Name: Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj równoległą analizę kinetyki rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek z endonukleazą NdeI. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów wiązania DNA z rozdzielczością do 1000 cząsteczek w jednym eksperymencie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant National Science Foundation MCB-1715317.

1. Tworzenie komórki przepływowej
<ol>
	<li>Mycie szkiełek nakrywkowych
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka nakrywkowe w słoikach do barwienia i poddaj sonikacji etanolem (EtOH), a następnie 1 M KOH (po 30 minut każdy). Aby uniknąć wytrącania się KOH w EtOH, należy dokładnie spłukać ddH2O między praniami.</li>
		<li>Powtórz zarówno etapy mycia EtOH, jak i KOH 1x, co daje łączną liczbę czterech płukań (dwa EtOH i dwa KOH). Oczyszczone szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w ddH2O w słoikach do barwienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetnij rurki załadowcze i wyjściowe (o długości 8 cm) za pomocą czystej brzytwy i włóż do otworów w czystym szklanym szkiełku. Użyj PE-20 do wlotu i PE-60 do wylotu. Żywica epoksydowa przez 5 minut, aby zabezpieczyć rurki i odciąć nadmiar rurek. 
	UWAGA: Szkiełka szklane mają wymiary 2'' x 3'' x 1 mm. Otwory wierci się parami w odstępach 15 mm. Każda para tworzy jeden koniec pojedynczego kanału. Rurka o mniejszym ID jest używana do wlotu, ponieważ zmniejsza to objętość martwą przed wlotem, a tym samym wymagany czas mieszania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1).</li>
	<li>Wyrównaj i nałóż wstępnie przyciętą taśmę dwustronną z wzorem kanałów wyciętym nad otworami w szklanym szkiełku. Wygładź za pomocą plastikowych kleszczyków, aby uzyskać dobre uszczelnienie. 
	UWAGA: Taśma dwustronna użyta w tym eksperymencie ma grubość 120 μm, a kanały mają 2 mm szerokości i 15 mm długości. Kanały wycinane są za pomocą drukarki nożowej (Tabela materiałów). Możliwe jest zamontowanie do czterech kanałów na jednym szkiełku nakrywkowym. Zobacz Rysunek 1 dla obrazu komórki przepływu.</li>
	<li>Po odklejeniu podłoża nałóż czyste szkiełko nakrywkowe (wysuszone sprężonym powietrzem) na taśmę i ponownie wygładź plastikowymi kleszkami, aby uzyskać dobre uszczelnienie.</li>
	<li>Epoksyduj krawędź szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić komórkę przepływową i pozwól jej się utwardzić.</li>
</ol>
2. Przygotowanie znakowanego DNA do wiązania
<ol>
	<li>W probówce do PCR przygotuj 50 μl mieszaniny reakcyjnej PCR zawierającej 0,02 U/μL polimerazy DNA o wysokiej wierności, 200 μM dNTP, 0,5 μM startera do przodu, 0,5 μM startera wstecznego i 250 ng wektora M13mp18 DNA. 
	UWAGA: W tym przypadku starter do przodu (biotyna-CCAACTTAATCGCCTTGC) i starter odwrotny (digoksygenina-TGACCATTAGATACATTTCGC) zostały wybrane do amplifikacji regionu o długości około 1000 pz, obejmującego od pozycji 6338 do 107 w kolistym genomie DNA M13mp18. W środku amplifikowanego regionu znajduje się pojedyncze miejsce NdeI. Starter do przodu jest oznaczony 5ʹ digoksygeniną, która wiąże antydigoksygeninę na szkiełku nakrywkowym. Odwrócony starter to 5ʹ oznaczony biotyną, która wiąże kulki pokryte streptawidyną.</li>
	<li>Włóż probówkę do PCR do termocyklera i postępuj zgodnie z cyklem, jak pokazano w Tabeli 1.</li>
	<li>Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Przy użyciu zestawu określonego w Tabeli Materiałów, typowa wydajność DNA wynosi ~2 μg.</li>
</ol>
3. Wiązanie DNA i koralików
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml buforu A (1 M Tris-HCl [pH = 7,5], 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mg/ml β-kazeiny, 1 mg/ml Pluronic F-127). Odgazowuje w eksykatorze próżniowym przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Aby funkcjonalizować komórkę przepływową, wstrzyknąć 25 μl fragmentów FAB anty-digoksygeniny (20 μg/ml) w PBS do kanału przepływowego. Użyj końcówek do ładowania żelu, aby dopasować je do rurki PE-60. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.</li>
	<li>Po inkubacji przepłukać kanał, przeciągając 0,5 ml buforu A przez kanał za pomocą strzykawki. Uważaj, aby nie wprowadzać powietrza do kanału.</li>
