Name: Ocena globalnej struktury gałki ocznej po locie kosmicznym z wykorzystaniem metody obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej (Micro-CT) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę mikrotomografii komputerowej do oceny globalnej struktury gałki ocznej po locie kosmicznym. Technika ta pozwala nieinwazyjnie wykryć zmiany w warstwach siatkówki, nabłonka barwnikowego i naczyniówki u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant NASA Space Biology # NNX15AB41G oraz Wydział Nauk Podstawowych LLU. Sungshin Choi, Dennis Leveson i Rebecca Klotz znacząco przyczynili się do sukcesu naszych badań nad lotami kosmicznymi i bardzo doceniamy ich wsparcie. Autorzy chcieliby również podziękować całej grupie NASA Biospecimen Sharing Program za ich wielką pomoc.
Autorzy chcieliby również podziękować Centrum Badań Stomatologicznych za usługę Micro-CT.

Badanie było zgodne z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health (NIH) i zostało zatwierdzone zarówno przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Loma Linda (LLU) oraz Narodową Agencję Aeronautyki i Przestrzeni Kosmicznej (NASA). Bardziej szczegółowe informacje na temat tego eksperymentu można znaleźć gdzie indziej9,15.
1. Warunki lotu i kontroli
UWAGA: Dwunasty ładunek Commercial Resupply Service (CRS-12) został wystrzelony przez SpaceX w Centrum Kosmicznym im. Kennedy'ego (KSC) na 35-dniową misję w sierpniu 2017 roku, która obejmowała na pokładzie 10-tygodniowe samce myszy C57BL/6 (n = 20) do dziewiątego eksperymentu NASA dotyczącego badań nad gryzoniami (RR-9).
<ol>
	<li>Przed powrotem na Ziemię za pomocą kapsuły Dragon firmy SpaceX, myszy powinny żyć w siedliskach gryzoni NASA (RH) na pokładzie ISS przez 35 dni w temperaturze otoczenia 26-28 °C z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności podczas lotu.</li>
	<li>Umieść myszy kontroli naziemnej (GC) w tej samej obudowie, która jest używana w locie, i jak najdokładniej dopasuj parametry środowiskowe, takie jak temperatura i poziom dwutlenku węgla (CO2 ) na podstawie danych telemetrycznych.</li>
	<li>Karm myszy GC tą samą dietą NASA Food Bar, co ich odpowiedniki w kosmosie. Zapewnij zarówno myszom kosmicznym, jak i GC taki sam dostęp ad libitum do wody i pożywienia.</li>
</ol>
2. Ocena myszy po locie
<ol>
	<li>W ciągu 28 godzin od lądowania na Ziemi przetransportuj myszy do Uniwersytetu Loma Linda (LLU). Po dotarciu na miejsce wyjmij myszy z wybiegu dla zwierząt i oceń, czy przeżyły i są zdrowe. 
	UWAGA: Po obserwacji, personel kontrolny poinformował, że wszystkie myszy przeżyły 35-dniową misję kosmiczną i były w dobrym stanie, tj. nie stwierdzono żadnych zauważalnych braków/nieprawidłowości.</li>
</ol>
3. Sekcja i zachowanie oczu myszy po locie kosmicznym
<ol>
	<li>W ciągu 38 (±4) godzin od rozprysku (n = 20 / grupa) poddaj myszy eutanazji w 100% CO2 i zbierz ich oczy.</li>
	<li>Wypreparuj siatkówkę prawego oka i umieść ją pojedynczo w sterylnych kriowiach, zamroź w ciekłym azocie i utrzymuj w temperaturze -80 °C przed użyciem.</li>
	<li>Utrwalić całe lewe oczy w 4% paraformaldehydzie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 24 godziny, a następnie przepłukać solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu przeprowadzenia testów mikro-CT.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki do badania mikro-tomografią komputerową
<ol>
	<li>Po utrwaleniu odwodnić oczy myszy w etanolu. Aby zapobiec dalszemu lub nagłemu kurczeniu się utrwalonej próbki, należy stosować stopniowaną serię roztworów etanolu: zaczynając od 50% etanolu przez 1 godzinę, a następnie zwiększając stężenia roztworów etanolu w następujący sposób przez 1 godzinę każdy: 70, 80, 90, 96 i 100%. 
	UWAGA: Oczy myszy muszą być dotykane w komorze kaptura.</li>
	<li>Barwienie kwasem fosfomolibdenowym (PMA) 
	UWAGA: Ze względu na to, że PMA jest, rakotwórczy i toksyczny dla narządów, konieczne jest stosowanie odpowiedniego sprzętu ochronnego, w tym stosowanie okapu wyciągowego.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór barwiący: 10 mg PMA w 100 ml absolutnego alkoholu etylowego.</li>
		<li>Barwieć oczy myszy (10% wag. kwas fosfomolibdowy - PMA rozpuszczony w absolutnym etanolu) przez 6 dni.</li>
		<li>Przed skanowaniem najpierw umyj próbki oczu w absolutnym etanolu, a następnie umieść każde oko w pojedynczych plastikowych pojemnikach o pojemności 2 ml, które są wypełnione 100% absolutnym etanolem. Dodaj wacik kosmetyczny do ustabilizowanych próbek podczas skanowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Skanowanie i analiza mikrotomografii komputerowej
UWAGA: Skaner SkyScan 1272, stacjonarny system rentgenowski Micro-CT, był używany do oceny uszkodzeń siatkówki w oczach myszy
<ol>
	<li>Zamontuj próbkę tkanek miękkich w odpowiednim uchwycie na próbkę. Aby zapobiec wszelkim ruchom podczas pomiarów rentgenowskich TK, upewnij się, że próbka jest ściśle dopasowana do jej uchwytu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Po skrupulatnym wyrównaniu każdej próbki, indywidualnie zeskanuj próbkę za pomocą promieni rentgenowskich.
	<ol>
		<li>Po otwarciu oprogramowania wyśrodkuj próbkę w ramce. W protokole nie używaj filtra i ustaw matrycę tak, aby zwiększała piksel przy 4 μm. Użyj mikropozycjonowania, aby utrzymać środek próbki na ramie.</li>
		<li>Następnie sprawdź parametr, aby zmaksymalizować środek kontrastowy. Aby przeprowadzić kalibrację, należy usunąć próbkę i sprawdzić, czy korekcja płaskiego pola jest większa niż 80%.</li>
