Name: Badanie wpływu dymu papierosowego na zakażenie Pseudomonas w komórkach nabłonka płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj metodę badania wpływu ekstraktu z dymu papierosowego na kolonizację bakterii Pseudomonas w komórkach nabłonka płuc. Protokół umożliwia pomiar obciążenia bakteryjnego i może być dostosowany do innych typów komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health R01 HL125435 i HL142997 (dla CZ).

1. 100% przygotowanie do CSE
<ol>
	<li>Pobrać 10 ml pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy (DMEM/F12 dla komórek BEAS-2B; podłoże podstawowe komórek nabłonka dróg oddechowych dla komórek HSAEC) do strzykawki o pojemności 60 ml.</li>
	<li>Odwrotnie przymocować odpowiednio przyciętą końcówkę pipety o pojemności 1 ml do dyszy strzykawki jako adapter do przytrzymywania papierosa (3R4F).</li>
	<li>Wyjmij filtr z papierosa. Przymocuj papierosa do adaptera końcówki i spal papierosa.</li>
	<li>Wciągnąć 40 ml powietrza zawierającego dym do 10 ml pożywki niezawierającej surowicy. Wymieszaj dym z podłożem, energicznie potrząsając (30 s na zaciągnięcie).</li>
	<li>Powtórz krok 1.4 około 11x w ciągu ~7 minut, aż papieros całkowicie się wypali.</li>
	<li>Przefiltruj 10 ml wędzonego podłoża za pomocą filtra 0,22 μm, aby wykluczyć wszelkie mikroorganizmy i nierozpuszczalne cząstki. Przenieść do zamkniętej sterylnej probówki. Przygotować 100% CSE nie później niż 30 minut przed kolejnym testem.</li>
</ol>
2. Kultura Pseudomonas
<ol>
	<li>Zaszczepić zamrożone P. aeruginosa (szczep PAO1) lub P. fluorescens Migula (szczep PAO143) na płytce agarowej z tryptycznego bulionu sojowego (TSB) w celu hodowli przez noc w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Aby uzyskać wystarczającą ilość bakterii do hodowli, rozprowadź jak najwięcej bakterii na płytce agarowej TSB.</li>
	<li>Pobrać rozmaz bakteryjny i inkubować w 20 ml TSB z 5% glicerolem jako źródłem węgla.</li>
	<li>Wytrząsać zawiesinę bakteryjną w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 200 obr./min przez 1 godzinę, aż wartość OD600 = 0,6, 
	UWAGA: Nie pozwól, aby prędkość wytrząsania przekroczyła 200 obr./min. Wyższe prędkości wytrząsania mogą uszkodzić morfologię wici bakteryjnej i wpłynąć na inwazję bakterii do nabłonka płuc. Podobnie, ogranicz czas wytrząsania do 1 godziny, aby uzyskać wysoce inwazyjne bakterie. Zmierz wartość OD600, aby oszacować liczbę bakterii. OD600 = 1 odpowiada ~109 jednostkom tworzącym kolonie (CFU)/ml.</li>
</ol>
3. Hodowla ludzkich komórek nabłonkowych płuc i leczenie CSE
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich komórek BEAS-2B w pożywce HITES (500 ml DMEM/F12, 2,5 mg insuliny, 2,5 mg transferyny, 2,5 mg seleninu sodu, 2,5 mg transferyny, 10 μM hydrokortyzonu, 10 μM β-estradiolu, 10 mM HEPES i 2 mM L-glutaminy) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), jak wcześniej opisano24.</li>
	<li>Hodowla ludzkich pierwotnych komórek nabłonka małych dróg oddechowych (HSAEC) w pożywce do hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych (500 ml podłoża podstawnego dla komórek dróg oddechowych, 500 μg/ml HSA, 0,6 μM kwasu linolowego, 0,6 μg/ml lecytyny, 6 mM L-glutaminy, 0,4% ekstraktu P, 1,0 μM epinefryny, 5 μg/ml transferyny, 10 nM T3, 1 μg/ml hydrokortyzonu, rh EGF 5 ng/ml i 5 μg/ml rh insuliny). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Odciąć komórki za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny przez 5 minut, aż komórki całkowicie oderwą się od dna płytki.</li>
	<li>Dodaj 10 ml kompletnej pożywki HITES, aby zneutralizować trypsynę i zbierz komórki w probówce o pojemności 15 ml. Wirować w temperaturze 4 °C przy 300 x g przez 5 min. 
	UWAGA: Uważnie monitoruj czas trawienia trypsyny pod mikroskopem, ponieważ nadmierne trawienie może spowodować śmierć komórki.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki HITES z 10% FBS.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl powyższej zawiesiny komórek na płytkę i umieścić ją w automatycznym liczniku komórek w celu uzyskania stężenia w komórkach/ml.</li>
	<li>Płytki komórek BEAS-2B w stężeniu 3 × 105 komórek/ml na 6 płytki dołkowe o łącznej objętości 2 ml w pożywce HITES uzupełnionej 10% FBS do hodowli przez noc.</li>
