Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans
15 sierpnia 2020
Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci długość życia człowieka uległa wydłużeniu dzięki poprawie standardu życia i postępowi w naukach medycznych. Wiek jest największym czynnikiem ryzyka wielu chorób zagrażających życiu, w tym zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona. W tym miejscu demonstrujemy metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne nowe modele metod, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywnymi kanałami jonowymi i agregacje białkowe indukujące neurotoksyczność, w celu monitorowania i analizowania komórkowego mechanizmu molekularnego degeneracji neuronów.
Szczyt zdrowych larw składa się z czterech i trzech nicieni Newtona na pożywce wzrostu nicieni, przesiewając z E. Coli za pomocą mikroskopu stereoskopowego do preparacji. Umieść dziesięć i cztery nicienie, płytkę z enzymami pasożytniczymi i hoduj je w standardowej temperaturze 20 stopni Celsjusza. Pięć dni później umyj płytkę 1 ml i 9 buforem i zbierz zwierzęta do probówki o pojemności 1,5 ml.
Odwirować przy 30 000 g przez 30 sekund i usunąć supernatant. Dodać 0,5 ml roztworu galwanicznego. Roztwór galwaniczny jest przechowywany w temperaturze pokojowej.
Wiruj i monitoruj okresowo, aż wszystkie się rozpuszczą. Unikaj powlekania przez okres dłuższy niż pięć minut. Odwirować przy 10 000 g przez 30 sekund i usunąć supernatant.
Umyj dwukrotnie paletę 1 ml i dziewięcioma. Wirować przy 10000 g przez 30 sekund i usunąć supernatant. Po umyciu ponownie zawieś jaja w 200 mikrolitrach buforu M9 i inkubuj je przez 25 minut w temperaturze 34 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.
Utrzymuj oddzielną grupę jaj w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Odpipetować 100 mikrolitrów zawierających jaja kontrolne lub poddane szokowi cieplnemu i umieścić je na nieobsianej płytce 10 GN. Każdy talerz zawiera co najmniej 100 do 200 jaj.
Wysiaduj jaja w temperaturze 20 stopni Celsjusza aż do wyklucia. Użyj buforu M9 do mycia płytek i zbierania życia L1 i nicieni w probówce o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 10 000 g przez 30 sekund.
Usuń supernatant i zachowaj paletę. Dodaj 100 mikrolitrów 20-milimolowego buforu lewangialnego M9, aby znieczulić nicienie. Odpipetuj 10 mikrolitrów buforu lewangialnego M9, zawierającego L1, obserwuj i zamontuj je w 2% miejscu agar-ls, delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki.
Obserwuj zegarek za pomocą mikroskopii DIC. Skanowanie degeneracji 630 neuronów receptorowych poprzez zliczanie komórek z charakterystycznym wirtualnym wspomaganym wyglądem tego nicienia. Zsynchronizuj nicienie, wybierając i przenosząc od 15 do 20 larw L4 każdego szczepu najpierw na płytki bakterii C, a następnie GMO.
Inkubuj i pozwól nicieniom rosnąć w standardowej temperaturze 20 stopni Celsjusza. Przeprowadzaj codzienne przygotowanie do przygotowania przez 30 minut, przenosząc płytki do inkubatora ustawionego na 34 stopnie Celsjusza. Następnie zwróć wstępnie przygotowane nicienie z powrotem do standardowej temperatury 20 stopni Celsjusza.
Dodaj 10 mikrolitrów 20-milimolowej kropli buforowej M9 levangial w środku plamki agar-ls. Wybierz odpowiednie nicienie transgeniczne i przenieś je w kropli levangial M9. Umieść od 20 do 30 nicieni na kroplę.
Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zachować wilgotność przez cały proces obrazowania. Korzystając z mikroskopu fluorescencyjnego połączonego z kamerą, wykryj i uchwyć badane obrazy obszaru głowy w 20-krotnym powiększeniu.
Monitoruj przez siedem dni transgeniczne nicienie pod kątem śmierci dopaminergicznych komórek neuronalnych. Zmierz neuronalne agregaty policulalne w okolicy głowy czterodniowych zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję fuzji 240 z żywymi ludźmi. Martwicza śmierć komórek wywołana nadpobudliwą substancją kanałów jonowych jest najczęstszą przyczyną u nicieni, które wcześniej warunkują jaja przed szokiem cieplnym.
Kondycjonowanie wstępne szoku cieplnego, promujące przewidywanie śmierci komórek wywołanej alfa-synukleiną u siedmiodniowego dorosłego hermafrodyty i zmniejsza agregaty białka Q40 w okolicy głowy czterodniowych dorosłych. Starzenie się jest konsekwencją uszkodzeń spowodowanych stopniową degeneracją homeostazy komórkowej i tkankowej. W związku z tym zrozumienie manipulacji związanym z wiekiem załamaniem neuronów jest priorytetem.
Zaprezentowane techniki w połączeniu z genetycznymi i farmakologicznymi badaniami przesiewowymi mogą doprowadzić do powiadomienia o prawidłowych modulatorach śmierci komórkowej o potencjalnym znaczeniu terapeutycznym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodologie wykorzystujące wszechstronne modele nicieni do badania chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem. Koncentracja skupia się na nekrozie indukowanej hiperaktywacją kanałów jonowych oraz neurotoksyczności indukowanej agregatami białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Choroby neurodegeneracyjne
- Biologia komórkowa i molekularna
Wstęp
- Długość życia ludzi uległa wydłużeniu dzięki postępom w medycynie.
- Wiek jest istotnym czynnikiem ryzyka wystąpienia zaburzeń neurodegeneracyjnych.