	<li>Po funkcjonalizacji zamontuj komórkę przepływową na odwróconym mikroskopie. Podłączyć rurkę wylotową do pompy strzykawkowej i umieścić rurkę wlotową w probówce mikrowirówki zawierającej bufor A.</li>
	<li>Ręcznie wyciągnij co najmniej 0.5 ml buforu A, aby przepłukać system i zalać pompę. Pozwól pompie pracować z prędkością 10 μl/min przez co najmniej 5 minut, aby zrównoważyć system.</li>
	<li>Aby przygotować kulki (tabela materiałów), należy zmieszać butelkę z kulkami i odpipetować 1,6 μl kulek podstawowych 10 mg/ml do 50 μl buforu A, a następnie odwirować.</li>
	<li>Za pomocą separatora magnetycznego odpipetować bufor i ponownie zawiesić w 50 μl buforu A, a następnie odwirować.</li>
	<li>Powtórz krok 3.7 2x, co daje w sumie trzy prania. Do ostatniego płukania ponownie zawiesić w 100 μl buforu A i odwirować, aby uzyskać końcowe stężenie 160 μg/ml.</li>
	<li>Aby skompleksować DNA i kulki, najpierw przygotuj 480 μl znakowanego substratu DNA o wartości 0,5 pM w buforze A. Następnie odpipetować pipetą 20 μl zawiesiny kulek o stężeniu 160 μg/ml, upewniając się, że kulki zostały swirowane przed pipetowaniem. Umieść na rotatorze na 3 min.</li>
	<li>Po 3 minutach natychmiast załadować do kanału z natężeniem przepływu 10 μl/min przez ~15 min lub do momentu, gdy zaobserwuje się wystarczające wiązanie koralików. 
	UWAGA: Koraliki nie powinny być tak gęsto upakowane, aby oddziaływały ze sobą na powierzchni (patrz sekcja dyskusji).</li>
	<li>Aby umyć kanał ze wszystkich wolnych kulek, należy przełączyć rurkę doprowadzającą na nową rurkę z buforem A i przepływać z prędkością 50 μl/min przez co najmniej 10 minut lub do momentu, gdy nie zaobserwuje się luźnych kulek.</li>
</ol>
4. Gromadzenie i analiza danych
<ol>
	<li>Aby przygotować się do zbierania danych, umieść probówkę wlotową w probówce mikrowirówki zawierającej co najmniej 100 μl NdeI (0,25–4,00 U/ml) w buforze A. Opuść magnes trwały nad kanałem przepływowym i ustaw źródło światła poza osią do obrazowania w ciemnym polu. 
	UWAGA: Dwa pierścieniowe magnesy ziem rzadkich, epoksydowane razem, są utrzymywane 8 mm nad powierzchnią czynną kanału przepływowego za pomocą wspornikowego słupka optycznego podczas zbierania danych. Lampa na gęsiej szyi służy do przebiegu światła poza osią.</li>
	<li>Użyj komercyjnego mikroskopu, kamery wideo i oprogramowania do zbierania danych (Spis materiałów). W oprogramowaniu kliknij zakładkę "Ekspozycja" i ustaw "Czas ekspozycji" na 10 ms. Kliknij zakładkę "Timelapse" i ustaw "Liczba obrazów" na 600, "Czas trwania" na 20 minut, a "Interwał" na 2 s. Kliknij "Uruchom", aby rozpocząć zbieranie danych.</li>
	<li>Na pompie strzykawkowej ustaw natężenie przepływu na 150 μl/min, a objętość wtrysku na 80 μl. Naciśnij "Uruchom" po 1 minutzie, aby rozpocząć zbieranie danych. Po wstrzyknięciu należy wyłączyć pompę i zamknąć zawór, aby zapobiec przepływowi podczas zbierania danych.</li>
	<li>Po zebraniu danych otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (Tabela materiałów). W zakładce "Plik" wybierz "Importuj" | "Sekwencja obrazów". Znajdź pliki obrazów w menu podręcznym i kliknij "Otwórz".</li>
	<li>Ustaw próg, wybierając opcję "Dostosuj uchwyt" w menu rozwijanym "Obraz". Użyj suwaka, aby ustawić wartość progową, aby zidentyfikować jasne punkty odpowiadające koralikom na obrazie.</li>
	<li>Policz jasne punkty w każdej klatce, klikając "Analizuj cząstki" w menu rozwijanym "Analizuj". Kliknij "OK", a następnie wybierz "Tak", aby przetworzyć wszystkie obrazy. Zapisz plik wyników. 
	UWAGA: Spowoduje to zapisanie pliku danych, który zawiera liczbę koralików w każdej nagranej klatce wideo.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy danych (Tabela materiałów) i zaimportuj plik z wynikami, klikając "Importuj z pliku tekstowego" w menu rozwijanym "Plik". Wykreśl dane dotyczące liczby ściegów w funkcji czasu.</li>
	<li>Dopasuj liczbę koralików do czasu, klikając "Dopasuj krzywą" w menu rozwijanym "Analizuj". Wybierz równanie "Wykładnik naturalny" i kliknij "Wypróbuj dopasowanie" | "OK". 
	UWAGA: Tylko dane zarejestrowane po wstrzyknięciu próbki powinny być zawarte w obszarze dopasowania. Parametrem dopasowania w wykładniku funkcji dopasowania będzie współczynnik rozszczepienia.</li>
</ol>

