Name: Przygotowanie ekstraktów komórkowych metodą kriomielenia w automatycznym młynie zamrażarkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min
Description: Naucz się metody kriomielenia komórek drożdży w automatycznym młynie zamrażarkowym, aby uzyskać ekstrakty z zachowaniem integralności białek. Technika ta zapewnia wysoką wydajność izolacji funkcjonalnych makrocząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Gunjan są wspierane przez fundusze z National Institutes of Health, National Science Foundation i Departamentu Zdrowia Florydy. Dziękujemy studentowi studiów licencjackich Johnowi Parkerowi za pomoc techniczną.

1. Przygotowanie drożdżowego popcornu
<ol>
	<li>Hoduć komórki drożdży w 0,5 L pożywki YPD do gęstości 1 x 107 komórek/ml. Policz komórki za pomocą licznika Coulter’a lub innej metody.</li>
	<li>Wiruj komórki przez 10 min przy 2400 g i 4 °C.</li>
	<li>Każdą próbkę należy raz przemyć 500 ml lodowatej wody dejonizowanej Milli-Q o oporności 18 megaohmów.</li>
	<li>Osady resuspender w 15 ml lodowatego buforu lizującego [20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glicerolu, z dodanym bezpośrednio przed użyciem środkiem redukującym 10 mM β-merkaptoetanolem, koktajlem inhibitorów proteaz, 10 μM inhibitor proteasomów MG-132, 1 mM inhibitor deacetylazy maślan sodu oraz inhibitory fosfataz (1 mM wanadan sodu, 50 mM fluorek sodu, 50 mM $\beta$-glicerynian sodu)]. Patrz na Tabela materiałów w celu uzyskania dodatkowych szczegółów. Przechowywać resuspenderowane komórki w lodzie do momentu przygotowania próbek do następnego etapu. 
	UWAGA: Do próbek można stosować szeroki wachlarz buforów lizujących zawierających różne detergenty niejonowe oraz specyficzne inhibitory, zależnie od planowanego zastosowania w dalszych etapach analizy. Dodanie inhibitorów proteaz i proteasomów jest kluczowe dla zapobiegania degradacji białek, szczególnie po rozmrożeniu ekstraktów.</li>
	<li>Przygotuj zamrożony metodą snap-freezing „popcorn” drożdżowy, powoli dodając zawiesinę komórkową kropla po kropli za pomocą schłodzonej wcześniej pipety serologicznej do jednej lub kilku probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, umieszczonych na suchym lodzie i wypełnionych LN2.2 do poziomu tuż poniżej krawędzi. Często uzupełniać ciekły azot w probówce, aby zrekompensować jego ubytek wynikający z szybkiego odparowania. Pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, aby uniknąć zagrożeń związanych z uduszeniem azotem.
	<ol>
		<li>Zamiast jednej probówki 50 ml, do przygotowania pop-cornu należy użyć kilku probówek 50 ml związanych ze sobą (lub dowolnego pojemnika z szerokim otworem, np. dużej plastikowej butelki do wirówki, która jest odporna na temperatury kriogeniczne) (Rycina 1A). Im większy pojemnik i jego otwór, tym łatwiejsze jest przygotowanie popcornu, ponieważ zapobiega to zbrylaniu się popcornu i tworzeniu dużych aglomeratów. Zakres wielkości ziaren popcornu od 0,3 do 0,5 cm jest idealny do uzyskania prawidłowego zmielenia/sproszkowania przy użyciu młyna kriogenicznego (Rysunek 1B).</li>
		<li>Upewnij się, że LN2 całkowicie odparowało z probówek zawierających popcorn przed ich przechowywaniem w temperaturze -80 °CMożna przerwać pracę po przygotowaniu drożdżowego „popcornu”, ponieważ są one stabilne przez kilka lat przy przechowywaniu w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Przygotowanie do schładzania próbek PCR oraz porównanie rozmiaru kulek do eksperymentu z reakcją polimerazy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie drożdżowego „popcornu”. (A) Drożdżowy „popcorn” powstaje poprzez zamrażanie zawiesiny komórkowej w LN2 metodą kroplową. Używamy od jednej do trzech probówek o pojemności 50 mL, spiętych gumką recepturką i umieszczonych w wiaderku z lodem wypełnionym suchym lodem. Probówki wypełnia się LN2 niemal do pełna, a poziom ciekłego azotu jest często uzupełniany, aby utrzymać go blisko krawędzi, aż cała zawiesina komórkowa zostanie zamieniona w popcorn (B) Rozmiar popcornu jest istotnym czynnikiem determinującym optymalną wydajność mielenia. Zakres rozmiaru kulek popcornu powinien wynosić od 0,3 do 0,5 cm średnicy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Kriotarcie
<ol>
	<li>Na początek należy upewnić się, że znajduje się wystarczająca ilość LN22 dostępne w celu schłodzenia młyna kriogenicznego, probówek do mielenia i materiałów pomocniczych oraz do zasilania maszyny podczas przetwarzania wszystkich próbek. Dla mniej niż pięciu próbek wymagane jest 30–35 l LN22 powinno wystarczyć. Napełnić komorę młynka kriogenicznego ciekłym azotem (LN2)2 do linii napełnienia. 
	OSTRZEŻENIEWszystkie etapy obejmujące LN22 Należy przeprowadzić w dobrze wentylowanym pomieszczeniu; młyn mrożący powinien znajdować się w takim miejscu, aby uniknąć ryzyka uduszenia. Należy stosować środki ochrony indywidualnej, w tym odpowiednie obuwie, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, bazową warstwę rękawiczek nitrylowych, następnie rękawice termiczne, a na koniec kolejną parę rękawiczek nitrylowych. Podczas pracy z LN należy zachować najwyższą ostrożność.2.</li>
	<li>Powoli zamknij pokrywę młyna kriogenicznego, aby uniknąć rozpryskiwania LN22 i odczekać kilka minut, aż urządzenie ostygnie. Może być konieczne ponowne napełnienie komory LN2.2 aby zrekompensować ubytki wynikające z odparowania przed przejściem do następnego etapu. 
	UWAGA: Uzupełnić LN22 w razie potrzeby, maksymalnie do linii napełniania. Nie należy przepełniać komory, ponieważ może to być niebezpieczne i szkodliwe dla urządzenia. Dla młynków kriogenicznych dostępne są automatyczne systemy uzupełniania, które mogą w razie potrzeby uzupełniać odparowujący LN2 bezpośrednio ze zbiornika magazynowego podłączonego do młynka.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić duże probówki do mielenia oraz magnetyczny pręt uderzeniowy, zanurzając je w ciekłym azocie (LN2).2 przechowywany w oddzielnym małym naczyniu Dewara. Odlać cały LN22 kiedy LN2 przestaje bąbelkować. Następnie należy przenieść próbkę/popcorn drożdżowy do fiolki mielącej i szczelnie zamknąć ją za pomocą dwóch końcówek z stali nierdzewnej.
	<ol>
		<li>Nie należy wypełniać fiolki do mielenia próbką w więcej niż jednej trzeciej jej objętości, ponieważ może to obniżyć wydajność procesu. Większe próbki można przetworzyć, dzieląc je na dwie lub więcej fiolek i mieląc je sekwencyjnie. W przypadku mniejszych próbek (do 3 ml) można zastosować mniejsze fiolki do mielenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść fiolkę do mielenia w komorze młyna kriogenicznego i zablokuj ją. Zamknij pokrywę.</li>
	<li>W przypadku drożdży pączkujących próbki należy mielić przez łącznie trzy cykle po 2 min/cykl (z 2-minutowymi przerwami na chłodzenie między cyklami) przy prędkości kruszenia wynoszącej 14. Po zatrzymaniu urządzenia po zakończeniu cykli należy powoli otworzyć pokrywę młyna kriogenicznego, ostrożnie odblokować probówkę z zamrożonym lizatem komórkowym w postaci proszku i wyjąć ją z urządzenia. W przypadku użycia wielu małych probówek należy sprawnie wyjmować je pojedynczo i umieszczać w suchym lodzie. 
	UWAGA: Zazwyczaj nie ma potrzeby korygowania parametrów mielenia przy stosowaniu probówek o różnych rozmiarach dla tego samego rodzaju próbki. Niemniej jednak parametry mielenia, takie jak liczba cykli i szybkość mielenia, muszą zostać określone empirycznie dla różnych typów próbek, w zależności od łatwości ich lizy. Większość komórek ssaków i tkanek miękkich ulega lizie w 1-2 cyklach przy szybkości kruszenia wynoszącej 10. Próbki trudniejsze do lizy, takie jak bakterie, drożdże, larwy much i dorosłe muszki owocówki, wymagają 3-6 cykli przy maksymalnej szybkości, natomiast tkanki twarde, takie jak kości, zęby itp., mogą wymagać do 10 cykli. Przed i po mieleniu niewielką alikwotę rozmrożonej próbki można obejrzeć pod mikroskopem, aby policzyć liczbę nienaruszonych, nielizowanych komórek w celu określenia wydajności lizy. Wcześniej opublikowano znakomitą analizę wpływu parametrów kriomielenia na uwalnianie białek i DNA z drożdży pączkujących.15.</li>
	<li>Pracując szybko, aby nie dopuścić do rozmrożenia próbki, należy ostrożnie odkręcić jeden z elementów końcowych (wybierając ten, który wydaje się nieco poluzować podczas mielenia), używając narzędzia do otwierania. Następnie, za pomocą długiej pęsety (wcześniej schłodzonej w pojemniku z suchym lodem), należy wyjąć pręt uderzający. Sproszkowaną próbkę zbiera się poprzez odwrócenie i opukanie fiolki do mielenia nad polistyrenową szalką wagową, uprzednio schłodzoną w LN2.2 i przechowywano na suchym lodzie.</li>
	<li>Po odzyskaniu całego sproszkowanego mrożonego lizatu komórkowego z fiolki do rozcierania, przelać sproszkowany lizat z naczynia wagowego z powrotem do probówki 50 ml i niezwłocznie przystąpić do opisanego poniżej etapu powolnego rozmrażania, aby uzyskać najlepsze wyniki. Alternatywnie, mrożony sproszkowany lizat można przechowywać przez noc w temperaturze -80 °Cchoć może to doprowadzić do częścikowej degradacji.</li>
	<li>Przygotuj naczynie z 50% zawiesiną lodu i wody i umieść je na mieszadle magnetycznym z mieszadłem. Zanurz w zawiesinie lodowej statyw druciany lub inny odpowiedni statyw do utrzymania próbek.
	<ol>
		<li>Następnie powoli rozmrozić próbki w kąpieli z zawiesiny lodowej, stale mieszając zawiesinę za pomocą mieszadła magnetycznego. Dodawać lód w celu zastąpienia lodu, który się roztopił (być może konieczne będzie odlanie części wody, aby zapobiec przelaniu się naczynia z lodem). Ponieważ kilka inhibitorów ma krótki okres półtrwania w buforach wodnych, dodać dodatkowy koktajl inhibitorów proteaz (patrz Tabela materiałów) i 10 μM inhibitor proteasomów MG-132 do lizatu, gdy próbki zaczną tajać (po około 30 min).</li>
		<li>Co 5 minut usuwaj lód utworzony na zewnętrznych ściankach probówek, aby przyspieszyć proces rozmrażania. Należy pamiętać, że szybkie rozmrażanie próbek w temperaturze pokojowej lub wyższej może prowadzić do ich znacznej degradacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po całkowitym rozmrożeniu próbek (co, w zależności od ich ilości, może zająć ponad godzinę), odwirować lizat przy przyspieszeniu ok. 3220 g przez 20 min w chłodzonej wirówce nakładkowej przy 4 °C aby usunąć większość szczątków komórkowych z lizatu.</li>
	<li>Przenieś nadsącz do schłodzonych wcześniej na lodzie poliwęglanowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wiruj próbki z przyspieszeniem 16 000 g przez 20 min w temperaturze 4 °C (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Bardzo powoli i ostrożnie przenieś tylko przejrzysty nadsącz, składający się z oczyszczonego ekstraktu z całych komórek, z centrum kolumny cieczy w probówce, aby nie zaburzyć mętnej warstwy lipidowej (Rycina 2), do schłodzonej probówki o pojemności 15 ml, używając uprzednio schłodzonych pipet serologicznych. Należy unikać pobierania całego lizatu z probówki do wirowania, aby zapobiec przeniesieniu lipidów i zanieczyszczeń. Pozostały w probówce do wirowania lizat można wirować wielokrotnie, aby po każdym cyklu odzyskać niewielkie ilości ekstraktu. 
	UWAGA: Lipidy wraz z wszelkimi zdenaturowanymi białkami mają mętny lub mleczny wygląd i znajdują się na granicy fazy ciekłej i powietrznej, a okazjonalnie powyżej samego osadu, który składa się z nierozpuszczalnych resztek komórkowych (Rysunek 2).</li>
</ol>
<img alt="Schemat frakcjonowania komórkowego: warstwa lipidowa, ekstrakt z całych komórek, osad z zdenaturowanymi białkami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Warstwy ekstraktu w probówce do wirowania. Wskazano główne widoczne cechy ekstraktu z całych komórek w probówce po wirowaniu przy 16,000 g przez 20 min. Względna ilość każdego z tych elementów zależy od rodzaju próbki, fazy wzrostu komórek (eksponencjalnej w stosunku do stacjonarnej), ilości buforu do lizy użytego do resuspensji komórek oraz wydajności lizy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="12">
	<li>Wirować pozostały lizat przez 5 min, aby odzyskać więcej ekstraktu. W razie potrzeby powtórzyć to 5-minutowe wirowanie wielokrotnie, aby odzyskać jak największą ilość klarownego ekstraktu. Odrzucić mętny lizat zawierający lipidy, znajdujący się przy dnie probówki w pobliżu osadu.</li>
	<li>Wykorzystać uzyskane ekstrakty w dalszych zastosowaniach, takich jak oczyszczanie kompleksów białkowych, immunoprecypitacja oraz analiza proteomiczna.</li>
</ol>

