Oznaczanie ilościowe kwasów humusowych i fulwowych w rudach humatów, DOC, materiałach humififikowanych i produktach handlowych zawierających substancje humusowe

Nowa standardowa metoda oznaczania ilościowego kwasów humusowych zapewnia dokładniejszą i bardziej precyzyjną analizę w porównaniu z istniejącymi metodami akceptowanymi przez przepisy, a także zapewnia standardową metodę oznaczania ilościowego czystego hydrofobowego kwasu fulwowego. Zaletą tego protokołu jest to, że zapewnia analizę grawimetryczną stężeń humusowych i hydrofobowych kwasów fulwowych na bazie bezpopiołowej, a proces ekstrakcji został zoptymalizowany w celu uzyskania najwyższych odzysków zarówno kwasów humusowych, jak i fulwowych z próbek. Procedurę zademonstruje Ryan Fountain, chemik analityczny z naszego laboratorium chemii humusowej.

Aby przygotować próbkę stałą, użyj moździerza i tłuczka, aby zmiażdżyć około pięciu gramów próbki do analizy, aż 100% dobrze wymieszanej próbki będzie mogło przejść przez standardowe w USA sito o rozmiarze oczek 200. Aby grawimetrycznie określić zawartość wilgoci w proszku, należy przenieść około dwóch gramów próbki proszku do wstępnie obważonej aluminiowej łodzi wagowej i zapisać masę łodzi i próbki. Następnie umieść łódź wagową w piecu do suszenia w temperaturze 102 stopni Celsjusza na 24 godziny.

Następnego dnia umieścić łódź w eksykatorze do ostygnięcia przez co najmniej godzinę przed zważeniem i zarejestrowaniem masy łodzi wagowej i wysuszonej próbki, a następnie użyć wzoru do oznaczenia zawartości wilgoci zgodnie ze wskazaniami. Aby przeprowadzić ekstrakcję z próbki stałej, należy zważyć około 2,5 grama pozostałej próbki i zapisać masę z dokładnością do czterech miejsc po przecinku. Następnie załaduj próbkę do litrowej kolby Erlenmeyera i przepłucz łódkę wagową wodą dejonizowaną, aby usunąć całą rudę.

Napełnić zlewkę do objętości jednego litra 0,1-molowym wodorotlenkiem sodu i dodać mieszadło magnetyczne o średnicy od pięciu do siedmiu centymetrów, aby ułatwić szybkie mieszanie próbki z prędkością od 300 do 400 obrotów na minutę na płytce mieszającej. Po dokładnym wymieszaniu próbki opróżnić przestrzeń czołową kolby z gazowym azotem, następnie uszczelnić otwór kolby hermetyczną pokrywą i umieścić kolbę na płytce mieszającej w celu mieszania z prędkością 300 do 400 obrotów na minutę przez 16 do 18 godzin. W przypadku ekstrakcji materiału płynnego należy dokładnie wstrząsnąć próbką, aby upewnić się, że badana ciecz jest jednorodnie wymieszana, łącznie z wszelkimi pozostałościami, które mogły spaść na dno pojemnika.

Zważyć około pięciu gramów badanej cieczy i zanotować masę z dokładnością do czterech miejsc po przecinku. Następnie dodaj płyn do jednolitrowego cylindra z podziałką i napełnij cylinder 0,1-molowym wodorotlenkiem sodu do końcowej objętości jednego litra. Za pomocą mieszadła magnetycznego szybko wymieszać próbkę, jak pokazano, aż próbka do badań zostanie całkowicie wymieszana, a następnie przenieść mieszaninę do jednolitrowej kolby Erlenmeyera, następnie opróżnić przestrzeń nad wodą za pomocą azotu gazowego i mieszać zawartość kolby z prędkością 300–400 obrotów na minutę przez jedną godzinę, jak pokazano.

Aby usunąć nierozpuszczalne substancje z ekstraktów alkalicznych, pod koniec inkubacji z mieszaniem, przenieść mieszaninę do odpowiednich probówek wirówkowych i odwirować całą objętość próbki przy 4,921x G przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec wirowania zebrać alkaliczny supernatant zawierający kwas humusowy i frakcję fulwową, która zawiera hydrofobowy kwas fulwowy, w czystej, jednolitrowej kolbie Erlenmeyera z mieszadłem magnetycznym. W przypadku wytrącania kwasu humusowego z frakcji fulwowej, mieszając zebrany ekstrakt alkaliczny z prędkością od 300 do 400 obrotów na minutę na płytce mieszającej, włożyć sondę pH do środkowej części roztworu i dodawać stężony kwas solny kroplami, aż do osiągnięcia stabilnego pH 1,0 plus lub minus 0,1.

