Name: Blokowanie przepływu limfy poprzez zszywanie aferentnych naczyń limfatycznych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Poznaj metodę chirurgicznego blokowania przepływu limfy poprzez szycie naczyń aferentnych u myszy. Technika minimalizuje uszkodzenia komórek śródbłonka limfatycznego i umożliwia precyzyjną kontrolę czasu blokady w badaniach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Avie Zardynezhad za korektę manuskryptu. Praca ta jest wspierana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem (CIHR, PJT-156035) i Kanadyjską Fundację Innowacji dla SL (32930) oraz przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin dla Yujia Lin (81901576).

Wszystkie prace ze zwierzętami muszą być zatwierdzone przez instytucjonalną i rządową komisję etyki i postępowania ze zwierzętami. To jest operacja niepozwalająca na przeżycie. 
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotuj 100 ml 70% etanolu, mieszając 70 ml 100% etanolu z 30 ml sterylnej wody. Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed zabiegiem i przechowuj je w 70% etanolu przed i w trakcie operacji, aby utrzymać sterylizację.</li>
	<li>Przygotować aparat do wstrzykiwań.
	<ol>
		<li>Wytnij ~30 cm rurki polietylenowej (średnica 0,28 mm). Podłącz końcówkę igły 30 G x 1/2 (igły A) do jednego końca rurki polietylenowej. Ostrożnie usuń kolejną igłę 30 G x 1/2 (igłę B) i podłącz złamaną stronę do drugiego końca rurki polietylenowej.</li>
		<li>Przymocować igłę A do strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml. 
		UWAGA: W przypadku tej rurki polietylenowej 1,6 cm płynu w wężyku odpowiada 1 μL20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować mieszaninę ketaminy i ksylazyny w stosunku 10:1 (10 mg/ml ketaminy i 1 mg/ml ksylazyny) w soli fizjologicznej (bakteriostatyczny 0,9% [w/v] chlorek sodu). Przygotuj roztwór na świeżo przed użyciem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierzęcia do operacji
UWAGA: Używaj myszy w wieku 6−10 tygodni. Można używać zarówno samic, jak i samców myszy. W tym badaniu wykorzystano 6-10-tygodniowe samice myszy C57BL/6. Metodę tę można dostosować do innych szczepów myszy.
<ol>
	<li>Znieczulij mysz, wstrzykując dootrzewnowo 250 μl mieszaniny ketaminy i ksylazyny. Poczekaj, aż mysz całkowicie przejdzie w stan uśpienia. Upewnij się, że mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca, aby wykryć pełne znieczulenie.</li>
	<li>Ogol futro wokół nóg za pomocą maszynki do strzyżenia włosów.</li>
	<li>Nałóż krem do depilacji na nogę i odczekaj 5 minut. Zetrzyj resztki sierści i kremu do depilacji wilgotną chusteczką i umyj nogę sterylną wodą. Rozpyl 70% etanolu wokół nogi, aby wysterylizować obszar operacyjny. Etanol jest ograniczony do miejsca nacięcia. </li>
</ol>
3. Chirurgiczne szycie doprowadzających naczyń limfatycznych
UWAGA: Prawa noga jest zszyta, a lewa noga jest używana jako kontrola pozorowana. Protokół szwu limfatycznego (kroki 3.1−3.8) trwa 20−30 min.
<ol>
	<li>Trzymaj mysz w pozycji leżącej i przymocuj ją taśmą chirurgiczną, aby odsłonić obszar operacji na prawej nodze.</li>
	<li>Śródskórnie wstrzyknąć 5 μl 1% niebieskiego barwnika Evansa lub 9 cm płynu z rurki aparatu do wstrzykiwań do opuszki stopy. Delikatnie masuj opuszkę pod stopy, aby pomóc Evans blue dostać się do naczyń limfatycznych. 