		<li>Po kalibracji ponownie włóż próbkę do komory skanującej. Do skanowania należy użyć kroku obrotu 0,400, uśrednienia klatek 4, losowego ruchu 30 i obrócenia próbek o 180°.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj przyrządu pozycjonującego do powtarzania pomiarów. Dzięki wzmocnieniu kontrastu fazowego wykonanemu zgodnie z opisem, szczegóły obiektu o wielkości zaledwie 4 μm mogą być wykrywane w promieniowaniu rentgenowskim generowanym przez szczelną lampę rentgenowską z mikroogniskowaniem (anoda wolframowa) o natężeniu 50 keV i 80 mA z czasem integracji wynoszącym 90 minut. 
	UWAGA: Parametry akwizycji określone w tej sekcji do wyboru w celu uzyskania przeglądowych skanów CT o najwyższej jakości obrazu.</li>
	<li>Po zeskanowaniu użyj oprogramowania (np. NRecon), aby zrekonstruować dane.
	<ol>
		<li>Dostosuj histogram i użyj tego samego zakresu (0 – 0,24) dla wszystkich próbek. Rekonstrukcją obszaru zainteresowania był okrąg, nie użyto żadnych skal ani etykiet.</li>
		<li>Aby zredukować artefakty podczas skanowania, należy użyć poprawki utwardzania wiązki 20, poprawki wygładzania 1, redukcji artefaktów pierścieniowych 6 i nie wprowadzać żadnych zmian w kompensacji niewspółosiowości. Po rekonstrukcji potwierdzono, że próbka znajdowała się w obszarze zainteresowania.</li>
		<li>Zmień położenie obrazów za pomocą płaszczyzny równoległej do nerwu wzrokowego i soczewki oczu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zeskanowaniu użyj oprogramowania (np. DataViewer), aby zobrazować zrekonstruowane obrazy we wszystkich trzech widokach. 
	UWAGA: W razie potrzeby za pomocą tego oprogramowania obrazy można zmienić za pomocą płaszczyzny równoległej do nerwu wzrokowego i soczewki oczu w celu przeprowadzenia standardowej analizy.</li>
	<li>Analiza opisowa
	<ol>
		<li>Zmierz konstrukcje za pomocą narzędzia pomiarowego w oprogramowaniu (np. CTAn). Użyj nerwu wzrokowego, aby wyznaczyć obszar zainteresowania do analizy. Zgodnie z obliczeniami, protokół wykorzystał środkowy wycinek do wykonania pomiarów. Ocena ta została przeprowadzona za pomocą analizy opisowej (Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Wykonaj pomiary siatkówki, nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), naczyniówki i warstwy twardówki w widoku strzałkowym (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2) i osiowym (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3). Wykonaj trzy pomiary każdej struktury, aby obliczyć średnią.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dawson, L. The New Space Race. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDawson%2C+L+%22The+Politics+and+Perils+of+Space+Exploration%22">The Politics and Perils of Space Exploration</a>. , Springer Praxis Books. 1-24 (2017).</li>
<li>Mao, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spaceflight+environment+induces+mitochondrial+oxidative+damage+in+ocular+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue.</a> Radiation Research. 180, 340-350 (2013).</li>
<li>Overbey, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+Exposed+to+Combined+Chronic+Low-Dose+Irradiation+and+Modeled+Microgravity+Develop+Long-Term+Neurological+Sequelae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094(2019).</li>
<li>Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgravity-induced+fluid+shift+and+ophthalmic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes.</a> Life. 4, 621-665 (2014).</li>
<li>Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Space+flight-associated+neuro-ocular+syndrome+%28SANS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS).</a> Eye. 32, 1164-1167 (2018).</li>
<li>Stenger, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStenger%2C+MB+%22Evidence+Report%3A+Risk+of+Spaceflight+Associated+Neuro-ocular+Syndrome+%28SANS%29%22">Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS)</a>. , (2017).</li>
<li>Garrett-Bakelman, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NASA+Twins+Study%3A+A+multidimensional+analysis+of+a+year-long+human+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight.</a> Science. 364, (2019).</li>
<li>Mader, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+disc+edema%2C+globe+flattening%2C+choroidal+folds%2C+and+hyperopic+shifts+observed+in+astronauts+after+long+duration+space+flight%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight.</a> Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).</li>
<li>Mao, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mouse+ocular+response+to+a+35-day+spaceflight+mission%3A+Evidence+of+blood-retinal+barrier+disruption+and+ocular+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations.</a> Science Reports. 9 (1), 8215(2019).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+developmental+biology%3A+a+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).</li>
<li>Silva, J. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+non-destructive+soft-tissue+visualization+with+X-ray+staining+micro-tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography.</a> Science Reports. 5, 14088(2015).</li>
<li>Descamps, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+tissue+discrimination+with+contrast+agents+using+micro-CT+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Belgian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning.</a> Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).</li>
<li>Wu, J., Yin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+research+of+nasolabial+muscle+structure+in+fetus+with+cleft+lip%3A+an+iodine+staining+technique+based+on+microcomputed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Craniofacial+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography.</a> Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).</li>
