Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro
2 czerwca 2020
Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.
Różnicowanie neuronów na podstawie testów mysich jest doskonałym modelem do zilustrowania kluczowych mechanizmów zaangażowanych w neurogenezę. Demonstrujemy zoptymalizowaną metodę neurogenezy zarodków przy użyciu firmowej strategii badań przesiewowych toro. Technika ta ma zalety wysokiej wydajności, niskich kosztów i łatwej obsługi i nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów.
Jest to potężne narzędzie do badań neurobiologicznych. Aby przeprowadzić różnicowanie przy użyciu protokołu pierwszego, należy wysiać 20 000 mysich embrionalnych komórek macierzystych w dwóch mililitrach podstawowej pożywki różnicującej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki pokrytej 0,1% żelatyną. Po przyłączeniu komórek umyj komórki dwoma mililitrami PBS i dodaj dwa mililitry pożywki do różnicowania podstawowego do każdej studzienki, a następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze.
Pozwól komórkom różnicować się przez osiem dni, wymieniając pożywkę co dwa dni. Aby wykonać protokół drugi, dodaj 1,5 miliona mysich embrionalnych komórek macierzystych do nieprzywierającego naczynia bakteryjnego w 10 mililitrach podstawowej pożywki różnicującej i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić tworzenie ciała zarodka. Po dwóch dniach przenieś agregaty komórek do 15-mililitrowych probówek wirówkowych i pozwól im osiąść grawitacyjnie.
Usunąć supernatant i dodać 10 mililitrów świeżej pożywki do różnicowania podstawowego, aby ponownie zawiesić ciała zarodków. Następnie przesadź je do nowego nieprzywierającego naczynia i inkubuj przez kolejne dwa dni. Zebrać i wysiać około 50 ciał zarodków w dwóch mililitrach podstawowej pożywki różnicującej na studzienkę na pokrytą żelatyną płytkę sześciodołkową.
W celu indukcji kwasu retinowego dodaj dwa mikrolitry bulionu RZS do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromola. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze i różnicuj komórki przez kolejne cztery dni. Aby przeprowadzić różnicowanie przy użyciu protokołu trzeciego, powtórz protokół drugi, ale poczekaj tylko dwa dni na uformowanie ciała embrionalnego i sześć dni na indukcję RZS.
Kontrola jakości powstawania ciał zarodkowych powinna być przeprowadzana przy użyciu mikroskopii. Tylko te z jasnymi rdzeniami mogą skutecznie odróżnić się w kolejnym procesie. W przypadku protokołu czwartego należy umieścić 20 000 embrionalnych komórek macierzystych myszy w każdym dołku na płytki pokryte żelatyną i postępować zgodnie z protokołem pierwszym.
Po umożliwieniu komórkom różnicowania się przez cztery dni, dodaj dwa mikrolitry całego stada trans RA do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez kolejne cztery dni. Aby wykonać protokół piąty, powtórz protokół czwarty, ale rozpocznij indukcję RZS już po dwóch dniach różnicowania. W przypadku protokołu szóstego posadź 1,5 miliona komórek macierzystych w nieprzylepnym naczyniu bakteryjnym w 10 mililitrach N2B27 pożywki 2 i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić utworzenie ciała zarodka.
Po dwóch dniach zbierz agregaty komórkowe zgodnie z wcześniejszym opisem i ponownie zawieś ciała zarodków za pomocą 10 mililitrów świeżego podłoża N2B27 dwa. Przesadź je ponownie do nowego, nieprzywierającego naczynia bakteryjnego i pozwól im się różnicować przez kolejne dwa dni. Czwartego dnia zebrać i wysiać około 50 ciał zarodków na studzienkę na pokrytych żelatyną płytkach sześciodołkowych z dwoma mililitrami N2B27 podłoże dwa.
Dodaj dwa mikrolitry całego wywaru trans RA do każdej studzienki i wywołaj różnicowanie przez kolejne cztery dni. Aby wykonać protokół siódmy, wysiewaj około 20 000 komórek w dwóch mililitrach podstawowej pożywki różnicującej na studzienkę na płytki pokryte żelatyną. Po przyłączeniu komórek i dwóch płukaniach PBS dodaj dwa mililitry pożywki N2B7, po dwa do każdej studzienki i pozwól komórkom różnicować się przez osiem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Po przeprowadzeniu różnicowania w pierwszej fazie przy użyciu protokołu trzeciego, wysiewaj około 500 000 pochodnych embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwóch mililitrach podstawowej pożywki różnicującej na studzience na 0,1% płytki pokryte żelatyną. Losowo podziel pochodne na trzy grupy, aby przetestować trzy protokoły różnicowania fazy drugiej. Inkubować płytkę przez sześć godzin, a następnie przemyć komórki dwukrotnie dwoma mililitrami PBS i dodać dwa mililitry pożywki do różnicowania podstawowego, pożywki N2B27 po jednej lub pożywki N2B27 po dwie do każdej studzienki, w zależności od protokołu.
Umieść ostrza w inkubatorze i pozwól komórkom różnicować się przez kolejne 10 dni, zmieniając odpowiednią pożywkę co dwa dni. Przetestowano siedem protokołów w celu określenia optymalnego protokołu różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w ogólnych komórkach prekursorowych lub NPC. Protokoły przetestowano zarówno na zamkach A2lox, jak i na 129 komórkach, a stan różnicowania każdej grupy monitorowano za pomocą mikroskopu świetlnego.
Większość pochodnych A2lox i 129 wykazywała dobrze ułożone i podobne do neurytów morfologie zgodnie z protokołem trzecim, co wskazuje na powstawanie NPC. Jednak komórki zróżnicowane za pomocą protokołu drugiego wydawały się apoptotyczne, co może być spowodowane brakiem składników odżywczych w ciałach embrionalnych. Aby dodatkowo potwierdzić powstawanie NPC, wykryto komórki gniazdo-dodatnie za pomocą testu immunofluorescencyjnego.
Protokół trzeci spowodował najwyższy odsetek komórek nestin-dodatnich, osiągający odpowiednio 78 i 69% w pochodnych A2lox i 129. Przetestowano trzy protokoły różnicowania NPC w neurony. Stwierdzono, że protokół trzeci najskuteczniej indukuje różnicowanie.
Większość pochodnych A2lox i 129 w drugiej fazie protokołu trzeciego miała wydłużone struktury podobne do neuronów z wyraźnymi neurytami i przedłużeniami ciała komórki. Testy immunofluorescencyjne dodatkowo potwierdziły wytwarzanie neuronów z procentem trzech dodatnich komórek beta tubuliny do 68 i 59% odpowiednio w pochodnych A2lox i 129 przy użyciu protokołu trzeciego. Próbując tej procedury, ważne jest, aby upewnić się, że testy na myszach są zdrowe i niezróżnicowane przed różnicowaniem.
Ponadto ścisła kontrola jakości powinna być przeprowadzana po utworzeniu w korpusach wiertniczych, a przed różnicowaniem w drugiej fazie. Technika ta stanowi standardowy model dla badaczy neurobiologii i biologii rozwoju i oczekuje się, że będzie potężnym narzędziem do zilustrowania kluczowych mechanizmów zaangażowanych w neurogenezę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zoptymalizowaną i kosztowo efektywną metodę różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w neurony. Wykorzystując testy na embrionalnych komórkach macierzystych myszy, technika ta wykazuje wysoką wydajność i prostotę, co czyni ją idealną do szerokiego zastosowania laboratoryjnego w badaniach neurologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Różnicowanie komórek
- Biologia komórek macierzystych
Wprowadzenie
- Różnicowanie neuronalne jest kluczowe dla zrozumienia neurogenezy.
- Modele embrionalnych komórek macierzystych są efektywne w badaniu rozwoju komórek.
- Optymalne protokoły mogą poprawić wydajność i żywotność zróżnicowanych komórek.
Cel badania
- Opracowanie standardowej, wydajnej metody otrzymywania neuronów z embrionalnych komórek macierzystych.
- Umożliwienie stosowania tej metody w różnych laboratoriach.
- Ocena różnych protokołów w celu uzyskania najlepszych wyników różnicowania komórek.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek na płytkach powlekanych żelatyną oraz nieprzywierających szalkach bakteryjnych.
- Mysie embrionalne komórki macierzyste jako model biologiczny do różnicowania.
- Siedem protokołów różnicowania obejmujących zmienne warunki tworzenia ciał embrionalnych i indukcji kwasem retinowym.
- Monitorowanie różnicowania za pomocą mikroskopii oraz testów immunofluorescencyjnych.
- Środki kontroli jakości w zakresie żywotności ciał embrionalnych i sukcesu różnicowania.
Główne wyniki
- Protokół trzeci zapewnił najwyższy procent komórek prekursorowych neuronów wykazujących pozytywną ekspresję nestyny (78% w pochodnych A2lox i 69% w pochodnych 129).
- Neurony wykazujące pozytywną ekspresję beta-tubuliny III zaobserwowano w odsetkach odpowiednio 68% dla pochodnych A2lox i 59% dla pochodnych 129.
- Kontrola jakości wykazała, że zdrowe ciała embrionalne są kluczowe dla skutecznego różnicowania.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza niezawodnego narzędzia do różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w neurony, co usprawnia badania w dziedzinie neurobiologii.
- Opisane metodologie mogą zostać dostosowane do szerszych zastosowań w biologii rozwoju.
- Stwarza to możliwości lepszego zrozumienia rozwoju neuronalnego oraz zaburzeń z nim związanych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustanowienie wiarygodnych modeli neurogenezy in vitro jest kluczowe dla walidacji celów w programach badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Niniejsza metoda zapewnia skalowalny i cost-effective system generowania komórek prekursorowych neuronów oraz neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy, co wspiera wczesny etap ograniczania ryzyka mechanistycznego. Podejście to umożliwia odtwarzalne przesiewy fenotypowe oraz opracowywanie testów dla badań nad modulacją szlaków sygnałowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych w szlakach neurorozwojowych z wykorzystaniem zdefiniowanego systemu różnicowania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odnawialne źródło komórek prekursorowych neuronów wykazujących pozytywną ekspresję nestyny do badań nad oddziaływaniem na cel molekularny.
- Wartość prognostyczna: Wspiera dostosowanie biomarkerów poprzez mierzalne wyniki, takie jak generowanie neuronów wykazujących pozytywną ekspresję beta-tubuliny III.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie standaryzowanych populacji neuronów odpowiednich do screeningu związków oraz testów modulacji szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje niskokosztowe, łatwe w obsłudze protokoły zgodne z formatami płytek wielodołkowych, co umożliwia uzyskanie wysokiej przepustowości.
- Wartość powtarzalności: Zdefiniowane etapy tworzenia ciałek zarodkowych oraz indukcji kwasem retinowym zapewniają spójność między poszczególnymi partiami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie istotnych z punktu widzenia chorób komórek neuronalnych, które modelują kluczowe mechanizmy neurogenezy w celu walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera długotrwałe dojrzewanie w pośrodku N2B27 medium II, umożliwiając przedłużone utrzymanie neuronów oraz prowadzenie analiz funkcjonalnych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap różnicowania komórek macierzystych w fazie odkryć z procesami badawczymi w zakresie przedklinicznej neurobiologii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, umożliwiając tworzenie pochodnych z komórek macierzystych modeli neuronalnych do testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu oraz przygotowania analiz przed rozpoczęciem prac nad identyfikacją wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia mechanistyczną minimalizację ryzyka poprzez zapewnienie kontrolowanego systemu do badania szlaków neurogennych i dynamiki różnicowania.
- Przesiewanie: Dostarcza mierzalne odczyty oparte na mikroskopii i immunofluorescencji do oceny wpływu związków w populacjach prekursorów neuronalnych i neuronów.
- Analityka: Generuje metryki wydajności różnicowania wyrażone w procentach (nestin+, beta-tubulin III+), które wspierają analizę porównawczą warunków i selekcję hitów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od różnicowania komórek macierzystych do dojrzewania neuronalnego w celu późniejszej walidacji fenotypowej i funkcjonalnej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielorazową, standaryzowaną platformę różnicowania, którą można zastosować w wielu projektach z zakresu neurobiologii i biologii rozwoju.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez powtarzalne generowanie prekursorów neuronalnych i neuronów z mESC.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność techniczną dzięki zdefiniowanej kontroli jakości ciał zarodkowych i określonych w czasie etapach indukcji kwasem retinowym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność podejmowania decyzji go/no-go poprzez dostarczenie wczesnych odczytów biologicznych w fizjologicznie istotnym systemie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, umożliwiając mechanistyczne ograniczanie ryzyka w szlakach neurogenezy.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest doświadczenie w hodowli komórek macierzystych, obchodzeniu się z ciałami embrionoidalnymi oraz w technikach analizy immunofluorescencyjnej.
- Metoda opiera się na zastosowaniu płytek powlekanych żelatyną, nieprzylepnych naczyń do hodowli bakterii oraz kontrolowanych warunków w inkubatorze (37°C, 5% CO2).
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania roztworu zapasowego kwasu retinowego oraz ocena jakości ciał embrionoidalnych za pomocą mikroskopii.
- Wymagane jest uwzględnienie adaptacji przy przenoszeniu protokołów między liniami mESC (np. A2lox a pochodne 129).
- Ograniczeniem jest konieczność rygorystycznej kontroli jakości stanu ciał embrionoidalnych przed indukcją kwasem retinowym, aby zapewnić sukces różnicowania.
