B+Periosteal+Skeletal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).</li>
<li>Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+gene+expression+identifies+distinct+molecular+signatures+of+bone+marrow-+and+periosteal-skeletal+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 13 (1), 0190909(2018).</li>
<li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+remodeling+during+fracture+repair%3A+The+cellular+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+identifies+osteogenic+progenitors+for+bone+formation+and+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).</li>
<li>Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin-receptor-expressing+mesenchymal+stromal+cells+represent+the+main+source+of+bone+formed+by+adult+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).</li>
<li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+bone+marrow+MSCs+are+dynamic%2C+fate-restricted+participants+in+bone+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).</li>
<li>Nitzsche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+MSC+Adhesion+Cascade-Insights+into+Homing+and+Transendothelial+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration.</a> Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).</li>
<li>Adler, J., Pagakis, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+image+distortions+due+to+temperature-related+microscope+stage+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift.</a> Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).</li>
<li>Roberts, S. J., Ke, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anabolic+Strategies+to+Augment+Bone+Fracture+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing.</a> Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).</li>
</ol>

L.C.O. i D.P. ujawniają zgłoszony patent zatytułowany "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podczas gojenia się kości komórki okostnej są głównym źródłem nowo różnicujących się chondrocytów i osteoblastów w obrębie modzeliuszkodzonej 3. Podobnie jak w przypadku szpiku kostnego, osteogenne/chondrogenne SSC zostały również zidentyfikowane w okostnej 4,5,6. Ocena endogennych cech funkcjonalnych P-SSC jest technicznie trudna. Często dynamika migracji SSC jest oceniana in vitro, co sprawia, że interp...

Naprawa złamań to dynamiczny, wielokomórkowy proces, który różni się od rozwoju i przebudowy embrionalnej części szkieletu. Podczas tego procesu, po indukcji sygnałów urazu z uszkodzonej tkanki następuje szybka rekrutacja, proliferacja, a następnie różnicowanie szkieletowych komórek macierzystych/progenitorowych, które mają kluczowe znaczenie dla ogólnej stabilności i utrwalenia złamań1. W szczególności wczesne etapy gojenia się złamań wymagają tworzenia miękkiego kalusa, co przypisuje się głównie komórkom rezydującym w okostnej2. Kiedy kości są uszkodzone, podzbiór komórek okostnej szybko reaguje i przyczynia się do nowo zróżnicowanych produktów pośrednich chrząstki i osteoblastów w obrębie kalus3, co sugeruje obecność odrębnej populacji szkieletowych komórek macierzystych/progenitorowych w okostnej. W związku z tym identyfikacja i charakterystyka funkcjonalna szkieletowych komórek macierzystych (SSC) rezydujących w okostnej stanowi obiecujące podejście terapeutyczne w chorobach zwyrodnieniowych kości i ubytkach kostnych4. 
SSC są uważane za znajdujące się w wielu miejscach tkanki, w tym w szpiku kostnym. Podobnie jak szpik kostny, osteogenne/chondrogenne SSC zostały również zidentyfikowane w periosteum4,5,6. Te okostnowe SSC (P-SSC) mogą być oznaczone wczesnymi markerami linii mezenchymalnej (tj. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7, and Axin2-CreER8) podczas rozwoju kości płodu4,7,8,9,10. Istotnym ograniczeniem tych pojedynczych modeli śledzenia linii genetycznych jest znaczna heterogeniczność w znakowanych populacjach komórek. Co więcej, nie są w stanie odróżnić oznakowanych SSC od ich potomstwa in vivo. Aby rozwiązać ten problem, niedawno opracowaliśmy podwójną mysz reporterową (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+αSMA-GFP+) do wyraźnej wizualizacji P-SSC z SSC szpiku kostnego (BM-SSCs)11. Dzięki temu modelowi ustalono, że P-SSC są oznaczone podwójnym znakowaniem Mx1 + αSMA +, podczas gdy bardziej zróżnicowane komórki Mx1 + znajdują się w szpiku kostnym, powierzchniach śródkostnych i okostnych oraz kościach korowych i beleczkowych11,12. 
Wiele cytokin i czynników wzrostu jest znanych z regulowania przebudowy i naprawy kości i zostało przetestowanych pod kątem poprawy naprawy szkieletu w krytycznych wadach segmentu1,13. Jednak ze względu na złożoność komórkową modeli urazów generowanych przez przerwanie bariery fizycznej przedziału kostnego, bezpośredni wpływ tych cząsteczek na endogenną migrację i aktywację P-SSC podczas gojenia jest niejasny. Cechy funkcjonalne i dynamika migracji SSC są często oceniane in vitro poprzez wykonanie testu transwell lub scratch, w połączeniu z cytokinami lub czynnikami wzrostu, o których wiadomo, że indukują migrację w innych populacjach komórek. W związku z tym interpretacja wyników tych eksperymentów in vitro w celu zastosowania w odpowiadających im systemach in vivo jest trudna. Obecnie ocena in vivo migracji komórek macierzystych/progenitorowych szkieletu nie jest zwykle obserwowana w czasie rzeczywistym; Jest raczej mierzony w ustalonych punktach czasowych po złamaniu5,7,14,15,16. 
Ograniczeniem tej metody jest to, że migracja nie jest oceniana na poziomie pojedynczej komórki; raczej mierzy się ją poprzez zmiany w populacjach komórek. Dzięki niedawnym postępom w mikroskopii przyżyciowej żywych zwierząt i generowaniu dodatkowych myszy reporterowych, możliwe jest teraz śledzenie pojedynczych komórek in vivo. Korzystając z mikroskopii przyżyciowej żywych zwierząt, zaobserwowaliśmy wyraźną migrację P-SSC z niszy szwu kalwarii do urazu kości w ciągu 24-48 godzin po urazie u myszy Mx1 / Tomato / αSMA-GFP. 
CCL5/CCR5 został niedawno zidentyfikowany jako mechanizm regulacyjny wpływający na rekrutację i aktywację P-SSC podczas wczesnej reakcji na uraz. Co ciekawe, nie wykryto znacznej migracji P-SSC w odpowiedzi na uraz w czasie rzeczywistym. Jednak leczenie urazu za pomocą CCL5 powoduje solidną, wyraźną kierunkowo migrację P-SSC, które można uchwycić w czasie rzeczywistym. Dlatego celem tego protokołu jest zapewnienie szczegółowej metodologii rejestrowania migracji in vivo P-SSC w czasie rzeczywistym po leczeniu CCL5.