	UWAGA: Strzykawka insulinowa nie jest łatwa do kontrolowania w przypadku wstrzykiwań o małej objętości. Objętość można dokładniej kontrolować za pomocą aparatu iniekcyjnego. Naczynia limfatyczne są uwidocznione przez niebieski barwnik pod skórą. Przy intensywnym treningu oba aferentne naczynia limfatyczne można zobaczyć gołym okiem jako przezroczyste naczynia w tkance tłuszczowej, równoległe do tętnicy odpiszczelowej. Dzięki intensywnemu szkoleniu możliwe jest zszywanie naczyń bez wstrzykiwania barwnika Evans Blue w przypadkach, gdy istnieją obawy o potencjalne zakłócenia spowodowane przez barwnik.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wybierz miejsce nacięcia 5 mm od dolnej krawędzi dołu podkolanowego. Wykonaj małe nacięcie (~ 5 mm) w skórze nożyczkami. Używając precyzyjnych kleszczyków operacyjnych, rozciągnij nacięcie i odsłoń naczynia limfatyczne zbierające (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: W razie potrzeby można usunąć niewielki fragment skóry, aby odsłonić naczynia limfatyczne.</li>
	<li>Zidentyfikuj oba doprowadzające naczynia limfatyczne prowadzące do pLN pod mikroskopem preparacyjnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: Od opuszki stopy do pLN znajdują się dwa doprowadzające naczynia limfatyczne. Oba muszą być zszyte, aby całkowicie zablokować przepływ limfy.</li>
	<li>Za pomocą uchwytu na igłę ostrożnie wprowadzić igłę do szycia (0,7 metra lub mniej) między doprowadzające naczynie limfatyczne a tętnicę odpiszczelową i delikatnie wyciągnąć igłę wokół doprowadzającego naczynia limfatycznego. Delikatnie pociągnij sznurek do szycia i zostaw około 2 cm sznurka do szwów. Użyj uchwytu na igłę, aby mocno zawiązać sznurek, aby zszyć jedno naczynie limfatyczne węzłem chirurgicznym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: Tkanka pod nacięciem może wyschnąć przy długotrwałym wystawieniu na działanie powietrza. Wykonanie jak najmniejszego nacięcia i szybkie wykonanie szwu (tj. w ciągu 5 minut) zapobiegnie wysychaniu tkanki. Utrzymuj wilgotność tkanki, nakładając niewielką objętość soli fizjologicznej za pomocą bawełnianego wacika.</li>
	<li>Delikatnie masuj podkładkę, aby upewnić się, że barwnik Evans Blue nie przechodzi przez miejsce szwu, a następnie odetnij nadmiar sznurka nożyczkami.</li>
	<li>Wykonaj te same kroki szwu (tj. kroki 3.5 i 3.6) na drugim doprowadzającym naczyniu limfatycznym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). Zamknij nacięcie skóry tym samym szwem, który został użyty do zszycia naczyń w kroku 3.5 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>W celu pozorowanej kontroli wstrzyknij śródskórnie 5 μl 1% niebieskiego barwnika Evansa w lewą opuszkę stopy i masuj opuszkę stopy, aby uwidocznić naczynia limfatyczne. Otwórz skórę przez wycięcie, a następnie zamknij ranę bez zszywania naczynia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Opcjonalnie monitoruj operowane myszy przez 2-4 godziny. Strona nogawki do szwu powinna wykazywać obrzęk z niebieskim Evansem rozprzestrzenionym na udo, podczas gdy noga kontrolna będzie wykazywać ograniczony niebieski barwnik Evansa w opuszkach stóp. Jeśli myszy się obudzą, zostanie wstrzyknięta dodatkowa mieszanka ketaminy i ksylazyny, aby utrzymać znieczulenie do czasu eutanazji.</li>
</ol>
4. Śledzenie przepływu limfy
<ol>
	<li>Bezpośrednio po zabiegu należy śródskórnie wstrzyknąć 10 μL 2% izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) w opuszkę stopy zarówno kontrolnej, jak i nogi zszytej limfatycznie.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji 400 μl mieszaniny ketaminy i ksylazyny i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, gdy myszy są w pełni znieczulone.</li>
	<li>Pobrać pLN z dołu podkolanowego i ostrożnie usunąć okołowęzłową tkankę tłuszczową wokół pLN pod mikroskopem preparacyjnym po 2, 6 i 12 godzinach od wstrzyknięcia FITC.</li>
	<li>Osadź pLN z obszarem zatoki szpikowej skierowanym w stronę boku kriomoldu w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1G, H).</li>
	<li>Przygotuj zamrożone skrawki o wielkości 20 μm za pomocą kriotomi.</li>
	<li>Zobrazuj kriosekcje pod mikroskopem konfokalnym, aby określić rozkład FITC.</li>
</ol>

