Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka

ACE jest optymalnym celownikiem do obrazowania. Umożliwia to powtórzenie tego w długoterminowym obrazowaniu in vivo komórek wysp trzustkowych w celu zbadania ich funkcji i żywotności w sytuacji szczepienia. Można go również rozszerzyć o badanie innych aspektów w warunkach fizjologicznych i patologicznych w czasie rzeczywistym.

Zaletą techniki ACE jest fakt, że te same pojedyncze ludzkie wyspy trzustkowe mogą być obserwowane nieinwazyjnie z subkomórkową rozdzielczością przez dłuższy czas. Wskaźniki powodzenia terapii zastępczej komórek beta nadal się poprawiają. Jednak ocena skuteczności szczepienia wysp trzustkowych i przeżywalności in vivo pozostaje nadal wyzwaniem.

Metoda ta może pomóc w ocenie i optymalizacji wyników przeszczepów wysp trzustkowych. Podejście to nie ogranicza się tylko do wysp trzustkowych. Doskonale nadaje się również do badania tkanek dotkniętych chorobą.

Na przykład w powikłaniach cukrzycowych, takich jak kłębuszki nerkowe lub fragmenty wątroby, żeby wymienić tylko kilka. Aby rozpocząć, umieść mysz na ciepłej poduszce grzewczej, umieść ją w uchwycie na głowę i załóż maskę na nos. Użyj kciuka i palca wskazującego, aby lekko podnieść głowę.

Przymocuj go metalowymi elementami po bokach. Upewnij się, że wkładki douszne mocują głowę bezpośrednio pod uszami. Podskórnie wstrzyknąć roztwór buprenorfiny w tylną część myszy.

Delikatnie cofnij powieki oka, które ma być przeszczepione, za pomocą kleszczy. Wysuń oko i luźno przymocuj je pęsetą pokrytą rurką polietylenową. Po przeniesieniu powiek na szalkę Petriego z PBS, zbierz około 20 do 30 wysepek w kaniuli oka.

Używając igły o rozmiarze 25 do góry, ostrożnie włóż końcówkę do rogówki i wykonaj pojedyncze boczne nacięcie. Ostrożnie podnieś rogówkę z kaniulą wstępnie załadowaną wyspami trzustkowymi i powoli uwolnij wysepki do oka. Powoli schuj kaniulę i nałóż żel pod oczy na oko.

Po 10 minutach zdejmij kleszcze, przytrzymując powiekę i ustaw oko z powrotem w normalnej pozycji. W przypadku obrazowania wszczepionych ludzkich wysp trzustkowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej należy umieścić platformę uchwytu głowy pod mikroskopem i podać żel do oczu w postaci płynu zanurzeniowego między rogówką a soczewką. Umieść oko pod obiektywem i wyobraź sobie wszczepione ludzkie wysepki zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.

Aby usunąć autofluorescencję, przejdź do zakładki przetwarzanie obrazu, wybierz arytmetykę kanałów i wpisz kanał pierwszy minus kanał drugi. W ten sposób powstaje nowy kanał czwarty. Zmień jego nazwę na unaczynienie.

Powtórz ten proces i wpisz kanał trzeci minus kanał drugi, aby utworzyć nowy kanał piąty i zmienić jego nazwę na pomidor wszystko. Aby ręcznie zdefiniować wysepkę, utwórz nową powierzchnię i wybierz opcję edytuj ręcznie w kreatorze. Utrzymuj wskaźnik w trybie zaznaczania i w widoku 3D.

I kliknij głośność, aby wyświetlić sekcje. Na karcie rysunku wybierz kontur i kliknij przycisk rysuj, aby rozpocząć rysowanie konturów wokół granicy wysepki, zaczynając od pierwszego położenia przekroju. Następnie przejdź do nowej pozycji przekroju i powtórz rysowanie konturów.

Zakończ ostatnim przekrojem na górze wysepki i zakończ, klikając kartę tworzenia powierzchni. Następny segment, unaczynienie wysp trzustkowych i fluorescencja pomidorów wysp trzustkowych za pomocą maski wysp trzustkowych. Wybieramy wcześniej zdefiniowany obiekt maski wysepki, przechodzimy do zakładki edycji i klikamy zakładkę maskuj wszystko, co otwiera nowe okno.

Wybierz kanał naczyniowy z menu rozwijanego wyboru kanału i aktywuj opcje duplikuj kanał przed nałożeniem maski. Stała wewnątrz, na zewnątrz i ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na 0,000, co tworzy nowy kanał szósty. Zmień nazwę tego kanału na unaczynienie wysepek.

