Name: Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę izolacji jąder z dojrzałych adipocytów do analizy transkryptomiki na poziomie pojedynczych komórek. Protokół minimalizuje agregaty jądrowe i pozwala badać organizację tkanki tłuszczowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Davidowi Reynoldsowi z centrum Albert Einstein Genomics i Jinghangowi Zhangowi z rdzenia cytometrii przepływowej za wsparcie techniczne. Dziękujemy za wsparcie ze strony National Institutes of Health (NIH) (DK110426) oraz granty pilotażowe i granty na wykonalność z Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) i New York Obesity Research Center (DK026687) (wszystkie dla K.S.). Chcielibyśmy również podziękować Albert Einstein Cancer Center (CA013330) za podstawowe wsparcie.

Opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Albert Einstein College of Medicine.
1. Przygotowanie do trawienia i lizy tkanek
<ol>
	<li>Przygotować bufor do trawienia tkankowego.
	<ol>
		<li>Przygotuj ~1 ml buforu trawiennego na każdy gram tkanki tłuszczowej.</li>
		<li>Odważyć 1,5 j./ml kolagenazy D i 2,4 j./ml dypazy II i dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor do przygotowania jąder (NPB).
	<ol>
		<li>Przygotuj 10 mM HEPES, 1,5 mM chlorku magnezu, 10 mM chlorku potasu, 250 mM sacharozy i 0,1% NP-40 w wodzie wolnej od nukleaz. Dobrze wymieszaj. Sacharoza może potrzebować więcej czasu na rozpuszczenie niż inne składniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 0,5% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
	<ol>
		<li>Przygotować 0,5% BSA w PBS zawierającym EDTA. Zaleca się stosowanie sterylnie przefiltrowanych hodowli komórkowych klasy PBS (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Trawienie enzymatyczne tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Sekcja myszy w celu ekstrakcji tkanki tłuszczowej zgodnie z Aune et al.13. Zebrać wyizolowaną tkankę w naczyniu zawierającym PBS. Przenieś chusteczkę na ręcznik papierowy, aby osuszyć. Następnie umieść chusteczkę w czystym naczyniu.</li>
	<li>Dodać chlorek wapnia do buforu wytrawiającego do końcowego stężenia 10 mM. Dodaj niewielką objętość buforu trawiącego do naczynia i dokładnie zmiel tkankę tłuszczową. Wymagana objętość buforu trawiennego będzie zależeć od ilości wyizolowanej tkanki. Zwykle stosuje się ~1 ml lub mniej.</li>
	<li>Dodaj około połowy ilości przygotowanego buforu do trawienia (np. ~10 ml dla pięciu myszy) do zmielonej tkanki. Za pomocą pipety serologicznej przenieść próbkę do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać pozostałą ilość buforu do umycia naczynia i przenieść do probówki o pojemności 50 ml zawierającej próbkę. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół. Następnie inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 200-210 obr./min w temperaturze 37 °C przez 12-15 min.</li>
</ol>
3. Izolacja adipocytów
<ol>
	<li>Po inkubacji dodać do próbki 0,5% BSA w stosunku 1:1. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu odwirowania frakcji zrębu naczyniowego (SVF). Frakcja adipocytów pozostanie w górnej warstwie próbki.</li>
	<li>Umieść filtr komórkowy 40 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i przefiltruj próbkę, zbierając górną warstwę i pozostawiając SVF na dnie probówki. Przenieś górną warstwę (frakcję adipocytów) do nowej probówki, odwracając filtr do góry nogami nad probówką i używając 0,5% BSA do odwrotnego mycia filtra i zbierania próbki do probówki.</li>
	<li>Doprowadzić całkowitą objętość 0,5% BSA do 10-15 ml w zależności od wielkości próbki i pipetować w górę iw dół za pomocą pipety serologicznej lub krótko wstrząsnąć w górę iw dół, aby wymieszać próbkę. Ponownie odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Izolacja jąder