<ol><li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li>
<li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microlymphatics+and+lymph+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li>
<li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li>
<li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions%2C+measured+in+draining+lymph%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li>
<li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li>
<li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation%3A+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li>
<li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li>
<li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li>
<li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li>
<li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li>
<li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li>
<li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li>
<li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li>
<li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GlyCAM-1%2C+an+endothelial+ligand+for+L-selectin%2C+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li>
<li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+organ+development%3A+from+ontogeny+to+neogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li>
<li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li>
<li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6(2014).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li>
<li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Blokowanie przepływu limfy będzie miało szerokie zastosowanie w manipulowaniu dostarczaniem antygenu do LN w warunkach zdrowych i chorych. Możliwe jest zastosowanie tej metody do kontrolowania czasu dostarczania antygenu w celu zbadania, w jaki sposób ciągły przepływ limfy reguluje odpowiedź immunologiczną w drenujących LN. Ta metoda przerywania przepływu limfy może być również wykorzystana do zbadania, w jaki sposób limfa wpływa na kompartkalizację komórek, aktywację komórek, migrację komórek i interakcje komórka-komórk...

Przestrzenna organizacja układu limfatycznego zapewnia strukturalne i funkcjonalne wsparcie dla skutecznego usuwania płynu pozakomórkowego oraz transportu antygenów i komórek prezentujących antygen (APC) do drenujących LN. Początkowe naczynia limfatyczne (zwane również naczyniami włosowatymi limfatycznymi) są wysoce przepuszczalne ze względu na ich nieciągłe połączenia międzykomórkowe, które ułatwiają skuteczne zbieranie płynów, komórek i innych materiałów z otaczających przestrzeni zewnątrzkomórkowych1. Początkowe naczynia limfatyczne łączą się w zbiorcze naczynia limfatyczne, które mają ścisłe połączenia międzykomórkowe, ciągłą błonę podstawną i pokrycie mięśni limfatycznych. Naczynia limfatyczne zbierające są odpowiedzialne za transport zebranej limfy do drenujących LN i ostatecznie powrót limfy do krążenia2,3. Naczynia limfatyczne zbierające, które napędzają limfę do drenującego LN, to doprowadzające naczynia limfatyczne4,5,6,7. Niedrożność doprowadzających naczyń limfatycznych może blokować przepływ limfy do LN, co jest przydatną techniką podczas badania funkcji przepływu limfy.
Poprzednie badania wykazały, że przepływ limfy odgrywa znaczącą rolę w transporcie antygenów i APC, a także w utrzymaniu homeostazy LN. Dobrze wiadomo, że APC pochodzenia tkankowego, zazwyczaj aktywowane migrujące komórki dendrytyczne (DC), przemieszczają się przez aferentne naczynia limfatyczne do LN, aby aktywować limfocyty T8. Pomysł, że wolne antygeny, takie jak drobnoustroje lub rozpuszczalne antygeny, pasywnie przepływają z limfą do LN, aby aktywować APC rezydujące w LN, zyskał akceptację w ciągu ostatniej dekady9,10,11,12. Wolne antygeny przemieszczające się z limfą potrzebują kilku minut po zakażeniu, aby przemieścić się do LN, a aktywacja komórek rezydujących w LN może nastąpić w ciągu 20 minut po stymulacji. Jest to znacznie szybsze niż aktywacja migrujących kontrolerów domeny, która zajmuje więcej niż 8 godzin, aby wprowadzić drenujący LN9. Oprócz transportu antygenów w celu zainicjowania ochrony immunologicznej, limfa przenosi również cytokiny i DC do LN, aby utrzymać jego mikrośrodowisko i wspierać homeostazę komórek odpornościowych13,14. Wcześniej blokowanie przepływu limfy poprzez zszywanie aferentnych naczyń limfatycznych wykazało, że limfa jest wymagana do utrzymania fenotypu HEV wymaganego do wspierania homeostatycznych limfocytów T i limfocytów B naprowadzających do LN15,16,17. CCL21 to krytyczna chemokina, która kieruje pozycjonowaniem komórek DC i T w klasie LN8,< klasa sup = "xref">18. Blokowanie przepływu limfy przerywa ekspresję CCL21 w LN i potencjalnie przerywa pozycjonowanie i/lub interakcję limfocytów DC i T w klasie LN<sup="xref">19. Tak więc zablokowanie przepływu limfy może bezpośrednio lub pośrednio znieść dostęp antygenu/DC do drenującego LN poprzez zakłócenie mikrośrodowiska LN, które reguluje odpowiedzi immunologiczne w LN. Aby lepiej zbadać funkcję przepływu limfy, przedstawiono eksperymentalny protokół (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) blokujący przepływ limfy u myszy poprzez zszycie aferentnych naczyń limfatycznych od opuszki stopy do pLN. Metoda ta może być ważną techniką dla przyszłych badań nad funkcją limfy w zdrowych i chorych warunkach.

