Blokowanie przepływu limfy poprzez zszywanie aferentnych naczyń limfatycznych u myszy
14 maja 2020
Przedstawiono protokół blokowania przepływu limfy poprzez chirurgiczne zszywanie doprowadzających naczyń limfatycznych.
Metoda ta przerywa przepływ limfy przy minimalnym uszkodzeniu komórek śródbłonka limfatycznego, a dzięki precyzyjnej kontroli czasu blokady może być wykorzystana do zbadania, jak przepływ limfy wpływa na homeostazę i odpowiedzi immunologiczne w węźle chłonnym. W zademonstrowaniu procedury pomoże Jingna Xue, doktorantka z mojego laboratorium. Aby przygotować aparat do wstrzykiwań, należy przeciąć około 30 centymetrów rurki polietylenowej.
Podłącz końcówkę igły A do jednego końca rurki. Ostrożnie wyjmij kolejną igłę i połącz złamaną stronę z drugim końcem rurki polietylenowej. Następnie przymocuj igłę A do jednomililitrowej strzykawki tuberkulinowej .
Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować mieszaninę ketaminy i ksylazyny w proporcji 10:1 w soli fizjologicznej. Po znieczuleniu myszy poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo 250 mikrolitrów mieszaniny ketaminy/ksylazyny, należy zapewnić pełne znieczulenie za pomocą uszczypnięcia palca. Ogol sierść wokół nóg maszynką do strzyżenia włosów, a następnie nałóż krem do depilacji wokół nogi.
Po pięciu minutach zetrzyj resztki sierści i krem do depilacji wilgotną chusteczką, a następnie umyj nogę sterylną wodą. Rozpyl 70% etanolu wokół nogi, aby wysterylizować obszar operacyjny. Umieść mysz w pozycji leżącej i użyj taśmy chirurgicznej, aby odsłonić obszar operacyjny na prawej nodze.
Śródskórnie wstrzyknij pięć mikrolitrów 1% niebieskiego barwnika Evansa lub dziewięć centymetrów płynu z rurki aparatu iniekcyjnego do prawej opuszki stopy myszy. Delikatnie masuj opuszkę pod stopy, aby płyn dostał się do naczyń limfatycznych. Pod mikroskopem preparacyjnym zlokalizuj miejsce nacięcia pięć milimetrów od dolnej krawędzi dołu podkolanowego.
Za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie o długości około pięciu milimetrów. Następnie użyj cienkich kleszczy operacyjnych, aby rozciągnąć nacięcie i odsłonić naczynia limfatyczne zbierające. Zidentyfikuj oba doprowadzające naczynia limfatyczne prowadzące do węzłów chłonnych podkolanowych.
Za pomocą uchwytu na igłę ostrożnie wprowadzić igłę do szycia między doprowadzające naczynia limfatyczne a tętnicę odpiszczelową. Delikatnie wyciągnąć igłę wokół doprowadzających naczyń limfatycznych. Ostrożnie pociągnij sznurek do szwów, pozostawiając około dwóch centymetrów sznurka do szwów.
Użyj uchwytu na igłę, aby pomóc zawiązać węzeł chirurga. Delikatnie masuj opuszkę pod stopy, aby upewnić się, że niebieski barwnik Evansa nie przejdzie przez miejsce szwu, a następnie odetnij nadmiar sznurka nożyczkami. Zszyj pozostałe doprowadzające naczynia limfatyczne, a następnie zamknij nacięcie skóry tym samym szwem, który był używany do naczyń limfatycznych.
W celu pozorowanej kontroli wstrzyknij śródskórnie pięć mikrolitrów 1% niebieskiego barwnika Evansa w lewą poduszkę stopy i masuj opuszkę stopy. Otwórz skórę z nacięciem, a następnie zamknij ranę bez zszywania naczynia. Podczas monitorowania myszy po operacji, prawa noga powinna wykazywać obrzęk, z niebieskim barwnikiem Evansa rozprzestrzeniającym się na udo, podczas gdy noga kontrolna będzie wykazywać niebieski barwnik Evansa ograniczony do opuszki stopy.
Bezpośrednio po zabiegu wstrzyknąć śródskórnie 10 mikrolitrów 2%FITC zarówno w prawą, jak i lewą opuszkę stopy. Dwie, sześć i 12 godzin po wstrzyknięciu FITC należy pobrać węzły chłonne podkolanowe z dołu myszy poddanych eutanazji. Ostrożnie usuń okołowęzłową tkankę tłuszczową wokół pLNs.
Osadź pLN w związku o optymalnej temperaturze skrawania, tak aby obszar zatoki szpikowej był skierowany w bok formy kriogenicznej. Użyj kriotomu, aby przygotować zamrożone kawałki o grubości 20 mikronów. Aby określić rozkład FITC w pLN, należy zobrazować kriosekcje pod mikroskopem konfokalnym.
Obrazy konfokalne wykonane dwie, sześć i 12 godzin po wstrzyknięciu FITC wykazują znacznie zmniejszoną akumulację FITC w węzłach chłonnych podkolanowych po zszyciu doprowadzających naczyń limfatycznych. Resztkowy FITC w pLN był preferencyjnie gromadzony w zatokach węzłów chłonnych. Obrazy konfokalne tkanki tłuszczowej okołowęzłowej pokazują, że gdy naczynia limfatyczne są zablokowane przez szycie, FITC dostaje się do tkanki, gdy węzły chłonne zanikają, ale nie jest skutecznie rozprowadzany w węzłach chłonnych.