	<li>Traktuj komórki przy około 80% zbieganiu, czyli 5 x 105 komórek/ml, z 4% CSE przez 3 godziny. Przed zabiegiem CSE należy zmienić pożywkę na pożywkę HITES z 1% FBS.</li>
</ol>
4. Infekcja bakteryjna
<ol>
	<li>Dodać P. aeruginosa lub P. fluorescens Migula (~1 × 107 CFU/ml) do każdej studzienki komórek poddanych działaniu CSE i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Odessać supernatanty i zastąpić 2 ml świeżej pożywki HITES w celu potraktowania 4% CSE i 100 μg/ml gentamycyny. 
	UWAGA: Gentamycyna jest stosowana, ponieważ nie jest w stanie przeniknąć przez błony komórkowe ludzkiego nabłonka płuc. W ten sposób może zabić wszystkie bakterie w pożywce, ale nie te, które zaatakowały komórki nabłonka płuc.</li>
	<li>Po 1 godzinie obróbki CSE/gentamycyną w temperaturze 37 °C w 5% CO2 należy odessać supernatanty i przemyć komórki 3x PBS w celu późniejszego oznaczenia stężenia bakterii. 
	UWAGA: Aby potwierdzić zinternalizowane bakterie, komórki zakażone P. fluorescens Migula znakowane GFP obserwowano pod mikroskopią fluorescencyjną.</li>
</ol>
5. Oznaczanie stężenia bakterii metodą kropli
<ol>
	<li>Aby określić obciążenie bakteryjne w zakażonych komórkach metodą płytki kroplowej, przemyj komórki potraktowane gentamycyną 2x 2 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Dodaj 1 ml buforu do lizy komórek (0,5% trytonu X-100 w PBS) do każdej studzienki.</li>
	<li>Rozcieńczyć lizaty komórkowe zawierające zinternalizowane bakterie w gradiacji (1:10, 1:100, 1:1,000 i 1:10,000) do następnego zaszczepienia na płytce agarowej TSB.</li>
	<li>Po 16 godzinach inkubacji uzyskać wyniki CFU poprzez zliczenie kolonii bakteryjnych.</li>
</ol>
6. Wykrywanie 16S rRNA bakterii metodą RT-qPCR
<ol>
	<li>Komórki nabłonka płuc zakażone Pseudomonas (~1 x 106 komórek/ml) należy traktować gentamycyną, jak opisano powyżej. Odessać pożywkę i przemyć komórki 2x 2 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Dodać 0,35 ml buforu do lizy tiocyjanianu guanidu do dołka na płytce 6-dołkowej. Zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Odpipetować lizat do probówki mikrowirówkowej i delikatnie wymieszać pipetą.</li>
	<li>Dodaj taką samą objętość (0,35 ml) świeżo przygotowanego 70% etanolu do lizatu i dobrze wymieszaj. Przenieść wszystkie próbki do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze 20–25 °C. Następnie wyrzuć bufor do probówki zbiorczej.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 0,7 ml buforu do przemywania 1. Odwirować kolumnę przy 10 000 x g przez 30 s. Przemyć kolumnę 2x 0,5 ml buforu w celu przepłukania RNA związanego z błoną. Powtórzyć wirowanie przy 10 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 30–50 μl wody wolnej od RNaz. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min. Zbierz przepływ i zmierz stężenie RNA.</li>
	<li>Wykonaj reakcję odwrotnej transkrypcji zgodnie z protokołem producenta. Wymieszać 1 μg całkowitego RNA z 10 ml buforu reakcyjnego, 1 μl odwrotnej transkryptazy i wodą wolną od RNaz, aby uzyskać 20 μl reakcji. Przeprowadzić reakcję odwrotnej transkrypcji w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Wymieszaj ze sobą matryce cDNA (1 μl każdej reakcji odwrotnej transkrypcji powyżej), 5 μl Master Mix zawierającego barwnik SYBR, 1 μl każdego specyficznego startera 200 nM i wodę w mieszaninie 20 μl do następnej analizy PCR, zgodnie z zaleceniami producenta. 
	UWAGA: Poniżej znajdują się startery ukierunkowane na 16S rRNA P. aeruginosa: forward 5′-CAAAACTGAGCTAGAGTACG-3′; rewers 5′-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH został użyty jako kontrola obciążenia z następującymi starterami: do przodu: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′; rewers: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.</li>
	<li>Użyj metody porównawczej CT, aby określić wyrażenie.</li>
</ol>
7. Wykrywanie fluorescencyjnych Pseudomonas za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Potraktuj powyższe fluorescencyjne komórki nabłonka płuc zakażone Pseudomonas (~1 x 106 komórek/ml) gentamycyną, jak opisano wcześniej. Odessać pożywkę i przemyć komórki 2x 2 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Analizować próbki za pomocą cytometru przepływowego o długości fali 509 nm w celu wykrycia GFP. Zakończ każdy odczyt przy 100 000 zliczeń. Analizuj pozyskane dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
</ol>