<ol><li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+restriction+and+anti-restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li>
<li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li>
<li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+restriction+endonucleases%3A+structure+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li>
<li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+genetic+recombination%3A+hops%2C+flips%2C+and+flops%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li>
<li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li>
<li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7%3A+a+target+site-specific+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li>
<li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+and+Specificity+of+CRISPR%2FCas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li>
<li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li>
<li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li>
<li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li>
<li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li>
<li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409(2016).</li>
<li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li>
<li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li>
<li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li>
<li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Journal%22%5BJournal%5D)">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22(2014).</li>
<li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół może być wykorzystany do pomiaru kinetyki dowolnego systemu SSDC, pod warunkiem, że podczas eksperymentu zaobserwowano separację nici. Na wykrycie rozszczepienia ma wpływ obserwacja oderwania się koralika na uwięzi, a zatem oznacza moment oddzielenia pasma. Wszystkie poprzednie kroki zachodzą przed wykryciem rozszczepienia; W ten sposób rejestrowany jest tylko całkowity czas tranzytu.
Szkiełko nakrywkowe z komórek przepływowych jest funkcjonalizowane poprzez niespecyficzną adsorpcję b...

Specyficzne dla miejsca rozszczepienie DNA (SSDC) jest kluczowym krokiem w wielu transakcjach genomowych. Na przykład systemy bacterial restriction-modification (RM)1 i CRISPR2 chronią komórki przed atakiem fagów i plazmidów, rozpoznając i rozszczepiając obce DNA w określonych sekwencjach. W typie II RM endonukleazy restrykcyjne (RE) rozpoznają krótkie sekwencje 4–8 par zasad (bp) poprzez interakcje białko-kwas nukleinowy3. Endonukleazy związane z CRISPR, takie jak Cas9, wiążą się z miejscami poprzez hybrydyzację miejsca docelowego z crRNA związanymi z endonukleazami4. Tworzenie specyficznych dla miejsca dwuniciowych pęknięć (DSB) jest również pierwszym krokiem w wielu zdarzeniach rekombinacji DNA5. Na przykład różnorodność regionów wiążących antygen utworzonych przez rekombinację V(D)J wymaga rozpoznania i rozszczepienia określonych miejsc docelowych6. Wiadomo, że niektóre transpozony celują również w określone sekwencje DNA7. Nic dziwnego, że wiele specyficznych dla miejsca nukleaz biorących udział w tych procesach, takich jak Cas9, jest kluczowym składnikiem technologii edycji genów8. Ponadto nowe endonukleazy specyficzne dla miejsca (tj. nukleazy palca cynkowego9 i TALENS10) zostały również zmodyfikowane do edycji genomów.
