Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

Szybka izolacja tkanek OUN, w tym opon mózgowych, pozwala na kompleksową analizę fenotypu, funkcji i lokalizacji komórek odpornościowych w warunkach homeostatycznych i patogennych. Dwie zademonstrowane metody pozwalają na szybką ekstrakcję tkanek OUN wraz z oponami mózgowymi, co jest idealne do dalszej analizy przy użyciu technik jednokomórkowych i metod histologicznych. Chociaż reprezentatywne wyniki koncentrują się na analizie komórek odpornościowych, te dwie metody można wykorzystać do analizy komórek rezydujących w OUN, w tym mikrogleju, astrocytów, perycytów, komórek śródbłonka, komórek zrębu i neuronów.

Zacznij od wyizolowania próbek mózgu i rdzenia kręgowego od myszy poddanych eutanazji. Po zdjęciu głowy wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry i odwróć je nad oczami, aby uwolnić czaszkę. Przeciąć kość nosową, aby uwolnić żuchwę od czaszki.

Następnie usuń żuchwę, język i oczy. Przeciąć wzdłuż bocznych aspektów czaszki, aby uwolnić tkankę wzdłuż zewnętrznego przewodu słuchowego i przyciąć ją. Aby pobrać próbkę rdzenia kręgowego, oddziel klatkę piersiową od kręgosłupa, przecinając równolegle do kręgosłupa ostrymi nożyczkami.

Wykonaj małe nacięcie w dolnej części odcinka lędźwiowego, aby odizolować kręgosłup, a następnie przytnij i usuń pozostały mięsień wzdłuż kręgosłupa, aby odsłonić kręgi. Podczas wykonywania odwapnienia należy codziennie sprawdzać kość, aby określić, czy jest miękka i giętka. Usuń tkankę z roztworu EDTA za pomocą kleszczy, umieść ją na szalce Petriego i delikatnie przetestuj miękkość kości za pomocą igły o rozmiarze 25.

Jeśli igła z łatwością wbije się w kość, proces odwapniania jest zakończony. Aby wydobyć czapkę czaszki w mózgu, wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry i odwróć skórę nad oczami. Umieść nożyczki w otworze wielkim i zacznij ciąć czaszkę bocznie wzdłuż kory w kierunku opuszki węchowej, utrzymując nacięcia nad zewnętrznym przewodem słuchowym i żuchwą.

Wykonaj te same nacięcia po przeciwnej stronie z nacięciami spotykającymi się przy opuszce węchowej, aby uwolnić czapkę czaszki z mózgu. Za pomocą kleszczy odklej nasadkę czaszki i umieść ją w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej pięć mililitrów zimnego podłoża RPMI uzupełnionego 25-milimolowym HEPES. Umieść zakrzywione kleszcze poniżej podstawy mózgu i podnieś je, aby uwolnić mózg z czapeczki czaszki.

Wyciągnij kręgosłup i tkankę rdzenia kręgowego, przecinając równolegle do kręgosłupa, aby oddzielić klatkę piersiową od kręgosłupa. Następnie wykonaj małe nacięcie w dolnej części odcinka lędźwiowego, aby odizolować kolumnę kręgów. Przytnij i usuń pozostały mięsień wzdłuż kręgosłupa, aby odsłonić kręgi.

Następnie umieść bardzo cienkie nożyczki chirurgiczne w kręgosłupie i przetnij wzdłuż bocznej krawędzi kolumny. Całkowicie odetnij przeciwległą krawędź boczną, aby podzielić kręgosłup na część przednią i tylną. Za pomocą kleszczy powoli i ostrożnie oderwij rdzeń kręgowy od kręgosłupa i umieść go w 15-mililitrowej stożkowej rurce zawierającej pięć mililitrów zimnego RPMI z 25-milimolowym HEPES.

Następnie przenieś przednią i tylną część kręgosłupa do innej rurki. Aby usunąć opony mózgowe z czapeczki czaszki, wyjmij nasadkę czaszki z podłoża RPMI i użyj ostrych kleszczy, aby naciąć wokół zewnętrznej krawędzi. Oderwij opony mózgowe od krawędzi czapeczki czaszki, zeskrobując je w celu usunięcia opon oponowych opon twardych i pajęczynówkowych i umieść opony mózgowe na szalce Petriego.

Aby usunąć opony mózgowe z kręgosłupa, wyjmij kolumnę z pożywki i naciąć krawędzie kręgosłupa ostrymi kleszczami, aby uwolnić opony. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby oderwać opony mózgowe od krawędzi kręgów i umieść opony mózgowe na szalce Petriego. Umieść sitko z nylonowej siatki w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów.