<ol>
	<li>Użyj końcówki pipety o szerokim otworze i ostrożnie przenieś górną warstwę próbki do filtra komórkowego o wielkości 100 μm umieszczonego na nowej, wstępnie schłodzonej probówce na lodzie, pozostawiając resztki SVF.</li>
	<li>Wypłucz/umyj filtr odpowiednią ilością NPB i wyrzuć filtr. Od tego kroku naprzód należy umieszczać próbkę na lodzie tak często, jak to możliwe i pracować szybko, aby uniknąć nieszczelnych i/lub niezdrowych jąder. Pomocne jest wstępne schładzanie probówek wirówkowych, które mają być użyte w przyszłych krokach na lodzie.</li>
	<li>Umieścić próbkę na lodzie na nie dłużej niż 2 minuty, z przerywanym, delikatnym odwracaniem probówki do mieszania. Czas inkubacji na lodzie powinien być zoptymalizowany pod kątem wielkości próbki i rodzaju adipocytów. Wirować przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml NPB. Przenieść próbkę do czystej probówki do mikrowirówki. Podczas przenoszenia unikaj dotykania ścianek rurki, które zawierają zanieczyszczenia i lipidy. Dodać 0,6 U/μL inhibitora RNazy do próbki i wymieszać. Ponownie odwirować przy 1.000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. 
	UWAGA: Na tym etapie należy zmniejszyć prędkość i czas wirowania w przypadku mniejszych próbek.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml buforu do przemywania jąder (2% BSA/PBS + 0,6 U/μL inhibitora RNazy).</li>
	<li>Podwójny filtr w czystej rurce z filtrami 30 μm, które można układać jeden na drugim. Przemyć filtr niewielką objętością (~300 μL) buforu do płukania jąder. Alternatywnie, w przypadku mniejszych próbek, należy użyć filtra 30 μm, który mieści się w probówce mikrowirówkowej i przefiltrować bezpośrednio do niej.</li>
	<li>Potwierdź pomyślną izolację zdrowych jąder.
	<ol>
		<li>Zabarwić małą porcję próbki trypanem i użyć automatycznego licznika komórek do oceny średniej martwej wielkości i procentu martwych komórek. Średnia martwa wielkość próbki zawierającej głównie jądra powinna wynosić od 7 do 10 μm. Wielkość jąder wynosi zwykle około 8 μm.</li>
		<li>Wybarwić małą porcję próbki za pomocą DAPI i zbadać pod mikroskopem z obiektywem 20x lub wyższym. Błona jądrowa powinna być nienaruszona, a jądra powinny być okrągłe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Oczyszczanie FACS i etap koncentracji jąder
<ol>
	<li>Natychmiast przejdź do kroku FACS, aby oczyścić jądra i usunąć nadmiar zanieczyszczeń. Bufor kolekcji powinien zawierać bufor Nuclei Wash. Podczas FACS bufor jest rozcieńczany. Pomocne jest przygotowanie wyższego stężenia inhibitora BSA i RNazy w celu uwzględnienia rozcieńczenia podczas sortowania. Blok zbiorczy FACS powinien być w trybie chłodzenia.</li>
	<li>Po posortowaniu jąder odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zagęszczenia próbki. Rozpuścić w odpowiedniej objętości buforu do przemywania jąder do uzyskania stężenia 500-1 500 jąder/μl. Nie próbuj usuwać całego supernatantu. Spowoduje to utratę jąder.</li>
	<li>Użyj hemocytometru i podwielokrotności barwionej DAPI do końcowego zliczenia i wizualizacji jąder. Następnie natychmiast przystąp do sekwencjonowania snRNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiono prostą i solidną metodę izolowania pojedynczych jąder i badania niejednorodności tkanki tłuszczowej. W porównaniu z sekwencjonowaniem RNA całej tkanki, ten przepływ pracy oferuje bezstronny wgląd w heterogeniczność komórkową i markery specyficzne dla populacji. Jest to znaczące i innowacyjne dla postępu w biologii adipocytów, metabolizmie molekularnym i badaniach nad otyłością.
Protokół ten jest szczególnie zoptymalizowany pod kątem dalszego stosowania sekwencji snRNA. Etap "oczy...