<li>Roque-Torres, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoque-Torres%2C+GD+%22Application+of+Micro-CT+in+Soft+Tissue+Specimen+Imaging.+In%3A+Orhan+K.+%28eds%29+Micro-computed+Tomography+%28micro-CT%29+in+Medicine+and+Engineering%22">Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering</a>. , Springer. 139-170 (2020).</li>
<li>Overbey, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spaceflight+influences+gene+expression%2C+photoreceptor+integrity%2C+and+oxidative+stress-related+damage+in+the+murine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina.</a> Science Reports. 9 (1), 13304(2019).</li>
<li>Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+and+Limitations+of+X-Ray+Micro-CT+with+Applications+to+Sandstones+and+Limestones%5BTitle%5D)+AND+%22Transport+in+Porous+Media%22%5BJournal%5D)">Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones.</a> Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).</li>
<li>Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+limitations+of+X-Ray+micro-computed+tomography+in+arthropod+neuroanatomy%3A+A+methodological+and+comparative+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).</li>
<li>Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravitational+Influence+on+Intraocular+Pressure%3A+Implications+for+Spaceflight+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease.</a> Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).</li>
<li>Lee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spaceflight+associated+neuro-ocular+syndrome+%28SANS%29+and+the+neuro-ophthalmologic+effects+of+microgravity%3A+a+review+and+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Microgravity%22%5BJournal%5D)">Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update.</a> NPJ Microgravity. 6, 7(2020).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyniki tego badania wykazały, że w oku myszy lotu kosmicznego przy użyciu techniki mikro-CT wystąpiły zmiany strukturalne w porównaniu z grupami GC, szczególnie siatkówki, RPE i warstw naczyniówkowych oka, o czym świadczy ich zmniejszona grubość. Mikrotomografia komputerowa zapewnia skuteczną i nieniszczącą technikę charakteryzowania zmian bez konieczności manipulacji. Zastosowanie barwienia PMA poprawiło jakość obrazów mikro-CT, aby z powodzeniem uzyskać wyraźne obrazy tomograficzne 3D po rekonstrukcji, bez konieczności fizycznej zmiany struktury próbki. Dodatkową zaletą tych obrazów jest to, że wyświetlają one cyfrowo cały obszar zainteresowania, zwiększając w ten sposób dostępność, a także odtwarzalność wyników. Dzięki obrazom mikro-CT wykonanym podczas tego badania, docelowa próbka wykazała zróżnicowanie wielu struktur, takich jak siatkówka, RPE, naczyniówka i warstwa twardówki w celu określenia grubości każdej warstwy.
Krytycznym krokiem w ramach protokołu jest manipulacja próbkami ze względu na ich rozmiar i teksturę. Obchodzenie się z próbką musi odbywać się ostrożnie, bez wywierania nacisku na próbkę podczas przygotowania. Mikrotomografia komputerowa ma pewne ograniczenia: rozdzielczość i brak ustandaryzowanych wartości parametrów. Podczas skanowania różne mikrotomografy komputerowe mogą mieć różne algorytmy przetwarzania obrazu; Jednak kalibracja dla skali szarości może być kontynuowana, aby przezwyciężyć każdy problem. Po skanowaniu rekonstrukcja obrazów powinna opierać się na tkance i analizie, która zostanie wykonana. Może to mieć kluczowe znaczenie, ponieważ jakość obrazu zależy od systemu tomograficznego, ustawień, wielkości próbki, a także metod przygotowania 16,17.
Ze względu na jej udane zastosowanie w badaniu kilku typów tkanek prawidłowych i patologicznych, możliwości obrazowania mikro-CT powinny być wykorzystywane w przyszłych badaniach do kompilacji danych wolumetrycznych do innych analiz. W związku z tym, w oparciu o cel niniejszego badania, dopuszczalne było stosowanie pomiarów dwuwymiarowych, ale segmentacja brutto struktury 3D może być również korzystna w celu uzyskania precyzyjnego zarysu całej próbki. Nawet przy wszystkich zaletach techniki nieniszczącej, mikrotomografia komputerowa nie zastąpi innych metod, takich jak immunohistochemia, ale uzupełni i umożliwi późniejsze analizy histologiczne, jeśli zajdzie taka potrzeba.
Przedłużony lot kosmiczny powoduje szereg strukturalnych i funkcjonalnych zmian w oku astronautów w trakcie i po misji kosmicznej, określanych jako SANS. Wyniki obejmują przesunięcia nadwzroczne, spłaszczenie gałek ziemskich, fałdy naczyniówkowe/siatkówkowe i plamy waty19. W przeciwieństwie do wyników optycznej tomografii koherentnej (OCT) astronautów dotyczących pogrubienia warstwy włókien nerwowych siatkówki, ścieńczenie siatkówki i warstwy naczyniówki zostało udokumentowane w tym badaniu mikro-CT na zwierzętach. Wyniki te były nieoczekiwane. Ta rozbieżność może wynikać z czynników zakłócających. Myszy mają ograniczone przesunięcie płynu głowowego w porównaniu z człowiekiem. Ten brak przesunięcia płynów mógł wywołać różne reakcje na zmiany grawitacyjne. Po drugie, myszy poddano sekcji w ciągu 38 godzin po rozprysku, a ostra reakcja na readaptację może również przyczynić się do zmian morfologicznych w siatkówce i naczyniówce. Potwierdzenie tej możliwości wymaga dalszych pomiarów w trakcie lotu kosmicznego oraz w dłuższej perspektywie po zakończeniu misji.
Wyniki tego badania wskazują, że warunki lotu kosmicznego, zwłaszcza zmiany grawitacyjne, mogą wywołać ostrą i krótkotrwałą reakcję w oku. Potrzebne są dalsze badania, aby określić konsekwencje ostrych zmian w oku na funkcję siatkówki i mechanizm zmian strukturalnych wywołanych lotami kosmicznymi.