<table><tbody><tr><td>0,9% sól fizjologiczna chlorku sodu</td><td>Baxter</td><td>JB1323</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Greenfield Global</td><td></td><td>University of Calgary usługi dystrybucyjne UN1170.</td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Nair</td><td></td><td>Nair Sensitive Formula Depilacja Cr&egrave; me z olejem ze słodkich migdałów i oliwką dla dzieci, 200 ml. Lub podobny produkt.</td></tr><tr><td>Evans Blue dye</td><td>Sigma Life Science</td><td>E2129-10G</td><td>Na 1 ml niebieskiego barwnika Evans dodaj 0,1 g niebieskiego barwnika Evans do 10 ml PBS. Roztwór Evens Blue zostanie przefiltrowany przez filtry 0,22 mm i utrzymany w sterylnej postaci w podwielokrotnościach o pojemności 1 ml.</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)</td><td>Sigma Life Science</td><td>F7250-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #3</td><td>WPI</td><td>500337</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>WPI</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Aparat iniekcyjne</td><td></td><td></td><td>Podłącz jeden koniec rurki polietylenowej do 30G i razy; &frac12; igła. Podłączyć do igły strzykawkę o pojemności 1 ml TB. Usuń wałek igły z innego 30G i razy; &frac12; igła. Włóż koniec 30G i razy; &frac12; wałek igły do drugiego końca rurki. Średnica wewnętrzna tej rurki wynosi 0,28 mm. Zatem 1,6 cm płynu w rurce to 1 &mu;l.</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>IRIS Kleszcz prosty</mocny></td><td>WPI</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Nożyczki IRIS</mocny></td><td>WPI</td><td>14218-G</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Ketamina</td><td>Narketan</td><td>DIN 02374994</td><td>Dostawcy ketaminy i ksylazyny są zwykle objęci regulacjami instytucjonalnymi i rządowymi.</td></tr><tr><td>Needles (26Gx3/8)</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>Needles (30Gx1/2)</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Paton Uchwyt na igły</td><td>ROBOZ</td><td>RS6403</td><td>prosty, bez blokady; Ząbkowana</td></tr><tr><td><mocna> buforowana fosforanem sól fizjologiczna (PBS)</mocna></td><td>Sigma Life Science</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td><mocna>rurka polietylenowa</mocna></td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td><mocna>Taśma chirurgiczna (1,25cmx9,1m)</mocna></td><td>Transpore</td><td>1527-0</td><td></td></tr><tr><td><mocna>Taśma chirurgiczna (2,5cmx9,1m)</mocna></td><td>Transpore</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td><mocny>szew</mocny></td><td>Davis i Geck CYANAMID Kanada</td><td>11/04</td><td>0,7 monofilamentowa</td></tr> <tr><td>strzykawka polipropylenowa<mocna> 0,7 metryczna (1ml)</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>VANNAS nożyczki</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>14122-G</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Rompun</td><td>DIN02169606</td><td>Dostawcy ketaminy i ksylazyny są zwykle objęci regulacjami instytucjonalnymi i rządowymi.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td></td><td>Olympus S261 (522-STS OH141791) ze źródłem światła: Olympus Highlight 3100</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td></td><td>SP8</td></tr></tbody></table>

blokowanie przepływu limfy poprzez zszywanie aferentnych naczyń limfatycznych u myszy