Powtórz poprzednie kroki i wybierz pomidor wszystko z menu rozwijanego wyboru kanału, aby utworzyć nowy kanał, zmień jego nazwę, wysepka pomidor. Następnie utwórz nową powierzchnię w menu sceny i wybierz opcję automatycznego tworzenia w kreatorze. Ustaw kanał źródłowy na poprzednio utworzony układ naczyniowy wysepek i wybierz odejmowanie tła.

Opcjonalnie użyj filtrów. Na przykład wybierz głośność i dostosuj filtr w oknie, który może usunąć wybrane obiekty serwisowe. Zakończ pracę kreatora i nazwij nowy obiekt powierzchni, Wasculature (Unaczynienie wyspy).

W obiekcie usługi unaczynienia wysepek przejdź do zakładki edycji i kliknij kartę maskuj wszystko, co otworzy nowe okno. Wybierz kanał pomidorowy wysepki z menu rozwijanego wyboru kanału i ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na 10 000, co spowoduje utworzenie nowego kanału. Zmień nazwę tej wysepki kanałowej na unaczynienie pomidora.

Aby podzielić sygnał fluorescencyjny kapsułki pomidorowej na segmenty, wybierz arytmetykę kanałów w zakładce przetwarzania obrazu i wpisz kanał siódmy minus kanał ósmy, tworząc nowy kanał. Zmień nazwę na kapsułka pomidorowa. Utwórz nową powierzchnię zgodnie z wcześniejszym opisem i wybierz kanały źródłowe, wysepkę, układ krwionośny pomidora lub kapsułkę pomidorową w kreatorze.

Następnie wykonaj odejmowanie tła. Otwórz plik rozproszenia wstecznego wysepki i utwórz nową powierzchnię. W kreatorze wybierz opcję automatycznego tworzenia i zdefiniuj obszar zainteresowania.

W razie potrzeby dostosuj próg w intensywności bezwzględnej. Obiekt powierzchni można włączać i wyłączać, aby sprawdzić odpowiednią intensywność kanału. Po zakończeniu zamknij kreatora.

Na koniec wykonaj kwantyfikację, wybierz utworzony obiekt powierzchni w menu sceny i przejdź do zakładki statystyki. Aby pobrać szczegółowe dane o woluminie, wybierz kartę szczegółowe i wybierz określone wartości i głośność z menu rozwijanego. Aby pobrać łączną wartość objętości, przejdź do zakładki szczegółowe i wybierz wartości średnie.

Protokół ten został wykorzystany do przeszczepienia nieznakowanych ludzkich wysepek do wewnętrznej komory oka ośmiotygodniowych samic myszy z czerwoną fluorescencyjną krwią. Następnie wykorzystano interaktywne oprogramowanie do obrazowania, aby wyodrębnić dane ilościowe z obrazów. W obrazowaniu fluorescencyjnym in vivo przeszczepy ludzkich wysp trzustkowych były zagrożone przez znaczną interferencję autofluorescencji tkanek, której nie zaobserwowano w przeszczepach wysp trzustkowych myszy.

Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, kanał autofluorescencji został odjęty. Następnie ręcznie zdefiniowano granicę wysepki zwaną maską wysepki i odpowiadające jej kanały. Na koniec wykorzystano segmentację sygnału pomidora na układ naczyniowy powieki i torebkę powieki oraz końcowe renderowanie powierzchni w celu wyodrębnienia danych ilościowych.

Tutaj jako reprezentatywna sesja obrazowania podłużnego tego samego przeszczepu ludzkiej wyspy trzustkowej po dwóch tygodniach, dwóch miesiącach, pięciu miesiącach i ośmiu miesiącach po przeszczepie. Wyświetlane są obrazy MIP pierwotnie zarejestrowanych danych surowych, przetworzone obrazy po usunięciu autofluorescencji wysp trzustkowych oraz segmentowane obiekty wysepek. Podczas wykonywania iniekcji powiek należy upewnić się, że wyspy trzustkowe są wstępnie załadowane w małej objętości i użyć elastycznych podwójnych ramion świetlnych w mikroskopie stereoskopowym, aby podkreślić przestrzeń komory oka, aby skutecznie wstrzyknąć wyspy trzustkowe do ACE.

Po obrazowaniu in vivo oczy można utrwalić i dalej badać pod kątem barwienia przeciwciałami i konwencjonalnej histologii. Technika ta jest bardzo przydatna do badań funkcjonalnych poszczególnych ludzkich wysepek w czasie rzeczywistym i w warunkach fizjologicznych, zwłaszcza w kontekście badań unaczynienia, żywotności i metabolizmu.