<ol><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li>
<li>Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunn%2C+B+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 13, Unit 13 (2001).</li>
<li>Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+efficient+method+for+isolating+DNA+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast.</a> Gene. 42 (2), 169-173 (1986).</li>
<li>Nandakumar, M. P., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lysis+methods+and+preparation+protocols+for+one-+and+two-dimensional+electrophoresis+of+Aspergillus+oryzae+intracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins.</a> Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).</li>
<li>Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+yeast+DNA+extraction+by+boiling+and+freeze-thawing+without+using+chemical+reagents+and+DNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Archives+of+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification.</a> Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).</li>
<li>Baldwin, C., Robinson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Saccharomyces+cerevisiae+using+enzymatic+lysis+combined+with+high-pressure+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Techniques%22%5BJournal%5D)">Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization.</a> Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+yeast+mitochondrial+DNA+in+high+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).</li>
<li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function%2C+interactions%2C+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).</li>
<li>Bzducha-Wróbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+efficiency+of+different+disruption+methods+on+yeast+cell+wall+preparation+for+%CE%B2-glucan+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation.</a> Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).</li>
<li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3%27+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).</li>
<li>Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+sampling+of+dental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the sampling of dental DNA.</a> Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).</li>
<li>Sweet, D., Hildebrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+human+teeth+by+cryogenic+grinding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding.</a> Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).</li>
<li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+RNA+isolation+from+loblolly+pine+%28P.+taeda+L.%29+and+other+conifer+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1751(2010).</li>
<li>Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Cryogenic+Grinding+on+Release+of+Protein+and+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).</li>
<li>Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+levels+are+regulated+by+phosphorylation+and+ubiquitylation-dependent+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).</li>
<li>Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+dosage+regulates+DNA+damage+sensitivity+in+a+checkpoint-independent+manner+by+the+homologous+recombination+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway.</a> Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).</li>
<li>Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+E3+ubiquitin+ligases+that+regulate+histone+protein+levels+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (5), 36295(2012).</li>
<li>Gunjan, A., Verreault, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rad53+kinase-dependent+surveillance+mechanism+that+regulates+histone+protein+levels+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae.</a> Cell. 115 (5), 537-549 (2003).</li>
<li>Gill, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+remains+of+the+Romanov+family+by+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis.</a> Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).</li>
<li>Alain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extractions+from+deep+subseafloor+sediments%3A+novel+cryogenic-mill-based+procedure+and+comparison+to+existing+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).</li>
<li>Mohammad, F., Buskirk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Ribosome+Profiling+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria.</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3468(2019).</li>
<li>Liew, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microRNAs+in+the+coral+Stylophora+pistillata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata.</a> PLoS One. 9 (3), 91101(2014).</li>
<li>Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications%3A+a+comparison+of+yeast+lysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5 (14), (2004).</li>
<li>Grant, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+plant+cell+walls+with+adsorbed+polyphenols+alter+porcine+faecal+bacterial+communities+during+in+vitro+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation.</a> Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).</li>
<li>Lolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenic+grinding+pre-treatment+improves+extraction+efficiency+of+fluoroquinolones+for+HPLC-MS%2FMS+determination+in+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).</li>
<li>Santos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Cd+and+Pb+in+food+slurries+by+GFAAS+using+cryogenic+grinding+for+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).</li>
<li>da Silva, E. G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+method+for+the+determination+of+copper%2C+manganese+and+iron+in+seafood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Composition+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).</li>
<li>Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+preparation+of+hair+slurries+using+cryogenic+grinding+and+water-soluble+tertiary-amines+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+Part+B-Atomic+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium.</a> Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).</li>
<li>Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sr-87%2FSr-86+ratios+in+modern+and+fossil+food-webs+of+the+Sterkfontein+Valley%3A+Implications+for+early+hominid+habitat+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Geochimica+Et+Cosmochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference.</a> Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).</li>
<li>Nielsen-Marsh, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+preservation+of+osteocalcin+protein+and+mitochondrial+DNA+in+bison+bones+older+than+55+ka%5BTitle%5D)+AND+%22Geology%22%5BJournal%5D)">Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka.</a> Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ograniczeniem w badaniu natywnych białek drożdży jest nieefektywna liza komórek drożdży ze względu na ich twardą ścianę komórkową. Chociaż opracowano kilka metod, najbardziej spójną i wydajną metodą w naszych rękach jest kriomielenie komórek drożdży zamrożonych błyskawicznie jako popcorn. Ta metoda pozwala na niezawodne przygotowanie wysokiej jakości ekstraktów z całych komórek z pączkujących drożdży w porównaniu z innymi metodami lizy. Reprezentatywne wyniki wykazały, że kriomielenie jest lepsze od popularnej mechaniczn...