Badania wykazały, że brunatna tkanka tłuszczowa (BAT) ma niezwykłą zdolność do rozpraszania energii. Zarówno u gryzoni, jak i u ludzi występują dwa rodzaje adipocytów termogenicznych o wyraźnych cechach rozwojowych: adipocyty beżowe i adipocyty klasyczne brązowe. Podczas gdy klasyczne brązowe adipocyty znajdują się głównie w międzyłopatkowych magazynach BAT, beżowe adipocyty sporadycznie pojawiają się w białej tkance tłuszczowej (WAT) w odpowiedzi na pewne sygnały fizjologiczne, takie jak przewlekła ekspozycja na zimno, proces określany jako "brązowienie" lub "beżowanie". Dzięki zastosowaniu zaawansowanego obrazowania jest teraz jasne, że dorośli ludzie mają znaczne zapasy UCP1+ BAT, zwłaszcza w okolicy nadobojczykowej1,2,3,4. Ilość BAT u dorosłego człowieka odwrotnie koreluje z otyłością i może być zwiększona przez sygnały zewnętrzne, takie jak przewlekła ekspozycja na zimno5,6 lub agonista receptora β3-adrenergicznego7. Wydatek energetyczny zależny od BAT może stanowić realne podejście do walki z otyłością.
Do niedawna termogeniczne adipocyty były uważane za jednorodną populację. Jednak badania wykazały istnienie wielu podtypów lub subpopulacji, które różnią się pochodzeniem rozwojowym, zastosowaniem substratu i transkryptomem8,9,10. Na przykład rodzaj beżowych adipocytów, który preferencyjnie wykorzystuje glukozę do termogenezy, adipocyt g-beżowy, został niedawno opisany 10. Niepełne poznanie typów komórek w brunatnej i beżowej tkance tłuszczowej oraz brak specyficznych markerów stanowią krytyczną barierę w badaniu ich funkcji biologicznych.
Tradycyjne metody izolowania subpopulacji komórek opierają się na ekspresji tylko kilku znanych genów markerowych. Najnowsze postępy w genomice pojedynczych komórek umożliwiają wykorzystanie globalnych danych dotyczących ekspresji genów w pojedynczych komórkach w celu zapewnienia bezstronnego oszacowania liczby subpopulacji w tkance. Ostatecznym celem tego protokołu jest określenie wszystkich podtypów tkanki tłuszczowej pod wpływem różnych bodźców termogenicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki. W przeciwieństwie do innych tkanek i typów komórek, określenie podtypów komórkowych tkanki tłuszczowej jest trudne ze względu na kruchość adipocytów wypełnionych lipidami. W artykule przedstawiono solidny protokół izolacji pojedynczych jąder z tkanki tłuszczowej w celu dalszego zastosowania do sekwencjonowania snRNA. Co ważne, najnowsza literatura porównująca dobrze dopasowane zestawy danych sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder (snRNA-seq) i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) ujawniła, że sekwencjonowanie snRNA jest porównywalne z sekwencjonowaniem scRNA w wykrywaniu typu komórki i lepsze pod względem pokrycia komórkowego dla złożonej tkanki, takiej jak brain11. Protokół ten łączy metodę wirowania w gradiencie gęstości zoptymalizowaną dla tkanek tłuszczowych przez Rosen et al.12 z etapem "oczyszczania" jąder za pomocą szybkiego sortera MoFlo XDP. Jak widać w reprezentatywnych wynikach, analiza 7500 pojedynczych jąder z brunatnej tkanki tłuszczowej myszy między łopatkami zidentyfikowała wiele typów komórek w pozornie jednorodnych brązowych adipocytach. Ogólnie rzecz biorąc, ten prosty i solidny protokół można zastosować do badania organizacji adipocytów i komórek rezydujących w tkance tłuszczowej, identyfikacji genów markerowych specyficznych dla podtypu oraz fenotypowania rozwoju selektywnych myszy z nokautem/transgenicznymi selektywnymi pod względem tkanki tłuszczowej.

<table><tbody><tr><td>autoMACS Roztwór płuczący</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>PBS z EDTA; sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td>Sigma A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Filtr komórkowy 100 &mu; m</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Filtr komórkowy 40&mu; m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &mu; m)</td> <td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D Roche</td><td></td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Inteligentne filtry siatkowe MACS (30 &micro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>Filtry do układania w stosy</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP Sortownik komórek</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Protector Inhibitor RNazy</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Brązowy i beżowy tłuszcz to wyspecjalizowane tkanki tłuszczowe, które rozpraszają energię do termogenezy za pomocą zależnych i niezależnych od UCP1 (Uncoupling Protein-1) szlaków. Jeszcze do niedawna adipocyty termogeniczne były uważane za populację jednorodną. Jednak ostatnie badania wykazały, że istnieje wiele podtypów lub subpopulacji, które różnią się pochodzeniem rozwojowym, zastosowaniem substratu i transkryptomem. Pomimo postępów w genomice pojedynczych komórek, bezstronny rozkład tkanki tłuszczowej na podtypy komórkowe stanowi wyzwanie ze względu na delikatną naturę adipocytów wypełnionych lipidami. Przedstawiony protokół został opracowany w celu obejścia tych przeszkód poprzez skuteczną izolację pojedynczych jąder z tkanki tłuszczowej do dalszych zastosowań, w tym sekwencjonowania RNA. Heterogeniczność komórkowa może być następnie analizowana za pomocą sekwencjonowania RNA i analiz bioinformatycznych.

