Name: Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę różnicowania neuronalnego z mysich komórek macierzystych embrionalnych in vitro. Protokół ten charakteryzuje się wysoką wydajnością, niskimi kosztami i łatwością wykonania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31501099) oraz Średniego i Młodego z Departamentu Edukacji prowincji Hubei w Chinach (nr Q20191104). Dziękujemy profesorowi Wenshengowi Dengowi z Uniwersytetu Nauki i Technologii w Wuhan za dostarczenie linii embrionalnych komórek macierzystych myszy A2lox.

1. Hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy
<ol>
	<li>Przygotuj 0,1% pokryte żelatyną naczynia lub płytki do hodowli komórkowych.
	<ol>
		<li>Dodaj 2 ml wysterylizowanej 0,1% żelatyny (0,1% w/v w wodzie) do naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm. Delikatnie kołysz, aby zapewnić równomierne pokrycie szalek z kultur komórkowych.</li>
		<li>Umieścić naczynia w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C i pozostawić do powlekania przez 1 godzinę.</li>
		<li>Usuń 0,1% roztwór żelatyny przed wysiewem komórek. 
		UWAGA: Po wyjęciu żelatyny nie ma potrzeby suszenia ani mycia panierowanych naczyń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy (A2lox i 129)
	<ol>
		<li>Inkubować komórki mESC (A2lox i 129) na pokrytych 0,1% żelatyną 60-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych w pożywce wzrostowej mESC w temperaturze 37 °C odpowiednio w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Pożywka wzrostowa mESC składa się z 85% nokautującego DMEM/F12, 15% nokautującej surowicy zastępczej (KSR), 0,1 mM β-merkaptoetanolu (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% aminokwasu endogennego (NEAA), 1% penicyliny/streptomycyny (P/S), 1000 U/ml czynnika hamującego białaczkę (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inhibitor GSK-3) i 0,33 nM PD0325901 (inhibitor MEK). 
		UWAGA: β-merkaptoetanol jest łatwopalny i ma toksyczność inhalacyjną. Trzymaj z dala od źródeł ognia i noś maskę, aby uniknąć wdychania podczas użytkowania.</li>
		<li>Codziennie zmieniaj pożywkę wzrostową mESC, aby uzyskać lepszy wzrost A2lox i 129.</li>
		<li>Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, usuń pożywkę i dodaj 1 ml 0,1% trypsyny do naczynia. Delikatnie kołysz przez 30 sekund, aby zapewnić równomierne pokrycie trypsyny na wszystkich komórkach.</li>
		<li>Pozostaw komórki na około 1 minutę, aby wytrypsynasię poddała, a następnie usuń trypsynę za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Dodać 2 ml pożywki wzrostowej mESC do naczynia, kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
		<li>Policz gęstość komórek w zawiesinie tak dokładnie, jak to możliwe, za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Podziel komórki na 7 grup i wywołaj różnicowanie za pomocą różnych protokołów pokazanych w Tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Różnicowanie między mESC a NPC (Faza I)
<ol>
	<li>Przygotować 0,1% pokryte żelatyną płytki do hodowli komórkowych lub szkiełka nakrywkowe.