Wiele metod zostało wykorzystanych do pomiaru kinetyki specyficznego dla miejsca rozszczepienia kwasów nukleinowych. Należą do nich: analiza żelowa, fluorescence11,12 oraz metody oparte na sekwencjonowaniu13. Duży postęp osiągnięto dzięki wiązaniu mikrogranulek, które umożliwia wykrywanie DSB w pojedynczych cząsteczkach DNA przez ruch kulki po oddzieleniu nici. W tych metodach stosuje się różne rodzaje sił, aby zapewnić separację pasm i ruch stopki po rozszczepieniu. W jednym przypadku pułapki optyczne zostały użyte do pomiaru rozszczepienia DNA za pomocą EcoRV14. W tych eksperymentach celem badania jest wyszukiwanie docelowe, a warunki są zoptymalizowane tak, aby wiązanie specyficzne dla witryny było krokiem ograniczającym szybkość. Jedną z wad pułapek optycznych jest to, że w danym momencie można obserwować tylko jedno DNA. Ponadto należy przyłożyć okresową dużą siłę ciągnącą, aby sprawdzić separację pasm.
Inna technika wykorzystuje kombinację przepływu i słabych sił magnetycznych do ciągnięcia koralika w sposób ciągły15. W ten sposób mierzy się dyfuzyjną ograniczoną rozszczepialność przez NdeI. Zastosowana metoda pozwala na jednoczesny pomiar kilkuset DNA jednocześnie, co pozwala na uzyskanie istotności statystycznej w jednym eksperymencie. Przeprowadzono również eksperymenty oparte na pęsetach magnetycznych. W jednym z takich badań badano integrazę retrowirusową poprzez włączenie DSB do oligonukleotydu insercji16. Udana integracja doprowadziła do włączenia DSB do DNA na uwięzi i utraty dołączonego koralika. W podobnym badaniu endonukleazy restrykcyjnej typu III EcoPI zależnej od ATP, w jednym eksperymencie zaobserwowano dziesiątki DNA17. Pęseta magnetyczna ma tę zaletę, że napięcie, a także pętla DNA, mogą być kontrolowane i monitorowane podczas reakcji.
Prezentowana tutaj jest wysoce równoległa metoda pomiaru kinetyki SSDC, która wykorzystuje ostatnie ulepszenia w wiązaniu DNA na dużą skalę. Ta metoda jest ulepszeniem i rozszerzeniem poprzednich metod używanych do pomiaru replikacji DNA18, długości konturu DNA19 oraz rozszczepienia przez REs15. W tej technice liniowe DNA zawierające pojedynczą kopię sekwencji rozpoznawania są przygotowywane z biotyną na jednym końcu i digoksygeniną na drugim. Biotyna wiąże streptawidynę, która jest kowalencyjnie przyłączona do paramagnetycznej mikrokulki. Kompleksy DNA-kulki są wstrzykiwane do kanału mikroprzepływowego, który został sfunkcjonalizowany fragmentami FAB anty-digoksygeniny. DNA następnie wiąże się z punktami przyczepu do powierzchni poprzez wiązanie digoksygeniny z zaadsorbowanymi fragmentami FAB. Słabe siły magnetyczne przyłożone magnesem trwałym zapobiegają niespecyficznemu przywieraniu koralika do powierzchni. Próbki można szybko wstrzykiwać (<30 s) do kanału przepływowego w celu aktywacji reakcji rozszczepienia. Przepływ jest wyłączany podczas zbierania danych. Ponieważ każde DNA jest rozszczepiane, dokładny czas rozszczepienia można określić, rejestrując klatkę, w której koralik przesuwa się w górę i poza plan ogniskowy obiektywu, znikając w ten sposób z zapisu wideo. Liczenie pozostałych kulek klatka po klatce może być wykorzystane do ilościowego określenia postępu reakcji.
Poniżej znajduje się kompletny protokół, jak również przykładowe dane zebrane za pomocą NdeI. Przykładem tego, w jaki sposób można zastosować tę technikę, jest pomiar szybkości rozszczepienia dla różnych stężeń białek przy dwóch różnych stężeniach magnezu, niezbędnego kofaktora metalu. Chociaż to zastosowanie protokołu wykorzystuje NdeI, metodę można dostosować do użycia z dowolną nukleazą specyficzną dla danego miejsca poprzez zmianę projektu substratu DNA.