Aby utworzyć zawiesinę komórkową, przenieś opony mózgowe do sitka i dodaj trzy mililitry RPMI uzupełnionego HEPES, a następnie użyj tłoka z pięciomililitrowej strzykawki, aby zmielić tkankę i pożywkę przez sitko. Wlej tkankę mózgu lub rdzenia kręgowego z pożywką do 100-milimetrowej szalki Petriego i użyj kleszczy, aby przesunąć tkankę na dno. Zmiel tkankę mózgową sterylną żyletką i zbierz tkankę na dnie płytki.

Dodaj trzy mililitry RPMI uzupełnione 10% FCS do szalki Petriego, a następnie użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ponownie zawiesić tkankę w pożywce i przenieść ją do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj kolagenazę typu 1 i DNazę 1 do tkanki i inkubuj probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut. Odwracaj probówki co 15 minut, aby dokładnie wymieszać tkankę z enzymami.

Po inkubacji dodaj EDTA do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01 mola i inkubuj probówki przez dodatkowe pięć minut, aby dezaktywować kolagenazę. Dodaj dziewięć mililitrów RPMI uzupełnionych 10% FCS do każdej probówki, a następnie odwiruj probówki w temperaturze 450 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj pipety Pasteura z próżnią, aby zassać supernatant, uważając, aby nie dotknąć osadu komórkowego.

Dodaj trzy mililitry 100% roztworu gradientu gęstości izotonicznej do osadu komórkowego, a następnie dodaj dodatkowe podłoże RPMI 10% FCS, aby doprowadzić końcową objętość do 10 mililitrów i ponownie zawiesić osad komórkowy. Odwróć i dobrze wymieszaj probówkę, a następnie włóż pipetę serologiczną z jednym mililitrem 70% roztworu gradientu gęstości izotonicznej do dna probówki. Powoli podkładaj roztwór, uważając, aby nie zrobić pęcherzyków.

Wyjmij pipetę serologiczną z probówki, uważając, aby nie naruszyć gradientu. Odwirować probówkę o stężeniu 800 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odessać supernatant, w tym warstwę resztek mieliny, aż w probówce pozostaną dwa do trzech mililitrów. Użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby zebrać warstwę komórek między gradientem gęstości od 30% do 70% i przenieść ją do nowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Dodaj pożywkę RPMI 10% FCS, aby doprowadzić końcową objętość do 15 mililitrów, a następnie odwiruj komórki w temperaturze 450 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Protokół ten został wykorzystany do oceny limfocytów B i T w oponach mózgowych, mózgu i rdzeniu kręgowym podczas postępującego stwardnienia rozsianego. Bramkowanie przeprowadzono w celu odróżnienia naciekających komórek odpornościowych CD45 o wysokim pochodzeniu obwodowym od neuronów, astrocytów i oligodendrocytów CD45 o niskiej zawartości mikrogleju i CD45.

Niewiele komórek o wysokiej zawartości CD45 było obecnych w rdzeniu kręgowym i tkance mózgowej myszy leczonych pozorowanie. To samo odcięcie bramkowania dla wysokiej ekspresji CD45 zastosowano w oponach mózgowych w celu identyfikacji komórek o wysokiej odporności CD45 i wykluczenia komórek nieimmunologicznych. We wszystkich tkankach ośrodkowego układu nerwowego TMEV-IDD zaobserwowano zwiększony odsetek komórek odpornościowych o wysokiej zawartości CD45 w porównaniu z myszami leczonymi pozorami.

Podczas przewlekłego TMEV-IDD odsetek limfocytów B wśród komórek odpornościowych o wysokiej zawartości CD45 w mózgu i rdzeniu kręgowym był wyższy w porównaniu z przedziałem oponowym. Odwapnione mózgi i rdzeń kręgowy zobrazowano w celu zidentyfikowania lokalizacji komórek B i T w przedziale OUN. Konwencjonalne pobranie mózgu z pokrywy czaszki spowodowało powstanie nienaruszonej warstwy pia, ale pozostałe warstwy opon mózgowych zostały wykluczone.

Zarówno w odwapnionych mózgach, jak i rdzeniu kręgowym, wszystkie warstwy opon mózgowych były nienaruszone. Limfocyty B i limfocyty T przełączane izotypem były zlokalizowane odpowiednio z ekspresją IgG i CD3. Współbarwienie IgG z ER-TR7 ujawniło, że limfocyty B były obecne w miąższu OUN i oponach mózgowych, podczas gdy agregaty komórkowe w oponach mózgowo-dodatnich ER-TR7 zawierały wiele IgG dodatnich limfocytów B i limfocytów T CD3-dodatnich.

Kluczowym krokiem w tych protokołach jest staranna ekstrakcja tkanek OUN, niezbędna do poprawy czystości zawiesin pojedynczych komórek i uzyskania tkanki histologicznej o wysokiej jakości morfologii. Opisane techniki pozwalają na kompleksową analizę komórek zajmujących przedział OUN, idealną do badania fenotypu, funkcji i lokalizacji komórek w homeostazie i podczas patogenezy choroby.