	<ol>
		<li>Przed użyciem należy przygotować 0,1% pokryte żelatyną płytki 6-dołkowe lub szkiełka nakrywkowe, jak w kroku 1.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Faza I różnicowania z zastosowaniem protokołu 1 (Tabela 1)
	<ol>
		<li>Wysiewać około 2 x 104 mESC w 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego I na basenie w 0,1% pokrytych żelatyną płytkach 6-dołkowych. Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 6 godzin, aby umożliwić przyłączenie.</li>
		<li>Po przyłączeniu wyjąć komórki z inkubatora i dwukrotnie przemyć je 2 ml PBS.</li>
		<li>Dodać 2 ml pożywki do różnicowania podstawowego I (Tabela 1) do każdej studzienki i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze.</li>
		<li>Pozostaw komórki do różnicowania na 8 dni. Pożywkę różnicowania podstawowego I należy wymieniać co 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Faza I różnicowania z zastosowaniem protokołu 2 (Tabela 1)
	<ol>
		<li>Dodać 1,5 x 106 mESC do nieprzywierającego naczynia bakteryjnego w 10 ml podstawowej pożywki różnicującej I, aby umożliwić tworzenie się ciała zarodka w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
		<li>Po 2 dniach przenieś agregaty komórek do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść grawitacyjnie.</li>
		<li>Usunąć supernatant i dodać 10 ml świeżej pożywki do różnicowania podstawowego I w celu ponownego zawieszenia ciał zarodków. Przesadź je ponownie do nowego nieprzywierającego naczynia bakteryjnego i pozwól im się różnicować przez kolejne 2 dni.</li>
		<li>Sprawdź formowanie się ciał embrionalnych pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A).</li>
		<li>Pobrać ciała zarodków zgodnie z opisem w krokach 2.3.2-2.3.3. Wysiewać około 50 ciał zarodkowych w 2 ml podstawowej pożywki różnicującej I na studzienkę na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną.</li>
		<li>Przygotuj 1 mM wywar all-trans RA (w DMSO) i przechowuj z dala od światła w zamrażarce o temperaturze -80 °C po zapakowaniu. 
		UWAGA: RZS jest niestabilny i należy zwrócić uwagę na trzymanie go z dala od światła i zmniejszenie kontaktu powietrza podczas przygotowywania wywaru RA.</li>
		<li>W przypadku indukcji RA dodać 2 μl wywaru RA do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C i różnicować przez kolejne 4 dni.</li>
		<li>Zmieniaj całe 2 ml pożywki do różnicowania podstawowego I (z 1 μM RA) co 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Faza I różnicowania przy użyciu protokołu 3 (Tabela 1)
	<ol>
		<li>Posadzić 1,5 x 106 mESC w nieadhezyjnym naczyniu bakteryjnym w 10 ml podłoża do różnicowania podstawowego I. Pozostawić na 2 dni do utworzenia ciała zarodka w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
		<li>Sprawdź formowanie się ciał embrionalnych pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B).</li>
		<li>Przenieś agregaty komórek do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść grawitacyjnie.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć sklarowany osad i dodać 10 ml świeżej pożywki do różnicowania podstawowego I w celu ich ponownego zawieszenia.</li>
		<li>Wysiewać około 50 ciał zarodkowych do 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego I na basenie na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną.</li>
		<li>W przypadku indukcji RA dodać 2 μl wywaru RA do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C i różnicować przez kolejne 6 dni. Zmieniaj całe podstawowe podłoże różnicujące I (z 1 μM RA) co 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Faza I różnicowanie przy użyciu protokołu 4 (Tabela 1)
	<ol>
		<li>Wysiewać około 2 x 104 mESC w obrębie 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego I na studzienkę na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić załączenie przez 6 godzin.</li>
		<li>Po przyłączeniu umyj komórki dwukrotnie 2 ml PBS. Dodać 2 ml podstawowej pożywki różnicującej I do każdej studzienki i pozostawić do różnicowania przez 4 dni w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W celu indukcji RA dodać 2 μl wywaru all-trans RA do każdego dołka (stężenie robocze wynosi 1 μM), aby wywołać różnicowanie przez kolejne 4 dni.</li>
		<li>W całym procesie wymieniaj całe podłoże co 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Faza I różnicowanie z zastosowaniem protokołu 5 (Tabela 1)