W środowisku mikrograwitacji lotów kosmicznych, zwiększone ciśnienie śródczaszkowe (ICP) spowodowane przesunięciem płynów mogło przyczynić się do zespołu nerwowo-ocznego związanego z lotami kosmicznymi (SANS)1,2,3,4,5. Rzeczywiście, ponad 40% astronautów doświadczyło SANS podczas i po misji na Międzynarodowej Stacji Kosmicznej (ISS)6, w tym lot kosmiczny objęty badaniem NASA Twins Study7. Obecna patofizjologia SANS obejmuje zmiany fizjologiczne, takie jak obrzęk tarczy nerwu wzrokowego, spłaszczenie gałki nerwowej, fałdy naczyniówkowe i siatkówkowe, nadwzroczne przesunięcia wady refrakcji oraz zawały warstwy włókien nerwowych (tj. plamki waty) i są dobrze udokumentowane5,8. Jednak mechanizmy leżące u podstaw tych zmian i czynniki przyczyniające się do rozwoju uszkodzeń są niejasne. Aby lepiej zrozumieć SANS, dostępne są modele zwierzęce do charakteryzowania zmian w strukturze i funkcji siatkówki związanych z lotami kosmicznymi.
W poprzednim badaniu na tych samych zwierzętach, opisaliśmy wpływ 35 dni lotów kosmicznych na siatkówkę myszy. Wyniki wyjaśniają, że loty kosmiczne wywołują znaczne uszkodzenia w siatkówce i unaczynieniu siatkówki, a niektóre białka/szlaki związane ze śmiercią komórki, stanem zapalnym i stresem metabolicznym zostały znacząco zmienione po locie kosmicznym9.
Obecnie, istnieje wiele nieinwazyjnych technik obrazowania opracowanych do monitorowania rozwoju i postępu choroby, a także fizjologicznych reakcji na różne stresory środowiskowe, które są również szeroko stosowane w modelach małych gryzoni. Jedną z tych technik jest mikrotomografia komputerowa, która ocenia struktury anatomiczne i procesy patologiczne i jest z powodzeniem stosowana na organizmach tak małych jak myszy10.
Micro-CT może osiągnąć rozdzielczość mikro i może zapewnić wysoki kontrast do analizy wolumetrycznej tkanek miękkich z dodatkiem odpowiedniego środka kontrastowego10,11,12,13,14. Technologia mikro-CT jest korzystna w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak anatomia ogólna, mikroskopia świetlna i badanie histologiczne, ponieważ minimalizuje fizyczne uszkodzenia profilu geometrycznego próbek i nie zmienia relacji przestrzennych między strukturami. Ponadto trójwymiarowe (3D) modele struktur mogą być rekonstruowane na podstawie obrazów z mikrotomografii komputerowej12,14. Do tej pory, pomimo dowodów wskazujących na upośledzenie wzroku po ekspozycji na środowisko kosmiczne, dostępnych jest niewiele danych w modelach zwierzęcych, które pozwoliłyby lepiej zrozumieć zmiany w strukturze i funkcji siatkówki związane z lotami kosmicznymi. W obecnym badaniu myszy zostały wysłane na 35-dniową misję na pokładzie ISS w celu określenia wpływu środowiska lotu kosmicznego na struktury tkanki oka poprzez ilościowe określenie mikrostruktury siatkówki, RPE i warstw naczyniówki za pomocą mikrotomografii komputerowej.