Gdy pH się ustabilizuje, wyjmij sondę i mieszadło, przepłucz je wodą dejonizowaną i zamknij kolbę hermetyczną pokrywą. Pozostawić kolbę na jedną do sześciu godzin, aż wytrącony kwas humusowy osiądzie na dnie, przed odwirowaniem ekstraktu i wytrąceniem kwasu humusowego w temperaturze 4,921 x G przez jedną godzinę. Pod koniec wirowania wlać supernatanty zawierające frakcję fulwową do czystej, litrowej kolby Erlenmeyera i zamknąć kolbę hermetyczną pokrywą.

Umieść probówki wirówkowe zawierające kwas humusowy w piecu suszącym o temperaturze 100 stopni Celsjusza na 24 godziny i upewnij się, że pokrywki są luźne lub zdjęte, aby zapewnić suszenie. Po wysuszeniu probówki schłodzić w eksykatorze, aż osiągną temperaturę pokojową. Po schłodzeniu za pomocą szpatułki przenieś pozostałość z każdej probówki do pojedynczej tarowanej łodzi wagowej w celu określenia masy wyekstrahowanej próbki kwasu humusowego.

Aby określić zawartość popiołu w próbce, należy przenieść około 30 miligramów wysuszonego kwasu humusowego do czystego, wstępnie zważonego naczynia ceramicznego w celu określenia masy próbki do ważenia i naczynia. Następnie spalaj kwas humusowy w piekarniku muflowym przez dwie godziny w temperaturze 600 stopni Celsjusza przed schłodzeniem naczynia w eksykatorze. Po ostygnięciu zważ naczynie i użyj wzoru do obliczenia stosunku popiołu.

Aby określić końcową masę czystego kwasu humusowego, należy użyć wzoru do skorygowania zawartości popiołu. Następnie użyj wzorów, aby określić stężenie czystego kwasu humusowego. Aby przygotować nową, niskociśnieniową kolumnę chromatograficzną DAX8 wypełnioną żywicą z polimetakrylanu metylu, należy zanurzyć żywicę w metanolu przez dwie godziny w zlewce, a następnie dokładnie spłukać żywicę wodą dejonizowaną, aż cały metanol zostanie usunięty.

Następnie usuń wszelkie drobne cząsteczki żywicy unoszące się na wodzie. Po dokładnym wypłukaniu wlej wypłukaną lub zregenerowaną żywicę do szklanej kolumny chromatograficznej o wymiarach 5 na 25 centymetrów wyposażonej w końcówkę z 10-mikronową frytą jako podparcie złoża żywicy, pozostawiając 2,5 do 5 centymetrów w górnej części kolumny i umieść górną część na kolumnie. Aby odnowić poprzednio używaną żywicę lub przygotować świeżo umytą nową żywicę, użyj pompy perystaltycznej do pompowania 0,1-molowego kwasu solnego o natężeniu przepływu od 35 do 40 mililitrów przez dno kolumny, aż pH ścieków zrówna się z pH dopływu, a następnie pompuj wodę dejonizowaną do górnej części kolumny, aż pH ścieków będzie równe pH dopływu.

Po zapakowaniu złoża żywicy użyj pompy perystaltycznej, aby załadować frakcję fulwową na kolumnę pod niskim ciśnieniem przez górną część kolumny przy natężeniu przepływu od 35 do 40 mililitrów. Gdy frakcja fulwowa zostanie całkowicie załadowana na żywicę, umyj żywicę wodą dejonizowaną, aby usunąć niezaadsorbowaną hydrofilową frakcję fulwową. Przemyć kolumnę wodą dejonizowaną, aż absorpcja ścieków z kolumny o wielkości 350 nanometrów będzie równa absorpcji wody dejonizowanej użytej do przemywania kolumny.

Aby zdesorbować HFA, należy przepompować 0,1-molowy wodorotlenek sodu przez dno kolumny i wychwycić ścieki z fulwionu sodu pompy do czystego pojemnika o odpowiedniej wielkości. Cały HFA został zdesorbowany, gdy absorbancja ścieków z kolumny jest równa absorbancji 0,1-molowego wodorotlenku sodu wpływającego na głębokości 350 nanometrów. Aby usunąć popiół HFA przez protonację, najpierw wlej żywicę protonowo-kationwymienną do dużej zlewki, a następnie przykryj i wymieszaj żywicę ze świeżą wodą dejonizowaną kilka razy, wylewając wodę po każdym płukaniu, aż czerwony kolor zostanie całkowicie usunięty.