	<ol>
		<li>Wysiewać około 2 x 104 mESC w obrębie 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego I na studzienkę na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić załączenie przez 6 godzin.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie 2 ml PBS. Dodać 2 ml podstawowej pożywki różnicującej I do każdej studzienki i pozostawić do różnicowania przez 2 dni w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W celu późniejszej indukcji RA dodać 2 μl wywaru RA do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C w celu wywołania różnicowania przez kolejne 6 dni.</li>
		<li>W całym procesie wymieniaj całe podłoże co 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie fazy I przy użyciu protokołu 6 (Tabela 1)
	<ol>
		<li>Posadź 1,5 x 106 mESC w nieadhezyjnym naczyniu bakteryjnym w 10 ml pożywki N2B27 II (Tabela 1), aby umożliwić tworzenie ciał zarodkowych.</li>
		<li>Drugiego dnia zebrać agregaty komórkowe zgodnie z opisem w krokach 2.3.2-2.3.3 i ponownie zawiesić ciała zarodków przy użyciu 10 ml świeżej pożywki N2B27 II.</li>
		<li>Przesadzić je do nowego nieprzywierającego naczynia bakteryjnego i pozwolić na różnicowanie przez kolejne 2 dni w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Sprawdzić formowanie się ciał zarodkowych pod mikroskopem.</li>
		<li>W 4 dniu zbierz ciała zarodków. Wysiewać około 50 ciał zarodkowych na studzienkę na 0,1% pokrytych żelatyną 6-dołkowych płytkach z 2 ml pożywki N2B27 II.</li>
		<li>Dodać 2 μl wywaru all-trans RA do każdej studzienki i wywołać różnicowanie przez kolejne 4 dni. Wymieniać całe podłoże (pożywkę N2B27 II na 1 μM RA) co dwa dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Faza I różnicowania przy użyciu protokołu 7 (Tabela 1)
	<ol>
		<li>Wysiewać około 2 x 104 mESC w obrębie 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego I na studzienkę na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić załączenie przez 6 godzin.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS. Następnie dodać 2 ml pożywki N2B27 II do każdej studzienki i pozostawić do różnicowania przez 8 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
		<li>Wymieniaj całe podłoże N2B27 II co 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obserwacja morfologii komórek
<ol>
	<li>Codziennie sprawdzaj stan różnicowania wyżej wymienionych 7 grup pod mikroskopem światła z odwróconymi fazami kontrastu.</li>
	<li>Losowo wybierz co najmniej 12 pól i zrób zdjęcia, aby zarejestrować zmiany morfologiczne każdej grupy na D8.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki: Wysiewa się mESC na 0,1% szkiełkach nakrywkowych pokrytych żelatyną i pozostawia do różnicowania przez 8 dni przy użyciu protokołów wymienionych w kroku 2.</li>
	<li>Płukanie: W 8 dniu wyjąć próbki z inkubatora i usunąć pożywkę różnicującą przez aspirację. Delikatnie płucz komórki raz 1 ml PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Utrwalanie: Dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu do każdej próbki i utrwal komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Płukanie: Po utrwaleniu delikatnie przepłucz komórki 1 ml PBS 3 razy, przez 5 minut każda.</li>
	<li>Permeabilizacja: Dodaj 1 ml 0,2% TritonX-100 w PBS do każdej próbki i pozostaw na 8 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płukanie: Po permeabilizacji delikatnie spłucz komórki 1 ml PBS 3 razy, po 5 minut każda.</li>
	<li>Blokowanie: Dodać 1 ml 10% koziej surowicy w PBS do każdej próbki i inkubować w RT przez 1 godzinę, aby zablokować wszelkie niespecyficzne interakcje.</li>
	<li>Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało anty-Nestin w stosunku 1:100 przy użyciu 5% surowicy koziej w PBS.</li>
		<li>Nałożyć 500 μl rozcieńczonego przeciwciała na różne próbki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płukanie: Usunąć przeciwciało i delikatnie przepłukać próbki 1 ml PBS 3 razy przez 8 minut każda.</li>
	<li>Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć kozią anty-mysią IgG znakowaną Alexa Fluor 488 w stosunku 1:500, używając 5% koziej surowicy w PBS.</li>
		<li>Nałożyć 500 μl rozcieńczonego przeciwciała na różne próbki i inkubować w ciemności przez 2 godziny w temperaturze RT. 
