Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Protokół ten można zastosować do dowolnego procesu, który powoduje pęknięcia dwuniciowego DNA, dostarcza szczegółowych danych ilościowych na temat kinetyki. Chociaż metoda ta ma rozdzielczość pojedynczej cząsteczki, mierzy do 1000 DNA w jednym eksperymencie, zapewniając w ten sposób dobre statystyki. Podstawowym zastosowaniem tej metody jest badanie mechanizmów związanych z wiązaniem i modyfikacją DNA.

Na przykład jesteśmy zainteresowani badaniem poszukiwania celów DNA, które jest istotne dla wszystkich białek wiążących DNA. Próbując tej techniki po raz pierwszy, pamiętaj, że uwięzi jednocząsteczkowe są delikatne i po uformowaniu należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Niezbędna jest odpowiednia proporcja funkcjonalizowanych powierzchni.

Jest kilka sztuczek, dzięki którym przepływ będzie tak płynny. Oprócz zmiany probówek z próbkami podczas zbierania danych, demonstracja wizualna może pomóc komuś, kto jest nowy w tej procedurze. Aby umyć szkiełka nakrywkowe, umieść je w słoikach do barwienia i poddaj sonikacji etanolem przez 30 minut.

Dokładnie opłucz je wodą dejonizowaną i destylowaną, a następnie zanurz je w jednym molowym wodorotlenku potasu i poddaj sonikacji przez kolejne 30 minut. Powtórz sekwencję prania, pamiętając, aby po każdym praniu spłukać szkiełka nakrywkowe wodą. Oczyszczone szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w słoikach do barwienia wodą.

Użyj czystej brzytwy, aby przeciąć ośmiocentymetrowe rurki ładujące i wyjściowe i włóż je do otworów w czystym szklanym szkiełku. Pokryj rurkę żywicą epoksydową i pozostaw do utwardzenia przez pięć minut, aby ją zabezpieczyć. Nałóż taśmę dwustronną wstępnie wyciętą ze wzorem kanału na szkiełka i wygładź ją plastikowymi kleszkami, aby uzyskać dobre uszczelnienie.

Oderwij podkład od taśmy i nałóż czystą szkiełko nakrywkowe, wygładzając je kleszczami. Następnie pokryj żywicą epoksydową krawędź szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić komórkę przepływową i pozwól jej się utwardzić. Przygotuj znakowane DNA do wiązania poprzez wykonanie PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Następnie oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR. Przygotować 10 mililitrów buforu A i odgazować go w eksykatorze próżniowym przez co najmniej godzinę. Aby sfunkcjonalizować komórkę przepływową, wstrzyknij 25 mikrolitrów anty-digoksygeniny i fragmentów fab w PBS do kanału przepływowego, używając końcówki ładującej żel, która pasuje do rurki PE60.

Inkubować komórkę przepływową w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji przeciągnąć strzykawką 0,5 mililitra buforu A przez kanał, uważając, aby nie wprowadzić powietrza do kanału. Następnie przelej komórkę przepływową na odwrócony mikroskop.

Podłącz rurkę wylotową do pompy strzykawkowej i włóż rurkę wlotową do probówki mikrowirówki zawierającej bufor A. Ręcznie wyciągnij co najmniej 0.5 mililitra buforu A, aby przepłukać system i zalać pompę. Następnie pozwól pompie pracować z prędkością 10 mikrolitrów na minutę przez co najmniej pięć minut, aby zrównoważyć system. Wiruj butelkę z kulkami i odpipetuj 1,6 mikrolitra kulek do 50 mikrolitrów buforu A, a następnie ponownie je zwiruj.

Umieść kulki na separatorze magnetycznym i odpipetuj bufor. Ponownie zawiesić je w 50 mikrolitrach buforu A i wymieszać. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu A, aby uzyskać końcowe stężenie 160 mikrogramów na mililitr.

Przygotować 480 mikrolitrów 0,5 pikomolarnego substratu DNA w buforze A i odpipetować 20 mikrolitrów zawiesiny kulek do rozcieńczonego DNA. Umieść mieszaninę na rotatorze na trzy minuty. Po upływie trzech minut natychmiast załaduj próbkę do kanału z natężeniem przepływu 10 mikrolitrów na minutę przez 15 minut lub do momentu, gdy zaobserwuje się wystarczające wiązanie koralików.

Umyj kanał ze wszystkich wolnych kulek, przełączając rurkę wlotową na nową rurkę buforu A i wlewając ją z prędkością 50 mikrolitrów na minutę przez co najmniej 10 minut lub do momentu, gdy nie zaobserwuje się luźnych kulek. Pomocne jest użycie wbudowanego zaworu, aby odciąć przepływ i przełączyć rurki. Przełączaj rurki jednym płynnym ruchem i upewnij się, że poziomy cieczy w nowych i starych probówkach na próbki są zgodne, aby uniknąć przepływu wstecznego.

Przed zebraniem danych należy przygotować odpowiednie stężenie enzymu rozszczepiającego DNA i wprowadzić rurkę wlotową do próbki. Opuść magnes na komorę przepływową. Ustaw pompę tak, aby wstrzykiwała 80 mikrolitrów próbki z prędkością 150 mikrolitrów na minutę i rozpocznij zbieranie danych.

Po minucie zbierania danych włącz pompę. Pokazany tutaj jest reprezentatywny obraz koralików na uwięzi przed i po reakcji. Przeprowadzono analizę danych w celu ilościowego określenia liczby kulek pozostających na uwięzi przez cały czas trwania reakcji rozszczepienia.

Technika ta została wykorzystana do pomiaru specyficznych dla miejsca szybkości rozszczepienia DNA Nde1 dla stężeń białka w zakresie od 0,25 do czterech jednostek na mililitr i dwóch różnych stężeń magnezu. Każdy warunek został zreplikowany co najmniej dwa razy, przy czym w jednym eksperymencie pobrano od 100 do 1000 DNA na uwięzi. Przy odpowiednio niskich stężeniach białka dawka jest proporcjonalna do białka i niezależna od magnezu.

W przypadku wysokich stężeń białka szybkość jest zależna od magnezu, ale niezależna od stężenia białka. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że pęcherzyki powietrza w rurce i kanale przepływowym mogą uruchomić eksperyment. Upewnij się, że nie wpuszczasz powietrza do przewodów podczas wymiany przewodów i odgazowuj wszystkie przed użyciem.

Metoda tetheringu pozwala na zbadanie wpływu napięcia w DNA na reakcję. Można to osiągnąć, zmieniając siłę magnesu lub stosując przepływ podczas zbierania danych.