Name: Pomiar zbiegu iPSC za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Poznaj metodę pomiaru zbiegu iPSC przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania. Protokół umożliwia szybką ocenę wzrostu komórek na różnych powłokach macierzy pozakomórkowej bez konieczności zliczania pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez granty z Fondazione Bambino Gesù i Ricerca Corrente (włoskie Ministerstwo Zdrowia) dla C.C. Chcielibyśmy podziękować Dr Enrico Bertini (Wydział Neurologii, Oddział Chorób Nerwowo-Mięśniowych i Neurodegeneracyjnych, Laboratorium Medycyny Molekularnej, Dziecięcy Szpital Badawczy Bambino Gesù), Dr Stefania Petrini (Główny Ośrodek Mikroskopii Konfokalnej, Laboratoria Badawcze, Dziecięcy Szpital Badawczy Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Oddział Hematologii Onkologicznej, Terapii Genowej i Komórkowej, Dziecięcy Szpital Badawczy Bambino Gesù) oraz Roberta Ferretti (Oddział Hematologii Onkologicznej, Terapii Genowej i Komórkowej, Dziecięcy Szpital Badawczy Bambino Gesù) w celu przeprowadzenia rozmów naukowych i pomocy technicznej. Maria Vinci jest stypendystką programu "Children with Cancer UK Fellowship".