<table><tbody>5-minutowe <tr><td>fragmenty antydigoksygeniny</td><td></td><td></td> Epoxy Devcon 14250 Roche Diagnostics 11214667001 <td></td></tr><tr><td>kamera i oprogramowanie</td><td>Jenoptik</td><td>Oprogramowanie do analizy danych GRYPHAX SUBRA</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Vernier Inc.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwustronna taśma</td> LP <td>Grace Biolabs</td><td>SA-S-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr> etanol <tr><td>95%</td><td>VWR</td><td>89370-082</td><td></td></tr><tr><td>podkład do przodu: digoksygenina-CCAACTTAATCGCCTTGC</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>brak</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowania do analizy obrazu</td> National <td>Institutes of Health</td>Mikroskop odwrócony <td>ImageJ</td><td></td></tr> Drukarka <tr><td>nożowa</td><td></td> Nikon TE2000 Sylwetka <td></td><td></td></tr><tr><td>M13mp18 DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki streptawidyny MyOne</td><td>Enzym Thermo Fisher Scientific</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Enzym NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Zestaw do czyszczenia PCR <td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>pluronic F-127</td><td>Anatrace</td><td>P305</td><td></td></tr><tr><td>rurka polietylenowa PE-20</td><td>BD Intramedic</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>rurka polietylenowa PE-60</td><td>BD Intramedic</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Mastermix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S magnes ziem rzadkich</td><td></td></tr><tr><td>0,5 "OD 0,25" ID</td><td>Import krajowy</td><td>NSN0814</td><td></td></tr> magnes <tr><td>ziem rzadkich 0,75 "OD 0,5" ID</td><td>Import krajowy</td><td>NSN0615</td><td></td></tr><tr><td>odwrócony starter: biotyna-TGACCATTAGATACATTTCGC</td><td>Zintegrowane technologie DNA bez</td><td></td> pompy strzykawkowej Kent Scientific Genie Plus&beta;-Kazeina <td></td></tr><tr><td>z mleka bydlęcego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia dna

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Specyficzne dla miejsca rozszczepienie DNA (SSDC) jest kluczowym krokiem w wielu procesach komórkowych i jest kluczowe dla edycji genów. W pracy opisano test kinetyczny zdolny do pomiaru SSDC w wielu pojedynczych cząsteczkach DNA jednocześnie. DNA substratu na uwięzi koralików, z których każdy zawiera pojedynczą kopię sekwencji docelowej, przygotowuje się w kanale przepływu mikroprzepływowego. Magnes zewnętrzny wywiera słabą siłę na kulki paramagnetyczne. Integralność do 1000 pojedynczych DNA może być monitorowana poprzez wizualizację mikrogranulek w obrazowaniu w ciemnym polu przy użyciu obiektywu o szerokim polu widzenia i małym powiększeniu. Wstrzyknięcie endonukleazy restrykcyjnej, NdeI, inicjuje reakcję rozszczepienia. Mikroskopia wideo służy do rejestrowania dokładnego momentu rozszczepienia DNA poprzez obserwację ramy, w której powiązany koralik porusza się w górę i poza płaszczyznę ogniskową obiektywu. Liczenie koralików klatka po klatce określa ilościowo reakcję, a dopasowanie wykładnicze określa szybkość reakcji. Metoda ta pozwala na zebranie ilościowych i statystycznie istotnych danych na temat reakcji SSDC pojedynczej cząsteczki w jednym eksperymencie.

Zastosowanie tej techniki pozwoliło na zmierzenie szybkości SSDC dla NdeI w zakresie stężeń białka od 0,25 do 4,00 U/mL przy dwóch różnych stężeniach magnezu (2 mM i 4 mM). Każdy z tych warunków powtórzono co najmniej dwukrotnie, wykorzystując od kilkuset do 1000 przywiązanych cząsteczek DNA na eksperyment. Rycina 2 przedstawia schemat eksperymentalny. Rycina 3 prezentuje przykłady gromadzenia danych oraz szczegóły analizy. Rycina 4...