- Do powszechnych chorób neurodegeneracyjnych należą choroba Alzheimera, Parkinsona oraz Huntingtona.
- Zrozumienie mechanizmów komórkowych ma kluczowe znaczenie dla opracowania strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Monitorowanie i analiza mechanizmów komórkowych degeneracji neuronów.
- Wykorzystanie modeli nicieni do badania neurotoksyczności.
- Eksploracja metodologii, które mogą być szeroko dostępne dla badaczy.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie nekrozy indukowanej przez nadaktywne kanały jonowe.
- Ocena neurotoksyczności indukowanej przez agregaty białkowe.
- Użycie nicieni na płytkach z podłożem wzrostowym.
- Zbiór i analiza nicieni po inkubacji.
Główne wyniki
- Zaprezentowane metodologie są skuteczne w badaniu neurodegeneracji.
- Dostarczono informacji na temat komórkowych i molekularnych podstaw chorób związanych z wiekiem.
- Podkreślono użyteczność modeli nicieni w badaniach z zakresu neuronauki.
- Ułatwiono zrozumienie mechanizmów neurotoksyczności.
Wnioski
- Przedstawione metodologie są przystępne i wszechstronne.
- Mogą one pomóc w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu opracowania podejść terapeutycznych.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modelowanie mechanizmów neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem u C. elegans zapewnia skalowalny, genetycznie podatny system do wczesnej walidacji celów terapeutycznych i ograniczania ryzyka mechanistycznego. Podejście to umożliwia ilościową ocenę integralności neuronalnej oraz agregacji białek, co zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących związków. Ta platforma oparta na nicieniach łączy biologię odkrywczą z relewancją translacyjną w przypadku proteinopatii związanych z wiekiem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez modelowanie konserwowanych szlaków neurodegeneracji za pośrednictwem nadaktywności kanałów jonowych i neurotoksyczności indukowanej agregatami białek.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez genetyczne i farmakologiczne badania przesiewowe modulatorów śmierci komórek w kontekście całego organizmu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez powiązanie perturbacji genetycznych z mierzalnymi wynikami przeżywalności neuronów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych modeli nicieni do późniejszego przesiewania związków poprzez standaryzację populacji larw w stadium L4 zsynchronizowanych pod względem wieku.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie powtarzalnych, ilościowych wyników, takich jak zliczanie neuronów dopaminergicznych i pomiar agregatów poliglutaminianu w obszarze głowy.
- Skalowalność: Umożliwienie ponownego wykorzystania platformy dzięki zsynchronizowanym schematom wstępnego przygotowania (np. szok termiczny w 34°C) oraz zestandaryzowanym protokołom obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Modeluje ewolucyjnie konserwatywny rozpad neuronów związany z wiekiem, co umożliwia ekstrapolację na ludzkie mechanizmy neurodegeneracyjne.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia związki przyczynowo-skutkowe między agregacją białek (np. α-synuclein, poli-glutaminian) a dysfunkcją neuronów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez pomiar supresji nekrotycznej śmierci komórek oraz obciążenia agregatami u dorosłych hermafrodytów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, zapewniając system istotny w kontekście danej choroby do testowania hipotez i oceny związków wiodących przed walidacją na ssakach.
- Biologia odkryć: Wspiera badanie mechanizmów neurodegeneracji poprzez kontrolowaną indukcję fenotypów nekrotycznych i toksycznych.
- Przesiew: Umożliwia przygotowanie testów dzięki zestandaryzowanej obsłudze nicieni, anestezji lewamisolem oraz obrazowaniu DIC/fluorescencyjnemu przy powiększeniu 20x.
- Analityka: Generuje ilościowe zmienne zależne, w tym liczbę komórek neuronalnych i intensywność agregatów, niezbędne do badań zależności dawka-odpowiedź oraz interakcji genetycznych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie progresji białkowej zależnej od wieku w zdefiniowanym genetycznie tle.
- Zastosowanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy możliwość powtarzalnego prowadzenia podłużnych badań nad neurodegeneracją dzięki kriokonserwowanym szczepom i protokołom zsynchronizowanego starzenia.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do celu poprzez redukcję ryzyka związanego z niejednoznacznością mechanistyczną w szlakach degradacji neuronalnej związanej z wiekiem.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji dzięki określonym zmianom temperatury, schematom karmienia bakteriami oraz kontrolowanemu czasowo podawaniu środków znieczulających.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wysokoprzepustowe badania genetyczne i farmakologiczne w niskokosztowym modelu bezkręgowca.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez ilościowe określenie skuteczności modulatorów w fenotypach neurodegeneracyjnych przed zainwestowaniem w badania na ssakach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli nicieni, obsłudze szczepów genetycznych oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależne od inkubatorów z kontrolą temperatury, mikroskopów sekcyjnych oraz systemów obrazowania z możliwością DIC i fluorescencji.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie synchronizacji wieku, harmonogramów wstępnego kondycjonowania oraz ślepej oceny integralności neuronalnej.
- Kwestie adaptacyjne obejmują specyficzną dla szczepu ekspresywność modeli degeneracji (np. deg-3(d), mec-4(d)) oraz penetrację transgenu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność odpowiedzi na szok termiczny oraz konieczność starannego unikania przedłużonej ekspozycji na lewamisol (>5 min), aby zapobiec artefaktom anestetycznym.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:39
Necrotic Cell Death-induced by Hyperactive Ion Channels
4:06
Protein Aggregate-induced Neurodegeneration
5:58
Representative Results: Monitor Necrotic Cell Death-Induced by Hyperactive Ion Channels and Protein Aggregate-induced Neurodegeneration
6:30
Conclusion