Drożdże są popularnym organizmem modelowym do badań nad białkami, ponieważ są prostym organizmem eukariotycznym z obfitością genetycznych i biochemicznych narzędzi dostępnych dla badaczy1. Ze względu na ich solidną ścianę komórkową, jednym z wyzwań, przed którymi stoją naukowcy, jest skuteczna liza komórek bez uszkadzania zawartości komórkowej. Dostępne są różne metody otrzymywania ekstraktów białkowych poprzez rozbijanie komórek drożdży, które obejmują lizę enzymatyczną (zymolyase)2,3, liza chemiczna4, fizyczna liza przez zamrażanie-rozmrażanie5, oparte na ciśnieniu (prasa francuska)6,7, mechaniczne (szklane koraliki, młynek do kawy)8,9, sonikation-based10 i crygenic2,11. Wydajność lizy komórek i wydajność białka mogą się znacznie różnić w zależności od zastosowanej techniki, wpływając w ten sposób na wynik końcowy lub przydatność do pożądanego dalszego zastosowania lizatu. Podczas badania białek, które są niestabilne, mają ulotne modyfikacje potranslacyjne lub są wrażliwe na temperaturę, szczególnie ważne jest zastosowanie metody, która zminimalizuje utratę lub degradację próbki podczas przygotowania.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Technika przygotowania ekstraktu</td>
			<td>Szczegóły</td>
			<td>Zalety</td>
			<td>Wady</td>
			<td>Dalsza analiza</td>
			<td>odniesienie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prasa francuska: Homogenizator wysokociśnieniowy (znany również jako mikrofluidyzator) z enzymatyczną obróbką wstępną przy użyciu zymoliazy</td>
			<td>Zymolyase-20T, homogenizator wysokociśnieniowy Microfluidizer. Zakłócacz składa się z napędzanej powietrzem, wysokociśnieniowej pompy (stosunek 1:250; wymagane ciśnienie powietrza 0,6 l MPa) oraz specjalnej komory zakłócającej z dodatkowym agregatem przeciwciśnieniowym. Do przetworzenia wymagana jest próbka o minimalnej wielkości 20 ml.</td>
			<td>Ostateczna całkowita przerwa uzyskana przy użyciu protokołu połączonego zbliżyła się do 100 % przy 4 przejściach pod ciśnieniem 95 MPa, w porównaniu z zaledwie 32 % zakłóceniami przy 4 przejściach przy ciśnieniu 95 MPa przy użyciu tylko homogenizacji bez Zymolyazy.</td>
			<td>Nie nadaje się do zastosowań na małą skalę. Enzymy mogą być drogie w przypadku preparatów na dużą skalę.</td>
			<td>Oczyszczanie białek</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubijak do koralików: Komórki poddane działaniu zymoliazy poddane lizie za pomocą szklanych kulek w instrumencie fastprep</td>
			<td>Mniej więcej równa objętość zimnych, suchych, przemytych kwasem kulek szklanych o średnicy 0,5 mm jest dodawana do danej objętości osadu komórkowego w buforze do lizy, a komórki są rozbijane przez energiczne mieszanie ręczne.</td>
			<td>Jest to szczególnie przydatne przy wytwarzaniu ekstraktów z wielu różnych małych kultur drożdży do celów testowych, a nie do oczyszczania białek.</td>
			<td>Podczas procedury kulek szklanych białka są poddawane surowej obróbce, powodując nadmierne pienienie prowadzące do denaturacji białek. Stopień uszkodzenia komórek jest różny, podczas gdy proteoliza, jak również modyfikacja białek może wynikać z podgrzania ekstraktu powyżej 4°C podczas mechanicznego pękania.</td>
			<td>Głównie analizy DNA i RNA, ale także analiza białek poprzez denaturację elektrofenorezy żelowej, z Western blot lub bez.</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leczenie zymoliazą, a następnie liza przy użyciu kombinacji wstrząsu osmotycznego i homogenizacji Dounce</td>
			<td>Po enzymatycznym trawieniu ścian komórkowych sferoplasty są poddawane lizie za pomocą 15 do 20 uderzeń ciasno dopasowanego tłuczka (prześwit od 1 do 3 μm) w homogenizatorze Dounce.</td>
			<td>Korzystne jest stosowanie szczepów z niedoborem proteazy, takich jak BJ926 lub EJ101. Jest to najdelikatniejszy sposób rozbijania komórek drożdży, dlatego najlepiej nadaje się do przygotowywania ekstraktów, które mogą pełnić złożone funkcje enzymatyczne (np. translacja, transkrypcja, replikacja DNA) i w których musi być zachowana integralność struktur makromolekularnych (np. rybosomów, splicesomach). Jest również przydatny do izolowania nienaruszonych jąder, które można wykorzystać do badań chromatyny (Bloom i Carbon, 1982) lub do ekstraktów białek jądrowych (Lue i Kornberg, 1987).</td>
			<td>Główną wadą procedury lizy sferoplastów jest to, że jest ona stosunkowo żmudna i kosztowna, zwłaszcza w przypadku preparatów na dużą skalę (>10 litrów), a długie okresy inkubacji mogą prowadzić do proteolizy lub modyfikacji białek. W przypadku preparatów chromatyny wydają się one być różnej lub niższej jakości niż te wytwarzane przez wirowanie różnicowe (w oparciu o integralność drabinki nukleosomów).</td>
			<td>Izolowanie nienaruszonych jąder do badań chromatyny, ekstrakty, które mogą pełnić złożone funkcje enzymatyczne, ekstrakty wymagające integralności 
			struktury makromolekularne, ekstrakty białek jądrowych.</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozbijanie komórek zamrożonych błyskawicznie przez mielenie w ciekłym azocie za pomocą moździerza/tłuczka lub blendera</td>
			<td>Komórki są natychmiast zamrażane w ciekłym azocie, a następnie poddawane lizie poprzez ręczne mielenie w moździerzu za pomocą tłuczka lub za pomocą blendera Waring w obecności ciekłego azotu.</td>
			<td>Protokół jest szybki i łatwy. Może pomieścić różne ilości komórek drożdży, w tym bardzo duże kultury. Jego główną zaletą jest to, że komórki są natychmiast pobierane ze stanu aktywnego wzrostu do ciekłego azotu (−196°C), co zmniejsza aktywność enzymów degradacyjnych, takich jak proteazy i nukleazy, a także aktywność modyfikującą białka (np. fosfatazy i kinazy). Szczególnie nadaje się do wytwarzania ekstraktów całokomórkowych z pojedynczej kultury drożdży w celu oczyszczania białek na dużą skalę. </td>
			<td>Trochę niechlujne i potencjalnie niebezpieczne dla nieostrożnego śledczego. Małe próbki (tj. 10 do 100 ml kultur drożdży) nie są łatwe do przetworzenia, ponieważ nie ma wystarczającej masy zamrożonych grudek komórek, aby skutecznie rozbić się w mieszalniku. Przetwarzanie pojedynczych próbek i czyszczenie sprzętu między użyciami jest czasochłonne.</td>
			<td>Ekstrakty całokomórkowe z pojedynczej kultury drożdży do oczyszczania białek na dużą skalę.</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoliza, Młyn perełkowy</td>
			<td>pH 5,0, 50 °C, 24 h, 200 obr/min / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min</td>
			<td>Szybka i wydajna liza, szczególnie w przypadku przygotowywania ekstraktów na małą skalę</td>
			<td>Wytwarzanie ciepła prowadzi do denaturacji i degradacji makrocząsteczek. Wymagany sprzęt do ubijania koralików.</td>
			<td>Analizy na małą skalę.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoliza, Sonikacja</td>
			<td>pH 5,0, 50 °C, 24 h, 200 obr./min, 4 × 5 min/2 min, pulsator 80%, moc 80%</td>
			<td>Sprzęt do sonikacji jest zwykle dostępny w większości instytucji.</td>
			<td>Wytwarzanie ciepła prowadzi do denaturacji i degradacji makrocząsteczek. Wymagany sprzęt do sonikacji. Powolna liza może potrwać dłużej niż 24 godziny.</td>
			<td>Preparaty ściany komórkowej drożdży.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proces gotowania i zamrażania i rozmrażania</td>
			<td>Nie jest potrzebny żaden specjalistyczny sprzęt poza standardową zamrażarką i blokiem grzewczym lub wanną z gorącą wodą.</td>
			<td>Wydajne, powtarzalne, proste i niedrogie.</td>
			<td>Wytwarzanie ciepła prowadzi do denaturacji i degradacji makrocząsteczek.</td>
			<td>Analizy DNA metodą PCR.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Porównanie dostępnych metod przygotowania ekstraktów drożdżowych.
Mielenie kriogeniczne (znane również jako mielenie kriogeniczne/mielenie kriogeniczne) jest powszechnie stosowane do pobierania kwasów nukleinowych, białek lub substancji chemicznych z próbek wrażliwych na temperaturę w niezawodny sposób do analiz ilościowych lub jakościowych. Jest z powodzeniem stosowany w wielu zastosowaniach w różnych dziedzinach, w tym w biotechnologii, toksykologii, kryminalistyce12,13, naukach o środowisku, biologii roślin14 i naukach o żywności. Izolacja nienaruszonych makrocząsteczek biologicznych jest zwykle krytycznie zależna od temperatury. Ekstremalnie niskie temperatury zapewniają, że proteazy i nukleazy pozostają nieaktywne, co skutkuje niezawodną izolacją nienaruszonych białek, kwasów nukleinowych i innych makrocząsteczek do późniejszych analiz. Rzeczywiście, młyn zamrażalniczy zazwyczaj utrzymuje temperaturę próbki -196 °C (temperatura wrzenia LN2), minimalizując w ten sposób denaturację i degradację DNA/RNA lub białka.
Młyn zamrażalniczy wykorzystuje elektromagnetyczną komorę mielenia, która szybko przesuwa metalowy pręt lub cylinder tam i z powrotem wewnątrz fiolki zawierającej próbkę, która ma zostać sproszkowana między zatyczkami końcowymi ze stali nierdzewnej. Przyrząd wytwarza i szybko odwraca pole magnetyczne w komorze mielenia. Gdy pole magnetyczne przesuwa się do przodu i do tyłu, magnes miażdży próbkę o korki, uzyskując w ten sposób "kriomielenie" i sproszkowanie popcornu. Młyn zamrażarkowy zastępuje moździerz i tłuczek i umożliwia sekwencyjne przetwarzanie wielu próbek (lub do 4 mniejszych próbek jednocześnie) z wysoką powtarzalnością i pozwala uniknąć zmienności między użytkownikami związanej z ręcznym mieleniem. Po przetworzeniu próbek, ekstrakty komórkowe mogą być wykorzystywane do różnych dalszych zastosowań.

<table><tbody><tr><td>Probówki poliwęglanowe 50 ml z nakrętkami</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Probówki wirówkowe</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptone</td><td>BD Biosiences</td><td>211677</td><td>Drożdże Składnik podłoża YPD</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Bacto BD</td><td>Biosiences</td><td>212750</td><td>Składnik pożywki drożdżowej YPD</td></tr><tr><td>Wirówka Beckman Avanti</td><td>Beckman</td><td>B38624</td><td>Wirówka szybkoobrotowa</td></tr><tr><td>Beckman JLA-9.1000</td><td>Beckman</td><td>366754</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>D-(+)-dekstroza bezwodna</td><td>MP Biomedicals</td><td>901521</td><td>Drożdże YPD składnik podłoża</td></tr><tr><td>Eppendorf A-4-44</td><td>Eppendorf</td><td>22637461</td><td>Obrotowy wirnik kubełkowy</td></tr><tr><td>Eppendorf Wirówka z chłodzeniem Eppendorf 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td>Wirówka z chłodzeniem</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5150-1GA</td><td>Ogranicznik objętości i krioprotektant</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBiotech</td><td>BP310-100</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Przeciwciało HIS6</td><td>Przeciwciało Novagen</td><td>70796</td><td>dla znacznika HIS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-1KG</td><td>Sól do utrzymania siły jonowej</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>CALBIOCHEM</td><td>474790</td><td>Inhibitor proteasomu</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32957</td><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>SIGMA</td><td>P7170-1L</td> Koktajl inhibitorów proteazy <td>białkowej ThermoFisher</td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>A32963</td><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td></tr><tr><td>Rotor JLA 25.500</td><td>Beckman</td><td>JLA 25.500</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>EM Science</td><td>BX2165-1</td><td>Inhibitor deacetylazy histonowej</td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6521</td><td>Inhibitor fosfatazy</td></tr><tr><td>Wanadan sodu</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Inhibitor fosfatazy</td></tr><tr><td>Sodu &beta;-glicerofosforan</td><td>Alfa Aesar</td><td>13408-09-8</td><td>Inhibitor fosfatazy</td></tr><tr><td>Młyn zamrażarkowy Spex Certiprep 6850</td><td>SPEX Przygotowanie próbki</td><td>6850</td><td>Młyn zamrażarkowy</td></tr><tr><td>TALON Powinowactwo do metalu Żywica</td><td>BD Biosiences</td><td>635502</td><td>Do ściągania białek oznaczonych tagiem HIS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>VWR International</td><td>VW1521-07</td><td>Niejonowy detergent</td></tr> <tr><td>i beta;-merkaptoetanol</td><td>AMRESCO</td><td>M131-250ML</td><td>Środek redukujący</td></tr></tbody></table>

przygotowanie ekstraktów komórkowych metodą kriomielenia w automatycznym młynie zamrażarkowym

