Mikropęcherzyki reagujące na magnesy, akustycznie i optycznie do hipertermii magnetycznej i potototermicznej skojarzonej terapii nowotworów

Prezentowany tutaj jest protokół wytwarzania mikropęcherzyków z nanocząsteczkami tlenku żelaza (NSM) poprzez samoorganizację, synergię reakcji magnetycznej, akustycznej i optycznej w jednej nanoterapeutycznej platformie do hipertermii magnetycznej i fototermicznej terapii przeciwnowotworowej.

Protokół ten jest bardzo obiecujący dla poprawy dostarczania po wprowadzeniu nanomedycyny i skuteczności przeciwnowotworowej nanocząstek w leczeniu raka. Technika ta łączy synergię reakcji magnetycznych, akustycznych i optycznych w jedną platformę nanoterapeutyczną do kontroli i ukierunkowanego dostarczania nanomedycyny oraz ułatwia połączenie terapii fototermicznej i hipertermii magnetycznej. Procedurę zademonstruje Siyu Wang, specjalista od magnetycznych, akustycznych i potrójnie reagujących na optykę mikropęcherzyków do hipertermii magnetycznej i fototermicznej terapii przeciwnowotworowej z mojego laboratorium.

W celu tworzenia mikropęcherzyków z powłoką nanocząstek, równomiernie rozproszyć magnetyczne nanocząstki tlenku żelaza w wodzie dejonizowanej, aby wytworzyć roztwór podstawowy 10 miligramów na mililitr i załadować roztwór nanocząstek do myjki ultradźwiękowej na 20 minut. Pod koniec sonikacji dodać 150 mikrolitrów wody dejonizowanej, 150 mikrolitrów 10-milimolowego dodecylosiarczanu sodu i 400 mikrolitrów sonikowanego roztworu nanocząstek tlenku żelaza w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej. Następnie zamocuj homogenizator z rusztowaniem w łaźni lodowej i umieść roztwór nanocząstek w łaźni lodowej.

Zanurz sondę homogenizatora w roztworze nanocząstek i homogenizuj zawiesinę przez trzy minuty z prędkością 20 000 obrotów na minutę. Pod koniec homogenizacji pozwól roztworowi ustabilizować się przez 12 godzin w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem probówki w uchwycie magnetycznym w celu adsorpcji mikropęcherzyków z nanocząstkami do ścianki probówki. Zastąp supernatant jednym mililitrem świeżej wody dejonizowanej trzy razy, aby umyć mikropęcherzyki pokryte nanocząsteczkami.

Po ostatnim umyciu lekko potrząśnij probówką i przenieś 10 mikrolitrów mikropęcherzyków pokrytych nanocząstkami na czyste szklane szkiełko. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego i 20-krotnego powiększenia, aby zobrazować mikropęcherzyki pokryte nanocząstkami. Po zobrazowaniu otwórz obraz w oprogramowaniu mikroskopu i za pomocą linijki ustaw czerwoną linię o tej samej długości co linijka.

Kliknij przycisk ustaw i skaluj, aby wprowadzić długość linijki i narysować linie o tej samej długości przy średnicach co najmniej 200 pojedynczych mikropęcherzyków. Następnie kliknij raport i wyświetl raport. Aby zmierzyć odpowiedź akustyczną mikropęcherzyków, rozcieńczyć 200 mikrolitrów mikropęcherzyków pokrytych nanocząstkami w 800 mikrolitrach wody dejonizowanej w rurki o pojemności 1,5 mililitra i podłączyć generator funkcyjny, wzmacniacz, dopasowanie impedancji i domowy przetwornik ostrości.

Umieść przetwornik na środku dna sztucznego prostopadłościanu i połącz hydrofon z oscyloskopem, aby monitorować intensywność wyjściowych ultradźwięków. Dodaj tyle wody dejonizowanej, aby zanurzyć przetwornik i dostosować generator funkcyjny do trybu zamiatania. Dostosuj zakres częstotliwości od 10 do 900 kiloherców i ustaw amplitudę na 20 napięć od szczytu do szczytu.

Użyj wzmacniacza, aby dostosować moc ultradźwięków do 0.1%, a czas trwania cyklu do czterech sekund z jednosekundowym odstępem czasu. Umieść rurkę z nanocząstkami w rusztowaniu na górze domowego przetwornika ostrości i przymocuj magnes do dolnej części rurki. Włącz generator funkcyjny i moc wzmacniacza.

Po pięciu 25-sekundowych cyklach ultradźwiękowych wyłącz generator funkcyjny i wyjmij magnes. Następnie zastąp roztwór nanocząstek jednym mililitrem wody dejonizowanej i powtórz ultradźwięki i zabieg. Aby skonfigurować laser do optycznego leczenia mikropęcherzyków, najpierw włącz zasilanie lasera.

Po kilku minutach zamocuj diodę laserową sprzężoną ze światłowodem o długości 808 nanometrów na stojaku retortowym i użyj światłowodu, aby skierować wiązkę laserową na stolik próbki. Użyj wypukłej soczewki, aby ustawić ostrość na stoliku próbki, aby uzyskać plamkę świetlną o średnicy sześciu milimetrów i zmierz moc wyjściową za pomocą miernika mocy lasera. Następnie dostosuj moc do jednego wata na centymetr kwadratowy.

Aby wykonać pomiar fototermiczny, należy przygotować mililitrowe objętości nanocząstek tlenku żelaza o różnych stężeniach w pojedynczych 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych i umieścić pierwszą probówkę w skupionym obszarze wiązki laserowej. Zapisz temperaturę bazową próbki i włącz kamerę termowizyjną z laserem i podczerwienią. Naświetlać próbkę w sposób ciągły przez 10 minut, rejestrując temperaturę w czasie rzeczywistym.

Następnie wyłącz laser i kamerę i poczekaj, aż temperatura obszaru powróci do linii bazowej, zanim zmierzysz inne stężenia próbki w ten sam sposób. Do pomiaru hipertermii magnetycznej w roztworze wodnym należy przygotować różne rozcieńczenia nanocząstek tlenku żelaza, jak pokazano, i umieścić jedno rozcieńczenie w środku cewki miedzianej z zimną indukcją magnetyczną. Włącz zmienne pole magnetyczne i kamerę termowizyjną na podczerwień i nieprzerwanie indukuj próbkę przez 10 minut, rejestrując temperaturę w czasie rzeczywistym.

Na zakończenie zabiegu należy wyłączyć zmienne pole magnetyczne i kamerę. Gdy temperatura cewki miedzianej powróci do wartości wyjściowej, zmierz następną próbkę. Mikropęcherzyki z powłoką nanocząstek zazwyczaj wykazują kulisty kształt o średniej średnicy około 5,41 mikrometra.

Chociaż mikropęcherzyki pozostają nienaruszone przez okres do roku, stopniowe uwalnianie żelaza można osiągnąć, zwiększając liczbę cykli ultradźwiękowych. Pomiar fototermiczny za pośrednictwem nanocząstek tlenku żelaza w roztworze wodnym ujawnia szybki wzrost temperatury nanocząstek tlenku żelaza w czasie przy wzroście temperatury o 30 stopni Celsjusza osiągniętym po 10 minutach ekspozycji na światło laserowe w bliskiej podczerwieni przy stężeniu żelaza wynoszącym pięć miligramów na mililitr. W porównaniu z grupą kontrolną nie obserwuje się różnic w morfologii ani liczbie żywych komórek, gdy linie komórkowe raka piersi są inkubowane z wysokim stężeniem żelaza, co sugeruje dobrą biodostępność nanocząstek tlenku żelaza.

Po napromieniowaniu komórki rakowe poddane działaniu nanocząsteczek nabrały zaokrąglonego kształtu i wykazały zmniejszoną żywotność, co wskazuje na apoptozę. Pięć minut po napromieniowaniu temperatura miejsc wstrzyknięcia żelatyny gwałtownie wzrasta o około 20 stopni Celsjusza. Po poddaniu terapii zmiennym polem magnetycznym, obrazowanie termiczne różnych stężeń nanocząstek tlenku żelaza ujawnia naprzemienną reakcję pola magnetycznego charakterystyczną dla mikropęcherzyków pokrytych nanocząstkami.

Co więcej, całościowe obrazowanie myszy narażonych na terapię zmiennym polem magnetycznym ujawnia znaczące szybkie zmiany temperatury w obszarze zainteresowania. Podczas mieszania roztworu nanocząstek upewnij się, że sonda homogenizatora pozostaje całkowicie zanurzona w roztworze. Protokół ten może również zapewnić i poprawić penetrację do tkanek nowotworowych, aby sprostać wyzwaniom związanym z dostarczaniem nanoleków w leczeniu raka.