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Naczynia limfatyczne są kluczowe dla utrzymania równowagi płynów tkankowych i optymalizacji ochrony immunologicznej poprzez transport antygenów, cytokin i komórek do drenujących węzłów chłonnych (LN). Przerwanie przepływu limfy jest ważną metodą podczas badania funkcji naczyń limfatycznych. Doprowadzające naczynia limfatyczne od mysiej opuszki stopy do węzłów chłonnych podkolanowych (pLN) są dobrze zdefiniowane jako jedyne drogi drenażu limfy do pLN. Szycie tych aferentnych naczyń limfatycznych może selektywnie zapobiegać przepływowi limfy do pLN. Metoda ta pozwala na zakłócenie przepływu limfy przy minimalnym uszkodzeniu komórek śródbłonka limfatycznego w drenującym pLN, doprowadzających naczyniach limfatycznych, a także innych naczyń limfatycznych w okolicy. Metoda ta została wykorzystana do zbadania, w jaki sposób limfa wpływa na żyłki śródbłonkowe (HEV) i ekspresję chemokin w LN oraz jak limfa przepływa przez tkankę tłuszczową otaczającą LN przy braku funkcjonalnych naczyń limfatycznych. Wraz z rosnącym uznaniem znaczenia funkcji limfatycznej, metoda ta będzie miała szersze zastosowanie w celu dalszego odkrywania funkcji naczyń limfatycznych w regulacji mikrośrodowiska LN i odpowiedzi immunologicznej.

Przeszycie naczyń chłonnych było stosowane w poprzednich badaniach15,16,17,19, gdzie służyło jako istotne narzędzie do badania funkcji przepływu limfy, zanim biologia molekularna naczyń chłonnych została lepiej poznana. Zablokowanie przepływu limfy przerywa homeostazę węzłów chłonnych (LN), co prowadzi do utraty przez naczynia wysokich włośnic (HEV) krytycznej ekspresji genów niezbędnej do opty...

Przedstawiono protokół blokowania przepływu limfy poprzez chirurgiczne zszywanie doprowadzających naczyń limfatycznych.

Blokowanie przepływu limfy poprzez zszywanie aferentnych naczyń limfatycznych u myszy