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

Łatwość manipulacji genetycznej i silne ewolucyjne zachowanie eukariotycznej maszynerii komórkowej w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae uczyniły z nich wybitny genetyczny organizm modelowy. Ponieważ jednak skuteczna izolacja białek zależy od optymalnego rozerwania komórek, użycie drożdży do analizy biochemicznej białek komórkowych jest utrudnione przez ich ścianę komórkową, która jest kosztowna w trawieniu enzymatycznym (przy użyciu litykazy lub zymolyazy) i trudna do mechanicznego zakłócenia (przy użyciu tradycyjnego ubijaka do kulek, prasy francuskiej lub młynka do kawy) bez powodowania podgrzewania próbek. co z kolei powoduje denaturację i degradację białek. Chociaż ręczne mielenie komórek drożdży w ciekłym azocie (LN2) za pomocą moździerza i tłuczka pozwala uniknąć przegrzania próbek, jest pracochłonne i podlega zmienności w lizie komórek między operatorami. Od wielu lat z powodzeniem przygotowujemy wysokiej jakości ekstrakty drożdżowe metodą kriomielenia komórek w zautomatyzowanej zamrażarce. Temperatura -196 °C osiągnięta przy użyciu LN2 chroni materiał biologiczny przed degradacją przez proteazy i nukleazy, umożliwiając odzyskanie nienaruszonych białek, kwasów nukleinowych i innych makrocząsteczek. Tutaj szczegółowo opisujemy tę technikę pączkowania komórek drożdży, która polega najpierw na zamrożeniu zawiesiny komórek w buforze do lizy poprzez jej kroplowe dodanie do LN2 w celu wytworzenia zamrożonych kropelek komórek znanych jako "popcorn". Ten popcorn jest następnie proszkowany pod LN2 w młynie zamrażarkowym w celu wytworzenia zamrożonego "sproszkowanego" ekstraktu, który jest powoli rozmrażany i klarowany przez wirowanie w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Otrzymane ekstrakty są gotowe do dalszych zastosowań, takich jak oczyszczanie białek lub kwasów nukleinowych, analizy proteomiczne lub badania koimmunoprecypitacji. Technika ta ma szerokie zastosowanie do przygotowywania ekstraktów komórkowych z różnych mikroorganizmów, tkanek roślinnych i zwierzęcych, okazów morskich, w tym koralowców, a także do izolowania DNA/RNA z kryminalistycznych i wiecznych zmarzlin.

Porównaliśmy dwie różne metody lizy komórek drożdży, mianowicie rozcieranie z użyciem szklanych kulek w temperaturze 4 °C oraz zautomatyzowaną metodę kriomielenia w temperaturze -196 °C, aby ocenić względną odzyskiwalność białek w ekstraktach komórkowych przygotowanych obiema metodami. W badaniu tym zdecydowaliśmy się na użycie szczepu drożdży pączkujących YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221...

Opisujemy niezawodną metodę przygotowania ekstraktów z całych komórek z drożdży lub innych komórek za pomocą kriogenicznego młyna zamrażającego, który minimalizuje degradację i denaturację białek. Ekstrakty komórkowe nadają się do oczyszczania funkcjonalnych kompleksów białkowych, analiz proteomicznych, badań koimmunoprecypitacji i wykrywania labilnych modyfikacji białek.

Przygotowanie ekstraktów komórkowych metodą kriomielenia w automatycznym młynie zamrażarkowym