<table><tbody><tr><td>&frac12; &rdquo; słupek optyczny</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>Do montażu obrazowego</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td> Igła <td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G</td><td></td> BD Strzykawka insulinowa <td>PercisionGlide</td> 305111 <td></td></tr><tr><td>29G</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon</td><td></td><td>352098</td><td>Do unieruchamiania myszy</td></tr><tr><td>Regulowana płyta</td><td>kątowa Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>Do montażu obrazowego</td></tr><tr><td>Chusteczki nasączone alkoholem</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>betadynowy peeling chirurgiczny</td><td>Henry Schen</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1mg/ml Combo o przedłużonym uwalnianiu</td></tr><tr><td>III</td><td>Uzyskane od lekarza weterynarii</td><td>N/A</td><td>37,6 mg/ml Ketamina; 1,9 mg/ml Ksylazyna; 0,37 mg/ml Acepronazyna</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-545-87</td><td>24 x 40 premium superslip</td></tr><tr><td>Cienka końcówka</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8MP z DM6000CFS</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R & D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>Taśma medyczna</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>3" x 10 jardów (7,6 cm x 9,1 m)</td></tr><tr><td>Metoceluloza</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikrodysekcji</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany etap</td><td>Automatyka Anaheim</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igły</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Szwy niewchłanialne</td><td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>monofilament nylon 5-0 nici niewchłanialne z dołączoną igłą do odwrotnego cięcia C-1</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Rugby</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 &micro; g/50 i mikro; L</td></tr><tr><td>Zacisk kątowy do &frac12; &rdquo; słupek, 3/16" Hex</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>Do montażu obrazowego</td></tr><tr><td>Sprężynowy 3/16" Blokowanie sześciokątne &frac14; &rdquo; śruba skrzydełkowa</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>Do montażu obrazowego</td></tr><tr><td>Sterylne waciki bawełniane</td><td>Henry Schen</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne DPBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne obłożenia</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice chirurgiczne</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td><td></td></tr><tr><td>Maść z potrójnym antybiotykiem</td><td>Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. </td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do pobierania krwi Vacutainer</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>Zestaw do infuzji igłami motylkowymi 25G z rurką 12"</td></tr></tbody></table>

obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez ccl5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Szkieletowe komórki macierzyste okostnej (P-SSC) są niezbędne do utrzymania i naprawy kości przez całe życie, co czyni je idealnym celem dla rozwoju terapii przyspieszających gojenie złamań. Komórki okostnej szybko migrują do urazu, aby dostarczyć nowe chondrocyty i osteoblasty do gojenia złamań. Tradycyjnie, skuteczność cytokin w indukowaniu migracji komórek była badana tylko in vitro poprzez wykonanie testu transwell lub scratch. Dzięki postępom w mikroskopii przyżyciowej z wykorzystaniem wzbudzenia wielofotonowego odkryto niedawno, że 1) P-SSC wyrażają migrujący gen CCR5 i 2) leczenie ligandem CCR5 znanym jako CCL5 poprawia gojenie się złamań i migrację P-SSC w odpowiedzi na CCL5. Wyniki te zostały zarejestrowane w czasie rzeczywistym. Opisano tutaj protokół wizualizacji migracji P-SSC z niszy szkieletowych komórek macierzystych (SSC) szwu kalwaryjnego w kierunku urazu po leczeniu CCL5. Protokół szczegółowo opisuje konstrukcję urządzenia do unieruchamiania myszy i mocowania do obrazowania, chirurgiczne przygotowanie kalwarii myszy, indukcję ubytku kalwarii oraz akwizycję obrazowania poklatkowego.

Zaproponowano, że progenitorzy szkieletowi posiadają potencjał migracyjny lub krążeniowy20. Niedawno stworzono myszy reporterowe Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+αSMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), w których P-SSC są znakowane podwójnie jako Mx1+αSMA+ (Rysunek 2A,B). Znaczna migracja P-SSC Mx1+αSMA+ poza mezen...

Ten protokół opisuje wykrywanie migracji komórek macierzystych okostnej szkieletu za pośrednictwem CCL5 w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii intravital żywych zwierząt.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez CCL5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

Ustandaryzowany protokół może być stosowany do oceny endogennej migracji komórek i może być stosowany do kilku typów komórek, a także fenotypów szkieletu. Zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na śledzenie migracji komórek in vivo dla pojedynczych komórek, a nie populacji komórek w odpowiedzi na uraz i/lub leczenie cytokinami. Przed rozpoczęciem zabiegu należy potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy i nałożyć maść na oczy zwierzęcia.Następnie wykonaj poprzeczne, mniej niż jednocentymetrowe nacięcie od bezpośrednio przyśrodkowego do prawego ucha w kierunku lewego ucha i wykonaj drugie nacięcie od początkowego nacięcia, około dwóch do trzech milimetrów za prawym okiem w kierunku nosa. Użyj kleszczy, aby oddzielić skórę od okostnej i użyj nożyczek, aby delikatnie przeciąć tkankę łączną, aby oddzielić skórę od okostnej kalwarii. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nałóż maść okulistyczną na górną część płata skóry i delikatnie zawiń płatek nad lewym okiem.Przecięcie szwów strzałkowych i koronalnych powinno być wyraźnie odsłonięte. Przepłucz otwartą powierzchnię sterylnym PBS, aby oczyścić obszar z krwi i resztek włosów, a następnie umieść końcówkę skosu o szerokości jednej do dwóch igieł w kierunku nosa od szwu koronalnego i jednej do dwóch szerokości igły po prawej stronie szwu strzałkowego. Używając bardzo małego nacisku w dół, ostrożnie obrócić strzykawkę jeden raz w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara i kilka razy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.Następnie użyj igły o rozmiarze 27, aby poszerzyć mikropęknięcie do około 40 mikrometrów. Jeśli pozostaną fragmenty kości, przepłucz mikrozłamanie PBS. Jeśli fragmenty kości nadal pozostają, użyj igły o rozmiarze 29, aby delikatnie zgarnąć fragmenty.Do leczenia CCL5 użyj podstawowego roztworu CCL5 o stężeniu 100 nanogramów na mililitr i matrycy błony podstawnej, aby uzyskać działający roztwór chemoatraktantu o stężeniu 10 nanogramów na mililitr. Aby wyleczyć ranę, należy załadować pipetę o pojemności 220 mikrolitrów pięcioma mikrolitrami roztworu i nałożyć dwa mikrolitry chemokiny na szew. Następnie pozwól matrycy zestalić się i delikatnie przykryj kalwarię płatem skóry, aby upewnić się, że tkanka nie zostanie odwodniona podczas godzinnej kuracji chemokiną.W celu przyżyciowego obrazowania migracji komórek macierzystych okostnej w czasie rzeczywistym, przed przeniesieniem myszy do mikroskopu, należy delikatnie docisnąć tył głowy myszy, aby sprawdzić wizualną płaszczyznę kalwarii. Jeśli płaszczyzna nie jest wypoziomowana, delikatnie obróć ogranicznik myszy w lewo lub w prawo, aby wyregulować pozycję. Następnie przykryj całą kalwarię w płatze skóry sterylną 2% metylocelulozą w wodzie i umieść mysz na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu z osią XYZ.Używając światła epifluorescencyjnego, ustaw mysz tak, aby była skierowana w stronę mikroskopu, a przecięcie szwów koronalnych i strzałkowych było wyśrodkowanym punktem odniesienia stolika. Następnie umieść szklaną osłonę w obszarze obrazowania i dokładnie sprawdź wyrównanie. Aby uzyskać obrazowanie poklatkowe migracji do i z szwu, wybierz soczewkę zanurzeniową w wodzie o małym powiększeniu, aby zeskanować kalwarię.Uzyskaj obraz referencyjny przecięcia szwu strzałkowego i koronalnego i wykorzystując SHG i sygnały fluorescencyjne z komórek, zlokalizuj każde miejsce urazu i zapisz współrzędne XYZ, a także odległości od szwów strzałkowych i koronalnych. Wybierz miejsce na szwach koronalnych lub strzałkowych do długotrwałego obrazowania i uzyskaj szczegółowy obraz ZStack tego obszaru z odniesienia podczas obrazowania. Użyj ustawień oprogramowania poklatkowego, aby rejestrować obraz co minutę przez co najmniej godzinę, porównując bieżące pole view z początkowym polem widzenia w czasie między migawkami.Jeśli pola widzenia są różne, użyj obrazu ZStack, aby określić, w którym kierunku należy dostosować pole widzenia. Ostatnio wygenerowano myszy reporterowe Mx1 alfa-SMA GFP, w których komórki macierzyste szkieletu okostnego są oznaczone podwójnym znakowaniem Mx1 dodatnim alfa-SMA. W ciągu jednej godziny obrazowania, 24 godziny po założeniu szwów, obserwuje się niewielką lub żadną migrację okostnych komórek macierzystych okostnej alfa-SMA z dodatnim wynikiem Mx1.Leczenie chemokiną CCL5 ubytku kalwarii 24 godziny po urazie indukuje kierunkowo wyraźną migrację od szwu koronalnego w kierunku miejsca urazu. W tej reprezentatywnej analizie, w ciągu godziny od obrazowania, jedna z komórek macierzystych okostnej okostnej omega dodatnich alfa-SMA Mx1 migrowała około 50 mikrometrów w kierunku urazu. Najważniejszym aspektem tego protokołu, o którym należy pamiętać, jest ograniczenie leczenia CCL5 do miejsca urazu w celu stymulacji migracji specyficznej dla komórek.Po zakończeniu tej procedury leczenie miejscowe można kontynuować przez tydzień. Mikrotomografia komputerowa może być wykorzystana do oceny gojenia się urazów kalwarii i osadzania minerałów.