		UWAGA: Po zastosowaniu fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego wszystkie kolejne kroki należy wykonać w ciemności, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płukanie: Usunąć przeciwciało drugorzędowe i delikatnie przepłukać próbki 1 ml PBS 3 razy przez 8 minut każda.</li>
	<li>Barwienie jądrowe i montaż
	<ol>
		<li>Umieść jedną kroplę medium montażowego DAPI na czystym mikroszkiełku.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij próbki z płytek i umieść próbkę na podłożu montażowym DAPI z kuwetą skierowaną w dół. Pozostaw w ciemności na 5 minut w RT.</li>
		<li>Usuń nadmiar nośnika montażowego DAPI za pomocą papieru chłonnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja pod mikroskopem fluorescencyjnym
	<ol>
		<li>Umieść próbki pod mikroskopią fluorescencyjną i wykryj sygnał dla DAPI i Alexa Fluor 488 za pomocą odpowiednich filtrów.</li>
		<li>Równomiernie i losowo wybierz 10-15 różnych pól wizualnych dla każdej próbki i nagraj obrazy za pomocą kamery CCD.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Różnicowanie od NPC do neuronów (Faza II)
<ol>
	<li>Przygotuj pochodne mESC w ramach różnicowania fazy I, korzystając z protokołu 3 (8 dni, tabela 1), jak opisano w kroku 2.4, który ma najwyższą skuteczność różnicowania (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
	UWAGA: Po różnicowaniu w fazie I należy przeprowadzić kontrolę jakości za pomocą obserwacji morfologii komórek i testu immunofluorescencyjnego, o których mowa powyżej, w celu zapewnienia zdrowych i wysokowydajnych NPC.</li>
	<li>Wysiewać około 5 x 10 pochodnych5 mESC w obrębie 2 ml podstawowej pożywki różnicującej I na studzienkę na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną. Losowo podziel pochodne mESC na 3 grupy, odpowiednio jako protokół 1 fazy II, protokół 2 i protokół 3.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić naczepianie na 6 godzin. Przemyć je dwukrotnie 2 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki różnicującej I, pożywki N2B27 I i pożywki N2B27 II (Tabela 2) odpowiednio do każdej studzienki z powyższych grup.</li>
	<li>Umieść płytki w inkubatorze i pozostaw do rozróżnienia przez kolejne 10 dni. Zmieniaj odpowiednie podłoże co 2 dni.</li>
	<li>Sprawdź stan różnicowania i zapisz zmiany morfologiczne, jak wspomniano w kroku 3.</li>
	<li>W dniu 18 oceń generację neuronów (dodatni β-tubulina III) i określ skuteczność różnicowania 3 protokołów użytych w kroku 4.</li>
</ol>

<ol><li>Vieira, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+differentiation+into+mature+neurons%3A+mechanisms+of+regulation+and+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).</li>
<li>Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+embryonic+stem+cells+on+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genomic+Medicine%2C+Biomarkers%2C+and+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy.</a> Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).</li>
<li>Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+an+in+vitro+tool+for+the+study+of+the+expression+patterns+of+the+neuronal+cytoskeleton+during+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).</li>
<li>Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+modified+by+the+Neural+Growth+Factor+%28NGF%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene.</a> Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).</li>
<li>Yoshimatsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+efficacy+of+small+molecules+for+neural+differentiation+of+common+marmoset+ESCs+and+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs.</a> Neuroscience research. , (2019).</li>
<li>Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+matrix+microenvironment+for+targeted+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+and+glial+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages.</a> Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).</li>
<li>Gazina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+derivation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+generating+synchronous+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).</li>
<li>Ohnuki, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hanging+drop+culture+conditions+on+embryoid+body+formation+and+neuronal+cell+differentiation+using+mouse+embryonic+stem+cells%3A+Optimization+of+culture+conditions+for+the+formation+of+well-controlled+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).</li>