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

Drożdże są popularnym organizmem modelowym, nie tylko do badań genetycznych, ale także do badań biochemicznych białek i innych makrocząsteczek ekstrahowanych z dzikich i zmutowanych szczepów drożdży. Jednak ze względu na ich twarde ściany komórkowe, głównym wyzwaniem, przed którym stoją naukowcy, jest skuteczna liza komórek drożdży bez uszkadzania zawartości komórkowej. Izolacja nienaruszonych makrocząsteczek biologicznych jest zwykle krytyczna, zależna od temperatury.Przygotowanie ekstraktów w niskiej temperaturze zapewnia, że wewnątrzkomórkowe proteazy i nukleazy pozostają nieaktywne, co skutkuje niezawodną izolacją nienaruszonego białka, kwasów nukleinowych i innych makrocząsteczek w celu uzyskania wystarczającej lizy. Dostępne są różne metody otrzymywania ekstraktów drożdżowych poprzez lizę enzymatyczną, chemiczną i fizyczną. Jednak liza enzymatyczna jest kosztowna ze względu na zapotrzebowanie na oczyszczone enzymy do trawienia ściany komórkowej, co ogranicza użycie mniejszej liczby komórek.Ponadto reakcje enzymatyczne muszą być ściśle monitorowane, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu i przedwczesnej lizie komórek. Metody chemiczne wykorzystujące silne środki denaturujące, choć skuteczne, powodują denaturację białek i jako takie nie nadają się do izolacji kompleksów białkowych lub enzymów funkcjonalnych. Metody fizyczne, takie jak liza pod wysokim ciśnieniem w prasie francuskiej, można przeprowadzić na zimno w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ale nie jest to wystarczająco zimne, aby zapobiec degradacji i denaturacji wszystkich natywnych białek.Inne popularne metody fizyczne to użycie moździerza i tłuczka, blendera lub młynka do kawy do mielenia komórek drożdży ponownie zawieszonych w buforze do lizy i zamrożonych w postaci kropelek lub mielenie i mieszanie szklanych kulek i drożdży w szybkim młynku do ubijania kulek lub liza przez sonikację. Jednak ręczne mielenie jest pracochłonne, a uzyskany uzysk białka może się znacznie różnić w zależności od zastosowanych technik, podczas gdy liza przez sonikację lub mielenie w blenderze, młynku do kawy lub młynku do kulek generuje znaczną ilość ciepła, co powoduje denaturację i degradację białka. Dlatego, aby uzyskać lizę komórek drożdży z białkami w ich stanie natywnym przy minimalnej denaturacji i degradacji do zastosowań takich jak oczyszczanie funkcjonalnych kompleksów białkowych, testy biochemiczne lub wykrywanie ulotnych modyfikacji potranslacyjnych, konieczne jest zastosowanie łatwo skalowalnej metody lizy, która zminimalizuje wytwarzanie ciepła, a jednocześnie pozwoli na wydajną lizę niezależnie od liczby komórek.Tutaj opisujemy metodę, która polega na użyciu młyna do zamrażania kriogenicznego do lizy komórek w ciekłym azocie w temperaturze minus 196 stopni Celsjusza w celu wytworzenia ekstraktów z zamrożonych komórek, umożliwiając w ten sposób odzyskanie nienaruszonych funkcjonalnych makrocząsteczek, takich jak białka lub DNA i RNA, w bardzo niskich temperaturach, co minimalizuje denaturację i degradację. Metodę tę można łatwo dostosować do stosowania z dowolnym rodzajem próbki komórek lub tkanek dowolnego gatunku, w tym z próbkami kryminalistycznymi, a nawet starożytnymi próbkami odzyskanymi ze stanowisk archeologicznych lub znalezionymi zamrożonymi w wiecznej zmarzlinie. Młyn zamrażarczy wykorzystuje nadprzewodzącą elektromagnetyczną komorę mielenia, która szybko przesuwa solidny metalowy pręt tam iz powrotem w pilniku poliwęglanowym zawierającym próbkę, która ma zostać sproszkowana między zatyczkami końcowymi ze stali nierdzewnej.Ta fizyczna metoda lizy komórek pozwala na bardziej wydajną lizę i powtarzalnie skutkuje lepszą jakością ekstraktu. Komórki drożdży hodowano w stężeniu 10 milionów komórek na promil. Te komórki drożdży umieszczono we wstępnie schłodzonej butelce wirówkowej i wirowano przez 10 minut w temperaturze 2 400 G. Po zakończeniu wirowania zdekantować supernatant bez naruszania granulowanych komórek.Osad ten został ponownie zawieszony w niewielkiej ilości lodowatej wody, około połowy początkowej objętości kultury w celu umycia komórek. Zawieszone komórki były ponownie wirowane przez kolejne 10 minut w temperaturze 2 400 G. Po zakończeniu następnego wirowania, ponownie dekantujemy cały supernatant bez naruszania osadu. Osad ten zostanie następnie ponownie zawieszony i 15 ml lodowatego buforu do lizy.Upewnij się, że granulat jest całkowicie zawieszony. Zawieszone komórki powinny pozostać na lodzie we wstępnie oznaczonej probówce, dopóki nie będą gotowe do następnego kroku. Podczas pracy z ciekłym azotem należy zawsze nosić środki ochrony osobistej, takie jak okulary ochronne, ochrona rąk i fartuchy laboratoryjne.Aby zmaksymalizować naszą zręczność, często nosimy parę białych rękawiczek termicznych wciśniętych między dwie pary rękawiczek nitrylowych. Często zmieniaj rękawice zewnętrzne i nitrylowe, ponieważ łatwo się rozrywają po wystawieniu na działanie ciekłego azotu. W naszym laboratorium przenosimy porcję ciekłego azotu do małego pięciolitrowego pojemnika na ciekły azot.Ciekły azot wlewa się następnie do probówki o pojemności 50 ml, która została wstępnie schłodzona na suchym lodzie. Gdy probówka o pojemności 50 ml jest napełniona ciekłym azotem, powoli, kroplami, dodajemy ekstrakt drożdżowy do probówki w odstępach co 1,5 mililitra. Aby zminimalizować tworzenie się dużych granulek popcornu, zawiesinę drożdży dodaje się ruchem okrężnym.Aby jeszcze bardziej zapobiec tworzeniu się dużych granulek popcornu, używamy dużych kleszczy, aby upewnić się, że wszystkie granulki mają średnicę od 0,3 do 0,5 centymetra. Ponieważ ciekły azot zawsze paruje, należy ponownie napełnić probówkę ciekłym azotem przed dodaniem każdej 1,5 mililitra podwielokrotności zawiesiny drożdży. Gdy cała zawiesina drożdży zostanie przekształcona w popcorn, pozwól tubce z popcornem siedzieć bez pokrywki przez dwie do trzech minut, aby cały pozostały ciekły azot odparował.Aby mieć pewność, że cały ciekły azot wyparował, zamknij pokrywkę prawie całkowicie i delikatnie wstrząśnij. Jeśli