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Mikroskopia przyżyciowa myszy M. cremaster microcirculation oferuje unikalny i dobrze ustandaryzowany model in vivo do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego.

Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

Ilościowy pomiar funkcji progenitora kości w gojeniu złamań wymaga technologii obrazowania seryjnego o wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu przedstawiono protokoły wykorzystujące mikroskopię przyżyciową i śledzenie linii kostnych w celu sekwencyjnego obrazowania i ilościowego określenia migracji, proliferacji i różnicowania endogennych osteogennych komórek macierzystych / progenitorowych w procesie naprawy złamań kości.

Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Ten protokół opisuje skuteczny sposób monitorowania trwałości komórek i biodystrybucji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (haMSC) poprzez znakowanie fluorescencyjne na czerwono w modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego szczura (KOA) poprzez wstrzyknięcie dostawowe (IA).

In vivo (in vivo) Śledzenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura z fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem błonowym

W tym badaniu prezentujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej do obserwacji komórek poruszających się w kierunku uszkodzonej tkanki poprzez inkubację ex vivo z nabłonkiem ślimaka zawierającym narząd Cortiego.

Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

Ta praca przedstawia nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubej, trójwymiarowej analizy przekroju poprzecznego tkanki, który umożliwia pełne wykorzystanie modalności obrazowania konfokalnego. Protokół ten zachowuje antygenowość i stanowi solidny system do analizy histologii skóry i potencjalnie innych typów tkanek.

Horizontal Whole Mount: nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubych, trójwymiarowych przekrojów tkanek skóry

Poznaj metodę obrazowania w czasie rzeczywistym migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy z użyciem CCL5. Technika ta umożliwia śledzenie pojedynczych komórek w odpowiedzi na uraz.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez CCL5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy

Przeglądaj więcej filmów