<li>Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+serum-free+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture.</a> Journal of Visualized experiments. (99), e52823(2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+neuronal+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486(2020).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+optimal+suspension+culture+time+for+the+osteoblastic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+the+embryoid+body+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).</li>
<li>Lu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinoic+acid+promotes+neural+lineage+entry+by+pluripotent+embryonic+stem+cells+via+multiple+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways.</a> BMC Cell Biology. 10, 57(2009).</li>
<li>Kanungo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+in+P19+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).</li>
<li>Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+and+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation%3A+Cross+talk+between+genomic+and+non-genomic+effects+of+RA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+maintains+self-renewal+of+murine+embryonic+stem+cells+via+a+feedback+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism.</a> Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).</li>
<li>Wu, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-induced+upregulation+of+miR-219+promotes+the+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Disease%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells.</a> Cell Death Disease. 8, 2953(2017).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+regulates+germ+cell+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+through+a+Smad-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).</li>
<li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+neuronal+induction+of+the+P19+embryonic+carcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line.</a> Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).</li>
<li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li>
<li>Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Differentiation+of+Retinoic+Acid-Induced+Human+Pluripotent+Embryonic+Carcinoma+Stem+Cell+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons.</a> PLoS ONE. 6 (1), 16174(2011).</li>
<li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym badaniu opracowaliśmy prostą i skuteczną metodę różnicowania neuronów od mESC, przy niskich kosztach i łatwych do uzyskania materiałach. W tej metodzie 2 dni tworzenia ciała zarodka, a następnie 6 dni indukcji RZS mogą skutecznie promować różnicowanie mESC w NPC (protokół fazy I 3). W przypadku różnicowania fazy II, podłoże N2B27 II (Faza II-protokół 3) najskuteczniej indukuje różnicowanie się od NPC do neuronów. Aby zapewnić sukces, należy zwrócić większą uwagę na kilka kluczowych kroków.
<p class="jove...

Embrionalne komórki macierzyste (ESC) są pluripotencjalne i mogą różnicować się w neuronalne komórki prekursorowe (NPC), a następnie w neurony w określonych warunkach1. Neurogeneza oparta na ESC stanowi najlepszą platformę do naśladowania neurogenezy, służąc w ten sposób jako użyteczne narzędzie do badań biologii rozwojowej i potencjalnie pomagając w medycynie regeneracyjnej2,3. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opisano wiele strategii indukowania neurogenezy embrionalnej, takich jak metoda transgeniczna4, przy użyciu małych cząsteczek5, przy użyciu mikrośrodowiska matrycy 3D6, oraz technika współhodowli7. Jednak większość z tych protokołów jest albo ograniczona pod względem warunków, albo trudna w obsłudze, dlatego nie nadają się do użytku w większości laboratoriów.
Aby znaleźć łatwą w obsłudze i tanią metodę skutecznego różnicowania neuronów od mESC, zastosowano tutaj kombinatoryczną strategię przesiewową. Jak opisano w Rysunek 1, cały proces neurogenezy embrionalnej został podzielony na 2 fazy. Faza I odnosi się do procesu różnicowania się od mESC do NPC, a faza II odnosi się do późniejszego różnicowania się od NPC do neuronów. Opierając się na zasadach łatwej obsługi, niskich kosztów, łatwo dostępnych materiałów i wysokiej wydajności różnicowania, wybrano siedem protokołów w Fazie I i trzy protokoły w Fazie II w oparciu o tradycyjny przylegający system hodowli jednowarstwowej lub system tworzenia ciał zarodkowych8,9. Efektywność różnicowania protokołów w obu fazach oceniano za pomocą obserwacji morfologii komórek i testu immunofluorescencji. Łącząc najbardziej efektywny protokół każdej fazy, opracowaliśmy zoptymalizowaną metodę różnicowania neuronów od mESC.