Ocena globalnej struktury gałki ocznej po locie kosmicznym z wykorzystaniem metody obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej (Micro-CT)
27 października 2020
Prezentujemy protokół wykorzystujący obrazowanie mikrokomputerowe o wysokiej rozdzielczości w celu określenia, czy lot kosmiczny spowodował uszkodzenie struktur oka. Protokół przedstawia pomiar struktur oka gryzoni ex vivo za pomocą mikrotomografii komputerowej. Wykazujemy zdolność do oceny zmian morfologicznych oka po locie kosmicznym przy użyciu nieniszczącej techniki trójwymiarowej do oceny uszkodzenia oka.
W niniejszej pracy proponujemy metodę oceny globalnej struktury gałki ocznej po locie kosmicznym z wykorzystaniem metody obrazowania metodą tomografii mikrokomputerowej. Środowisko lotów kosmicznych, które obejmuje paragrawitację i ekspozycję na promieniowanie, powoduje unikalne zmiany w ludzkiej fizjologii, w tym zmiany płynów. Te przesunięcia płynów prowadzą do podwyższonego ciśnienia śródczaszkowego i są przypisywane jako główna przyczyna zespołu nerwowo-ocznego związanego z lotami kosmicznymi.
Fizjologiczny wpływ SANS wpływa na wiele elementów oka i obejmuje obrzęk tarczy nerwu wzrokowego, spłaszczenie gałki strzelistycznej, fałdy naczyniówkowe i siatkówkowe, nadwzroczność i przesunięcia wad refrakcji oraz infracts warstwy włókien nerwowych. Podczas gdy fizjologiczne cechy SANS są dobrze udokumentowane, mechanizmy, które napędzają SANS, są nadal słabo poznane. Aby lepiej zrozumieć SANS, modele gryzoni są wykorzystywane do nieinwazyjnych technik obrazowania.
Jedną z tych technik jest mikrotomografia komputerowa, która jest z powodzeniem stosowana do oceny struktur anatomicznych i procesów patologicznych u zwierząt tak małych jak myszy. Mikrotomografia komputerowa może osiągnąć mikrorozdzielczość, a w połączeniu ze środkiem kontrastowym może zapewnić dobry kontrast dla tkanek miękkich. Mikrotomografia komputerowa zapewnia wyraźną przewagę w porównaniu z tradycyjnymi metodami, w tym anatomią ogólną, mikroskopią świetlną i badaniem histologicznym, aby nie powodować uszkodzeń profilu geometrycznego próbek i relacji przestrzennych między strukturami.
W naszym obecnym badaniu myszy były wystawione na działanie środowiska kosmicznego przez 35 dni na pokładzie Międzynarodowej Stacji Kosmicznej, aby ustalić, czy środowisko kosmiczne powoduje uszkodzenie oczu, poprzez ilościowe określenie mikrostruktury siatkówki, RPE i warstw naczyniówki za pomocą mikro-CT. Tutaj pokazaliśmy, w jaki sposób przygotowaliśmy próbki do analizy Micro-CT. Myszy zostały użyte i oczy w ciągu 38 plus minus czterech godzin po rozprysku
.Oczy wyłuszczono, a lewe oczy utrwalono w czteroprocentowych paraformaldehydu i fosforanów soli fizjologicznej przez 24 godziny. Po fiksacji oczy zostały odwodnione w etanolu. Aby zapobiec dalszemu i gwałtownemu kurczeniu się utrwalonej próbki, zastosowano stopniowaną serię roztworów etanowych.
Najpierw próbki przeniesiono do 50% etanolu na jedną godzinę, a następnie zwiększano stężenia przez jedną godzinę każda, 70, 80, 90, 96 i 100%Następnie oczy barwiono kwasem fosfolipidowym o stężeniu 10% wagowym na objętość przez sześć dni. Na koniec próbki przemyto w etanolu absolutnym, a następnie umieszczono w pojedynczych pojemnikach z tworzywa sztucznego wypełnionych etanolem absolutnym w celu skanowania. Dodano również wacik, aby ustabilizować próbkę podczas skanowania.
Następnie próbkę umieszczono w stacjonarnym skanerze rentgenowskim Micro-CT SkyScan 1272 w celu oceny uszkodzenia siatkówki. Do skanowania użyliśmy oprogramowania SkyScan 1272. Po otwarciu oprogramowania wyśrodkowaliśmy naszą próbkę w ramce.
W naszym protokole nie używamy filtra i ustawiamy matrycę tak, aby zwiększyć rozmiar piksela do czterech mikronów. Mikropozycjonowanie służy do utrzymywania próbki wyśrodkowanej w ramce. Następnie sprawdzamy parametry, aby zmaksymalizować poziom środka kontrastowego w naszej próbce i skalibrować maszynę.
W celu wykonania kalibracji wyjmujemy próbkę ze skanera i ustawiamy parametry skanowania. Podczas kalibracji sprawdzana jest również korekta wypełniona na płasko. Powinien być większy niż 80%Po kalibracji próbka jest ponownie wprowadzana do komory skanującej.
Przed skanowaniem przykładowe pliki są nazywane. Parametry skanowania są następujące, krok obrotu 0,4, klatki cztery, losowy ruch 30, sprawdź dwukrotnie, czy rozmiar piksela jest ustawiony na 4 mikrony. Następnie rozpoczyna się skanowanie.
Po zeskanowaniu NRecon służy do rekonstrukcji próbki. Najpierw otwieramy pliki ze skanu i przeglądamy surowe obrazy skanowania. Dostosowujemy odbicie histogramu, aby pasowało do krzywej.
Następnie korygujemy artefakt hartowania belki. Następnie dostosowujemy artefakt wygładzania. Na koniec korygujemy redukcję artefaktu pierścienia.
Po wszystkich poprawkach potwierdziliśmy, że nasze próbki mieszczą się w naszym obszarze zainteresowania. Wtedy możemy przystąpić do odbudowy. Używamy oprogramowania DataViewer do wizualizacji zrekonstruowanych obrazów we wszystkich trzech obszarach.
Do analizy wykorzystywane jest oprogramowanie CTAn. Zrekonstruowane obrazy są wczytywane do oprogramowania. Nerw wzrokowy został wykorzystany do wyeliminowania obszaru zainteresowania do analizy.
Zgodnie z obliczeniami, użyliśmy środkowego wycinka obszaru zainteresowania do wykonania wszystkich pomiarów do analizy. Wykonano trzy powtórzone pomiary w celu obliczenia liniowego pomiaru obszaru. Poniższe pomiary zostały wykonane dla tkanek oka, siatkówki, RPE, naczyniówki, a nasza analiza Micro-CT wykazała, że obszary przekroju siatkówki, RPE i warstwy naczyniówki były znacznie niższe w próbkach lotów kosmicznych w porównaniu z kontrolami naziemnymi.
Mikrotomografia komputerowa zapewnia skuteczną i nieniszczącą technikę obliczania wielkości zmian bez żadnej manipulacji. Dzięki zastosowaniu środka kontrastowego poprawia jakość obrazów Micro-CT, które pomagają nam uzyskać wyraźny obraz graficzny rekonstrukcji bez ingerencji w strukturę próbki. Dodatkowo pokazuje, że oryginalne dane są cyfrowe, co zwiększa dostępność i odtwarzalność wyników.
Ponadto, podstawowym celem, dopuszczalne jest stosowanie pomiarów trójwymiarowych, ale segmentacja brutto trójwymiarowej struktury może być korzystna w celu uzyskania określonego zarysu całego próbki. Nasze wyniki wskazują, że warunki lotu kosmicznego, zwłaszcza zmiany grawitacyjne, mogą wywoływać ostrą i krótkotrwałą reakcję w oku. Co więcej, przyszłe prace powinny wykorzystywać dane wolumetryczne do wykonywania innych analiz wykorzystujących możliwości obrazowania Micro-CT, ponieważ jest ona z powodzeniem wykorzystywana do badania wielu normalnych i patologicznych tkanek.
Przegląd
To badanie bada wpływ lotu kosmicznego na struktury oka za pomocą wysokiej rozdzielczości mikrotomografii komputerowej (mikro-CT). Stosując niedestrukcyjną technikę na ex vivo próbkach oczu gryzoni, badania mają na celu ocenę zmian morfologicznych wynikających z unikalnego środowiska lotu kosmicznego.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Zdrowie oczu podczas lotu kosmicznego
- Syndrom neuro-okulistyczny związany z warunkami kosmicznymi
- Zastosowanie technik mikro-CT
Tło
- Lot kosmiczny powoduje fizjologiczne zmiany, w tym przemieszczanie płynów i podwyższone ciśnienie wewnątrzczaszkowe.
- Zmiany te mogą prowadzić do obrzęku tarczy nerwu wzrokowego, spłaszczenia gałki ocznej i błędów refrakcji.
- Mechanizmy leżące u podstawy zespołu neuro-okulistycznego związanego z lotem kosmicznym (SANS) pozostają niejasne.
Stosowane metody
- Mikro-CT do trójwymiarowej oceny struktur oczu.
- Modele gryzoni narażone na środowisko kosmiczne w celu analizy.
- Zastosowanie środków kontrastowych w celu poprawy jakości obrazowania mikro-CT.
Główne wyniki
- Znaczące zmniejszenie obszarów przekrojów warstw siatkówki, epitelium barwnikowego siatkówki i naczyniówki w próbkach pochodzących z lotu kosmicznego w porównaniu do kontroli.
- Niedestrukcyjne obrazowanie umożliwia dokładną ocenę morfologii oczu.
- Badanie zapewnia wgląd w ostre reakcje oczu na warunki kosmiczne.
Wnioski
- Badania wykazują, że warunki lotu kosmicznego powodują wykrywalne uszkodzenia oczu.
- Wyniki są istotne dla zrozumienia SANS i poprawy zdrowia astronautów podczas misji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This study demonstrates the utility of micro-CT imaging for detecting structural changes in ocular tissues following exposure to spaceflight conditions, offering a non-destructive method to assess tissue-level responses to environmental stressors. The approach supports mechanistic de-risking in preclinical models by enabling quantitative evaluation of retinal, RPE, and choroid layer thickness, which are relevant to neuro-ocular syndrome research. These findings enhance predictive confidence in using rodent models to study environmental stress effects on global ocular structure, with implications for translational biomarker development and preclinical risk assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to structural ocular changes induced by environmental stress.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative, reproducible measurement of tissue layer thickness in preclinical models.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing measurable endpoints for assessing ocular safety in early discovery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, high-resolution imaging outputs suitable for assay standardization in ocular toxicity screening.
- Operational Value: Ensures reproducibility through non-destructive imaging and contrast-enhanced visualization of soft tissue structures.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple ocular tissue types and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant structural endpoints aligned with spaceflight-associated neuro-ocular syndrome (SANS) pathology.
- Operational Value: Supports translational continuity from discovery through preclinical validation via consistent imaging protocols.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying microstructural changes in ocular tissues under stress conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, particularly for studies assessing environmental or physiological stressors on ocular structure.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise measurement of retinal, RPE, and choroid layer alterations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, quantitative imaging of ocular tissue cross-sections.
- Analytics: Generates linear and areal measurements that allow comparison between experimental and control conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing structural biomarkers relevant to SANS-like phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability across multiple ocular disease models and stressor paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ocular structural responses.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through non-destructive, contrast-enhanced micro-CT workflows.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of ocular liability, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable, translatable ocular structural endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in micro-CT operation, image reconstruction, and tissue preparation for contrast agent staining.
- Dependent on access to high-resolution micro-CT instrumentation capable of micron-scale imaging.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, dehydration, and staining protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method across different ocular models or species.
- Limited by the ex vivo nature of the technique, which precludes longitudinal in vivo tracking in the same subject.
