Name: Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj metody modelowania chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans. Wykorzystaj nicienie do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych neurodegeneracji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Chaniotakis M. i Kounakis K. za nagranie i edycję wideo. K.P. jest finansowany z grantu Greckiej Fundacji Badań i Innowacji (HFRI) oraz Sekretariatu Generalnego ds. Badań i Technologii (GSRT). N.T. jest finansowany z grantów Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC – GA695190 – MANNA), Programów Ramowych Komisji Europejskiej, oraz greckie Ministerstwo Edukacji.

1. Martwicza śmierć komórek wywołana przez nadpobudliwe kanały jonowe
UWAGA: Mutacje zwiększające funkcjonalność w rodzinie genów degeneryn, w tym między innymi mec-4 i deg-3, powodują generowanie nadpobudliwych kanałów jonowych, które powodują martwiczą śmierć komórek sześciu neuronów receptora dotyku wymaganych do mechanosensacji u robaków3. Nekroza wywołana nieprawidłową stymulacją degeneryn wykazuje kilka mechanistycznych i morfologicznych podobieństw do ekscytotoksyczności u ssaków. Utrzymanie metabolizmu energetycznego i homeostazy wapnia odgrywa kluczową rolę w przeżywalności neuronów podczas martwicy11. Następujące szczepy mogą być używane do monitorowania martwiczej śmierci komórek wywołanej przez nadaktywne kanały jonowe, mec-4(u231)X i deg-3(u662)V.
<ol>
	<li>Utrzymanie, synchronizacja i przygotowanie zmutowanych robaków do badania martwiczej śmierci komórek
	<ol>
		<li>Dzień 1: Wybierz larwy L4 zmutowanych nicieni mec-4 (u231) lub deg-3 (u662) na pożywkę wzrostu nicieni (NGM; Tabela 1) płytki wysiane Escherichia coli (OP50) za pomocą stereomikroskopu preparacyjnego.</li>
		<li>Umieść 10 nicieni L4 na wysiewanej płytce NGM i hoduj je w standardowej temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Dzień 5: Umyj płytki 1 ml buforu M9 (Tabela 1) i zbierz zwierzęta do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Wirować przy 10 000 x g przez 30 s i usunąć supernatant.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml roztworu wybielającego (7 mlH2O, 1 ml 5 N NaOH i 2 ml wybielacza). 
		UWAGA: Roztwór wybielający stopniowo traci swoją skuteczność; dlatego należy go przygotowywać codziennie.</li>
		<li>Wiruj i monitoruj okresowo, aż robaki się rozpuszczą. 
		UWAGA: Unikaj wybielania przez okres dłuższy niż 5 minut, ponieważ wpłynie to na żywotność zarodków.</li>
		<li>Wirować przy 10 000 x g przez 30 s i usunąć supernatant.</li>
		<li>Umyć dwukrotnie osadki (jaja) 1 ml buforu M9.</li>
		<li>Po umyciu jaja ponownie zawiesić w 200 μl buforu M9 i inkubować je przez 25 minut w temperaturze 34 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Utrzymywać oddzielną grupę próbek kontrolnych (jaja) w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Odpipetować 100 μl jaj kontrolnych lub poddanych szokowi termicznemu i umieścić je na niewysiewanych płytkach NGM. Każdy talerz zawiera co najmniej 100-200 jaj.</li>
		<li>Jaja inkubowały się w temperaturze 20 °C aż do wyklucia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż larw L1 do badania za pomocą różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC; Nomarsky) mikroskopia
	<ol>
		<li>Przygotuj 2% płatki agarozowe.</li>
		<li>Użyj 1 ml buforu M9 do umycia płytek i zbierz larwy L1 nicienie do probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Wirować przy 10 000 x g przez 30 s.</li>
		<li>Usunąć supernatant i zachować osad (nicienie).</li>
		<li>Dodać 100 μl 20 mM buforu M9/lewamizolu, aby znieczulić nicienie. 
		UWAGA: Unikaj azydku sodu jako środka znieczulającego. Azydek sodu wyzwala uszkodzenia mitochondriów i stres oksydacyjny, co ostatecznie prowadzi do indukcji śmierci komórki</li>
		<li>Odpipetować 10 μl buforu M9/lewamizolu zawierającego robaki L1 i umieścić je na 2% płatkach agarozowych (Tabela 1).</li>
		<li>Delikatnie umieścić szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki. 
		UWAGA: Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zachować wilgotność przez cały proces obrazowania.</li>
		<li>Obserwuj robaki za pomocą różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC; Nomarsky) mikroskopia.</li>
		<li>Oceń neurodegenerację sześciu neuronów receptora dotyku, licząc komórki o charakterystycznym wakuolizowanym wyglądzie na nicienie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Neurodegeneracja wywołana agregatem białkowym
UWAGA: Następujące szczepy mogą być użyte do zbadania neurotoksyczności wywołanej przez agregaty białkowe: (A) nadekspresja ludzkiej α-synukleiny w neuronach dopaminergicznych, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] i (B) nadekspresja ludzkiego białka poliglutaminy (PolyQ) pan-neuronalnie, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
<ol>
	<li>Utrzymanie, synchronizacja i przygotowanie nicieni transgenicznych do badania neurodegeneracji
	<ol>
		<li>Użyj mikroskopu stereoskopowego do monitorowania rozwoju i wzrostu C. elegans.</li>
		<li>Dzień 1: Zsynchronizuj populację nicieni transgenicznych, wybierając i przenosząc 15-20 larw L4 z każdego szczepu na świeżo wysiane płytki NGM z nasionami OP50. 
		UWAGA: Użyj co najmniej trzech płytek z każdego szczepu na warunek.</li>
		<li>Przeprowadzić inkubację i pozwolić nicieniom rosnąć w standardowej temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Dzień 2: Przeprowadzać codzienne kondycjonowanie wstępne przez 30 minut, przenosząc płytki do inkubatora ustawionego na temperaturę 34 °C. Następnie należy zwrócić wstępnie przygotowane nicienie z powrotem do standardowej temperatury 20 °C. 
		UWAGA: Różne tła genetyczne mogą być wrażliwe na wysoką temperaturę przez długi czas.</li>
		<li>(A) Jeśli badasz nadekspresję ludzkiej α-synukleiny w neuronach dopaminergicznych, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: w dniu 9 monitoruj 7-dniowe nicienie transgeniczne pod kątem śmierci dopaminergicznej komórki neuronalnej.</li>
		<li>(B) Jeśli badasz nadekspresję ludzkiego białka poliglutaminy (PolyQ) panneuronalnie, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: w dniu 5 zmierz neuronalne agregaty PolyQ w obszarze głowy 4-dniowych zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję Q40::YFP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż próbek do badania mikroskopowego
	<ol>
		<li>Przygotuj 2% płatki agarozowe (Tabela 1).</li>
		<li>Dodać 10 μl 20 mM kropli buforowej M9/lewamizolu na środek podkładki agarozowej.</li>
		<li>Wybierz odpowiednie nicienie transgeniczne i przenieś je w kropli M9/lewamizolu. 
		UWAGA: Umieść 20-30 nicieni w kropli.</li>
		<li>Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na wierzch próbki. 
		UWAGA: Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zachować wilgotność przez cały proces obrazowania.</li>
		<li>Przystąp do badania mikroskopowego odpowiednich próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proces akwizycji i analiza danych dotyczących transgenicznych nicieni wykazujących współekspresję α-synukleiny i cytozolowego GFP w neuronach dopaminergicznych
	<ol>
		<li>Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego połączonego z kamerą (np. EVOS FL Auto 2).</li>
		<li>Wykrywaj i rejestruj obrazy obszaru głowy w z-stacku przy 20-krotnym powiększeniu.</li>
		<li>Zapisuj i zbieraj obrazy projekcji o maksymalnej intensywności.</li>
		<li>Przejdź do analizy pozyskanych obrazów.</li>
		<li>Zbadaj transgeniczne robaki pod kątem neurodegeneracji, oceniając następujące cechy komórkowe: (i) utrata fluorescencji z neuronów wyrażających GFP pod promotorem dat-1, (ii) neurony wykazujące pęcherzyki somy i / lub aksonów, wyrostki lub utratę dendrytyki.</li>
		<li>Importuj i analizuj dane za pomocą pakietu oprogramowania (np. Excel).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Proces akwizycji i analiza danych transgenicznych nicieni wykazujących panneuronalną ekspresję PolyQ40 połączonego z YFP
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego połączonego z kamerą (np. EVOS FL Auto 2).</li>
	<li>Wykrywaj i rejestruj obrazy obszaru głowy w z-stacku przy 20-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Zapisuj i zbieraj obrazy projekcji o maksymalnej intensywności.</li>
	<li>Przejdź do analizy uzyskanych obrazów za pomocą oprogramowania Fiji.</li>
	<li>Otwórz obrazy za pomocą Fiji program14.</li>
	<li>Wybierz polecenie Podziel kanały za pomocą menu rozwijanego Obraz i kolor. 
	UWAGA: Zachowaj zielony obraz kanału.</li>
	<li>Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby ręcznie ustawić obszar zainteresowania fluorescencyjny (ROI; np. głowa).</li>
	<li>Dodaj odpowiedni zwrot z inwestycji w Menedżerze zwrotu z inwestycji za pomocą menu rozwijanego Analiza i narzędzia.</li>
	<li>Odejmij tło do 50%, wybierając Przetwarzaj i Odejmij tło.</li>
	<li>Ustawianie i stosowanie wartości progowych za pomocą polecenia menu Obraz | Dostosuj | Próg. Zachowaj i ustaw te same wartości progowe podczas analizy obrazu w całym eksperymencie.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni zwrot z inwestycji w Menedżerze zwrotu z inwestycji.</li>
	<li>Analizuj liczbę agregatów białkowych za pomocą polecenia menu Analizuj i analizuj cząstki.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.5-3.12 dla każdego uzyskanego obrazu.</li>
	<li>Skopiuj wyświetlane wartości z osobnego okna Wyniki.</li>
	<li>Wklej/importuj i analizuj wyniki za pomocą pakietu oprogramowania.</li>
</ol>
4. Raport analizy statystycznej
<ol>
	<li>Użyj co najmniej 30 nicieni dla każdego warunku doświadczalnego. Wykonać trzy kontrpróby biologiczne.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do analizy statystycznej, aby przeprowadzić test t-Studenta (porównanie między dwiema grupami) lub ANOVA (porównanie między wieloma grupami) do analizy statystycznej z p < 0,05 jako istotnym.</li>
</ol>