1. Powlekanie płytek 96-dołkowych
UWAGA: Różne powłoki były testowane na tej samej płycie, ale w oddzielnych studzienkach (zobacz Plik uzupełniający).
<ol>
	<li>Rozcieńczyć Matrigel w stosunku 1:100 w DMEM. Dodać 100 μl na studzienkę do 96 płytek dołkowych i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń roztwór i dwukrotnie umyj studzienki 100 μl DMEM.</li>
	<li>Rozcieńczyć lamininę (20 μg/ml, LN-521) w PBS (z wapniem i magnezem). Dodać 100 μl do studzienki i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia wykonaj dwa płukania DMEM przed wysiewem komórek.</li>
	<li>Rozcieńczyć witronektynę (10 μg/ml) w buforze rozcieńczającym. Dodać 100 μl na studzienkę do płytki 96-dołkowej i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj studzienki PBS (bez wapnia i magnezu) przed posiewem komórek.</li>
	<li>Rozcieńczyć HU-Fibronektynę (30 μg/ml) w ddH2O. Dodać 100 μl do studzienek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Następnie umyj studzienki pożywką przed wysianiem komórek.</li>
</ol>
2. Utrzymanie iPSC w kulturze
UWAGA: iPSC zostały zakupione komercyjnie. Komórki iPS pochodziły ze zdrowych ludzkich fibroblastów i zostały przeprogramowane przy użyciu technologii episomalnej.
<ol>
	<li>Z zamrażarki o temperaturze -80 °C lub ciekłego azotu rozmrozić kriokonserwowane iPSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Oczyścić fiolkę zawierającą komórki 70% etanolem przed włożeniem jej do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Dodać zawiesinę komórkową do 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych (np. mTeSR1) kropla po kropli za pomocą pipety 1000 μl w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 304 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową należy umieścić w dwóch dołkach z 6 dołków (105 iPSC na 6-dołkową szalkę do hodowli komórek), w których wcześniej posiano mysie fibroblasty embrionalne (MEF). Wysiewać MEF na dwa dni przed posiewem iPSC o gęstości 2,4 x 104/cm2 w DMEM (zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% L-glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny).</li>
	<li>Po wysianiu uzupełnij pożywkę komórkową 10 μM inhibitora ROCK Y-27632.</li>
	<li>Hoduj iPSC na MEF przez pierwsze 4-5 tygodni, a następnie w stanie wolnym od MEF (stan wolny od MEF), używając jednej z powłok będących przedmiotem zainteresowania (patrz krok 1 i tabela 1) w mTeSR1.</li>
	<li>Gdy iPSC są w 70-80% zlewne, pasaż 1:4 przy użyciu 0,5 mM EDTA przez 3-5 minut w RT. Dodaj 1 ml 0,5 mM EDTA na płytkę 6-dołkową (lub proporcjonalne ilości dla innych typów płytek). Przenieść do nowych dołków w warunkach bezzasilających i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 20%O2. </li>
	<li>Zmieniaj pożywkę na nowy mTeSR1 każdego dnia i dziel komórki co 2 dni.</li>
</ol>
3. Charakterystyka zbiegu komórek
<ol>
	<li>Do eksperymentów użyj 96-dołkowych płytek.</li>
	<li>Wysiewaj 10 000 komórek na studzienkę po co najmniej 1 miesiącu hodowli w stanie wolnym od karmnika, aby mieć pewność, że MEF nie zostały pasażowane. Użyj jednorazowych szkiełek do liczenia, aby policzyć komórki za pomocą mikroskopu optycznego.</li>
	<li>Wykonaj eksperymenty w trzech egzemplarzach. Dlatego przetestuj każdy warunek wysiewu w trzech dołkach.</li>
	<li>Wykonaj automatyczną akwizycję obrazu od 1 dnia po wysiewie za pomocą cytometru w trybie jasnego pola. Wykonuj automatyczną akwizycję obrazu co 24 godziny przez 5 dni. Szczegółowe informacje na temat parametrów eksperymentalnych można znaleźć w pliku uzupełniającym.</li>
	<li>Użyj automatycznego kontrastu i automatycznej ekspozycji, aby lepiej wizualizować komórki.</li>
	<li>Ustaw ustawienie analizy (patrz Plik uzupełniający) dla analizy konfluencji, aby zastosować maskę 60%, 80% i 100% na odwiert, aby ocenić zmiany ostrości spowodowane załamaniem światła na granicy studzienek. Użyj innego ustawienia analizy maski, o którym mowa powyżej, aby przeanalizować zbieg komórek w każdym punkcie czasowym.</li>
</ol>
4. Analizy statystyczne
<ol>
	<li>Proszę podać wyniki ilościowe jako średnią ± błędu standardowego średniej (SEM).</li>
	<li>Aby porównać ogólne różnice w różnych warunkach powlekania, należy uzyskać dane przy użyciu tych samych próbek i wykonać test t dla sparowanych prób Studenta. Wartości P mniejsze niż 0,05 są uważane za statystycznie istotne, a wszystkie podane wartości p są dwustronne.</li>
</ol>
5. Charakterystyka mikrowłókien cytoszkieletu
<ol>
	<li>Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (4% PFA) w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwa przemycia w PBS (łącznie 10 minut).</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu blokującego (składającego się z 5% BSA, 0,1% Tritonu w PBS) do każdego dołka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący i przemyć próbki dwukrotnie PBS przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu roboczego sprzężonego z falloidyną na próbkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć komórki dwukrotnie PBS (10 min w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Jądra barwić Hoechst 33342 rozcieńczonym w stosunku 1:10000 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór Hoechsta i przemyć komórki dwukrotnie PBS przez 10 minut za każdym razem.</li>
	<li>Umyć próbkę za pomocąH2Oi pozostawić do wyschnięcia pod kapturem chemicznym.</li>
	<li>Dodać 100 μl pożywki montażowej (tj. PBS:glicerol, 1:1) w celu pokrycia komórek i zachowania fluorescencji próbek.</li>
	<li>Obserwuj celę przy Ex/Em 493/517 nm na laserowo-skaningowym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w źródło światła białego (WLL) i laser diodowy 405 nm. Sekwencyjne obrazy konfokalne można uzyskać za pomocą obiektywu HC PLAPO 40x z olejkiem immersyjnym. Użyj tej samej mocy lasera, rozdzielaczy wiązki, ustawień filtrów, średnic otworków i trybu skanowania dla wszystkich badanych próbek.</li>
</ol>

