Test immunoprecypitacji metylowanego RNA do badania modyfikacji m⁵C u Arabidopsis

Immunoprecypitacja metylowanego RNA, zwana również MeRIP, jest metodą przeznaczoną do identyfikacji grup metylowanych w całych transkryptomach. Może być przystosowany do ekstraktów RNA wielu organizmów modelowych. Metoda jest prosta, nie wymaga żadnej ostrej obróbki chemicznej i może być stosowana do mapowania dowolnej modyfikacji RNA, o ile określona zmienna.

Aby wyekstrahować próbkę RNA, najpierw zmiel 200 miligramów próbki tkanki roślinnej będącej przedmiotem zainteresowania na proszek w ciekłym azocie, uważając, aby tkanka pozostała zamrożona przez cały czas trwania procedury. Następnie dodaj jeden mililitr odczynnika do ekstrakcji RNA zawierającego tiocyjanian guanidyny i kwaśny fenol do zmielonej tkanki roślinnej i dobrze wymieszaj przez inwersję, upewniając się, że cała tkanka jest mokra. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej odwirować próbki i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Dodać 200 mikrolitrów 1-bromo-3-chloropropanu do supernatantu i energicznie zawirować próbkę. Oddzielić fazy przez odwirowanie i przenieść około 500 mikrolitrów górnej fazy wodnej do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać 500 mikrolitrów izopropanolu i 50 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu do próbki i dobrze wymieszać przez inwersję.

Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przed wytrąceniem RNA przez odwirowanie. Po odrzuceniu supernatantu przemyć osad dwa razy 500 mikrolitrami 80% etanolu i jeden raz 500 mikrolitrami 99% etanolu. Po ostatnim praniu suszyć granulki przez pięć do 10 minut przed rozpuszczeniem w 30 mikrolitrach wody wolnej od RNaz.

Zmierzyć stężenie RNA na spektrofotometrze i strawić 20 mikrogramów próbki RNA w wodzie i roztworze buforowym DNazy. Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza należy użyć odpowiedniej objętości odczynnika do inaktywacji DNazy w celu usunięcia enzymu i sprawdzenia jakości i czystości wyizolowanego RNA za pomocą elektroforezy kapilarnej zgodnie ze standardowymi protokołami. Jeśli liczba integralności RNA w próbce strawionej przez DNazę jest wyższa niż siedem, dodaj co najmniej 12 mikrogramów każdej próbki RNA do nowej probówki.

Zwiększ o 0,1 nanograma każdego wcześniej przygotowanego transkryptu in vitro, jednego metylowanego i jednego niemetylowanego, na trzy mikrogramy próbki RNA i doprowadzić końcową objętość w każdej probówce do 80 mikrolitrów wodą wolną od RNaz. Następnie należy poddać sonifikacji całą objętość każdej próbki RNA w poszczególnych probówkach sonifikacyjnych i potwierdzić skuteczność sonikacji oraz stężenie próbek RNA za pomocą elektroforezy kapilarnej. Średnia wielkość rozdrobnionego RNA powinna wynosić około 100 nukleotydów.

W celu immunoprecypitacji metylowanego RNA dodaj dziewięć mikrogramów każdej sonicznej próbki RNA i do 60 mikrolitrów wody wolnej od RNaz do nowych pojedynczych probówek o niskim poziomie wiązania i podgrzej RNA do 70 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 10 minut. Pod koniec inkubacji schłodzić próbki przez 10 minut w lodowatej łaźni wodnej i przenieść 20 mikrolitrów każdej próbki do nowej probówki o niskim poziomie wiązania do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza jako wejście. Dodaj wodę wolną od RNaz do pozostałych 40 mikrolitrów każdej próbki do końcowej objętości 860 mikrolitrów i podziel każdą próbkę na jedną rurkę o niskim poziomie wiązania do immunoprecypitacji i jedną rurkę o niskim poziomie wiązania jako próbkę próbną.

Do każdej próbki dodać 50 mikrolitrów buforu 10X MeRIP i 10 mikrolitrów inhibitora RNazy. Następnie dodaj 10 mikrolitrów przeciwciała anty-M5C do probówek immunoprecypitacyjnych i 10 mikrolitrów wody do próbnych probówek. Uszczelnić probówki parafilmem i inkubować próbki przez 12 do 14 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza z obrotem nad głową.

Następnego ranka dodaj 40 mikrolitrów kulek do jednej 15-mililitrowej probówki na próbkę. Umyj kulki trzema pięciominutowymi płukaniami z 800 mikrolitrami buforu MeRIP i rotacją nad głową na próbkę na pranie, zbierając kulki na magnesie po każdym płukaniu, aby umożliwić wyrzucenie buforu. Po trzecim płukaniu ponownie zawiesić kulki w 40 mikrolitrach świeżego buforu MeRIP na próbkę i dodać 40 mikrolitrów ponownie zawieszonych kulek do immunoprecypitacji i pozorować probówki z próbkami do dwugodzinnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją nad głową.

Pod koniec inkubacji umieścić probówki na stojaku magnetycznym na jedną minutę, a następnie ostrożnie wyrzucić supernatant bez naruszania kulek. Umyj kulki pięć razy w 700 mikrolitrach buforu MeRIP uzupełnionego 0,01%Tween-20 przez 10 minut na pranie w temperaturze pokojowej z obrotem nad głową. Po ostatnim praniu ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach buforu do trawienia proteinazy K i 3,5 mikrolitrach proteinazy K na trzygodzinną inkubację w temperaturze 50 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 800 obrotów na minutę.

Pod koniec inkubacji wyekstrahować RNA za pomocą 800 mikrolitrów odczynnika do ekstrakcji RNA i protokołu ekstrakcji chloroformem kwaśnego tiocyjanianu guanidyny, jak pokazano. Po ekstrakcji ponownie zawieś wyekstrahowany osad RNA w dokładnie 20 mikrolitrach wody wolnej od RNaz. Na tym rysunku pokazano reprezentatywną serię dobrej próbki RNA.

W tej samej próbce po sonikacji można zaobserwować obecność jednego jednolitego piku przesuniętego w lewo o wielkości około 100 nukleotydów. Niższe stężenie jest spowodowane zarówno utratą RNA podczas fragmentacji, jak i zwiększoną objętością próbki. Jakość immunoprecypitacji i próbek próbnych można ocenić za pomocą ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkryptazą.

W tej reprezentatywnej analizie około 80% metylowanego transkryptu in vitro zostało odzyskane w próbce immunoprecypitacji, podczas gdy tylko około 2% zostało odzyskane w próbce próbnej. W przypadku kontroli niemetylowanej odzysk wynosił poniżej 1% zarówno w próbkach immunoprecypitacyjnych, jak i próbnych. Po głębokim sekwencjonowaniu i dopasowaniu odczytów do genomu, można zastosować algorytmy wywoływania pików w celu zidentyfikowania statystycznie istotnych okien, które są wzbogacone w próbkach immunoprecypitacji w porównaniu z danymi wejściowymi.

Korzystając z danych sekwencjonowania, możemy zidentyfikować motyw, przy którym najczęściej zachodzi metylacja RNA, a motyw ten może służyć jako przynęta do ściągania określonych białek wiążących.