Opisano wysoce równoległą metodę pomiaru specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół ten demonstruje technikę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej NdeI. Metodę można łatwo zmodyfikować w celu zbadania dowolnego procesu, który prowadzi do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA.

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Protokół ten można zastosować do dowolnego procesu, który powoduje pęknięcia dwuniciowego DNA, dostarcza szczegółowych danych ilościowych na temat kinetyki. Chociaż metoda ta ma rozdzielczość pojedynczej cząsteczki, mierzy do 1000 DNA w jednym eksperymencie, zapewniając w ten sposób dobre statystyki. Podstawowym zastosowaniem tej metody jest badanie mechanizmów związanych z wiązaniem i modyfikacją DNA.Na przykład jesteśmy zainteresowani badaniem poszukiwania celów DNA, które jest istotne dla wszystkich białek wiążących DNA. Próbując tej techniki po raz pierwszy, pamiętaj, że uwięzi jednocząsteczkowe są delikatne i po uformowaniu należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Niezbędna jest odpowiednia proporcja funkcjonalizowanych powierzchni.Jest kilka sztuczek, dzięki którym przepływ będzie tak płynny. Oprócz zmiany probówek z próbkami podczas zbierania danych, demonstracja wizualna może pomóc komuś, kto jest nowy w tej procedurze. Aby umyć szkiełka nakrywkowe, umieść je w słoikach do barwienia i poddaj sonikacji etanolem przez 30 minut.Dokładnie opłucz je wodą dejonizowaną i destylowaną, a następnie zanurz je w jednym molowym wodorotlenku potasu i poddaj sonikacji przez kolejne 30 minut. Powtórz sekwencję prania, pamiętając, aby po każdym praniu spłukać szkiełka nakrywkowe wodą. Oczyszczone szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w słoikach do barwienia wodą.Użyj czystej brzytwy, aby przeciąć ośmiocentymetrowe rurki ładujące i wyjściowe i włóż je do otworów w czystym szklanym szkiełku. Pokryj rurkę żywicą epoksydową i pozostaw do utwardzenia przez pięć minut, aby ją zabezpieczyć. Nałóż taśmę dwustronną wstępnie wyciętą ze wzorem kanału na szkiełka i wygładź ją plastikowymi kleszkami, aby uzyskać dobre uszczelnienie.Oderwij podkład od taśmy i nałóż czystą szkiełko nakrywkowe, wygładzając je kleszczami. Następnie pokryj żywicą epoksydową krawędź szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić komórkę przepływową i pozwól jej się utwardzić. Przygotuj znakowane DNA do wiązania poprzez wykonanie PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Następnie oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR. Przygotować 10 mililitrów buforu A i odgazować go w eksykatorze próżniowym przez co najmniej godzinę. Aby sfunkcjonalizować komórkę przepływową, wstrzyknij 25 mikrolitrów anty-digoksygeniny i fragmentów fab w PBS do kanału przepływowego, używając końcówki ładującej żel, która pasuje do rurki PE60.Inkubować komórkę przepływową w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji przeciągnąć strzykawką 0,5 mililitra buforu A przez kanał, uważając, aby nie wprowadzić powietrza do kanału. Następnie przelej komórkę przepływową na odwrócony mikroskop.Podłącz rurkę wylotową do pompy strzykawkowej i włóż rurkę wlotową do probówki mikrowirówki zawierającej bufor A. Ręcznie wyciągnij co najmniej 0.5 mililitra buforu A, aby przepłukać system i zalać pompę. Następnie pozwól pompie pracować z prędkością 10 mikrolitrów na minutę przez co najmniej pięć minut, aby zrównoważyć system. Wiruj butelkę z kulkami i odpipetuj 1,6 mikrolitra kulek do 50 mikrolitrów buforu A, a następnie ponownie je zwiruj.Umieść kulki na separatorze magnetycznym i odpipetuj bufor. Ponownie zawiesić je w 50 mikrolitrach buforu A i wymieszać. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu A, aby uzyskać końcowe stężenie 160 mikrogramów na mililitr.Przygotować 480 mikrolitrów 0,5 pikomolarnego substratu DNA w buforze A i odpipetować 20 mikrolitrów zawiesiny kulek do rozcieńczonego DNA. Umieść mieszaninę na rotatorze na trzy minuty. Po upływie trzech minut natychmiast załaduj próbkę do kanału z natężeniem przepływu 10 mikrolitrów na minutę przez 15 minut lub do momentu, gdy zaobserwuje się wystarczające wiązanie koralików.Umyj kanał ze wszystkich wolnych kulek, przełączając rurkę wlotową na nową rurkę buforu A i wlewając ją z prędkością 50 mikrolitrów na minutę przez co najmniej 10 minut lub do momentu, gdy nie zaobserwuje się luźnych kulek. Pomocne jest użycie wbudowanego zaworu, aby odciąć przepływ i przełączyć rurki. Przełączaj rurki jednym płynnym ruchem i upewnij się, że poziomy cieczy w nowych i starych probówkach na próbki są zgodne, aby uniknąć przepływu wstecznego.Przed zebraniem danych należy przygotować odpowiednie stężenie enzymu rozszczepiającego DNA i wprowadzić rurkę wlotową do próbki. Opuść magnes na komorę przepływową. Ustaw pompę tak, aby wstrzykiwała 80 mikrolitrów próbki z prędkością 150 mikrolitrów na minutę i rozpocznij zbieranie danych.Po minucie zbierania danych włącz pompę. Pokazany tutaj jest reprezentatywny obraz koralików na uwięzi przed i po reakcji. Przeprowadzono analizę danych w celu ilościowego określenia liczby kulek pozostających na uwięzi przez cały czas trwania reakcji rozszczepienia.Technika ta została wykorzystana do pomiaru specyficznych dla miejsca szybkości rozszczepienia DNA Nde1 dla stężeń białka w zakresie od 0,25 do czterech jednostek na mililitr i dwóch różnych stężeń magnezu. Każdy warunek został zreplikowany co najmniej dwa razy, przy czym w jednym eksperymencie pobrano od 100 do 1000 DNA na uwięzi. Przy odpowiednio niskich stężeniach białka dawka jest proporcjonalna do białka i niezależna od magnezu.W przypadku wysokich stężeń białka szybkość jest zależna od magnezu, ale niezależna od stężenia białka. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że pęcherzyki powietrza w rurce i kanale przepływowym mogą uruchomić eksperyment. Upewnij się, że nie wpuszczasz powietrza do przewodów podczas wymiany przewodów i odgazowuj wszystkie przed użyciem.Metoda tetheringu pozwala na zbadanie wpływu napięcia w DNA na reakcję. Można to osiągnąć, zmieniając siłę magnesu lub stosując przepływ podczas zbierania danych.