<ol><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).</li>
<li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+neuronal+necrosis%3A+rogue+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).</li>
<li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+mechanotransduction%3A+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).</li>
<li>Berkowitz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+C.+elegans+dopamine+neuron+degeneration+assay+for+the+validation+of+potential+Parkinson%27s+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li>
<li>Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+disruption+of+cellular+protein+folding+in+models+of+polyglutamine+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases.</a> Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li>
<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li>
<li>Labbadia, J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of proteostasis in aging and disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).</li>
<li>Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+dopamine+neuron+degeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).</li>
<li>Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+protect+from+heat-stroke-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration.</a> Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).</li>
<li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat+shock+proteins+and+neurodegeneration%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22BioMolecular+Concepts%22%5BJournal%5D)">Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments.</a> BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).</li>
<li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W tym miejscu przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wzrostu, synchronizacji i badania mikroskopowego niektórych wszechstronnych modeli C. elegans badających neurodegenerację zależną od wieku. W szczególności oceniamy i analizujemy komórkowe i molekularne podstawy rozpadu neuronów związanego z wiekiem za pomocą nekrozy wywołanej hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczności wywołanej agregatem białkowym 1,2,3,4,5,7,9,10,11.</s...

Przez ostatnie dwie dekady, C. elegans był szeroko stosowany jako organizm modelowy do badania molekularnych mechanizmów martwiczej śmierci komórek. C. elegans oferuje wyjątkowo dobrze scharakteryzowany i zmapowany układ nerwowy, przezroczystą strukturę ciała oraz różnorodny repertuar metod genetycznych i obrazowych do monitorowania in vivo funkcji komórkowych i przeżycia przez cały okres starzenia się. W związku z tym opracowano już kilka modeli genetycznych neurodegeneracji C. elegans w celu oceny żywotności neuronów. W szczególności dobrze opisane i używane modele nicieni obejmują martwicę wywołaną nadpobudliwym kanałem jonowym1,2,3 oraz śmierć komórki wywołana zwiększoną agregacją białek4,5,6,7,8,9,10 i heat stroke11,12, między innymi.
Krótkotrwała ekspozycja na subletalne temperatury zapewniała odporność na martwiczą śmierć komórki, wywołaną przez późniejszy stres cieplny zarówno u nicieni, jak i u neuronów ssaków11. Co ciekawe, codzienne kondycjonowanie nicieni w łagodnej podwyższonej temperaturze chroni przed neurodegeneracją, która jest wywoływana przez różne bodźce, takie jak brak równowagi jonowej (np. Mec-4(U231) i/lub Deg-3(U662)) i agregacja białek (np. α-synukleina i poliQ40)11,13.
Tutaj opisujemy wszechstronne metodologie wykorzystujące C. elegans do monitorowania i oceny zależnej od wieku neurodegeneracji w dobrze znanych modelach chorób ludzkich, takich jak śmierć komórek wywołana ekscytotoksycznością, choroba Parkinsona i Huntingtona. Ponadto podkreślamy neuroprotekcyjną rolę wstępnego kondycjonowania ciepła w kilku modelach neurodegeneracji. Połączenie tych technik wraz z genetycznymi i/lub farmakologicznymi badaniami przesiewowymi doprowadzi do identyfikacji i scharakteryzowania nowych modulatorów śmierci komórkowej, które mogą mieć potencjalne znaczenie terapeutyczne.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>8,40,004</td><td></td></tr><tr><td>AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwodnienie chlorku wapnia (CaCl2?2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cholesterol SERVA Elektroforeza</td><td>17101.01</td><td></td></tr><tr><td>deg-3(u662)V lub deg-3(d)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Utrzymuj zwierzęta w temperaturze 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Mikroskop DIC (Nomarsky)</td>Mikroskop stereoskopowy <td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Vert A1</td></tr><tr><td></td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td>SMZ645</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>EVOS Cell Imaging Systems</td></tr><tr><td>Escherichia coli Szczep OP50</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greiner Petri naczynia (60 mm x 15 mm)Oprogramowanie</td> do analizy obrazu <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5237</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fidżi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://fiji.sc KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,37,010</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>EMD Milipore</td><td>1,04,873</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>mec-4(u231)X lub mec-4(d)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Utrzymuj zwierzęta w temperaturze 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe (75 mm x 25 mm x 1 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td><td>10 006 12</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nasadkowe mikroskopu (18 mm x 18 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td><td>01 010 30</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania Microsoft Office 2011 Excel</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Milipore</td><td>1,06,586</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka dla nicieni (NGM) Płytki agarowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy nystatyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td>fosforanowy</tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>EMD Milipor</td><td>1,06,40,41,000</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe wyposażenie do przygotowania płytek agarowych ( autoklaw, szalki Petriego itp.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardowe wyposażenie do konserwacji ślimaków (wytrychy z drutu platynowego, inkubatory itp.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie do analizy statystycznej</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Pakiet oprogramowania GraphPad Prism</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetramizolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>UA44: Is[baIn1; pdat-1&alpha;-syn, pdat-1GFP]</td><td></td><td></td><td>Na życzenie: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)</td></tr></tbody></table>

modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Walka z ludzkimi patologiami neurodegeneracyjnymi i zarządzanie ich wszechobecnym wpływem społeczno-ekonomicznym staje się globalnym priorytetem. Pomimo ich szkodliwego wpływu na jakość życia człowieka i system opieki zdrowotnej, większość chorób neurodegeneracyjnych u ludzi nadal pozostaje nieuleczalna i nie można im zapobiec. W związku z tym opracowanie nowatorskich interwencji terapeutycznych przeciwko takim chorobom staje się pilną potrzebą. Związane z wiekiem pogorszenie obwodów i funkcji neuronów jest ewolucyjnie zachowane w organizmach tak różnych, jak niski robak Caenorhabditis elegans i ludzie, co oznacza podobieństwa w podstawowych mechanizmach komórkowych i molekularnych. C. elegans jest wysoce plastycznym modelem genetycznym, który oferuje dobrze scharakteryzowany układ nerwowy, przezroczystość ciała oraz różnorodny repertuar technik genetycznych i obrazowych do oceny aktywności neuronalnej i kontroli jakości podczas starzenia się. W tym miejscu przedstawiamy i opisujemy metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywnymi kanałami jonowymi (np. Deg-3 (d) i MEC-4 (d)) oraz neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym (np. α-syuncleiną i poliglutaminianem), w celu monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw rozpadu neuronów związanego z wiekiem. Połączenie tych zwierzęcych modeli neurodegeneracji wraz z genetycznymi i farmakologicznymi badaniami przesiewowymi modulatorów śmierci komórkowej doprowadzi do bezprecedensowego zrozumienia związanego z wiekiem załamania funkcji neuronów i dostarczy krytycznych informacji o szerokim znaczeniu dla zdrowia i jakości życia ludzi.

Nekroza komórek wywołana przez nadaktywne kanały jonowe 
Stosując przedstawione tutaj procedury, embriony mutantów mec-4(u231) oraz deg-3(u662) inkubowano przez 25 min w temperaturze 34 °C lub utrzymywano w standardowej temperaturze 20 °C. Po wykluciu określono liczbę martwych komórek neuronalnych w stadium larwalnym L1 w obu grupach. Nekroza komórek jest ograniczona u nicieni wyklutych z jaj poddanych wstępnemu przygotowaniu w formie szoku termicznego (Rysunek 1...

Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

W ciągu ostatnich dziesięcioleci długość życia człowieka uległa wydłużeniu dzięki poprawie standardu życia i postępowi w naukach medycznych. Wiek jest największym czynnikiem ryzyka wielu chorób zagrażających życiu, w tym zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona. W tym miejscu demonstrujemy metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne nowe modele metod, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywnymi kanałami jonowymi i agregacje białkowe indukujące neurotoksyczność, w celu monitorowania i analizowania komórkowego mechanizmu molekularnego degeneracji neuronów.Szczyt zdrowych larw składa się z czterech i trzech nicieni Newtona na pożywce wzrostu nicieni, przesiewając z E. Coli za pomocą mikroskopu stereoskopowego do preparacji. Umieść dziesięć i cztery nicienie, płytkę z enzymami pasożytniczymi i hoduj je w standardowej temperaturze 20 stopni Celsjusza. Pięć dni później umyj płytkę 1 ml i 9 buforem i zbierz zwierzęta do probówki o pojemności 1,5 ml.Odwirować przy 30 000 g przez 30 sekund i usunąć supernatant. Dodać 0,5 ml roztworu galwanicznego. Roztwór galwaniczny jest przechowywany w temperaturze pokojowej.Wiruj i monitoruj okresowo, aż wszystkie się rozpuszczą. Unikaj powlekania przez okres dłuższy niż pięć minut. Odwirować przy 10 000 g przez 30 sekund i usunąć supernatant.Umyj dwukrotnie paletę 1 ml i dziewięcioma. Wirować przy 10000 g przez 30 sekund i usunąć supernatant. Po umyciu ponownie zawieś jaja w 200 mikrolitrach buforu M9 i inkubuj je przez 25 minut w temperaturze 34 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.Utrzymuj oddzielną grupę jaj w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Odpipetować 100 mikrolitrów zawierających jaja kontrolne lub poddane szokowi cieplnemu i umieścić je na nieobsianej płytce 10 GN. Każdy talerz zawiera co najmniej 100 do 200 jaj.Wysiaduj jaja w temperaturze 20 stopni Celsjusza aż do wyklucia. Użyj buforu M9 do mycia płytek i zbierania życia L1 i nicieni w probówce o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 10 000 g przez 30 sekund.Usuń supernatant i zachowaj paletę. Dodaj 100 mikrolitrów 20-milimolowego buforu lewangialnego M9, aby znieczulić nicienie. Odpipetuj 10 mikrolitrów buforu lewangialnego M9, zawierającego L1, obserwuj i zamontuj je w 2% miejscu agar-ls, delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki.Obserwuj zegarek za pomocą mikroskopii DIC. Skanowanie degeneracji 630 neuronów receptorowych poprzez zliczanie komórek z charakterystycznym wirtualnym wspomaganym wyglądem tego nicienia. Zsynchronizuj nicienie, wybierając i przenosząc od 15 do 20 larw L4 każdego szczepu najpierw na płytki bakterii C, a następnie GMO.Inkubuj i pozwól nicieniom rosnąć w standardowej temperaturze 20 stopni Celsjusza. Przeprowadzaj codzienne przygotowanie do przygotowania przez 30 minut, przenosząc płytki do inkubatora ustawionego na 34 stopnie Celsjusza. Następnie zwróć wstępnie przygotowane nicienie z powrotem do standardowej temperatury 20 stopni Celsjusza.Dodaj 10 mikrolitrów 20-milimolowej kropli buforowej M9 levangial w środku plamki agar-ls. Wybierz odpowiednie nicienie transgeniczne i przenieś je w kropli levangial M9. Umieść od 20 do 30 nicieni na kroplę.Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zachować wilgotność przez cały proces obrazowania. Korzystając z mikroskopu fluorescencyjnego połączonego z kamerą, wykryj i uchwyć badane obrazy obszaru głowy w 20-krotnym powiększeniu.Monitoruj przez siedem dni transgeniczne nicienie pod kątem śmierci dopaminergicznych komórek neuronalnych. Zmierz neuronalne agregaty policulalne w okolicy głowy czterodniowych zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję fuzji 240 z żywymi ludźmi. Martwicza śmierć komórek wywołana nadpobudliwą substancją kanałów jonowych jest najczęstszą przyczyną u nicieni, które wcześniej warunkują jaja przed szokiem cieplnym.Kondycjonowanie wstępne szoku cieplnego, promujące przewidywanie śmierci komórek wywołanej alfa-synukleiną u siedmiodniowego dorosłego hermafrodyty i zmniejsza agregaty białka Q40 w okolicy głowy czterodniowych dorosłych. Starzenie się jest konsekwencją uszkodzeń spowodowanych stopniową degeneracją homeostazy komórkowej i tkankowej. W związku z tym zrozumienie manipulacji związanym z wiekiem załamaniem neuronów jest priorytetem.Zaprezentowane techniki w połączeniu z genetycznymi i farmakologicznymi badaniami przesiewowymi mogą doprowadzić do powiadomienia o prawidłowych modulatorach śmierci komórkowej o potencjalnym znaczeniu terapeutycznym.

modeling-age-associated-neurodegenerative-diseases-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

Celem przedstawionej tutaj metody jest zbadanie agregacji białek podczas normalnego starzenia się w modelowym organizmie C. elegans. Protokół stanowi potężne narzędzie do badania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów, które tworzą się wraz z wiekiem i do określenia, w jaki sposób zmiany w proteostazie wpływają na agregację białek.

Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół prostej izolacji określonych grup żywych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne z transgenicznych linii Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia różnorodne badania ex vivo skoncentrowane na konkretnych neuronach i ma zdolność izolowania komórek do dalszej krótkoterminowej hodowli.

Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje dwa czułe testy do rozróżniania między łagodnym, umiarkowanym i ciężkim upośledzeniem motorycznym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans, z ogólną użytecznością dla szczepów C. elegans, ze zmienioną ruchliwością.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

W tym wywiadzie dr Lindquist opisuje zależności między fałdowaniem białek, chorobami prionowymi a zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Problem fałdowania białek stanowi centrum współczesnej biologii. Oprócz swoich tradycyjnych funkcji biochemicznych, białka mogą pośredniczyć w przekazywaniu informacji biologicznych, a zatem mogą być uznane za materiał genetyczny. Ta niedawno odkryta funkcja białek ma istotne znaczenie dla badań nad zaburzeniami u ludzi. Dr Lindquist opisuje również aktualne...

Wywiad: Fałdowanie białek i badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Poznaj metody modelowania chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans. Wykorzystaj nicienie do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych neurodegeneracji.

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów