Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Derozkład tkanki tłuszczowej na podtypy był wyzwaniem ze względu na delikatną naturę adipocytów. Protokół ten został opracowany w celu przezwyciężenia tego problemu poprzez skuteczną izolację pojedynczych jąder. Ten przepływ pracy zapewnia wysoce oczyszczone pojedyncze jądra ze zminimalizowanymi agregatami jądrowymi i szczątkami komórkowymi.

Jest to korzystne dla profilowania transkryptomu pojedynczej komórki tysięcy komórek. Ten prosty i solidny protokół może być stosowany do badania organizacji adipocytów na poziomie tkanek w ich komórkach rezydujących w tkance tłuszczowej. A w szczególności do rozwoju fenotypowania, nokautu tkanki tłuszczowej i myszy transgenicznych.

Wizualna demonstracja tego protokołu ma kluczowe znaczenie, aby osoby, które nie mają dużego doświadczenia w obchodzeniu się z adipocytami, mogły replikować i wgląd w niejednorodność tkanki tłuszczowej. Po pobraniu tkanki tłuszczowej od myszy osusz ją ręcznikiem papierowym i umieść w czystym naczyniu. Dodać chlorek wapnia do buforu wytrawiającego do końcowego stężenia 10 mM.

Następnie dodaj niewielką objętość do tkanki i dokładnie ją zmielić. Do zmielonej tkanki dodać około połowy ilości przygotowanego buforu do wytrawiania. Za pomocą pipety serologicznej przenieś próbkę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.

Umyj naczynie pozostałym buforem i dodaj go do probówki o pojemności 50 ml. Kilkakrotnie odpipetować próbkę w górę i w dół. Następnie inkubuj go przez 12 do 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością od 200 do 210 obr./min.

Po inkubacji dodać 0,5% BSA do próbki w stosunku objętościowym 1 do 1 i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Odwirować próbkę o stężeniu 300 xg przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby odwirować frakcję zrębowo-naczyniową, pozostawiając frakcję adipocytów na wierzchu. Przefiltruj górną frakcję przez filtr komórkowy o długości 400 m do probówki o pojemności 50 ml.

Następnie odwróć filtr do góry nogami nad rurką i przenieś adipocyty do nowej probówki za pomocą 0,5% BSA, aby odwrócić płukanie filtra. Doprowadzić całkowitą objętość BSA do 10 do 15 ml i pipetować próbkę w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej. Następnie ponownie odwiruj go w temperaturze 300 xg przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby ostrożnie przenieść górną warstwę próbki do 100-metrowego filtra komórkowego na wierzchu nowej, wstępnie schłodzonej rurki na lodzie. Przepłukać filtr odpowiednią ilością buforu do przygotowania jąder, a następnie wyrzucić go. Od tego kroku naprzód trzymaj próbkę na lodzie i pracuj szybko.

Pozostawić próbkę na lodzie na maksymalnie dwie minuty, z przerwami odwracając probówkę do wymieszania. Następnie odwirować w temperaturze 1000 xg i 4 stopni Celsjusza przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do przygotowywania jąder.

Przenieś próbkę do czystej probówki do mikrowirówki, uważając, aby nie dotykać ścianek starej probówki. Dodaj 0,6 jednostki na l inhibitora RNazy i wymieszaj. Następnie odwirować próbkę przez kolejne 10 minut.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad i 1 ml buforu do przemywania jąder. Dwukrotnie przefiltruj próbkę do czystej probówki za pomocą 30-metrowych filtrów, które można układać jeden na drugim. Następnie przemyć filtry około 300 L buforu do przemywania jąder.

Aby potwierdzić pomyślną izolację zdrowych jąder, należy zabarwić małą porcję próbki trypanem i użyć automatycznego licznika komórek do oceny średniej martwej wielkości i procentu martwych komórek. Wybarwić małą porcję próbki za pomocą DAPI i zbadać ją pod mikroskopem z obiektywem 20X lub wyższym. Jądra powinny być okrągłe i mieć nienaruszoną błonę jądrową.

Białe strzałki wskazują jądra bez nienaruszonej błony. Po oczyszczeniu jąder za pomocą FACS, zagęścić tę próbkę, wirując w temperaturze 500 xg przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie należy go rozpuścić w odpowiedniej objętości buforu do płukania jąder.

Aby osiągnąć stężenie od 50 do 1500 jąder na L i postępować z jądrami pojedynczych komórek, RNA sekwencjonuje. Aby usunąć resztki komórkowe i dublety, jądra adipocytów są sortowane pod względem wielkości i ziarnistości, aby wykluczyć agregaty jądrowe i wielokrotności. I wreszcie pozytywne wydarzenia DAPI.

Ta strategia klasyfikacji prowadzi do wysoce oczyszczonych pojedynczych jąder z minimalną ilością agregatów i zanieczyszczeń. Podczas badania mikroskopowego posortowane jądra powinny być okrągłe i mieć nienaruszoną błonę. Skuteczne oczyszczanie jąder można również przeprowadzić za pomocą qRT-PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów dla powstającego mRNA Ucp1, genu markerowego dla brązowych adipocytów.

Platforma chromowa wyznaczyła transkryptom 7500 jąder z mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej między łopatkami. Ujawniono siedem różnych typów komórek z redukcją wymiarowości t-SNE i grupowaniem k-średnich. Wszystkie klastry wykazywały ekspresję Fabp4, genu pan adipocytów i podzbioru wyrażającego wysoki poziom mRNA Ucp1.

Jądra wyizolowane, a następnie potwierdzone, chociaż ten protokół może być poddany praktycznie każdej platformie ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki, w tym chromowi z 10x Genomics.