Po ostatnim praniu przykryj żywicę jednym molowym kwasem solnym i odstaw mieszaninę na co najmniej dwie godziny, mieszając co 30 minut. Pod koniec zakwaszania zastąp kwas wodą dejonizowaną i energicznie mieszaj prętem mieszającym przez 15 sekund, zanim żywica opadnie na dno kolby i wyleje wodę. Powtarzaj proces, aż przewodność elektryczna wody do płukania będzie mniejsza lub równa 0,7 mikroSiemensa na centymetr i załaduj zregenerowaną żywicę do kolumny o wymiarach 5 na 50 centymetrów z frytą szklaną w celu zatrzymania żywicy.

Następnie przykryj żywicę świeżą wodą dejonizowaną i wielokrotnie przepuszczaj fulwat sodu przez silną żywicę kationowo-protonową za pomocą zasilania grawitacyjnego, aż przewodność elektryczna ścieków będzie mniejsza niż 120 mikrosiemensów na centymetr. Aby upewnić się, że cały FA zostanie usunięty z żywicy, po ostatnim przejściu przepłucz żywicę wodą dejonizowaną, aż absorpcja ścieków na głębokości 350 nanometrów będzie taka sama, jak woda dejonizowana używana do mycia kolumny. Dodać płukanie i wszelkie ścieki użyte do sprawdzenia absorbancji do oczyszczonego roztworu FA.

Aby pomóc w usunięciu FA, żywicę można kilkakrotnie mieszać. Użyj wyparki obrotowej o temperaturze 55 stopni Celsjusza, aby zagęścić FA do około 15 plus minus dwumililitrowej objętości i całkowicie przenieś całą objętość koncentratu FA do 50-mililitrowej plastikowej probówki wirówkowej. Wysuszyć próbkę do temperatury 60 plus minus trzy stopnie Celsjusza do stałej suchości w piecu suszącym i przenieść probówkę do eksykatora w celu ostygnięcia.

Gdy próbka ostygnie, za pomocą szpatułki zeskrobać wyekstrahowany FA na kawałek wstępnie zważonego papieru wagowego i określić stosunek popiołu, wyekstrahowaną masę FA i procent czystego FA w oryginalnej próbce, jak pokazano dla kwasu humusowego. W powyższej tabeli przedstawiono precyzyjne dane dotyczące metody ekstrakcji HA i HFA z ciekłych próbek handlowych o bardzo różnych stężeniach HA i HFA. Resztkowe odchylenie standardowe dla HA było niższe niż dla HFA, ale średnie resztkowe odchylenie standardowe HFA dla trzech próbek cieczy wynosiło 6,83%, co wskazuje na wysoki stopień precyzji.

Współczynnik Horowitza był również większy niż dwa tylko dla jednej z analiz HFA. W powyższej tabeli przedstawiono dane dotyczące precyzji ekstrakcji HA i HFA z trzech próbek rudy humusowej. Podobnie jak w poprzedniej analizie, z wyjątkiem HFA wyekstrahowanego z rudy drugiej i HA z rudy trzeciej, wszystkie współczynniki Horowitza były poniżej dwóch, co świadczy o wysokim stopniu precyzji tej metody ekstrakcji HA i HFA z próbek rudy humusowej.

W tej analizie nie zaobserwowano, aby żadne dodatki biostymulujące rośliny znacząco wpływały na odzysk HA lub HFA. W tabelach tych przedstawiono poziomy odzysku kwasu hialuronowego i kwasu ciekłego z próbek cieczy, które stymulowały produkty handlowe o bardzo niskich stężeniach. Odzysk był doskonały, wahał się od 88% do 97% w przypadku HA oraz od 92% do 104% w przypadku HFA, ale wskazuje również na potrzebę przeprowadzenia powtórzeń laboratoryjnych.

Po tej procedurze otrzymane suche kwasy humusowe i fulwowe można wykorzystać do celów charakteryzacji, takich jak rezonans elektronowy węgla-13 i protonów NMR oraz spektrometria mas o ultrawysokiej rozdzielczości, a także inne przydatne techniki. Można to wykorzystać do scharakteryzowania składu chemicznego próchnicy, a także jako użyteczne narzędzie do zagłębienia się w związek struktura-aktywność ze sprawnością roślin i leżącymi u jej podstaw mechanizmami obronnymi roślin.