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Metoda ta przerywa przepływ limfy przy minimalnym uszkodzeniu komórek śródbłonka limfatycznego, a dzięki precyzyjnej kontroli czasu blokady może być wykorzystana do zbadania, jak przepływ limfy wpływa na homeostazę i odpowiedzi immunologiczne w węźle chłonnym. W zademonstrowaniu procedury pomoże Jingna Xue, doktorantka z mojego laboratorium. Aby przygotować aparat do wstrzykiwań, należy przeciąć około 30 centymetrów rurki polietylenowej.Podłącz końcówkę igły A do jednego końca rurki. Ostrożnie wyjmij kolejną igłę i połącz złamaną stronę z drugim końcem rurki polietylenowej. Następnie przymocuj igłę A do jednomililitrowej strzykawki tuberkulinowej .Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować mieszaninę ketaminy i ksylazyny w proporcji 10:1 w soli fizjologicznej. Po znieczuleniu myszy poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo 250 mikrolitrów mieszaniny ketaminy/ksylazyny, należy zapewnić pełne znieczulenie za pomocą uszczypnięcia palca. Ogol sierść wokół nóg maszynką do strzyżenia włosów, a następnie nałóż krem do depilacji wokół nogi.Po pięciu minutach zetrzyj resztki sierści i krem do depilacji wilgotną chusteczką, a następnie umyj nogę sterylną wodą. Rozpyl 70% etanolu wokół nogi, aby wysterylizować obszar operacyjny. Umieść mysz w pozycji leżącej i użyj taśmy chirurgicznej, aby odsłonić obszar operacyjny na prawej nodze.Śródskórnie wstrzyknij pięć mikrolitrów 1% niebieskiego barwnika Evansa lub dziewięć centymetrów płynu z rurki aparatu iniekcyjnego do prawej opuszki stopy myszy. Delikatnie masuj opuszkę pod stopy, aby płyn dostał się do naczyń limfatycznych. Pod mikroskopem preparacyjnym zlokalizuj miejsce nacięcia pięć milimetrów od dolnej krawędzi dołu podkolanowego.Za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie o długości około pięciu milimetrów. Następnie użyj cienkich kleszczy operacyjnych, aby rozciągnąć nacięcie i odsłonić naczynia limfatyczne zbierające. Zidentyfikuj oba doprowadzające naczynia limfatyczne prowadzące do węzłów chłonnych podkolanowych.Za pomocą uchwytu na igłę ostrożnie wprowadzić igłę do szycia między doprowadzające naczynia limfatyczne a tętnicę odpiszczelową. Delikatnie wyciągnąć igłę wokół doprowadzających naczyń limfatycznych. Ostrożnie pociągnij sznurek do szwów, pozostawiając około dwóch centymetrów sznurka do szwów.Użyj uchwytu na igłę, aby pomóc zawiązać węzeł chirurga. Delikatnie masuj opuszkę pod stopy, aby upewnić się, że niebieski barwnik Evansa nie przejdzie przez miejsce szwu, a następnie odetnij nadmiar sznurka nożyczkami. Zszyj pozostałe doprowadzające naczynia limfatyczne, a następnie zamknij nacięcie skóry tym samym szwem, który był używany do naczyń limfatycznych.W celu pozorowanej kontroli wstrzyknij śródskórnie pięć mikrolitrów 1% niebieskiego barwnika Evansa w lewą poduszkę stopy i masuj opuszkę stopy. Otwórz skórę z nacięciem, a następnie zamknij ranę bez zszywania naczynia. Podczas monitorowania myszy po operacji, prawa noga powinna wykazywać obrzęk, z niebieskim barwnikiem Evansa rozprzestrzeniającym się na udo, podczas gdy noga kontrolna będzie wykazywać niebieski barwnik Evansa ograniczony do opuszki stopy.Bezpośrednio po zabiegu wstrzyknąć śródskórnie 10 mikrolitrów 2%FITC zarówno w prawą, jak i lewą opuszkę stopy. Dwie, sześć i 12 godzin po wstrzyknięciu FITC należy pobrać węzły chłonne podkolanowe z dołu myszy poddanych eutanazji. Ostrożnie usuń okołowęzłową tkankę tłuszczową wokół pLNs.Osadź pLN w związku o optymalnej temperaturze skrawania, tak aby obszar zatoki szpikowej był skierowany w bok formy kriogenicznej. Użyj kriotomu, aby przygotować zamrożone kawałki o grubości 20 mikronów. Aby określić rozkład FITC w pLN, należy zobrazować kriosekcje pod mikroskopem konfokalnym.Obrazy konfokalne wykonane dwie, sześć i 12 godzin po wstrzyknięciu FITC wykazują znacznie zmniejszoną akumulację FITC w węzłach chłonnych podkolanowych po zszyciu doprowadzających naczyń limfatycznych. Resztkowy FITC w pLN był preferencyjnie gromadzony w zatokach węzłów chłonnych. Obrazy konfokalne tkanki tłuszczowej okołowęzłowej pokazują, że gdy naczynia limfatyczne są zablokowane przez szycie, FITC dostaje się do tkanki, gdy węzły chłonne zanikają, ale nie jest skutecznie rozprowadzany w węzłach chłonnych.Próbując tej metody, należy pamiętać, że wprowadzenie igły do szycia między naczyniem krwionośnym a naczyniem limfatycznym ma kluczowe znaczenie. Niewykonanie tego kroku może spowodować uszkodzenie naczyń. Po wykonaniu tej metody możliwe jest uodpornienie myszy na infekcję lub inną stymulację immunologiczną, aby zbadać, w jaki sposób przepływ limfy reguluje ochronę immunologiczną.Funkcja przepływu limfy nie jest dobrze poznana. Metoda ta może być stosowana do badania migracji komórek w węźle chłonnym przy braku przepływu limfy.

blocking-lymph-flow-by-suturing-afferent-lymphatic-vessels-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Aby śledzić przebieg odpowiedzi immunologicznej w czasie u tej samej myszy, węzły chłonne można usuwać sekwencyjnie drogą chirurgiczną. W niniejszym materiale opisujemy sposób wykonania tej techniki.