<ol><li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li>
<li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Care+Journal%22%5BJournal%5D)">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li>
<li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li>
<li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation%2C+Allergy%2C+Asthma+and+Other+Lung+Diseases%3A+A+Mechanistic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelated+role+of+cigarette+smoking%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li>
<li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li>
<li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+tobacco+use%3A+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li>
<li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Review%22%5BJournal%5D)">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li>
<li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li>
<li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li>
<li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li>
<li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations%3A+defining+their+cause+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li>
<li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbations+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%22%5BJournal%5D)">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).</li>
<li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).</li>
<li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li>
<li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li>
<li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells%3A+fortifying+the+barrier+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infection%22%5BJournal%5D)">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li>
<li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li>
<li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+p21%28CIP1%2FWAF1%29+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x%28L%29+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li>
<li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784(2013).</li>
<li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li>
<li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL%28R%29+VC10%28R%29+smoke+exposure+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li>
<li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li>
<li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF%28Fbxl17%29-recognized+acetyldegron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li>
<li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26(2009).</li>
<li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells%3A+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li>
<li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%3A+An+essential+issue+for+in+vitro+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiologyopen%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).</li>
<li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25%2FHDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li>
<li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Agitation%2C+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125(2018).</li>
<li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycosides%3A+activity+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li>
<li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li>
<li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).</li>
<li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Inwazja bakterii do komórek nabłonka płuc jest kluczowym etapem w patogenezie infekcji bakteryjnych. Proces inwazji bakterii do komórek można podzielić na następujące trzy etapy: Po pierwsze, bakterie kontaktują się i przylegają do powierzchni komórki nabłonka za pomocą wici. Po drugie, bakterie albo ulegają internalizacji, albo przenikają przez błonę komórkową. Wreszcie, bakterie replikują się i kolonizują komórki, jeśli uda im się uciec komórkowym mechanizmom obronnym25,26<sup class="...

Palenie papierosów wpływa na zdrowie publiczne milionów ludzi na całym świecie. Wiele szkodliwych chorób, w tym rak płuc i przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), jest związanych z paleniem papierosów1,2. Palenie papierosów zwiększa podatność na ostre infekcje bakteryjne układu oddechowego3,4,5. Co więcej, coraz więcej dowodów dowodzi, że palenie papierosów zwiększa patogenezę wielu przewlekłych zaburzeń6,7,8. Na przykład palenie papierosów może nasilać infekcje wirusowe lub bakteryjne, które powodują zaostrzenie POChP9. Wśród patogenów bakteryjnych, które etiologicznie przyczyniają się do ostrego zaostrzenia POChP, oportunistyczny patogen pałeczki Gram-ujemnej, Pseudomonas aeruginosa, powoduje infekcje, które korelują ze złymi rokowaniami i wyższą śmiertelnością10,11. Zaostrzenie POChP pogarsza chorobę poprzez przyspieszenie patologicznego postępu. Nie ma skutecznych metod leczenia zaostrzeń POChP, z wyjątkiem leczenia przeciwobjawowego12. Zaostrzenie POChP zwiększa śmiertelność pacjentów, obniża jakość życia i zwiększa obciążenie ekonomiczne społeczeństwa13.
Drogi oddechowe są systemem otwartym, stale narażonym na działanie różnych patogenów mikrobiologicznych obecnych na zewnątrz. Oportunistyczne patogeny bakteryjne są zwykle wykrywane w górnych drogach oddechowych, ale czasami obserwuje się je w dolnych drogach oddechowych14,15. W modelach zwierzęcych P. aeruginosa można wykryć w pęcherzykach płucnych już po 1 godzinie od zakażenia16. Jako główny mechanizm obronny, komórki odpornościowe, takie jak makrofagi lub neutrofile, eliminują bakterie w drogach oddechowych. Komórki nabłonka płuc, jako pierwsza bariera fizjologiczna, pełnią wyjątkową rolę w obronie gospodarza przed infekcjami bakteryjnymi. Komórki nabłonka płuc mogą regulować inwazję, kolonizację lub replikację drobnoustrojów niezależnie od komórek odpornościowych17. Niektóre cząsteczki znajdujące się w komórkach nabłonka, w tym PPARg, pełnią funkcje przeciwbakteryjne, regulując w ten sposób kolonizację i replikację bakterii w komórkach nabłonka płuc18. Palenie papierosów może zmieniać cząsteczki i upośledzać normalne funkcje obronne w komórkach nabłonka płuc19,20. Ostatnie badania wykazały bezpośrednie narażenie dymu papierosowego na komórki nabłonka płuc za pomocą robota palącego21,22. Narażenie na dym tytoniowy można jednak przeprowadzić na inne sposoby, w tym stosując CSE. Przygotowanie CSE jest powtarzalnym podejściem z potencjalnymi zastosowaniami w innych typach komórek, w tym w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, które są pośrednio narażone na dym papierosowy.
Ten raport opisuje protokół generowania ekstraktu z dymu papierosowego w celu zmiany obciążenia bakteryjnego w komórkach nabłonka płuc. CSE zwiększa obciążenie bakteryjne P. aeruginosa i może przyczyniać się do nawrotów zakażeń bakteryjnych zwykle obserwowanych w zaostrzeniu POChP. Do przygotowania CSE stosuje się konwencjonalną metodę. Komórki nabłonka płuc, w fazie wzrostu wykładniczego, traktuje się 4% CSE przez 3 godziny. Alternatywnie, komórki nabłonka płuc hodowane w monowarstwie mogą być bezpośrednio wystawione na dym papierosowy na granicy faz powietrze-ciecz. Komórki poddane działaniu CSE są następnie prowokowane Pseudomonas przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10. Bakterie rozmnażają się ze szczególną prędkością wytrząsania, aby zapewnić, że morfologia ich wici pozostaje nienaruszona, aby zachować ich pełną zdolność inwazyjną. Gentamycyna jest stosowana do zabijania bakterii pozostawionych w pożywce hodowlanej, zmniejszając w ten sposób potencjalne zanieczyszczenie podczas późniejszego określania obciążenia bakteryjnego. Protokół wykorzystuje również Pseudomonas znakowany GFP, który został wykorzystany jako potężne narzędzie do badania infekcji Pseudomonas w różnych modelach. Reprezentatywnym szczepem jest P. fluorescens Migula23. Stopień infekcji lub obciążenia bakteryjnego po leczeniu CSE określa się na trzy sposoby: metodą kropli z liczeniem kolonii, ilościową PCR przy użyciu starterów specyficznych dla rRNA Pseudomonas 16S lub cytometrią przepływową w komórkach zakażonych fluorescencyjnym Pseudomonas. Protokół ten jest prostym i powtarzalnym podejściem do badania wpływu dymu papierosowego na infekcje bakteryjne w komórkach nabłonka płuc.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pożywka dla komórek nabłonka dróg oddechowych</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka bakteryjna</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zestaw do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-040</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 System</td> <td>PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-Capacity RNA-to-DNA</td><td>KIT ThermoFisher Scientific</td><td>4387406</td><td></td></tr><tr><td>HITES medium</td><td>ATCC</td><td>ATCC 30-2004</td><td></td></tr><tr><td>ludzkie komórki BEAS-2B</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>ludzkie pierwotne komórki nabłonka małych dróg oddechowych</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Nikkon</td> Czytnik <td>OD Nikkon</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>USA Naukowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>startery PCR</td><td>ITD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>ATCC 47085</td><td>PAO1-LAC</td></tr><tr><td>Pseudomonas fluorescens Migula</td><td>ATCC</td><td>ATCC 27853</td><td>P.aeruginosa GFP</td></tr><tr><td>Papierosy klasy badawczej (3R4F)</td><td>University of Kentucky</td><td>TP-7-VA</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Transprent PET Transwell Insert</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Bulion BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie wpływu dymu papierosowego na zakażenie pseudomonas w komórkach nabłonka płuc

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Palenie papierosów jest główną przyczyną etiologiczną rozedmy płuc i przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP). Palenie papierosów sprzyja również podatności na infekcje bakteryjne w układzie oddechowym. Jednak wpływ palenia papierosów na infekcje bakteryjne w ludzkich komórkach nabłonka płuc nie został jeszcze dokładnie zbadany. Opisano tutaj szczegółowy protokół przygotowania ekstraktów z palenia papierosów (CSE), leczenia ludzkich komórek nabłonka płuc CSE oraz wykrywania infekcji bakteryjnych i infekcji. CSE został przygotowany metodą konwencjonalną. Komórki nabłonka płuc traktowano 4% CSE przez 3 godziny. Komórki traktowane CSE zostały następnie zakażone Pseudomonas przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10. Obciążenia bakteryjne komórek określono trzema różnymi metodami. Wyniki wykazały, że CSE zwiększa obciążenie Pseudomonas w komórkach nabłonka płuc. Protokół ten zapewnia zatem proste i powtarzalne podejście do badania wpływu dymu papierosowego na infekcje bakteryjne w komórkach nabłonka płuc.

Schemat ilustrujący protokół przedstawiono na Rysunku 1. Komórki nabłonka płuc BEAS-2B poddano działaniu CSE, a następnie zainfekowano bakteriami z rodzaju Pseudomonas. Bakterie Pseudomonas w pożywce hodowlanej zostały zneutralizowane za pomocą dodanej gentamycyny, a następnie komórki poddano analizie metodą drop plate, detekcji 16S RNA rybosomalnego Pseudomonas za pomocą RT-qPCR oraz cytometrii przepływowej. W porównaniu z kontrolą, traktowanie CSE znacząco zwięks...