<table><tbody><tr><td>10 % wag. fosfomolibdic</td><td>Sigma</td><td>12026-57-2</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol firmy Baker Analizowane</td><td>VWR</td><td>80252500</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td>System mikrotomografii rentgenowskiej <td>Merck</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Skaner SkyScan 1272</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena globalnej struktury gałki ocznej po locie kosmicznym z wykorzystaniem metody obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej (micro-ct)

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography (Micro-CT) Imaging Method

Raporty pokazują, że długotrwałe przebywanie w środowisku lotu kosmicznego powoduje morfologiczne i funkcjonalne zmiany okulistyczne u astronautów podczas i po misji Międzynarodowej Stacji Kosmicznej (ISS). Jednak mechanizmy leżące u podstaw tych zmian wywołanych lotami kosmicznymi są obecnie nieznane. Celem niniejszej pracy było określenie wpływu środowiska lotu kosmicznego na struktury oka poprzez ocenę grubości siatkówki myszy, nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), naczyniówki i warstwy twardówki za pomocą obrazowania mikro-CT. Dziesięciotygodniowe samce myszy C57BL/6 zostały umieszczone na pokładzie ISS na 35-dniową misję, a następnie wróciły na Ziemię żywe w celu analizy tkanek. Dla porównania, myszy kontroli naziemnej (GC) na Ziemi były utrzymywane w identycznych warunkach środowiskowych i sprzętowych. Próbki tkanki oka pobrano do analizy mikro-CT w ciągu 38 (±4) godzin po rozprysku. Obrazy przekroju siatkówki, RPE, naczyniówki i warstwy twardówki oka nieruchomego zarejestrowano w widoku osiowym i strzałkowym przy użyciu metody akwizycji mikrotomografii komputerowej. Analiza mikro-CT wykazała, że obszary przekroju poprzecznego siatkówki, RPE i grubości warstwy naczyniówki uległy zmianie w próbkach lotów kosmicznych w porównaniu z GC, przy czym próbki lotów kosmicznych wykazywały znacznie cieńsze przekroje i warstwy w porównaniu z grupą kontrolną. Wyniki tego badania wskazują, że ocena mikrotomografii komputerowej jest czułą i wiarygodną metodą charakteryzowania zmian w strukturze oka. Oczekuje się, że wyniki te przyczynią się do lepszego zrozumienia wpływu stresu środowiskowego na globalne struktury oka.

Średnią grubość warstwy siatkówki, RPE, naczyniówki i twardówki zarejestrowano za pomocą skanów mikro-CT po zastosowaniu powyższego protokołu (Rycina 1). Technika ta umożliwiła wielopłaszczyznową rekonstrukcję oczu w trzech różnych rzutach. Podczas analizy obserwator mógł przesuwać się przez całą próbkę, aby ustandaryzować analizę dokładnie w środkowej części preparatu.
Analiza micro-CT ukazała przekroje poprzeczne oczu w widoku strzałkowym i osiowym (Rysunek 2 oraz Rysunek 3), na których wykonano pomiary liniowe. Grubość RPE i warstwy naczyniówki była znacząco niższa lub wykazywała tendencję spadkową w grupie po locie kosmicznym w porównaniu z grupą GC (Rysunek 3).
<img alt="Eksperyment na myszach: proces ekstrakcji DNA, probówki do wirowania oraz konfiguracja spektroskopowa do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Procedura mikro-tomografii komputerowej (micro-CT) tkanek miękkich. (A) Próbka tkanki miękkiej (oko myszy). (BPróbki utrwalono w 4% formaldehydzie w roztworze buforu fosforanowego (PBS). Po utrwaleniu oczy myszy odwodniono w etanolu. Aby zapobiec dalszemu i gwałtownemu skurczeniu się utrwalonej próbki, zastosowano szereg roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, zaczynając od 50% etanolu przez 1 h, a następnie kolejne roztwory etanolu o stężeniach wymienionych poniżej, po 1 godzinie dla każdego z nich: 70, 80, 90, 96 i 10%.COczy myszy barwiono kwasem fosfomolibdowym (PMA) przez 6 dni, płukano w etanolu bezwodnym, a następnie umieszczano w poszczególnych plastikowych pojemnikach o pojemności 2 ml wypełnionych etanolem bezwodnym.DDo oceny uszkodzeń siatkówki w oczach myszy wykorzystano system skanera mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT) w wersji desktopowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat przekroju strzałkowego oka, z zaznaczeniem warstw siatkówki, pomiary w badaniu anatomicznym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Przekrój strzałkowy myszy z grupy kontrolnej. Warstwy oka po prawej stronie obrazu zostały opisane od góry do dołu: siatkówka (0,07 mm), nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE, 0,038 mm), naczyniówka (0,041 mm), twardówka (0,059 mm). Rysunek został pobrany z pracy Overbey i wsp.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przekrój osiowy oka w tomografii komputerowej (TK) z oznaczoną siatkówką, warstwą barwnikową i twardówką; stosowany w analizie struktury oka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Przekrój osiowy myszy z grupy kontrolnej. Warstwy oka po prawej stronie obrazu są opisane, od góry do dołu: siatkówka (0,14 mm), nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE, 0,051 mm), naczyniówka (0,041 mm) oraz twardówka (0,073 mm). Rysunek ten został zaczerpnięty z pracy Overbey i wsp.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe porównujące grubość warstw siatkówki; warunki naziemne vs. lot kosmiczny; dane z przekroju poprzecznego (mm)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Średnia grubość warstwy siatkówki, warstwy nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) i warstwy naczyniówki zmierzona za pomocą mikro-CT w grupie lotów kosmicznych i grupie kontrolnej. Liczby uśredniono dla pięciu siatkówek na grupę. Wartości przedstawiono jako średnią grubość ± błąd standardowy średniej (SEM). Błąd standardowy średniej zaznaczono słupkami błędów. Istotnie mniejsza grubość w przekroju poprzecznym w grupie lotu kosmicznego (FLT) w porównaniu z grupą kontrolną naziemną (GC) została oznaczona symbolem „*” (p &lt; 0,05). Rysunek ten został zaczerpnięty z pracy Overbey i wsp.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig04large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>

Prezentujemy protokół wykorzystujący obrazowanie mikrokomputerowe o wysokiej rozdzielczości w celu określenia, czy lot kosmiczny spowodował uszkodzenie struktur oka. Protokół przedstawia pomiar struktur oka gryzoni ex vivo za pomocą mikrotomografii komputerowej. Wykazujemy zdolność do oceny zmian morfologicznych oka po locie kosmicznym przy użyciu nieniszczącej techniki trójwymiarowej do oceny uszkodzenia oka.

Ocena globalnej struktury gałki ocznej po locie kosmicznym z wykorzystaniem metody obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej (Micro-CT)

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an ...

W niniejszej pracy proponujemy metodę oceny globalnej struktury gałki ocznej po locie kosmicznym z wykorzystaniem metody obrazowania metodą tomografii mikrokomputerowej. Środowisko lotów kosmicznych, które obejmuje paragrawitację i ekspozycję na promieniowanie, powoduje unikalne zmiany w ludzkiej fizjologii, w tym zmiany płynów. Te przesunięcia płynów prowadzą do podwyższonego ciśnienia śródczaszkowego i są przypisywane jako główna przyczyna zespołu nerwowo-ocznego związanego z lotami kosmicznymi.Fizjologiczny wpływ SANS wpływa na wiele elementów oka i obejmuje obrzęk tarczy nerwu wzrokowego, spłaszczenie gałki strzelistycznej, fałdy naczyniówkowe i siatkówkowe, nadwzroczność i przesunięcia wad refrakcji oraz infracts warstwy włókien nerwowych. Podczas gdy fizjologiczne cechy SANS są dobrze udokumentowane, mechanizmy, które napędzają SANS, są nadal słabo poznane. Aby lepiej zrozumieć SANS, modele gryzoni są wykorzystywane do nieinwazyjnych technik obrazowania.Jedną z tych technik jest mikrotomografia komputerowa, która jest z powodzeniem stosowana do oceny struktur anatomicznych i procesów patologicznych u zwierząt tak małych jak myszy. Mikrotomografia komputerowa może osiągnąć mikrorozdzielczość, a w połączeniu ze środkiem kontrastowym może zapewnić dobry kontrast dla tkanek miękkich. Mikrotomografia komputerowa zapewnia wyraźną przewagę w porównaniu z tradycyjnymi metodami, w tym anatomią ogólną, mikroskopią świetlną i badaniem histologicznym, aby nie powodować uszkodzeń profilu geometrycznego próbek i relacji przestrzennych między strukturami.W naszym obecnym badaniu myszy były wystawione na działanie środowiska kosmicznego przez 35 dni na pokładzie Międzynarodowej Stacji Kosmicznej, aby ustalić, czy środowisko kosmiczne powoduje uszkodzenie oczu, poprzez ilościowe określenie mikrostruktury siatkówki, RPE i warstw naczyniówki za pomocą mikro-CT. Tutaj pokazaliśmy, w jaki sposób przygotowaliśmy próbki do analizy Micro-CT. Myszy zostały użyte i oczy w ciągu 38 plus minus czterech godzin po rozprysku.Oczy wyłuszczono, a lewe oczy utrwalono w czteroprocentowych paraformaldehydu i fosforanów soli fizjologicznej przez 24 godziny. Po fiksacji oczy zostały odwodnione w etanolu. Aby zapobiec dalszemu i gwałtownemu kurczeniu się utrwalonej próbki, zastosowano stopniowaną serię roztworów etanowych.Najpierw próbki przeniesiono do 50% etanolu na jedną godzinę, a następnie zwiększano stężenia przez jedną godzinę każda, 70, 80, 90, 96 i 100%Następnie oczy barwiono kwasem fosfolipidowym o stężeniu 10% wagowym na objętość przez sześć dni. Na koniec próbki przemyto w etanolu absolutnym, a następnie umieszczono w pojedynczych pojemnikach z tworzywa sztucznego wypełnionych etanolem absolutnym w celu skanowania. Dodano również wacik, aby ustabilizować próbkę podczas skanowania.Następnie próbkę umieszczono w stacjonarnym skanerze rentgenowskim Micro-CT SkyScan 1272 w celu oceny uszkodzenia siatkówki. Do skanowania użyliśmy oprogramowania SkyScan 1272. Po otwarciu oprogramowania wyśrodkowaliśmy naszą próbkę w ramce.W naszym protokole nie używamy filtra i ustawiamy matrycę tak, aby zwiększyć rozmiar piksela do czterech mikronów. Mikropozycjonowanie służy do utrzymywania próbki wyśrodkowanej w ramce. Następnie sprawdzamy parametry, aby zmaksymalizować poziom środka kontrastowego w naszej próbce i skalibrować maszynę.W celu wykonania kalibracji wyjmujemy próbkę ze skanera i ustawiamy parametry skanowania. Podczas kalibracji sprawdzana jest również korekta wypełniona na płasko. Powinien być większy niż 80%Po kalibracji próbka jest ponownie wprowadzana do komory skanującej.Przed skanowaniem przykładowe pliki są nazywane. Parametry skanowania są następujące, krok obrotu 0,4, klatki cztery, losowy ruch 30, sprawdź dwukrotnie, czy rozmiar piksela jest ustawiony na 4 mikrony. Następnie rozpoczyna się skanowanie.Po zeskanowaniu NRecon służy do rekonstrukcji próbki. Najpierw otwieramy pliki ze skanu i przeglądamy surowe obrazy skanowania. Dostosowujemy odbicie histogramu, aby pasowało do krzywej.Następnie korygujemy artefakt hartowania belki. Następnie dostosowujemy artefakt wygładzania. Na koniec korygujemy redukcję artefaktu pierścienia.Po wszystkich poprawkach potwierdziliśmy, że nasze próbki mieszczą się w naszym obszarze zainteresowania. Wtedy możemy przystąpić do odbudowy. Używamy oprogramowania DataViewer do wizualizacji zrekonstruowanych obrazów we wszystkich trzech obszarach.Do analizy wykorzystywane jest oprogramowanie CTAn. Zrekonstruowane obrazy są wczytywane do oprogramowania. Nerw wzrokowy został wykorzystany do wyeliminowania obszaru zainteresowania do analizy.Zgodnie z obliczeniami, użyliśmy środkowego wycinka obszaru zainteresowania do wykonania wszystkich pomiarów do analizy. Wykonano trzy powtórzone pomiary w celu obliczenia liniowego pomiaru obszaru. Poniższe pomiary zostały wykonane dla tkanek oka, siatkówki, RPE, naczyniówki, a nasza analiza Micro-CT wykazała, że obszary przekroju siatkówki, RPE i warstwy naczyniówki były znacznie niższe w próbkach lotów kosmicznych w porównaniu z kontrolami naziemnymi.Mikrotomografia komputerowa zapewnia skuteczną i nieniszczącą technikę obliczania wielkości zmian bez żadnej manipulacji. Dzięki zastosowaniu środka kontrastowego poprawia jakość obrazów Micro-CT, które pomagają nam uzyskać wyraźny obraz graficzny rekonstrukcji bez ingerencji w strukturę próbki. Dodatkowo pokazuje, że oryginalne dane są cyfrowe, co zwiększa dostępność i odtwarzalność wyników.Ponadto, podstawowym celem, dopuszczalne jest stosowanie pomiarów trójwymiarowych, ale segmentacja brutto trójwymiarowej struktury może być korzystna w celu uzyskania określonego zarysu całego próbki. Nasze wyniki wskazują, że warunki lotu kosmicznego, zwłaszcza zmiany grawitacyjne, mogą wywoływać ostrą i krótkotrwałą reakcję w oku. Co więcej, przyszłe prace powinny wykorzystywać dane wolumetryczne do wykonywania innych analiz wykorzystujących możliwości obrazowania Micro-CT, ponieważ jest ona z powodzeniem wykorzystywana do badania wielu normalnych i patologicznych tkanek.