Próbując tej metody, należy pamiętać, że wprowadzenie igły do szycia między naczyniem krwionośnym a naczyniem limfatycznym ma kluczowe znaczenie. Niewykonanie tego kroku może spowodować uszkodzenie naczyń. Po wykonaniu tej metody możliwe jest uodpornienie myszy na infekcję lub inną stymulację immunologiczną, aby zbadać, w jaki sposób przepływ limfy reguluje ochronę immunologiczną.
Funkcja przepływu limfy nie jest dobrze poznana. Metoda ta może być stosowana do badania migracji komórek w węźle chłonnym przy braku przepływu limfy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół blokowania przepływu limfy poprzez chirurgiczne podwiązanie naczyniń limfatycznych doprowadzających. Metoda ta pozwala na zminimalizowanie uszkodzeń komórek śródbłonka limfatycznego oraz precyzyjną kontrolę czasu wprowadzenia blokady, co ułatwia badanie wpływu przepływu limfy na homeostazę i odpowiedzi immunologiczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia naczyniowa
Wstęp
- Naczynia limfatyczne odgrywają kluczową rolę w odpowiedziach odpornościowych.
- Zrozumienie przepływu limfy jest niezbędne do badania homeostazy.
- Obecne metody mogą uszkadzać komórki śródbłonka limfatycznego.
- Precyzyjna kontrola przepływu limfy jest konieczna dla zapewnienia dokładności eksperymentalnej.
Cel badania
- Przedstawienie protokołu chirurgicznego blokady przepływu limfy.
- Zbadanie wpływu przepływu limfy na odpowiedzi immunologiczne.
- Zminimalizowanie uszkodzeń struktur limfatycznych podczas przeprowadzania eksperymentów.
Zastosowane metody
- Chirurgiczne podwiązanie naczyń limfatycznych doprowadzających.
- Przygotowanie aparatury do iniekcji z użyciem rurek polietylenowych.
- Połączenie strzykawek i igieł w celu precyzyjnego wstrzyknięcia.
- Demonstracja procedury przeprowadzona przez studenta studiów doktoranckich.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie blokuje przepływ limfy.
- Zaobserwowano minimalne uszkodzenia komórek śródbłonka limfatycznego.
- Osiągnięto precyzyjną kontrolę nad czasem trwania blokady.
- Procedura ta umożliwia szczegółowe badanie funkcji układu limfatycznego.
Wnioski
- Protokół chirurgiczny jest cennym narzędziem w badaniach nad układem limfatycznym.
- Zrozumienie przepływu limfy może poszerzyć wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych.
- Metodę tę można dostosować do różnych konfiguracji eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Blokowanie przepływu limfy poprzez chirurgiczne podwiązanie naczyń limfatycznych doprowadzających umożliwia precyzyjną analizę funkcji limfatycznej w homeostazie immunologicznej i transporcie antygenów. Podejście to wspiera walidację celów w opracowywaniu leków immunomodulujących poprzez izolację mechanizmów zależnych od limfy. Stanowi ono narzędzie do mechanistycznej redukcji ryzyka w modelach przedklinicznych oceniających modulację mikrośrodowiska węzłów chłonnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia walidację funkcjonalną celów zależnych od limfy w szlakach regulacji odpornościowej.
- Wartość operacyjna: Pozwala na testowanie hipotez dotyczących wpływu przepływu limfy na ekspresję chemokin oraz funkcję naczyń wysokomiąższowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów blokady limfatycznej w celu oceny wpływu związków na transport antygenów pośredniczony przez limfę.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie powtarzalnego czasu blokady dla znormalizowanych warunków testowych w badaniach przesiewowych funkcji limfatycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie mikrośrodowiska węzła chłonnego istotne dla chorób w badaniach nad stanami zapalnymi i odpowiedzią immunologiczną.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej poprzez utrzymanie integralności struktury limfatycznej podczas interwencji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów badawczych, od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po walidację przedkliniczną leków modulujących układ limfatyczny.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie mechanizmów przepływu limfy w procesach migracji komórek odpornościowych i homeostazie węzłów chłonnych.
- Przesiewanie: Umożliwia ilościową ocenę akumulacji antygenu FITC jako funkcjonalnego wskaźnika skuteczności blokady limfatycznej.
- Analityka: Ułatwia ilościowe określanie rozkładu antygenu w węzłach chłonnych i tkance okołoguzowej na podstawie obrazowania konfokalnego.
- Badania translacyjne: Łączy funkcję limfatyczną z wynikami odpowiedzi immunologicznej w przedklinicznych modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę chirurgiczną do modulowania przepływu limfy w ramach wielu walidacji celów związanych z odpornością.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w interakcjach limfatyczno-immunologicznych poprzez umożliwienie precyzyjnej kontroli czasowej blokady.
- Wartość operacyjna: Minimalizuje uszkodzenia komórek śródbłonka, zachowując żywotność tkanek dla podłużnego monitorowania odpowiedzi immunologicznej.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji go/no-go w opracowywaniu immunomodulatorów poprzez wyjaśnienie limfozależnych mechanizmów działania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zależność ochrony immunologicznej od przepływu limfy.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrosurgerycznej identyfikacji naczyń i techniki szycia.
- Wymaga zastosowania mikroskopu do dysekcji oraz precyzyjnych instrumentów w celu uzyskania dostępu do doprowadzającego naczynia limfatycznego.
- Konieczne jest ustandaryzowane monitorowanie pooperacyjne w kierunku obrzęków i dyfuzji barwnika jako walidacji funkcjonalnej.
- Wymaga uwzględnienia różnic między szczepami myszy oraz zmienności naczyń limfatycznych.
- Ograniczone do badań nad blokadą ostrą ze względu na potencjalne kompensacyjne przebudowy układu limfatycznego w czasie.