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-Nestin [Rat-401]</td><td>Abcam</td><td>Ab11306</td><td>przechowywane w temperaturze -80 & deg; C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>przeciwciała anty-&beta-tubuliny III wytwarzanego w króliku</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>przechowywanym w temperaturze -80 & stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50X), bez surowicy</td><td>17504044 Gibco</td><td></td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021)</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Znakowana Cy3 kozia anty-królicza IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>przechowywana w temperaturze -20 stopni; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni C</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>przechowywana w temperaturze -20 ° C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>Mikroskopia fluorescencyjna</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Gibco</td><td>CM0635B</td><td>przechowywana w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Barwienie immunologiczne Bufor do rozcieńczania przeciwciał pierwotnych</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>czynnika hamującego białaczkę ludzkiego</td><td>Sigma</td><td>L5283</td><td>przechowywanego w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Medium montażowe z DAPI - wodne, Fluoroshield</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td>przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>N-2 Suplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Jackson</td><td>005-000-121</td><td>przechowywana w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Nieprzylepne naczynie bakteryjne</td><td>Corning</td><td>3262</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (1X)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny</td><td>Hyklon</td><td>SV30010</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni C</td></tr><tr><td>PD0325901(Mirdametinib)</td><td>Selleck</td><td>S1036</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>przechowywany w temperaturze -80 & deg; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Szczep 129 Mysie embrionalne komórki macierzyste</td><td>Cyagen</td><td>MUAES-01001</td><td>Utrzymywany w systemie hodowli bez karmienia</td></tr><tr><td>Stem-Cellbanker (wolny od DMSO)</td><td>ZENOAQ</td><td>stembankbanker DMSO wolny od DMSO</td><td>przechowywany w temperaturze -20 &deg; C, unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25% (1X) Roztwór</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni; C i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>6 - płytka dołkowa</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 60 mm</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>NUNC</td><td>339650</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) jest potencjalnym narzędziem do wyjaśnienia kluczowych mechanizmów związanych z neurogenezą i potencjalnie pomocne w medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu opracowaliśmy skuteczną i tanią metodę różnicowania neuronów od mESC in vitro, wykorzystując strategię kombinatorycznych badań przesiewowych. W określonych tutaj warunkach, 2-dniowy protokół indukcji ciała zarodkowego + 6-dniowy kwas retinowy umożliwia szybkie i skuteczne różnicowanie się z mESC w neuronalne komórki prekursorowe (NPC), co widać po tworzeniu dobrze ułożonych i podobnych do neurytów A2lox i 129 pochodnych, które są Nestin dodatnie. Stan zdrowia ciał zarodkowych i punkt czasowy, w którym stosuje się kwas retinowy (RA), a także stężenia RZS, mają kluczowe znaczenie w tym procesie. W późniejszym różnicowaniu się z NPC w neurony, N2B27 medium II (uzupełnione przez podłoże neurobazalne) może lepiej wspierać długoterminowe utrzymanie i dojrzewanie komórek nerwowych. Prezentowana metoda charakteryzuje się wysoką wydajnością, niskimi kosztami i łatwością obsługi oraz może być potężnym narzędziem do badań z zakresu neurobiologii i biologii rozwoju.

2-dniowe tworzenie ciał embrionalnych + 6-dniowa indukcja RA najlepiej kieruje różnicowaniem mESC w NPC (Faza I). Aby ustalić optymalny protokół najlepiej promujący różnicowanie mESC w NPC (Faza I), przetestowano 7 protokołów zarówno na mESC A2lox, jak i 129 (Tabela 1), a stan różnicowania każdej grupy monitorowano za pomocą mikroskopu świetlnego. Jak pokazano na Rysunku 3A, większość pochodnych A2lox i 129 poddanych działaniu „2-dniowego tworzenia ciał embrionalnych + 6-dni...