<ol><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+iPSCs+display+an+uncommon+mitochondrial+appearance+and+fail+to+undergo+in+vitro+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis.</a> Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195(2014).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521+based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Laperle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-5+Laminin+Synthesized+by+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Promotes+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).</li>
<li>Albalushi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+521+stabilizes+the+pluripotency+expression+pattern+of+human+embryonic+stem+cells+initially+derived+on+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells.</a> Stem Cell International. 2018, 7127042(2018).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-derived+laminin-511+promotes+midbrain+dopaminergic+neuron+survival+and+differentiation+through+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP.</a> Science Signaling. 10 (493), (2017).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).</li>
<li>Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+slow+cooling+cryopreservation+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells.</a> Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).</li>
<li>Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xeno-free culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vitronectin+is+a+functionally+defined+substrate+that+supports+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+via+alphavbeta5+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+vitronectin+concentration+and+surface+properties+on+the+stable+propagation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells.</a> Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).</li>
<li>Prowse, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+on+recombinant+vitronectin+in+ascorbate+free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media.</a> Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).</li>
<li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li>
<li>Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+amniotic+fluid+and+plasma+fibronectins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins.</a> Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).</li>
<li>Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+activation+by+dithiothreitol+or+Mn2%2B+induces+a+ligand-occupied+conformation+and+exposure+of+a+novel+NH2-terminal+regulatory+site+on+the+beta1+integrin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain.</a> Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).</li>
<li>Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+wound+healing+assay+in+an+epithelial-mesenchymal+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+%26+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system.</a> Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).</li>
<li>Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder+layer-and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).</li>
<li>Vaheri, A., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+molecular+weight%2C+cell+surface-associated+glyco-protein+%28fibronectin%29+lost+in+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).</li>
<li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+fibrillogenesis%2C+a+cell-mediated+matrix+assembly+process%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process.</a> Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).</li>
<li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states%3A+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).</li>
<li>Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibrillogenesis%3A+fibronectin%2C+integrins%2C+and+minor+collagens+as+organizers+and+nucleators%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).</li>
<li>Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tightening+the+connections+between+cadherins+and+fibronectin+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix.</a> Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+The+evolution+of+human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+from+feeder+cells+to+synthetic+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings.</a> Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Vigilante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Extrinsic+versus+Intrinsic+Drivers+of+Variation+in+Cell+Behavior+in+Human+iPSC+Lines+from+Healthy+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors.</a> Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykorzystanie iPSC do modelowania chorób i przyszłych badań przesiewowych leków wraz z ich możliwym zastosowaniem w medycynie precyzyjnej sprawia, że jest to technologia o ogromnym znaczeniu i z tego powodu uważamy, że konieczne jest jasne zrozumienie warunków hodowli in vitro, które lepiej przypominają sytuację fizjologiczną embrionalnych komórek macierzystych. W tym kontekście przetestowaliśmy różne powłoki ECM przy użyciu iPSC typu dzikiego, aby zrozumieć warunki, które pozwalają komórkom pozostać w stanie zdrowym i n...

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są uzyskiwane z komórek somatycznych i mogą być różnicowane na różne typy komórek. Są one często wykorzystywane jako system do modelowania patogenezy choroby lub wykonywania badań przesiewowych leków, a także oferują potencjał do wykorzystania w kontekście medycyny spersonalizowanej. Ponieważ iPSC mają ogromny potencjał, ważne jest, aby w pełni scharakteryzować je pod kątem wykorzystania jako niezawodny system modelowy. Wcześniej pokazaliśmy, jak ważne jest hodowanie iPSC w środowisku niedotlenionym, ponieważ komórki te opierają się na glikolizie, a środowisko tlenowe może powodować nierównowagę redoks1. iPSC są również podatne na inne warunki hodowli, zwłaszcza środowisko zewnątrzkomórkowe. Optymalizacja warunków hodowli jest kluczową kwestią, aby utrzymać je w zdrowiu i rozmnażaniu. Zdrowa hodowla iPSC doprowadzi do powstania zdrowych, zróżnicowanych komórek, które na ogół są punktem końcowym modelu używanego do zrozumienia molekularnych, komórkowych i funkcjonalnych cech określonych zaburzeń lub procesów komórkowych u ludzi.
W tym badaniu, prosty protokół został użyty do testowania konfluencji iPSC przy użyciu różnych warunków powlekania w oddzielnych studzienkach. iPSC wymagają warstwy zasilającej mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) w celu prawidłowego przyłączenia, ale współistnienie iPSC i MEF utrudnia przeprowadzenie analizy, takiej jak ekstrakcja RNA lub białka, ponieważ obecne są dwie populacje komórek. Aby uniknąć warstwy zasilającej, różne białka należące do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) zostały użyte do odtworzenia naturalnej niszy komórkowej i hodowli iPSC wolnej od karmienia. W szczególności Matrigel jest rozpuszczonym preparatem błony podstawnej ekstrahowanym z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), który jest wzbogacony w białka macierzy zewnątrzkomórkowej (tj. lamininę, kolagen IV, proteoglikany siarczanu heparanu, entaktynę/nidogen i czynniki wzrostu)2,3. Innymi stosowanymi warunkami powlekania są oczyszczone białka o znanym znaczeniu w budowie ECM: wiadomo, że laminina-521 jest wydzielana przez ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) w wewnętrznej masie komórkowej zarodka i jest jedną z najczęstszych laminin w organizmie po urodzeniu4,5,6,7,8,9,10,11; Witronektyna to wolna od ksenotypów matryca do hodowli komórkowych, o której wiadomo, że wspomaga wzrost i różnicowanie hPSC12,13,14,15,16; fibronektyna jest białkiem ECM ważnym dla rozwoju kręgowców oraz przyczepiania i utrzymania embrionalnych komórek macierzystych w stanie pluripotencjalnym17,18,19,20,21,22,23,24,25. Ze względu na to, że dostępne są różne warunki powlekania, porównujemy je pod względem ich wpływu na zbieganie się komórek iPSC.

<table><tbody><tr><td>10 ml pipety serologiczne paskowane, polistyren, indywidualnie owinięte papierem/tworzywem sztucznym, sterylne</td> narzędzie <td>Corning</td><td>4488</td><td>15</td></tr><tr><td>ml stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu (PP) o wysokiej czystości</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Tool</td></tr><tr><td>1x PBS (z Ca2+; Mg2+)</td><td>Thermofisher</td><td>14040133</td><td>Medium</td></tr><tr><td>1x PBS (bez Ca2+; Mg2+)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L</td><td>Medium</td></tr><tr><td>5 ml Pipety serologiczne paskowane, polistyren, indywidualnie owinięte papierem/tworzywem sztucznym, sterylne</td> narzędzie <td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96 WELL, PS, F-Bottom</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>Support</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowych, 6-dołkowa</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Support</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose)</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td>Medium</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED4SS-500g</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit</td><td>Odczynnik Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>FAST - READ 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>Tool</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td></td><td>Merck FC010</td><td>Powłoka</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>H2O</td><td></td><td>MILLIQ</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermofisher</td><td>33342</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Laminin 521</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>77003</td><td>Powłoka</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Odczynnik Gibco</td><td>LS25030081</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Matrigel z kwalifikacją hESC Matrix</td><td>354277</td><td>powłoka</td></tr><tr><td>Fibroblasty embrionalne myszy (MEF)</td><td>Life Technologies</td><td>A24903</td><td>Powłoka</td></tr><tr><td>MTESR1 Średnie</td><td>technologie komórek macierzystych</td><td>85851</td><td>Średni</td></tr><tr><td>suplement MTESR1</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>85852</td><td>Średnia</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Odczynnik Gibco</td><td>15140122</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7180</td><td>Powłoka</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Odczynnik</td></tr></tbody></table>

pomiar zbiegu ipsc za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

To badanie skupia się na zrozumieniu, w jaki sposób hodowla iPSC na różnych podłożach ECM może wpływać na konfluencję komórek. Stworzono protokół oceny konfluencji iPSC w czasie rzeczywistym bez konieczności liczenia komórek w zawiesinie pojedynczej komórki, aby uniknąć zaburzeń wzrostu. System analizy obrazu o wysokiej zawartości został wykorzystany do oceny konfluencji iPCS na 4 różnych modułach ECM w czasie w sposób zautomatyzowany. Do oceny zbiegu komórek przylegających iPSC zastosowano różne ustawienia analizy i zaobserwowano tylko niewielką różnicę (po 24 i 48 godzinach w przypadku lamininy), niezależnie od tego, czy zastosowano maskę 60, 80 czy 100%. Pokazujemy również, że laminina prowadzi do najlepszej konfluencji w porównaniu z Matrigel, witronektyną i fibronektyną.

W niniejszym badaniu zbadaliśmy stopień zrastania się (konfluencję) iPSCs hodowanych w różnych warunkach powlekania. Dzięki zastosowaniu cytometru byliśmy w stanie uzyskać miarodajne wyniki w trzech powtórzeniach w ciągu 5 dni. Ponieważ iPSCs słabo przywierają do naczyń plastikowych i niezbędna jest powłoka wspierająca ich proliferację, zdecydowaliśmy się monitorować konfluencję ludzkich iPSCs, ponieważ jest ona wskaźnikiem kondycji hodowli komórkowej i może odzwierciedlać ich potencjał różnicowania. Po ekspansji in vitr...

Celem protokołu jest porównanie różnych warunków powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aby ocenić, jak różnicowa powłoka wpływa na tempo wzrostu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). W szczególności dążymy do stworzenia warunków do uzyskania optymalnego wzrostu kultur iPSC.

Pomiar zbiegu iPSC za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia szybką ocenę indukowanej pluripotencjalnej konfluencji komórek macierzystych na różnych podłożach powlekających macierz zewnątrzkomórkową w czasie rzeczywistym. Główną zaletą tego protokołu jest to, że nie wymaga on zliczania zawiesiny pojedynczej komórki, co zapobiega zaburzeniom wzrostu iPSC, które są wrażliwe na pasażowanie. Procedurę zademonstruje Valentina Magliocca, doktor habilitowany z mojego laboratorium.Aby ustawić płytki pokryte matrycą membrany podstawnej, rozcieńczyć matrycę membrany podstawnej, ustawić stosunek 1 do 100 w DMEM i dodać 100 mikrolitrów powstałego roztworu do każdej studzienki płytki 96-dołkowej. Gdy wszystkie studzienki zostaną zakodowane, umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji wyrzucić roztwór matrycy błony podstawnej i przemyć każdą studzienkę dwa razy 100 mikrolitrami świeżego DMEM na studzienkę.Aby ustawić płytki pokryte lamininą, rozcieńczyć 20 mikrogramów na mililitr lamininy w PBS z wapniem i magnezem i dodać 100 mikrolitrów roztworu lamininy do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki. Następnie inkubować płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, a następnie dwukrotnie umyć studzienki świeżym DMEM, jak pokazano. Aby ustawić płytki pokryte witronektyną, rozcieńczyć 10 mikrogramów na mililitr witronektyny w buforze rozcieńczającym i dodać 100 mikrolitrów buforu do każdej studzienki nowej płytki 96-dołkowej.Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej umyj studzienki 100 mikrolitrami PBS bez wapnia i magnezu na studzienkę. Aby przygotować płytki pokryte ludzką fibronektyną, rozcieńczyć 30 mikrogramów na mililitr fibronektyny w podwójnie destylowanej wodzie i dodać 100 mikrolitrów roztworu fibronektyny do każdej studzienki nowej 96-dołkowej płytki. Po 45-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej umyć studzienki świeżym DMEM, jak pokazano.Dwa dni przed założeniem hodowli iPSC należy wysiać fibroblasty embrionalne myszy o gęstości od 2,4 na 10 do czwartej na centymetr kwadratowy w kompletnej pożywce do hodowli komórkowej do każdej z dwóch studzienek sześciodołkowych płytek do hodowli komórkowych i umieścić płytki w inkubatorze hodowli komórkowych. Aby założyć hodowlę iPSC, należy ogrzać podstawowy roztwór kriokonserwowanych iPSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki właśnie się rozmrozą, wyczyść fiolkę 70% etanolem i umieść komórki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów przenieś komórki kropla po kropli do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach świeżej pożywki do hodowli komórek. Następnie umieść płytki 1 na 10 do piątej komórki w każdym z dwóch dołków mysich embrionalnych płytek sześciodołkowych z zarodkowymi fibroblastami.Po wysianiu należy uzupełnić kultury komórkowe 10 mikromolami inhibitora ROCK Y-27632 i umieścić płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na cztery do pięciu tygodni. Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, potraktuj każdą kulturę jednym mililitrem 0,5 milimolowego EDTA przez trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Po odłączeniu komórek podziel je w stosunku jeden do czterech w pożywce do hodowli świeżych komórek i umieść komórki w każdym z czterech pozostałych dołków sześciodołkowej płytki w warunkach wolnych od podajnika.Następnie umieść płytki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Aby ocenić wpływ różnych powłok na zbieganie się komórek po co najmniej jednym miesiącu hodowli w warunkach bez karmienia, należy użyć jednorazowych szkiełek do liczenia do policzenia komórek z każdej kultury za pomocą komory liczącej. Rozcieńczyć komórki do jednego na 10 do czwartego komórki na 200 mikrolitrów średniego stężenia i zasiać komórki w trzech trzech dołkach jednej pokrytej 96-dołkową płytką na warunek.Po pokryciu wszystkich komórek umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Następnego dnia i codziennie przez następne pięć dni wykonuj automatyczne obrazowanie komórek przy użyciu ustawień automatycznego kontrastu i automatycznej ekspozycji w celu uzyskania optymalnej wizualizacji. Aby ocenić zmiany ostrości spowodowane załamaniem światła na granicy studzienek, ustaw ustawienia analizy na analizę konfluencji, aby zastosować maskę 60, 80 lub 100% na studzienkę, a następnie użyj różnych ustawień analizy maski do analizy zbiegu komórek w każdym punkcie czasowym.Aby porównać ogólne różnice w różnych warunkach kodowania, użyj przykładowych danych do wykonania testu T studenta dla próby sparowanej, podając wyniki ilościowe jako średnie zmiany konfluencji, plus lub minus błąd standardowy średniej. W celu scharakteryzowania mikrofilamentów cytoszkieletu, najpierw utrwal komórki za pomocą 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w PBS na studzienkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwa 10-minutowe płukania w 200 mikrolitrach PBS na pranie. Przenieś wcześniej umieszczony szkiełko nakrywkowe z płytki na szkiełko mikroskopowe.Dodać 100 mikrolitrów 5% surowicy bydlęcej i 0,1% Tritonu w PBS do każdej studzienki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania, a następnie przemyć próbki dwoma 10-minutowymi płukaniami PBS, jak pokazano. Po drugim przemyciu dodać 100 mikrolitrów sprzężonego roztworu roboczego falloidyny na próbkę na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie dwa 10-minutowe płukanie w PBS. Następnie wybarwić jądra Hoechst 33342 rozcieńczonym do stężenia 1 do 10 000 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwa płukania PBS.Po drugim praniu spłucz komórki wodą i pozostaw płytki do wyschnięcia pod kapturem chemicznym. Gdy szklane szkiełko nakrywkowe wyschnie, przykryj komórki 100 mikrolitrami odpowiedniego podłoża montażowego na studzienkę i umieść komórki w laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w źródło światła białego i laser diodowy 405 nm przy odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji. Następnie wybierz obiektyw z 63-krotnym zanurzeniem w oleju i uzyskaj sekwencyjne obrazy konfokalne komórek.Barwienie falloidyną umożliwia wizualizację stopnia przylegania komórek do powierzchni naczynia, a w szczególności powłoki użytej do naczynia. Komórki, które przylegają do powłoki, wykazują wyraźnie widoczne mikrowłókna cytoszkieletu zamiast zapadniętych mikrofilamentów. Obrazowanie w jasnym polu pozwala również na obrazowanie poziomu przyczepności iPSC do powlekanych powierzchni.IPSC wysiane na lamininie wykazują wysokie tempo proliferacji komórek w sposób liniowy w czasie w porównaniu z innymi powłokami. Natomiast komórki wysiane na macierzy błony podstawnej, witronektyna i ludzka fibronektyna, wykazują liniową szybkość proliferacji w ciągu pierwszych 96 godzin ze zwiększonym nachyleniem krzywej konfluencji w ciągu ostatnich 24 godzin, niezależnie od zastosowanej maski. Ponieważ początkowa różnica po 24 godzinach dla różnych powłok może wynikać z różnic w przyczepieniu komórek, wzrost komórek można znormalizować do danych 24-godzinnych dla późniejszych punktów czasowych.Jak zaobserwowano, nie ma różnic pod względem konfluencji między różnymi powłokami, co sugeruje, że różnice obserwowane w kulturach pokrytych lamininą są najprawdopodobniej spowodowane zwiększoną zdolnością iPSC do przylegania do tej powłoki podczas pasażu. Badanie to może przyczynić się do opracowania ustandaryzowanych metodologii hodowli iPSC i może pomóc w ich przyszłym możliwym zastosowaniu w klinikach. Obecnie badamy biologię głównych receptorów powierzchniowych komórek, które pośredniczą w kontaktach komórka-ECM i które mogą być odpowiedzialne za utrzymanie ich zdolności do samoodnawiania.

measuring-the-confluence-of-ipscs-using-an-automated-imaging-system

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Prezentujemy dyskretny system wprowadzania próbek kropel do spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICPMS). Opiera się na tanim i jednorazowym chipie mikroprzepływowym, który generuje wysoce monodyspersyjne kropelki w zakresie wielkości 40−60 μm przy częstotliwościach od 90 do 7 000 Hz.

Układ mikroprzepływowy do próbki ICPMS Wprowadzenie

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Przedstawiamy protokół zastosowania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM), 3-wymiarowej metody mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w super rozdzielczości, do obrazowania cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków. Takie podejście umożliwia opartą na świetle wizualizację cech strukturalnych w nanoskali, które w przeciwnym razie pozostałyby nierozwiązane przez konwencjonalną mikroskopię optyczną z ograniczoną dyfrakcją.

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)

W tej pracy znajduje się praktyczny przewodnik, opisujący różne kroki do ustanowienia sprzężenia systemów SMPS i ICPMS oraz jak z nich korzystać. Przedstawiono trzy przykłady opisowe.

Praktyczny przewodnik na temat sprzężenia skanera mobilności skanera i spektrometru mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (SMPS-ICPMS)

Przeciwciała, które wiążą się z docelowymi receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany konformacji i grupowania. Te dynamiczne zmiany mają implikacje dla charakterystyki rozwoju leków w komórkach docelowych. Protokół ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną i spektroskopię korelacji obrazów za pomocą ImageJ/FIJI w celu ilościowego określenia zakresu grupowania receptorów na powierzchni komórki.

Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Przedstawiamy protokół do optycznego wykrywania pojedynczych, nieznakowanych białek w czasie rzeczywistym, gdy są wydzielane z żywych komórek. Opiera się to na mikroskopii rozpraszania interferometrycznego (iSCAT), która może być stosowana do wielu różnych systemów i konfiguracji biologicznych.

Bezznacznikowe obrazowanie pojedynczych białek wydzielanych z żywych komórek za pomocą mikroskopii iSCAT

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Tworzenie właściwej sieci sarkomerowej jest ważne dla dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości, które pozwala na ilościową ocenę strukturalnego dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, w celu poprawy warunków hodowli sprzyjających rozwojowi serca.

Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek

Prezentujemy metodę pozyskiwania przebiegów czasu reporterowego fluorescencji z pojedynczych komórek za pomocą mikrowzorców. Protokół opisuje przygotowanie macierzy pojedynczych komórek, konfigurację i obsługę mikroskopii poklatkowej ze skanowaniem żywych komórek oraz narzędzie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym do automatycznej preselekcji, kontroli wizualnej i śledzenia przebiegów czasu fluorescencji zintegrowanych z komórkami na miejsce adhezji.

Obrazowanie żywych komórek macierzy jednokomórkowych (LISCA) - wszechstronna technika ilościowego określania kinetyki komórkowej

Poznaj metodę pomiaru zbiegu iPSC przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania. Protokół umożliwia szybką ocenę wzrostu komórek na różnych powłokach macierzy pozakomórkowej bez konieczności zliczania pojedynczych komórek.

Pomiar zbiegu iPSC za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania

Przeglądaj więcej filmów