parallel-high-throughput-single-molecule-kinetic-assay-for-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kursy czasowe aktywności glikozylazy DNA 8-oksoguaniny są dwufazowe, wykazując gwałtowne tworzenie produktu i liniową fazę stanu ustalonego. Wykorzystując techniki przepływu gaszącego, można zmierzyć szybkość rozerwania i stanu ustalonego, które odpowiadają odpowiednio wycięciu 8-oksoguaniny i uwolnieniu glikozylazy z DNA produktu.

Pomiar kinetyczny w stanie ustalonym, przed stanem ustalonym i pojedynczym obrotem dla aktywności glikozylazy DNA

Opisujemy czułe, żelowe testy nieciągłe, aby zbadać kinetykę inicjacji opóźnionej nici przy użyciu białek replikacyjnych bakteriofaga T7.

Kinetyka syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacji bakteriofagów T7

Ten protokół demonstruje prosty, solidny i wysokoprzepustowy test rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania jednowymiarowej (1D) dyfuzji cząsteczek wzdłuż DNA.

Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

SAMHD1 to trifosfohydrolaza deoksynukleozydowo-trifosforanowa, odgrywająca kluczową rolę w ludzkim zdrowiu i chorobie. Tutaj przedstawiamy wszechstronny test aktywności SAMHD1 sprzężony z enzymami, zastosowany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, który pozwala na ocenę małych cząsteczek i analogów nukleotydów jako substratów, aktywatorów i inhibitorów SAMHD1.

Wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Poznaj równoległą analizę kinetyki rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek z endonukleazą NdeI. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów wiązania DNA z rozdzielczością do 1000 cząsteczek w jednym eksperymencie.

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Przeglądaj więcej filmów