Nieposortowane jądra adipocytów zawierają zanieczyszczenia i dublety, które generują szum i wysokie tło w późniejszym sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek. Reprezentatywna strategia bramkowania FACS przedstawiona jest na Rysunku 1. Jądra były najpierw selekcjonowane na podstawie rozpraszania przedniego (FSC) i bocznego (SSC) (A), następnie wyselekcjonowano wyłącznie singlety na podstawie kombinacji szerokości i wysokości sygnałów SSC (<s...

Ta publikacja opisuje protokół izolacji jąder z dojrzałych adipocytów, oczyszczania przez sortowanie aktywowane fluorescencją oraz transkryptomiki na poziomie pojedynczej komórki.

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

Derozkład tkanki tłuszczowej na podtypy był wyzwaniem ze względu na delikatną naturę adipocytów. Protokół ten został opracowany w celu przezwyciężenia tego problemu poprzez skuteczną izolację pojedynczych jąder. Ten przepływ pracy zapewnia wysoce oczyszczone pojedyncze jądra ze zminimalizowanymi agregatami jądrowymi i szczątkami komórkowymi.Jest to korzystne dla profilowania transkryptomu pojedynczej komórki tysięcy komórek. Ten prosty i solidny protokół może być stosowany do badania organizacji adipocytów na poziomie tkanek w ich komórkach rezydujących w tkance tłuszczowej. A w szczególności do rozwoju fenotypowania, nokautu tkanki tłuszczowej i myszy transgenicznych.Wizualna demonstracja tego protokołu ma kluczowe znaczenie, aby osoby, które nie mają dużego doświadczenia w obchodzeniu się z adipocytami, mogły replikować i wgląd w niejednorodność tkanki tłuszczowej. Po pobraniu tkanki tłuszczowej od myszy osusz ją ręcznikiem papierowym i umieść w czystym naczyniu. Dodać chlorek wapnia do buforu wytrawiającego do końcowego stężenia 10 mM.Następnie dodaj niewielką objętość do tkanki i dokładnie ją zmielić. Do zmielonej tkanki dodać około połowy ilości przygotowanego buforu do wytrawiania. Za pomocą pipety serologicznej przenieś próbkę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.Umyj naczynie pozostałym buforem i dodaj go do probówki o pojemności 50 ml. Kilkakrotnie odpipetować próbkę w górę i w dół. Następnie inkubuj go przez 12 do 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością od 200 do 210 obr./min.Po inkubacji dodać 0,5% BSA do próbki w stosunku objętościowym 1 do 1 i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Odwirować próbkę o stężeniu 300 xg przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby odwirować frakcję zrębowo-naczyniową, pozostawiając frakcję adipocytów na wierzchu. Przefiltruj górną frakcję przez filtr komórkowy o długości 400 m do probówki o pojemności 50 ml.Następnie odwróć filtr do góry nogami nad rurką i przenieś adipocyty do nowej probówki za pomocą 0,5% BSA, aby odwrócić płukanie filtra. Doprowadzić całkowitą objętość BSA do 10 do 15 ml i pipetować próbkę w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej. Następnie ponownie odwiruj go w temperaturze 300 xg przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po odwirowaniu użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby ostrożnie przenieść górną warstwę próbki do 100-metrowego filtra komórkowego na wierzchu nowej, wstępnie schłodzonej rurki na lodzie. Przepłukać filtr odpowiednią ilością buforu do przygotowania jąder, a następnie wyrzucić go. Od tego kroku naprzód trzymaj próbkę na lodzie i pracuj szybko.Pozostawić próbkę na lodzie na maksymalnie dwie minuty, z przerwami odwracając probówkę do wymieszania. Następnie odwirować w temperaturze 1000 xg i 4 stopni Celsjusza przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do przygotowywania jąder.Przenieś próbkę do czystej probówki do mikrowirówki, uważając, aby nie dotykać ścianek starej probówki. Dodaj 0,6 jednostki na l inhibitora RNazy i wymieszaj. Następnie odwirować próbkę przez kolejne 10 minut.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad i 1 ml buforu do przemywania jąder. Dwukrotnie przefiltruj próbkę do czystej probówki za pomocą 30-metrowych filtrów, które można układać jeden na drugim. Następnie przemyć filtry około 300 L buforu do przemywania jąder.Aby potwierdzić pomyślną izolację zdrowych jąder, należy zabarwić małą porcję próbki trypanem i użyć automatycznego licznika komórek do oceny średniej martwej wielkości i procentu martwych komórek. Wybarwić małą porcję próbki za pomocą DAPI i zbadać ją pod mikroskopem z obiektywem 20X lub wyższym. Jądra powinny być okrągłe i mieć nienaruszoną błonę jądrową.Białe strzałki wskazują jądra bez nienaruszonej błony. Po oczyszczeniu jąder za pomocą FACS, zagęścić tę próbkę, wirując w temperaturze 500 xg przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie należy go rozpuścić w odpowiedniej objętości buforu do płukania jąder.Aby osiągnąć stężenie od 50 do 1500 jąder na L i postępować z jądrami pojedynczych komórek, RNA sekwencjonuje. Aby usunąć resztki komórkowe i dublety, jądra adipocytów są sortowane pod względem wielkości i ziarnistości, aby wykluczyć agregaty jądrowe i wielokrotności. I wreszcie pozytywne wydarzenia DAPI.Ta strategia klasyfikacji prowadzi do wysoce oczyszczonych pojedynczych jąder z minimalną ilością agregatów i zanieczyszczeń. Podczas badania mikroskopowego posortowane jądra powinny być okrągłe i mieć nienaruszoną błonę. Skuteczne oczyszczanie jąder można również przeprowadzić za pomocą qRT-PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów dla powstającego mRNA Ucp1, genu markerowego dla brązowych adipocytów.Platforma chromowa wyznaczyła transkryptom 7500 jąder z mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej między łopatkami. Ujawniono siedem różnych typów komórek z redukcją wymiarowości t-SNE i grupowaniem k-średnich. Wszystkie klastry wykazywały ekspresję Fabp4, genu pan adipocytów i podzbioru wyrażającego wysoki poziom mRNA Ucp1.Jądra wyizolowane, a następnie potwierdzone, chociaż ten protokół może być poddany praktycznie każdej platformie ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki, w tym chromowi z 10x Genomics.