słychać syczenie, oznacza to, że ciekły azot nie wyparował jeszcze w pełni. Otwórz pokrywkę na kolejną minutę, aby pozostały ciekły azot odparował przed szczelnym zamknięciem pokrywy.Pozostałości cieczy w rurce mogą spowodować wybuch, jeśli pokrywa zostanie przedwcześnie zamknięta. Ten popcorn drożdżowy może być przechowywany prawie w nieskończoność w temperaturze minus 80 stopni C. W przypadku co najmniej pięciu próbek upewnij się, że masz do dyspozycji od 30 do 35 litrów ciekłego azotu. Napełnij młynek zamrażarki do pełnej linii i zamknij pokrywę, aby młynek zamrażarki mógł się wstępnie schłodzić przez kilka minut.Ponownie, zawsze pamiętaj o noszeniu osobistego sprzętu ochronnego, gdy masz do czynienia z ciekłym azotem. Fiolki do mielenia z poliwęglanu, zaślepki końcowe ze stali nierdzewnej i pręt udarowy muszą być wstępnie schłodzone ciekłym azotem. Trzymaj te składniki zanurzone, aż ciekły azot przestanie bulgotać.Pamiętaj, aby wszystkie próbki popcornu przechowywać na suchym lodzie do momentu zakończenia całego procesu mielenia. Wyciągnij cały ciekły azot z fiolek do mielenia i przenieś popcorn do fiolki. Nie zapomnij również umieścić magnetycznego pręta udarowego w fiolce do mielenia.Uszczelnij fiolkę do mielenia, ostrożnie umieszczając zatyczkę ze stali nierdzewnej równomiernie na końcu fiolki do mielenia. Uderzamy każdym końcem fiolki do mielenia o drewnianą płytę stykową z gumowym podkładem pochłaniającym wibracje, aby upewnić się, że zaślepki końcowe są prawidłowo umieszczone i szczelnie uszczelniają fiolki do mielenia. Ważne jest, aby zabezpieczyć zaślepki końcowe, aby upewnić się, że nie poluzują się i nie pozwolą na rozlanie próbek w młynie zamrażarkowym podczas procesu mielenia.Umieść fiolkę do mielenia w komorze mielenia młyna zamrażarki i zablokuj na miejscu. Zamknij pokrywę młynka zamrażarki i miel próbkę przez trzy cykle po dwie minuty na cykl, z szybkością rozdrabniania 14. Po zakończeniu cykli mielenia odblokuj fiolkę z zamrożonym lizatem komórek w proszku.Aby zapobiec rozmrożeniu się lizatu, pracuj szybko i ostrożnie, aby odkręcić jedną z zaślepek końcowych za pomocą narzędzia do otwierania. Po otwarciu fiolki zdejmij pręt udarowy i szybko przenieś zamrożony ekstrakt w proszku na wstępnie schłodzone plastikowe naczynie wagowe. Odzyskaj jak najwięcej zamrożonego ekstraktu, uderzając fiolką w drewnianą deskę do krojenia chleba.Po usunięciu całego proszku z fiolki należy szybko przenieść wszystkie ekstrakty w proszku do wstępnie oznakowanej probówki o grubości 15 mil przechowywanej na suchym lodzie. Chociaż najlepiej jest od razu przystąpić do rozmrażania i stosowania ekstraktów, aby zminimalizować degradację białka, zamrożony lizat w proszku można przechowywać przez noc w temperaturze minus 80, jeśli zajdzie taka potrzeba. Powoli rozmrażaj lizat w proszku w zawiesinie lodu, która jest stale krążąca za pomocą mieszadła magnetycznego w wiadrze na lód.Aby ułatwić równomierne rozmrażanie, usuwaj lód, który często tworzy się na zewnątrz rurek, mniej więcej co pięć minut. Gdy ekstrakty zaczną się rozmrażać w koktajlu 1X inhibitora proteazy i 10 mikromolowym inhibitorze proteasomu MG132, aby zapobiec degradacji białek. Po całkowitym rozmrożeniu próbek, co może zająć ponad godzinę, należy je odwirowywać w temperaturze 3 220 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ten wir usunie większość resztek komórkowych z lizatu. Po zakończeniu wirowania przenieś supernatant do butelek z poliwęglanu, które zostały wstępnie schłodzone na lodzie i wyrzuć granulki. Odwirować supernat i próbki w temperaturze 16 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut w celu sklarowania ekstraktu.Po zakończeniu wirowania należy ostrożnie odzyskać tylko klarowny supernatant ze środka kolumny cieczy, nie naruszając mętnej warstwy zawierającej kawałek na górze lub granulowanych zanieczyszczeń na dnie probówki wirówkowej. Przenieś klarowny lizat do świeżej, wstępnie schłodzonej probówki o grubości 15 mil. Pozostałą mętną ciecz można ponownie odwirowywać przez pięć minut z tą samą prędkością, aby umożliwić odzyskanie większej ilości lizatu hurtowego.Ekstrakty są teraz gotowe do użycia w eksperymentach, takich jak oczyszczanie kompleksów białkowych i immunoprecypitacja. Porównaliśmy dwie różne metody lizy komórek drożdży, a mianowicie mielenie kulek szklanych w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zautomatyzowaną metodę mielenia kriogenicznego w temperaturze minus 196 stopni Celsjusza, aby ocenić względnie odzyskane białka i ekstrakty komórkowe przygotowane obiema metodami. Z tego badania zdecydowaliśmy się użyć pączkującego szczepu drożdży przenoszącego plazmid o wysokiej kopii wyrażający ubikwitynę oznaczoną tandemem HIS-MYC.Możemy więc ocenić powinowactwo do odzyskiwania znakowanych białek poliubikwitynowanych z ekstraktów hurtowych, po oczyszczeniu powinowactwa za pomocą kulek powinowactwa TALON kobalt HIS tag, a następnie Western blot z monoklonalnym przeciwciałem HIS Tag. Białka poliubikwitynowane, które zwykle są bardzo krótkotrwałe ze względu na ich szybką degradację przez maszynerię proteasomów ubikwityny, a tym samym stanowią bardzo dobry sposób na porównanie jakości ekstraktów hurtowych przygotowanych różnymi metodami. Jak widzimy na prawej połowie barwionej błony Ponceau, uzyskaliśmy wyższą całkowitą wydajność białka w ekstraktach hurtowych przygotowanych za pomocą protokołu młyna do zamrażania kriogenicznego, co oceniano na podstawie bardziej intensywnego barwienia Ponceau na całym pasie ekstraktu hurtowego.Jest to szczególnie widoczne w dolnej i górnej części młyna zamrażalniczego, gdzie całe tory ekstrakcji są widoczne. Dodatkowo, jak pokazuje prawa połowa znacznika HIS Western blot, zaobserwowaliśmy lepsze odzyskiwanie ubikwitynowanego białka znacznika HIS-MYC, a następnie ściąganie w dół za pomocą kulek Talon z hurtowych ekstraktów przygotowanych przez mielenie kriogeniczne. Dochodzimy do wniosku, że kriogeniczny młyn zamrażarkowy jest lepszy od innych metod przygotowania ekstraktów komórkowych, zwłaszcza gdy do dalszego zastosowania wymagane są funkcjonalne makrocząsteczki.