assessment-global-ocular-structure-following-spaceflight-using-micro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę obrazowania in vivo do wykrywania i ilościowego określania stanu zapalnego oka w mysim modelu poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Technika ta, znana jako optyczna tomografia koherentna (OCT), generuje obrazy przekroju poprzecznego oka o wysokiej rozdzielczości w celu oceny postępu choroby.

Obrazowanie optycznej koherentnej tomografii do oceny zapalenia błony naczyniowej oka w modelu mysim

Migracja siatki beleczkowej (TM) do przestrzeni kanału Schlemma może być wywołana przez ostre podniesienie ciśnienia przez oftalmodynamometr i obserwowana przez optyczną koherentną tomografię w domenie spektralnej. Celem tej metody jest ilościowe określenie morfometrycznej odpowiedzi żywej drogi odpływu na ostry wzrost ciśnienia w żywych tkankach in situ.

Reakcja siatki beleczkowej na wzrost ciśnienia w żywym ludzkim oku

Ten manuskrypt opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii spektralnej o wysokiej rozdzielczości (SD-OCT). Koncentruje się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w okolicy okołobrodawkowatej, z opisanymi kilkoma podejściami do skanowania i kwantyfikacji.

Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Opisujemy użycie pełnej koherentnej mikroskopii optycznej jako metody wysokiej jakości oceny zrębu dawcy rogówki. Protokół ten może być stosowany do identyfikacji cech wskazujących na zdrowie lub chorobę i ma na celu poprawę badań przesiewowych i selekcji tkanek dawcy, a tym samym wyników keratoplastyki.

Pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna do histologicznej analizy cech zrębu w przeszczepach rogówki

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Optyczna koherentna tomografia o wysokiej rozdzielczości (HR-OCT) jest obiecującą nieinwazyjną metodą diagnozowania i oceny terapeutycznej płaskonabłonkowej powierzchni oka (OSSN). W tym miejscu przedstawiono konfigurację systemu, technikę skanowania i reprezentatywne wyniki diagnostyczne.

Optyczna koherentna tomografia koherentna przedniej części oka w diagnostyce i monitorowaniu terapeutycznym płaskonabłonkowej powierzchni oka

Mikromacierze genów są potężnymi narzędziami w profilowaniu ekspresji genów na poziomie całego genomu. Technologia ta znajduje zastosowanie w wielu dyscyplinach biologicznych, w tym w biologii rozwoju i toksykologii. W tym filmie szczegółowo opisujemy protokół globalnej analizy ekspresji genów z wykorzystaniem kompleksowej platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla danio pręgowanego.

Analiza globalnej ekspresji genów z wykorzystaniem platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla ryby danio-ostrobramkowej

Poznaj metodę mikrotomografii komputerowej do oceny globalnej struktury gałki ocznej po locie kosmicznym. Technika ta pozwala nieinwazyjnie wykryć zmiany w warstwach siatkówki, nabłonka barwnikowego i naczyniówki u myszy.

Ocena globalnej struktury gałki ocznej po locie kosmicznym z wykorzystaniem metody obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej (Micro-CT) (Wideo) | JoVE Journal

Ocena globalnej struktury gałki ocznej po locie kosmicznym z wykorzystaniem metody obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej (Micro-CT)

Przeglądaj więcej filmów