Opisany tutaj jest protokół do badania, jak ekstrakt z dymu papierosowego wpływa na kolonizację bakteryjną w komórkach nabłonka płuc.

Badanie wpływu dymu papierosowego na zakażenie Pseudomonas w komórkach nabłonka płuc

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Protokół ten wykorzystuje trzy podejścia do określenia, czy dym papierosowy wpływa na obciążenie bakteryjne pseudomonas w komórkach nabłonka płuc. Metodę tę można rozszerzyć na komórki śródbłonka lub inne krany komórkowe. Przygotowanie ekstrakcji dymu papierosowego, infekcja bakteryjna i oznaczanie za pomocą ładunku bakteryjnego są szczegółowo opisane w tym filmie.Ta procedura jest bardzo łatwa do wykonania dla nowych użytkowników. Pobrać 10 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy do 60-mililitrowej strzykawki. Przymocuj wąską końcówkę ścinka do jednej mililitrowej końcówki pipety do dyszy strzykawki, jako adapter do przytrzymywania papierosa.Wyjmij filtr z papierosa i przymocuj papierosa do adaptera. Nie więcej niż 30 minut przed wykonaniem testu należy spalić papierosa i wciągnąć do strzykawki 40 mililitrów dymu zawierającego powietrze. Zmieszać dym z podłożem, energicznie potrząsając strzykawką.Powtarzaj proces rysowania, aż papieros całkowicie się wypali, co będzie wymagało około 11 zaciągnięć w ciągu około siedmiu minut. Aby usunąć mikroorganizmy i nierozpuszczalne cząstki z pożywki, przefiltruj je przez filtr 0,22 mikrona. Następnie przenieś pożywkę do zamkniętej sterylnej probówki.Zaszczepij tryptyczny bulion sojowy lub płytkę ślimakową TSB wybranym szczepem Pseudomonas. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotuj probówkę zawierającą 20 mililitrów TSB z 5% glicerolem jako źródłem węgla.Zbierz rozmaz z płytki ślimakowej i zaszczep TSB. Zawiesinę Pseudomonas inkubować w wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 200 obr./min przez około godzinę, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach wyniesie 0,6. Po wyhodowaniu komórek nabłonka płuc zgodnie z opisem w manuskrypcie, dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny do komórek.Po około pięciu minutach, gdy komórki całkowicie oderwą się od dna płytki, dodaj 10 mililitrów kompletnego podłoża Heights, aby zneutralizować trypsynę. Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki. Następnie odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 300 razy G. Usuń i wyrzuć supernatant.Następnie ponownie zawieś komórki w mililitrach pożywki Heights z 10% FBS. Odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny komórek nabłonka na nową płytkę. Użyj automatycznego licznika komórek, aby uzyskać stężenie komórek.Umieść komórki nabłonka płuc w stężeniu trzy razy 10 do piątej komórki na mililitr, w całkowitej objętości dwóch mililitrów pożywki na studzienkę. Inkubuj płytki przez noc. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, zastąp pożywkę pożywką Heights plus 1% FBS.Następnie dodaj 4% CSE do dołków i inkubuj płytki przez trzy godziny. Dodaj pseudomonas do każdej studzienki komórek nabłonka płuc poddanych działaniu CSE. Następnie inkubuj płytki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Następnie zastąp pożywkę w płytkach sześciodołkowych dwoma mililitrami świeżej pożywki Heights, zawierającej 4% CSE i 100 mikrogramów na mililitr gentamycyny. Po inkubacji płytek przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, odessać pożywkę z dołków. Umyj komórki potraktowane gentamycyną dwukrotnie, dwoma mililitrami zimnego PBS.Obciążenie bakteriami w komórkach nabłonka płuc można następnie wykryć za pomocą metody kropli, qRT-PCR lub cytometrii przepływowej. Dodaj jeden mililitr buforu do lizy komórek do każdej studzienki komórek nabłonka płuc. Napraw seryjne rozcieńczenia lizatu komórkowego, w zakresie od jednego do 10 do jednego do 10 000.Następnie zaszczepij płytkę ślimakową TSB. Po 16 godzinach inkubacji określ, ile jednostek tworzących kolonie było obecnych w komórkach nabłonka płuc, licząc liczbę kolonii bakteryjnych. Dodaj 0,35 mililitra buforu do lizy tiocyjanianu guanidyny do każdej studzienki komórek nabłonka płuc.Zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Odpipetować lizat do probówki z mikrowirówką i delikatnie wymieszać pipetą. Dodaj 0,35 mililitra świeżo przygotowanego do 70% etanolu do lizatu i dobrze wymieszaj.Przenieść wszystkie próbki do kolumny wirowej umieszczonej w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Wirować probówkę zbiorczą przez 30 sekund w temperaturze 10 000 razy G i temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Wyrzucić bufor do probówki zbiorczej i przemyć kolumnę 0,7 mililitra buforu do przemywania wodą.Odwirować kolumnę pod ciśnieniem 10 000 razy G przez 30 sekund. Przemyć kolumnę dwukrotnie 0,5 mililitra buforu. Powtórzyć wirowanie 10 000 razy G przez dwie minuty.Umieść kolumnę w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 mililitra i dodaj od 30 do 50 mikrolitrów wody wolnej od RNaz. Po odwirowaniu probówki o sile 10 000 razy G przez jedną minutę, zebrać przepływ i zmierzyć stężenie RNA. Aby przygotować się do 20 mikrolitrowej reakcji odwrotnej transkrypcji, należy wykonać jeden mikrogram całkowitego RNA z 10 mikrolitrami buforu reakcyjnego, jednym mikrolitrem odwrotnej transkryptazy i wodą wolną od RNaz.Reakcję odwrotnej transkrypcji należy przeprowadzać w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, zgodnie z protokołem producenta. Następnie zmieszaj jeden mikrolitr każdej próbki cDNA z pięcioma mikrolitrami mieszanki głównej zawierającej barwnik cybernetyczny i jednym mikrolitrem każdego 200 nanomolowego specyficznego startera. Dodaj wodę do całkowitej objętości 20 mikrolitrów.Wykonaj analizę PCR, zgodnie z zaleceniami producenta. A następnie użyj metody CT porównawczej, aby określić wyrażenie. W komórkach BEAS-2B żywotność nie zmieniła się znacząco, gdy komórki były traktowane 4% CSE przez trzy godziny.Jedna godzina jako zakażenie Pseudomonas również nie wpłynęło znacząco na żywotność. Wreszcie, użycie gentamycyny do zabicia Pseudomonas w pożywce hodowlanej nie miało statystycznie istotnego wpływu na żywotność komórek. Jak zmierzono metodą kropli, zakażenie bakteryjne w komórkach BEAS-2B było znacznie zwiększone po leczeniu CSE.To samo dotyczyło leczenia HSAEC przez CSE. Zakażenie bakteryjne komórek BEAS-2B traktowanych CSE oceniano również za pomocą RT-PCR w celu ilościowego określenia ilości obecnego 16S rRNA, co wskazywało na wzrost Pseudomonas aeruginosa. Komórki BEAS-2B potraktowane CSE i zakażone Pseudomonas fluorescens Migula analizowano za pomocą cytometrii przepływowej na głębokości 509 nanometrów.Wyniki wskazują również, że leczenie CSE nasila infekcje bakteryjne. Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej wykazały, że bakterie znakowane GFP kolokalizowały się z komórkami BEAS-2B w eksperymencie infekcji Pseudomonas fluorescens Migula. Komórki mogą być wystawione na dym papierosowy za pomocą palących robotów, co może naśladować ludzkie zachowanie i umożliwiać bezpośrednie badanie wpływu dymu papierosowego na komórki nabłonka płuc.Technika ta może być wykorzystana do zbadania dymu papierosowego na innych kranach komórkowych w kontekście infekcji płuc. Opisane podejście ma być podstawą do opracowania skutecznych terapii przeciwko paleniu papierosów, grzbietowemu uszkodzeniu płuc i C0PD extra

studying-effects-cigarette-smoke-on-pseudomonas-infection-lung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Source: Li, T., et al. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates how cigarette smoke extract weakens antimicrobial defense in lung epithelial cells by reducing AMP production, leading to increased bacterial invasion. The procedure measures intracellular bacterial load to assess the impact of smoke exposure on host-pathogen interactions.

Analyzing the Effects of Cigarette Smoke on Antimicrobial Defense in Lung Epithelial Cells

Opisujemy metodę koralików agarowych w celu ustalenia trwałego, długotrwałego przewlekłego zakażenia dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa w modelu mysim.

Długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa u myszy

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Celem tego protokołu jest wystawienie ludzkich organotypowych 3D modeli tkanek oskrzelowych i nosowych na główny nurt dymu papierosowego (CS) na granicy powietrze-ciecz. Wpływ CS na tkanki jest następnie badany za pomocą testu aktywności cytochromu P450, pomiaru bicia rzęsek i podejścia opartego na biologii systemowej.

Ocena skutków powtarzającego się narażenia organotypowych modeli 3D hodowli tkanek oskrzelowych i nosowych na cały dym papierosowy

Korzystając z zoptymalizowanych testów ex vivo ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), wykazaliśmy, że preparat palnego wyrobu tytoniowego wyraźnie hamuje wewnątrzkomórkowo wydzielane cytokiny za pośrednictwem receptorów i cytolityczną zdolność efektorowych PBMC. Te szybkie testy mogą być przydatne w ocenie produktu i zrozumieniu potencjalnych długoterminowych skutków narażenia na palenie tytoniu.

Metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

Prezentowany tutaj jest użyteczny protokół do unieruchomienia płuc, który tworzy stabilne warunki do oceny histologicznej próbek płuc z mysiego modelu rozedmy płuc. Główną zaletą tego modelu jest to, że może naprawić wiele płuc przy tym samym stałym ciśnieniu bez zapadania się płuc lub opróżniania.

Unieruchomienie płuc pod stałym ciśnieniem w celu oceny rozedmy płuc u myszy

Ten protokół demonstruje badanie patofizjologicznych skutków dymu papierosowego (CS) za pomocą systemu ekspozycji na inhalację całego ciała (WBI) (WBIS) zbudowanego we własnym zakresie. System ten może wystawiać zwierzęta na działanie CS w kontrolowanych, powtarzalnych warunkach w celu zbadania wpływu CS na rozedmę płuc i hematopoezę.

Narażenie na dym papierosowy u myszy korzystających z systemu inhalacji całego ciała

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Tutaj opisujemy model in vitro do izolowania i różnicowania mysich komórek nabłonka dróg oddechowych, skupiając się na ich aklimatyzacji do przewlekłego ekstraktu z dymu papierosowego (CSE). Model może zostać wykorzystany do kompleksowego scharakteryzowania multiomicznego wpływu CSE, co może dostarczyć informacji na temat reakcji komórkowych na przewlekłe narażenie na dym tytoniowy.

Model in vitro do badania różnicowania i zmian multiomiki na mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych stymulowanych ekstraktem z dymu papierosowego

Poznaj metodę badania wpływu ekstraktu z dymu papierosowego na kolonizację bakterii Pseudomonas w komórkach nabłonka płuc. Protokół umożliwia pomiar obciążenia bakteryjnego i może być dostosowany do innych typów komórek.

Badanie wpływu dymu papierosowego na zakażenie Pseudomonas w komórkach nabłonka płuc

Przeglądaj więcej filmów