preparation-cell-extracts-cryogrinding-an-automated-freezer

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Źródło: Wiegand, D. J., et al. Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Vibrio natriegens, szybko rosnącej bakterii znanej z wysokiej szybkości syntezy białek. Osad bakteryjny jest myty i ponownie zawieszany w buforze do lizy przed sonikacją na lodzie, aby zapobiec degradacji komórek. Lizat jest odwirowywany w celu oddzielenia nierozpuszczalnych szczątków komórkowych, a...

Przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego z Vibrio natriegens

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Metoda rozdrabniania kriogenicznego do przetwarzania mysich łap za pomocą młyna zamrażającego ciekły azot została opracowana w celu poprawy wydajności i jakości RNA lub białka ekstrahowanego z tkanek i umożliwienia analizy profili molekularnych związanych z reakcjami zapalnymi.

Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem

Prezentowany tutaj jest protokół hodowli komórek na membranach z azotku krzemu i zamrażania wgłębnego przed obrazowaniem fluorescencji rentgenowskiej za pomocą synchrotronowej kriogenicznej nanosondy rentgenowskiej. Gdy zapewniona jest tylko nanoanaliza w temperaturze pokojowej, zamrożone próbki można dalej liofilizować . Są to kluczowe kroki w celu uzyskania informacji na temat wewnątrzkomórkowego składu pierwiastków.

Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Naucz się metody kriomielenia komórek drożdży w automatycznym młynie zamrażarkowym, aby uzyskać ekstrakty z zachowaniem integralności białek. Technika ta zapewnia wysoką wydajność izolacji funkcjonalnych makrocząsteczek.

Przygotowanie ekstraktów komórkowych metodą kriomielenia w automatycznym młynie zamrażarkowym

Przeglądaj więcej filmów