isolation-adipose-tissue-nuclei-for-single-cell-genomic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ze względu na drastyczny i negatywny związek między otyłością a innymi chorobami współistniejącymi, uzasadnione są badania nad rolą tłuszczu w chorobach i ogólnym zdrowiu. Przedstawiamy protokół izolacji i wycinania magazynów tłuszczowych pozwalający na badanie tkanki tłuszczowej metodami in situ i in vitro.

Lokalizacja, identyfikacja i wycięcie mysich magazynów tłuszczu

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

To badanie opisuje nową metodę izolowania mysich brązowych adipocytów do analizy ekspresji genów i białek.

Izolowanie brązowych adipocytów z mysiej brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami w celu analizy ekspresji genów i białek

Tutaj prezentujemy protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych nerek myszy, który poprawia reprezentację typów komórek rdzeniastych nerek i pozwala uniknąć artefaktów ekspresji genów spowodowanych dysocjacją enzymatyczną tkanki.

Izolacja jąder z nerki dorosłej myszy w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Przedstawiamy protokół do oznaczania chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq) szczególnie na adipocytach za pomocą sortowania jąder z tkankami tłuszczowymi wyizolowanymi od transgenicznych myszy reporterowych z znakowaniem fluorescencji jądrowej.

Specyficzny dla adipocytów ATAC-Seq z tkankami tłuszczowymi przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Biologia międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) jest w dużej mierze niezbadana ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu identyfikacji składu komórkowego tego unikalnego magazynu tłuszczu.

Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

Poznaj metodę izolacji jąder z dojrzałych adipocytów do analizy transkryptomiki na poziomie pojedynczych komórek. Protokół minimalizuje agregaty jądrowe i pozwala badać organizację tkanki tłuszczowej.

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów