Name: Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę podłużnego obrazowania in vivo wysp trzustkowych w przedniej komorze oka myszy. Technika ta umożliwia nieinwazyjną ocenę funkcji i przeżywalności przeszczepów ludzkich komórek beta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych, Obszar Badań Strategicznych Exodiab, Dnr 2009-1039, Szwedzką Fundację Badań Strategicznych Dnr IRC15-0067 do LUDC-IRC, Królewskie Towarzystwo Fizjograficzne w Lund, Diabetesförbundet i Barndiabetesförbundet.

<ol><li>Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus%3A+The+epidemic+of+the+century%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus: The epidemic of the century.</a> World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).</li>
<li>Kanak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+response+in+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory response in islet transplantation.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 451035(2014).</li>
<li>Nanji, S. A., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+pancreatic+islet+transplantation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Obesity%2C+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Advances in pancreatic islet transplantation in humans.</a> Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).</li>
<li>Malaisse, W. J., Maedler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+the+beta+cells+of+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).</li>
<li>Kim, D., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Transplanted+Pancreatic+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 382(2017).</li>
<li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li>
<li>Yang, S. N., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eye+as+a+novel+imaging+site+in+diabetes+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The eye as a novel imaging site in diabetes research.</a> Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).</li>
<li>Schmidt-Christensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamics+of+CD11c%28%2B%29+cells+and+Foxp3%28%2B%29+cells+in+progressive+autoimmune+insulitis+in+the+NOD+mouse+model+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).</li>
<li>Berclaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+three-dimensional+visualisation+of+autoimmune+diabetes+by+functional+optical+coherence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging.</a> Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).</li>
<li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+fibroblasts+reconstitute+the+peri-islet+membrane%3A+a+longitudinal+imaging+study+of+human+islet+grafting+and+revascularisation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation.</a> Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).</li>
<li>Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenninger%2C+RK+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).</li>
<li>Goto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+the+automated+method+for+human+islet+isolation+and+presentation+of+a+closed+system+for+in+vitro+islet+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture.</a> Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).</li>
<li>Jansson, L., Carlsson, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft+vascular+function+after+transplantation+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets.</a> Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).</li>
<li>Konstantinova, I., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+development%3A+learning+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Microvascular development: learning from pancreatic islets.</a> Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).</li>
<li>Fransson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+support+endothelial+cell+interactions+in+an+intramuscular+islet+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model.</a> Regenerative Medicine Research. 3, 1(2015).</li>
<li>Nyqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+islet+endothelial+cells+in+pancreatic+islet+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization.</a> Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).</li>
<li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+common+anesthetics+on+eye+movement+and+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica.+Advances+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram.</a> Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).</li>
<li>Iwasaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+intolerance+during+prolonged+sevoflurane+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia.</a> Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).</li>
<li>Hamilton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+its+applications+in+fluorescent+microscopy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging.</a> Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).</li>
<li>Michelotti, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET%2FMRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li>
<li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging%3A+why+clinical+implementation+has+never+been+closer%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li>
<li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li>
<li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiono metodę badania procesu przeszczepiania ludzkich komórek wysp trzustkowych poprzez obserwację udziału tkanki biorcy i dawcy. Po minimalnie inwazyjnej operacji polegającej na wszczepieniu ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy z niedoborem odporności, mysz szybko wraca do zdrowia w ciągu kilku minut po operacji. Zabieg wykonywany jest na jednym oku. Ogólnie rzecz biorąc, od 5-7 dni po implantacji rogówka jest wystarczająco zagojona, aby można było wykonać obrazowanie przyżyciowe.
<p clas...

Cukrzyca opisuje grupę chorób metabolicznych charakteryzujących się podwyższonym poziomem glukozy we krwi, będącym wynikiem niedostatecznej produkcji insuliny spowodowanej utratą lub dysfunkcją komórek beta wysp trzustkowych, której często towarzyszy insulinooporność. Cukrzyca typu 1 (T1D) i typu 2 (T2D) są złożonymi chorobami, w których postępująca dysfunkcja komórek beta powoduje rozwój choroby. T1D jest wywoływana przez autoimmunologiczny atak na komórki beta, podczas gdy T2D jest uważana za napędzaną przez czynniki metaboliczne, aczkolwiek z coraz większą liczbą dowodów na ogólnoustrojowe zapalenie o niskim stopniu złośliwości1. Przeszczepianie ludzkich wysp trzustkowych od dawców, szczególnie u pacjentów z cukrzycą typu 1, daje możliwość zapewnienia fizjologicznej kontroli glikemii. Jednak niedobór dawców tkanek i słabe wszczepienie wysp trzustkowych sprawiły, że przeszczep wysp trzustkowych stał się główną opcją terapeutyczną. Znaczna część funkcjonalnego przeszczepu wysp trzustkowych zostaje utracona w bezpośrednim okresie po przeszczepieniu (24–48 godzin) z powodu niedotlenienia, stanu zapalnego, immunogennego środowiska gospodarza2,3. Aby ocenić skuteczność metod interwencyjnych w celu poprawy przeżywalności wysp trzustkowych, konieczne jest ciągłe monitorowanie takich przeszczepów.
Techniki in vivo do obrazowania i śledzenia losu przeszczepionych ludzkich wysp trzustkowych po przeszczepie nadal pozostają wyzwaniem dla badań nad cukrzycą4,5. Do tej pory nieinwazyjne techniki obrazowania, w tym pozytonowa tomografia emisyjna (PET), rezonans magnetyczny (MRI) lub ultrasonografia (US) wykazują potencjał w zakresie kwantyfikacji i oceny funkcjonalnej przeszczepionych wysp trzustkowych w warunkach eksperymentalnych5. Jednak ze względu na małe rozmiary wysepek pomiary ilościowe dokonywane za pomocą tych metod mają niewystarczającą rozdzielczość. Przednia komora oka (ACE) jako miejsce przeszczepienia do obserwacji jest obiecującym nieinwazyjnym rozwiązaniem do obrazowania, oferującym efektywnie wyższą rozdzielczość przestrzenną i częste monitorowanie przez długi czas6. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do badania biologii mysich wysp trzustkowych (recenzja w Yang et al.7), autoimmunologicznych odpowiedzi immunologicznych8, a także szczepienia ludzkich wysp trzustkowych9,10.
Tutaj metoda przeszczepu ACE jest połączona z podejściem do obrazowania 2-fotonowego w celu zbadania dynamiki procesu wszczepiania ludzkich wysp trzustkowych poprzez ciągłe i powtarzane zapisy na poszczególnych przeszczepach wysp trzustkowych przez okres do 10 miesięcy po przeszczepie. Właściwości obrazowania wielofotonowego zapewniające większą głębię obrazowania i zmniejszone ogólne fotowybielanie i uszkodzenia zdjęć przezwyciężają ograniczenia obrazowania mikroskopii konfokalnej11. Kwantyfikacja obrazowania fluorescencyjnego obejmuje kilka etapów, w tym przygotowanie próbki wysp trzustkowych, przeszczep wysp trzustkowych, akwizycję obrazu, filtrowanie obrazu w celu usunięcia szumu wysp trzustkowych lub tła, segmentację, kwantyfikację i analizę danych. Najtrudniejszym krokiem jest zwykle partycjonowanie lub segmentowanie obrazu na wiele części lub regionów. Może to obejmować oddzielenie sygnału od szumu tła lub grupowanie regionów wokseli na podstawie podobieństw w kolorze lub kształcie w celu wykrycia i oznaczenia wokseli objętości 3D, która reprezentuje na przykład unaczynienie wysp. Po podzieleniu na segmenty statystyki, takie jak rozmiary woluminów obiektów, są zazwyczaj łatwe do wyodrębnienia. Podano metodę kwantyfikacji i ekstrakcji danych obrazowych, takich jak segmentacja i wizualizacja danych. Szczególną uwagę zwrócono na usunięcie autofluorescencji w ludzkich wyspach trzustkowych oraz rozróżnienie między unaczynieniem wysp trzustkowych a torebką wysp trzustkowych tworzącą komórki biorcze.

<table><tbody><tr><td>Aparat anestezjologiczny, np. Aparat anestezjologiczny U-400</td><td>Agnthos</td><td>8323001</td><td>służy do znieczulenia izofluranem podczas operacji i</td></tr> <tr><td>komory obrazowo-indukcyjnej 1,4 L</td><td>Agnthos</td><td>8329002</td><td>podłączyć za pomocą rurki do</td></tr> <tr><td>przełącznika trasy gazu</td> U-400 <td>Agnthos</td><td>8433005</td><td>podłączyć za pomocą rurki do U-400</td></tr><tr><td>AngioSense 680 EX</td><td>Percin Elmer</td><td>NEV10054EX</td><td>Środek obrazujący do wstrzykiwań, stosowany do obrazowania naczyń krwionośnych w przeszczepach wysp trzustkowych u ludzi</td></tr><tr><td>Zespoły probówek aspiratora</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>łączą się z ciągnionymi pipetami kapilarnymi do ręcznego pobierania wysepek</td></tr><tr><td>Buprenorfina (Temgesic) 0,3 mg / ml</td><td>Schering-Plough Europ&eacute;</td><td>64022</td><td>płyn do uśmierzania bólu</td></tr><tr><td>Pipety kapilarne</td><td>VWR</td><td>321242C</td><td>używane razem z zespołami probówek aspiratora</td></tr><tr><td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1830</td><td>środek do obrazowania do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Kaniula do oczu, koniec, 25 G</td><td>BVI Visitec/BD</td><td>BD585107</td><td>wykonane na zamówienie z liniowca Tapered Hydrode [Blumenthal], wymiary: 0,5 x 22 mm (25 G x 7/8 cala) (45?), końcówka zwężająca się do 30 G ( 0,3 mm)</td></tr> <tr><td>Żel do oczu</td><td>Novartis</td><td></td><td>Viscotears, zawiera strzykawkę Carbomer 2 mg / g</td></tr><tr><td>Hamilton 0,5 ml, Model 1750 TPLT</td><td>Hamilton</td><td>81242</td><td>Gazoszczelna strzykawka typu tłokowego do wstrzykiwania wysp trzustkowych</td></tr><tr><td><mocna>Uchwyt na głowę</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-Adapter do trzymania głowicy</td><td>Narishige</td><td>SG-4N-S</td><td>montowany na metalowej</td></tr> <tr><td>płycie-masce przeciwgazowej</td><td>Narishige</td><td>GM-4-S-UST-2</td><td></td></tr> <tr><td>Solidny przegub uniwersalny</td><td>Narishige</td><td>UST-2</td><td>montowany na metalowej</td></tr> <tr><td>płycie-wykonana na zamówienie metalowa płyta do montażu</td><td></td><td></td><td></td> uchwytu</tr> <tr><td>głowy-Dumont #5, prosty</td><td>Agnthos</td><td>0207-5TI-PS lub 0208-5-PS</td><td>przymocowany do UST-2 (wykonane na zamówienie)</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza, wykonana</td><td></td><td></td> na zamówienie <td>przyklejona do platformy stereotaktycznej</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli ludzkich wysp trzustkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-CMRL 1066</td><td>ICN Biomedicals</td><td></td><td>pożywka do hodowli komórkowych wysp trzustkowych u</td></tr> <tr><td>ludzi-HEPES</td><td>GIBCO</td> BRL-L-glutamina <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>GIBCO</td> BRL-Gentamycyna <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>GIBCO BRL-Fungizone</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>GIBCO BRL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-Ciproxfloxacin</td><td>Bayer healthcare</td> AG-Nikotynamid <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Imaris 9</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do pozyskiwania obrazów</td><td>Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2010</td></tr><tr><td>Lampa na podczerwień</td><td>VWR</td><td>1010364937</td><td>służy do utrzymywania zwierząt w cieple w klatce budzenia</td></tr><tr><td>Isoflurane Isoflo</td><td>Abott Skandynawia/Apotek</td><td></td><td>płyn, do znieczulenia</td></tr><tr><td>Igła 25 G (0,5 x 16mm), pomarańczowa</td><td>BD</td><td>10442204</td><td>używana jako skalpel</td></tr><tr><td>szalki Petriego, 90mm</td><td>VWR</td><td>391-0440</td><td></td></tr><tr><td>2-Photon/mikroskop konfokalny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-LSM7 MP Mikroskop pionowy</td><td>Zeiss-Ti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>:Laser szafirowy Tsunami</td><td>Spectra-Physics, Mai Tai-długodystansowy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>obiektyw zanurzeniowy do zanurzania w wodzie 20x/NA1.0</td><td></td> Zeiss-ET710<td></td><td></td></tr><tr><td>/40m (Angiosense 680)</td><td>Chroma</td><td></td> 288003-ET645<td></td></tr><tr><td>/65m-2p (TR)</td><td>Chroma</td><td></td> NC528423-ET525<td></td></tr><tr><td>/50 (GFP)</td><td></td>Chroma-ET610<td></td><td></td></tr><tr><td>/75 (pomidor)</td><td>Chroma-światło</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>drogowe rozdzielacz T680lpxxr</td><td>Chroma</td><td>T680lpxxr</td><td>Lustro dichroiczne do transmisji 690 nm i powyżej oraz odbijania od 440 do 650 nm Rozmiar 25,5 x 36 x 1 mm</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa (0,38 mm ID, 1,09 mm OD)</td><td>Smiths Medical Danmark</td><td>800/100/120</td><td>do połączenia ze strzykawką Hamilton i kaniulą oka</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td></td><td>Model SMZ645, do wybierania wysepek</td></tr><tr><td><silny>Mikroskop stereoskopowy (Flourescence)</td><td></td><td></td><td>do obrazowania przeszczepów wysp</td> trzustkowych-AZ100</tr> <tr><td>Multizoom</td><td>Nikon</td><td></td><td>szerokokątny i długodystansowy-AZ</td></tr> <tr><td>Plan Apo 1x</td><td>Nikon-AZ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plan Apo 4x</td><td></td> Nikon-AZ-FL <td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescencja z lampą C-LHGFI HG</td><td>Nikon-HG</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Instrukcja obsługi Nowy Intensilight</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Blok filtra Epi-FL TEXAS RED</td><td>NIKON</td><td></td><td>zawiera EX540-580, DM595 i BA600-660-Blok</td></tr> <tr><td>filtra Epi-FL G-2A</td><td>Nikon</td><td></td> <td>(EX510-560, DM575 i BA590)</td></tr><tr><td>-Blok filtra Epi-FL B-2A</td><td>Nikon</td><td></td> <td>(EX450-490, DM505 i BA520)</td></tr><tr><td>-Kolorowy aparat cyfrowy DS-Fi1 (5MP)</td><td>Strzykawka Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-ml, Omnitix</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td>do wstrzykiwań buprenorfiny, stosowany z igłą 27 G</td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Obrazowanie komórek beta jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia przeszczepu wysp trzustkowych. Chociaż opracowano i wykorzystano różne platformy obrazowania do rejestrowania biologii komórek beta i ich wykorzystania in vivo, są one ograniczone pod względem umożliwiania rozdzielczości pojedynczej komórki i ciągłych zapisów podłużnych. Ze względu na przezroczystość rogówki, przednia komora oka (ACE) u myszy dobrze nadaje się do badania biologii ludzkich i mysich komórek wysp trzustkowych. Poniżej znajduje się opis, w jaki sposób to podejście można wykorzystać do wykonywania ciągłych podłużnych zapisów szczepienia i rewaskularyzacji pojedynczych przeszczepów ludzkich wysp trzustkowych. Przeszczepy ludzkich wysp trzustkowych są wprowadzane do ACE za pomocą NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-myszy jako biorcy. Pozwala to na badanie ekspansji komórek biorcy w stosunku do komórek dawcy oraz udziału komórek biorcy w promowaniu enkapsulacji i unaczynienia przeszczepu. Ponadto przedstawiono krok po kroku podejście do analizy obrazu i kwantyfikacji objętości wysp trzustkowych lub segmentowanego układu krwionośnego i torebki wysp trzustkowych tworzących komórki biorcze.

Nieoznaczone ludzkie wysepczki przeszczepiono do ACE samic myszy NOD w wieku 8 tygodni.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD.ROSA-tomato.Rag2−/−). Aby zapobiec odrzuceniu ludzkiej tkanki, jako biorców wybrano myszy z niedoborem odporności z zastosowaniem linii Rag2 z nокаutem genu. W tych transgenicznych myszach wszystkie komórki i tkanki wyrażały fluorescencyjny białkowy znacznik pomidora skierowany do błony (mT), umożliwiający jednoznaczną identy...

Celem tego protokołu jest ciągłe monitorowanie dynamiki procesu wszczepiania ludzkich wysp trzustkowych oraz komórek gospodarza i dawcy. Osiąga się to poprzez przeszczepienie ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka (ACE) NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mysz, a następnie wielokrotne obrazowanie 2-fotonowe.

Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

ACE jest optymalnym celownikiem do obrazowania. Umożliwia to powtórzenie tego w długoterminowym obrazowaniu in vivo komórek wysp trzustkowych w celu zbadania ich funkcji i żywotności w sytuacji szczepienia. Można go również rozszerzyć o badanie innych aspektów w warunkach fizjologicznych i patologicznych w czasie rzeczywistym.Zaletą techniki ACE jest fakt, że te same pojedyncze ludzkie wyspy trzustkowe mogą być obserwowane nieinwazyjnie z subkomórkową rozdzielczością przez dłuższy czas. Wskaźniki powodzenia terapii zastępczej komórek beta nadal się poprawiają. Jednak ocena skuteczności szczepienia wysp trzustkowych i przeżywalności in vivo pozostaje nadal wyzwaniem.Metoda ta może pomóc w ocenie i optymalizacji wyników przeszczepów wysp trzustkowych. Podejście to nie ogranicza się tylko do wysp trzustkowych. Doskonale nadaje się również do badania tkanek dotkniętych chorobą.Na przykład w powikłaniach cukrzycowych, takich jak kłębuszki nerkowe lub fragmenty wątroby, żeby wymienić tylko kilka. Aby rozpocząć, umieść mysz na ciepłej poduszce grzewczej, umieść ją w uchwycie na głowę i załóż maskę na nos. Użyj kciuka i palca wskazującego, aby lekko podnieść głowę.Przymocuj go metalowymi elementami po bokach. Upewnij się, że wkładki douszne mocują głowę bezpośrednio pod uszami. Podskórnie wstrzyknąć roztwór buprenorfiny w tylną część myszy.Delikatnie cofnij powieki oka, które ma być przeszczepione, za pomocą kleszczy. Wysuń oko i luźno przymocuj je pęsetą pokrytą rurką polietylenową. Po przeniesieniu powiek na szalkę Petriego z PBS, zbierz około 20 do 30 wysepek w kaniuli oka.Używając igły o rozmiarze 25 do góry, ostrożnie włóż końcówkę do rogówki i wykonaj pojedyncze boczne nacięcie. Ostrożnie podnieś rogówkę z kaniulą wstępnie załadowaną wyspami trzustkowymi i powoli uwolnij wysepki do oka. Powoli schuj kaniulę i nałóż żel pod oczy na oko.Po 10 minutach zdejmij kleszcze, przytrzymując powiekę i ustaw oko z powrotem w normalnej pozycji. W przypadku obrazowania wszczepionych ludzkich wysp trzustkowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej należy umieścić platformę uchwytu głowy pod mikroskopem i podać żel do oczu w postaci płynu zanurzeniowego między rogówką a soczewką. Umieść oko pod obiektywem i wyobraź sobie wszczepione ludzkie wysepki zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.Aby usunąć autofluorescencję, przejdź do zakładki przetwarzanie obrazu, wybierz arytmetykę kanałów i wpisz kanał pierwszy minus kanał drugi. W ten sposób powstaje nowy kanał czwarty. Zmień jego nazwę na unaczynienie.Powtórz ten proces i wpisz kanał trzeci minus kanał drugi, aby utworzyć nowy kanał piąty i zmienić jego nazwę na pomidor wszystko. Aby ręcznie zdefiniować wysepkę, utwórz nową powierzchnię i wybierz opcję edytuj ręcznie w kreatorze. Utrzymuj wskaźnik w trybie zaznaczania i w widoku 3D.I kliknij głośność, aby wyświetlić sekcje. Na karcie rysunku wybierz kontur i kliknij przycisk rysuj, aby rozpocząć rysowanie konturów wokół granicy wysepki, zaczynając od pierwszego położenia przekroju. Następnie przejdź do nowej pozycji przekroju i powtórz rysowanie konturów.Zakończ ostatnim przekrojem na górze wysepki i zakończ, klikając kartę tworzenia powierzchni. Następny segment, unaczynienie wysp trzustkowych i fluorescencja pomidorów wysp trzustkowych za pomocą maski wysp trzustkowych. Wybieramy wcześniej zdefiniowany obiekt maski wysepki, przechodzimy do zakładki edycji i klikamy zakładkę maskuj wszystko, co otwiera nowe okno.Wybierz kanał naczyniowy z menu rozwijanego wyboru kanału i aktywuj opcje duplikuj kanał przed nałożeniem maski. Stała wewnątrz, na zewnątrz i ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na 0,000, co tworzy nowy kanał szósty. Zmień nazwę tego kanału na unaczynienie wysepek.Powtórz poprzednie kroki i wybierz pomidor wszystko z menu rozwijanego wyboru kanału, aby utworzyć nowy kanał, zmień jego nazwę, wysepka pomidor. Następnie utwórz nową powierzchnię w menu sceny i wybierz opcję automatycznego tworzenia w kreatorze. Ustaw kanał źródłowy na poprzednio utworzony układ naczyniowy wysepek i wybierz odejmowanie tła.Opcjonalnie użyj filtrów. Na przykład wybierz głośność i dostosuj filtr w oknie, który może usunąć wybrane obiekty serwisowe. Zakończ pracę kreatora i nazwij nowy obiekt powierzchni, Wasculature (Unaczynienie wyspy).W obiekcie usługi unaczynienia wysepek przejdź do zakładki edycji i kliknij kartę maskuj wszystko, co otworzy nowe okno. Wybierz kanał pomidorowy wysepki z menu rozwijanego wyboru kanału i ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na 10 000, co spowoduje utworzenie nowego kanału. Zmień nazwę tej wysepki kanałowej na unaczynienie pomidora.Aby podzielić sygnał fluorescencyjny kapsułki pomidorowej na segmenty, wybierz arytmetykę kanałów w zakładce przetwarzania obrazu i wpisz kanał siódmy minus kanał ósmy, tworząc nowy kanał. Zmień nazwę na kapsułka pomidorowa. Utwórz nową powierzchnię zgodnie z wcześniejszym opisem i wybierz kanały źródłowe, wysepkę, układ krwionośny pomidora lub kapsułkę pomidorową w kreatorze.Następnie wykonaj odejmowanie tła. Otwórz plik rozproszenia wstecznego wysepki i utwórz nową powierzchnię. W kreatorze wybierz opcję automatycznego tworzenia i zdefiniuj obszar zainteresowania.W razie potrzeby dostosuj próg w intensywności bezwzględnej. Obiekt powierzchni można włączać i wyłączać, aby sprawdzić odpowiednią intensywność kanału. Po zakończeniu zamknij kreatora.Na koniec wykonaj kwantyfikację, wybierz utworzony obiekt powierzchni w menu sceny i przejdź do zakładki statystyki. Aby pobrać szczegółowe dane o woluminie, wybierz kartę szczegółowe i wybierz określone wartości i głośność z menu rozwijanego. Aby pobrać łączną wartość objętości, przejdź do zakładki szczegółowe i wybierz wartości średnie.Protokół ten został wykorzystany do przeszczepienia nieznakowanych ludzkich wysepek do wewnętrznej komory oka ośmiotygodniowych samic myszy z czerwoną fluorescencyjną krwią. Następnie wykorzystano interaktywne oprogramowanie do obrazowania, aby wyodrębnić dane ilościowe z obrazów. W obrazowaniu fluorescencyjnym in vivo przeszczepy ludzkich wysp trzustkowych były zagrożone przez znaczną interferencję autofluorescencji tkanek, której nie zaobserwowano w przeszczepach wysp trzustkowych myszy.Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, kanał autofluorescencji został odjęty. Następnie ręcznie zdefiniowano granicę wysepki zwaną maską wysepki i odpowiadające jej kanały. Na koniec wykorzystano segmentację sygnału pomidora na układ naczyniowy powieki i torebkę powieki oraz końcowe renderowanie powierzchni w celu wyodrębnienia danych ilościowych.Tutaj jako reprezentatywna sesja obrazowania podłużnego tego samego przeszczepu ludzkiej wyspy trzustkowej po dwóch tygodniach, dwóch miesiącach, pięciu miesiącach i ośmiu miesiącach po przeszczepie. Wyświetlane są obrazy MIP pierwotnie zarejestrowanych danych surowych, przetworzone obrazy po usunięciu autofluorescencji wysp trzustkowych oraz segmentowane obiekty wysepek. Podczas wykonywania iniekcji powiek należy upewnić się, że wyspy trzustkowe są wstępnie załadowane w małej objętości i użyć elastycznych podwójnych ramion świetlnych w mikroskopie stereoskopowym, aby podkreślić przestrzeń komory oka, aby skutecznie wstrzyknąć wyspy trzustkowe do ACE.Po obrazowaniu in vivo oczy można utrwalić i dalej badać pod kątem barwienia przeciwciałami i konwencjonalnej histologii. Technika ta jest bardzo przydatna do badań funkcjonalnych poszczególnych ludzkich wysepek w czasie rzeczywistym i w warunkach fizjologicznych, zwłaszcza w kontekście badań unaczynienia, żywotności i metabolizmu.

longitudinal-vivo-imaging-quantification-human-pancreatic-islet

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Poniższy protokół przedstawia proces wycinania trzustki do obrazowania wirtualnych przekrojów oraz następującą po nim kwantyfikację wszystkich komórek beta znakowanych GFP w całej trzustce.

Ilościowe oznaczanie masy komórek beta trzustki u myszy in situ

Ten film opisuje protokół szczepienia ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy w celu monitorowania rewaskularyzacji ludzkich przeszczepów wysp trzustkowych in vivo. Pomaga również zrozumieć udział komórek biorcy i dawcy w promowaniu enkapsulacji i unaczynienia przeszczepu.

Szczepienie wysp trzustkowych: metoda wszczepiania wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy w celu obrazowania in vivo

Nowe podejście łączące przeszczep wewnątrzgałkowy i mikroskopię konfokalną umożliwia podłużne, nieinwazyjne obrazowanie w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek w przeszczepionych tkankach in vivo.  Pokazujemy, jak przeszczepić wyspy trzustkowe do przedniej komory oka myszy.

Przeszczep do przedniej komory oka w celu podłużnego, nieinwazyjnego obrazowania in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

Celem protokołu jest pokazanie podłużnego śledzenia tymocytów w czasie rzeczywistym za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej w implantach grasicy w przedniej komorze oka myszy. Przezroczystość rogówki i unaczynienie przeszczepu pozwala na ciągłe rejestrowanie rekrutacji komórek progenitorowych i wyjścia dojrzałych komórek T.

Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej

To badanie przedstawia zastosowanie żywych wycinków tkanki trzustki do badania fizjologii wysp trzustkowych i interakcji między komórkami odpornościowymi wysp trzustkowych.

Obserwacja funkcji wysp trzustkowych i interakcji między wyspami trzustkowymi a komórkami układu odpornościowego w żywych wycinkach tkanki trzustkowej

Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Ten protokół opisuje prostą i minimalnie inwazyjną metodę przeszczepiania i obrazowania komórek NIT-1 u myszy z nieotyłym cukrzycą (NOD) z ciężkim niedoborem odporności, którym podano splenocyty oczyszczone z myszy NOD z spontaniczną cukrzycą.

Bioluminescencyjne monitorowanie przeżywalności przeszczepu w adoptywnym modelu transferowym cukrzycy autoimmunologicznej u myszy

Tutaj opisujemy platformę, która umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo sferoidów wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy. Przebieg pracy obejmuje zarówno generowanie sferoid z pierwotnych komórek wątroby, jak i przeszczep do oka myszy oraz obrazowanie in vivo w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie in vivo sferoid wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj metodę podłużnego obrazowania in vivo wysp trzustkowych w przedniej komorze oka myszy. Technika ta umożliwia nieinwazyjną ocenę funkcji i przeżywalności przeszczepów ludzkich komórek beta.

Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka (Wideo) | JoVE Journal

Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka

Przeglądaj więcej filmów