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Różnicowanie neuronów na podstawie testów mysich jest doskonałym modelem do zilustrowania kluczowych mechanizmów zaangażowanych w neurogenezę. Demonstrujemy zoptymalizowaną metodę neurogenezy zarodków przy użyciu firmowej strategii badań przesiewowych toro. Technika ta ma zalety wysokiej wydajności, niskich kosztów i łatwej obsługi i nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów.Jest to potężne narzędzie do badań neurobiologicznych. Aby przeprowadzić różnicowanie przy użyciu protokołu pierwszego, należy wysiać 20 000 mysich embrionalnych komórek macierzystych w dwóch mililitrach podstawowej pożywki różnicującej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki pokrytej 0,1% żelatyną. Po przyłączeniu komórek umyj komórki dwoma mililitrami PBS i dodaj dwa mililitry pożywki do różnicowania podstawowego do każdej studzienki, a następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze.Pozwól komórkom różnicować się przez osiem dni, wymieniając pożywkę co dwa dni. Aby wykonać protokół drugi, dodaj 1,5 miliona mysich embrionalnych komórek macierzystych do nieprzywierającego naczynia bakteryjnego w 10 mililitrach podstawowej pożywki różnicującej i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić tworzenie ciała zarodka. Po dwóch dniach przenieś agregaty komórek do 15-mililitrowych probówek wirówkowych i pozwól im osiąść grawitacyjnie.Usunąć supernatant i dodać 10 mililitrów świeżej pożywki do różnicowania podstawowego, aby ponownie zawiesić ciała zarodków. Następnie przesadź je do nowego nieprzywierającego naczynia i inkubuj przez kolejne dwa dni. Zebrać i wysiać około 50 ciał zarodków w dwóch mililitrach podstawowej pożywki różnicującej na studzienkę na pokrytą żelatyną płytkę sześciodołkową.W celu indukcji kwasu retinowego dodaj dwa mikrolitry bulionu RZS do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromola. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze i różnicuj komórki przez kolejne cztery dni. Aby przeprowadzić różnicowanie przy użyciu protokołu trzeciego, powtórz protokół drugi, ale poczekaj tylko dwa dni na uformowanie ciała embrionalnego i sześć dni na indukcję RZS.Kontrola jakości powstawania ciał zarodkowych powinna być przeprowadzana przy użyciu mikroskopii. Tylko te z jasnymi rdzeniami mogą skutecznie odróżnić się w kolejnym procesie. W przypadku protokołu czwartego należy umieścić 20 000 embrionalnych komórek macierzystych myszy w każdym dołku na płytki pokryte żelatyną i postępować zgodnie z protokołem pierwszym.Po umożliwieniu komórkom różnicowania się przez cztery dni, dodaj dwa mikrolitry całego stada trans RA do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez kolejne cztery dni. Aby wykonać protokół piąty, powtórz protokół czwarty, ale rozpocznij indukcję RZS już po dwóch dniach różnicowania. W przypadku protokołu szóstego posadź 1,5 miliona komórek macierzystych w nieprzylepnym naczyniu bakteryjnym w 10 mililitrach N2B27 pożywki 2 i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić utworzenie ciała zarodka.Po dwóch dniach zbierz agregaty komórkowe zgodnie z wcześniejszym opisem i ponownie zawieś ciała zarodków za pomocą 10 mililitrów świeżego podłoża N2B27 dwa. Przesadź je ponownie do nowego, nieprzywierającego naczynia bakteryjnego i pozwól im się różnicować przez kolejne dwa dni. Czwartego dnia zebrać i wysiać około 50 ciał zarodków na studzienkę na pokrytych żelatyną płytkach sześciodołkowych z dwoma mililitrami N2B27 podłoże dwa.Dodaj dwa mikrolitry całego wywaru trans RA do każdej studzienki i wywołaj różnicowanie przez kolejne cztery dni. Aby wykonać protokół siódmy, wysiewaj około 20 000 komórek w dwóch mililitrach podstawowej pożywki różnicującej na studzienkę na płytki pokryte żelatyną. Po przyłączeniu komórek i dwóch płukaniach PBS dodaj dwa mililitry pożywki N2B7, po dwa do każdej studzienki i pozwól komórkom różnicować się przez osiem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po przeprowadzeniu różnicowania w pierwszej fazie przy użyciu protokołu trzeciego, wysiewaj około 500 000 pochodnych embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwóch mililitrach podstawowej pożywki różnicującej na studzience na 0,1% płytki pokryte żelatyną. Losowo podziel pochodne na trzy grupy, aby przetestować trzy protokoły różnicowania fazy drugiej. Inkubować płytkę przez sześć godzin, a następnie przemyć komórki dwukrotnie dwoma mililitrami PBS i dodać dwa mililitry pożywki do różnicowania podstawowego, pożywki N2B27 po jednej lub pożywki N2B27 po dwie do każdej studzienki, w zależności od protokołu.Umieść ostrza w inkubatorze i pozwól komórkom różnicować się przez kolejne 10 dni, zmieniając odpowiednią pożywkę co dwa dni. Przetestowano siedem protokołów w celu określenia optymalnego protokołu różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w ogólnych komórkach prekursorowych lub NPC. Protokoły przetestowano zarówno na zamkach A2lox, jak i na 129 komórkach, a stan różnicowania każdej grupy monitorowano za pomocą mikroskopu świetlnego.Większość pochodnych A2lox i 129 wykazywała dobrze ułożone i podobne do neurytów morfologie zgodnie z protokołem trzecim, co wskazuje na powstawanie NPC. Jednak komórki zróżnicowane za pomocą protokołu drugiego wydawały się apoptotyczne, co może być spowodowane brakiem składników odżywczych w ciałach embrionalnych. Aby dodatkowo potwierdzić powstawanie NPC, wykryto komórki gniazdo-dodatnie za pomocą testu immunofluorescencyjnego.Protokół trzeci spowodował najwyższy odsetek komórek nestin-dodatnich, osiągający odpowiednio 78 i 69% w pochodnych A2lox i 129. Przetestowano trzy protokoły różnicowania NPC w neurony. Stwierdzono, że protokół trzeci najskuteczniej indukuje różnicowanie.Większość pochodnych A2lox i 129 w drugiej fazie protokołu trzeciego miała wydłużone struktury podobne do neuronów z wyraźnymi neurytami i przedłużeniami ciała komórki. Testy immunofluorescencyjne dodatkowo potwierdziły wytwarzanie neuronów z procentem trzech dodatnich komórek beta tubuliny do 68 i 59% odpowiednio w pochodnych A2lox i 129 przy użyciu protokołu trzeciego. Próbując tej procedury, ważne jest, aby upewnić się, że testy na myszach są zdrowe i niezróżnicowane przed różnicowaniem.Ponadto ścisła kontrola jakości powinna być przeprowadzana po utworzeniu w korpusach wiertniczych, a przed różnicowaniem w drugiej fazie. Technika ta stanowi standardowy model dla badaczy neurobiologii i biologii rozwoju i oczekuje się, że będzie potężnym narzędziem do zilustrowania kluczowych mechanizmów zaangażowanych w neurogenezę.

neuronal-differentiation-from-mouse-embryonic-stem-cells-in-vitro

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy nowy protokół w celu zwiększenia wydajności różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe in vitro. Zróżnicowane komórki ES nabyły cechy neuronów ruchowych, co potwierdzono poprzez wykazanie ekspresji markerów neuronalnych i neuronów ruchowych z wykorzystaniem technik immunohistochemicznych.

Efektywna różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Film prezentował metodę hodowli komórkowej do różnicowania neuronalnych komórek progenitorowych w neurony. Poprzez inkubację komórek w pożywce bogatej w składniki odżywcze uzupełnionej czynnikami wzrostu, komórki progenitorowe dojrzewały do neuronów z rozwiniętymi aksonami i dendrytami. Środek stabilizujący zapewniał żywotność komórek i chronił przed uszkodzeniami oksydacyjnymi w całym procesie różnicowania.

Różnicowanie nerwowych komórek progenitorowych w neurony

Ten film demonstruje technikę różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w połączoną w sieć populację neuronów z funkcjonującymi synapsami. Przedstawiono w nim etapy związane z różnicowaniem embrionalnych komórek macierzystych w neurony, indukcją tworzenia sieci neuronalnej i wzbogacaniem kultury w neurony połączone w sieć.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w populację neuronów połączonych w sieć

Opisany jest niestandardowy protokół różnicowania komórek ES myszy w zdefiniowane populacje wysoce czystych neuronów wykazujących działające synapsy i emergentne zachowanie sieci. Analiza elektrofizjologiczna wykazała utratę przekaźnictwa synaptycznego po ekspozycji na serotypy neurotoksyny botulinowej /A-/G i neurotoksynę tężcową.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Poznaj zoptymalizowaną metodę różnicowania neuronalnego z mysich komórek macierzystych embrionalnych in vitro. Protokół ten charakteryzuje się wysoką wydajnością, niskimi kosztami i łatwością wykonania.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Przeglądaj więcej filmów