Chirurgiczne usuwanie powierzchownych węzłów chłonnych u myszy

Ten film opisuje technikę in vivo generowania obrzęku limfatycznego mysiego ogona, nieprawidłowego gromadzenia się płynu w przestrzeni tkanki śródmiąższowej prowadzącej do obrzęku ogona. Model jest stosowany do badania mechanizmów i terapii obrzęku limfatycznego.

Model obrzęku limfatycznego mysiego ogona: technika in vivo generowania trwałego obrzęku limfatycznego w mysim ogonie

Ten film demonstruje procedurę chirurgicznej izolacji węzła chłonnego drenującego pachwinę na modelu mysim. Nacięcie okolicy brzusznej zapewnia dostęp do pachwinowego węzła chłonnego, który jest pobierany chirurgicznie. Pobrany półprzezroczysty pachwinowy węzeł chłonny można wykorzystać do badań immunologicznych.

Pobieranie węzła chłonnego drenującego pachwiny z modelu mysiego

Ten film demonstruje technikę kanniulacji krezkowego przewodu chłonnego u szczurów. Metoda ta umożliwia bezpośredni dostęp do całej objętości składników obecnych w płynie limfatycznym.

Kaniulacja krezki limfatycznej w modelu szczura w celu pobrania płynu limfatycznego

Tutaj demonstrujemy metody ilościowego oznaczania in vivo wyjścia leukocytów z naiwnej, zapalnej i złośliwej skóry myszy. Przeprowadzamy bezpośrednie porównanie dwóch modeli: transdermalnej aplikacji FITC i fotokonwersji in situ. Ponadto wykazujemy przydatność fotokonwersji do śledzenia wychodzenia leukocytów z guzów skóry.

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Ten model zwierzęcy umożliwia badaczom wywołanie statystycznie istotnego wtórnego obrzęku limfatycznego w tylnej kończynie myszy, trwającego co najmniej 8 tygodni. Model może być wykorzystany do badania patofizjologii obrzęku limfatycznego i badania nowych opcji leczenia.

Zmieniona metoda wywoływania wtórnego obrzęku limfatycznego w tylnej kończynie myszy

Obrzęk limfatyczny to obrzęk kończyn spowodowany dysfunkcją układu limfatycznego. Opisujemy przewlekły model obrzęku limfatycznego mysiego ogona i nowatorskie zastosowanie technologii nanotransfekcji tkanek (TNT) do dostarczania ładunku genetycznego do ogona.

Model obrzęku limfatycznego mysiego ogona

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej mysiej krezki limfadenektomii na każdym z czterech stacji wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych krezki. Procedura ta jest adaptowalna, aby umożliwić selektywne zakłócenie komunikacji limfatycznej z dalszym jelitem grubym, bliższym i/lub jelitem cienkim.

Mysia krezkowa limfadenektomia w celu selektywnego zakłócenia komunikacji limfatycznej z jelitem specyficznym dla regionu

Przedstawiamy tutaj protokół jasno definiujący kroki anastomozy głębokiego węzła chłonnego szyjnego lub jego naczynia aferentnego z tylną żyłą twarzową u szczura, aby zminimalizować wpływ innych zmiennych i ujednolicić prowadzenie badań chirurgicznych.

Protokoły chirurgiczne głębokiej anastomozy szyjnej szyjnej w modelu szczura: anastomozy węzłów chłonnych i naczyń chłonnych

Praca pokazuje innowacyjną metodę in vivo badania kurczliwości naczyń limfatycznych szyjnych i przepływu limfy u myszy w celu przetestowania różnych funkcji fizjologicznych naczyń limfatycznych szyi (cLV) oraz strategii terapeutycznych dotyczących modulacyjnych mechanizmów regulacji limfatycznej odpływu i oczyszczania mózgu.

Możliwość odtworzenia ustawień dla in vivo dwufotonowego obrazowania kurczliwości naczyń chłonnych szyjnych i przepływu limfy u myszy

Poznaj metodę chirurgicznego blokowania przepływu limfy poprzez szycie naczyń aferentnych u myszy. Technika minimalizuje uszkodzenia komórek śródbłonka limfatycznego i umożliwia precyzyjną kontrolę czasu blokady w badaniach immunologicznych.

Blokowanie przepływu limfy poprzez zszywanie aferentnych naczyń limfatycznych u myszy

Przeglądaj więcej filmów