Name: Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę LAMP do szybkiego wykrywania Salmonelli w karmie zwierzęcej. Ta technika izotermicznej amplifikacji oferuje krótszy czas badania i niższy wskaźnik fałszywie ujemnych wyników niż tradycyjna PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom Podkomitetu ds. Walidacji Metod Mikrobiologicznych FDA (MMVS) oraz Rady Podręcznika Analizy Bakteriologicznej (BAM) za krytyczny przegląd badań walidacyjnych metody Salmonella LAMP.

<ol><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).</li>
<li>Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+loop-mediated+isothermal+amplification+to+a+culture+medium+and+biological+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).</li>
<li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li>
<li>Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+food+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications.</a> Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).</li>
<li>Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+using+a+nondenatured+template%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).</li>
<li>Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+review+of+monitoring+methods+for+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP).</a> Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).</li>
<li>Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+reaction+by+loop-mediated+isothermal+amplification+using+loop+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.</a> Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).</li>
<li>Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+Salmonella+detection+in+food+and+feed%3A+Current+applications+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Foodborne+Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).</li>
<li>Mori, Y., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+Expansion+of+its+practical+application+as+a+tool+to+achieve+universal+health+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).</li>
<li>Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+diagnosis+of+18+World+Organization+for+Animal+Health+%28OIE%29+notifiable+viral+diseases+of+ruminants%2C+swine+and+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Health+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry.</a> Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).</li>
<li>Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+rapid+and+sensitive+tool+for+quality+assessment+of+meat+products%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Reviews+in+Food+Science+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).</li>
<li>WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en">http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en</a> (2016).</li>
<li>Kundapur, R. R., Nema, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification%3A+Beyond+microbial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Cogent+Biology%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification.</a> Cogent Biology. 2, 1137110(2016).</li>
<li>WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en</a> (2018).</li>
<li>FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf">http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf</a> (2015).</li>
<li>FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf">https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf</a> (2013).</li>
<li>Bird, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+3M+molecular+detection+assay+%28MDA%29+2+-+Salmonella+for+the+detection+of+Salmonella+spp.+in+select+foods+and+environmental+surfaces%3A+collaborative+study%2C+first+action+2016.01%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01.</a> Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).</li>
<li>D'Agostino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+loop-mediated+amplification%2FISO+6579-based+method+for+analysing+soya+meal+for+the+presence+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica.</a> Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).</li>
<li>Ge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-laboratory+validation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+screening+Salmonella+in+animal+food%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 562(2019).</li>
<li>D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loop-mediated+isothermal+amplification-based+method+for+analysing+animal+feed+for+the+presence+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella.</a> Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).</li>
<li>Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+the+Salmonella+invasion+gene+invA%3A+homology+of+InvA+to+members+of+a+new+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family.</a> Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).</li>
<li>Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+viable+salmonellae+in+produce+by+coupling+propidium+monoazide+with+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).</li>
<li>Yang, Q., Chen, S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Salmonella+serovars+in+shell+eggs+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+loop-mediated+isothermal+amplification+for+the+rapid%2C+reliable%2C+and+robust+detection+of+Salmonella+in+produce%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce.</a> Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).</li>
<li>Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Salmonella+in+food+and+feed+by+coupling+loop-mediated+isothermal+amplification+with+bioluminescent+assay+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 112(2016).</li>
<li>Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+in+animal+food%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food.</a> International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).</li>
<li>Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm">http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm</a> (2020).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Poglądy wyrażone w tym manuskrypcie są poglądami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają oficjalną politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) lub rządu Stanów Zjednoczonych. Odniesienie do jakichkolwiek materiałów komercyjnych, sprzętu lub procesu w żaden sposób nie stanowi aprobaty, poparcia ani rekomendacji Agencji ds. Żywności i Leków.

Przedstawiliśmy tutaj prostą, szybką, specyficzną i czułą metodę LAMP do badania przesiewowego i potwierdzania Salmonelli odpowiednio w żywności zwierzęcej i czystej kulturze. Dzięki wygodzie izotermicznej mieszanki wzorcowej, która zawiera cztery kluczowe odczynniki, oraz gotowej do użycia, przygotowanej przez siebie mieszanki starterów, przygotowanie reakcji LAMP wymaga tylko kilku etapów pipetowania (ilustracja 1). Całkowity czas pracy wraz z fazami amplifikacji i wyżarzania wynosi mniej niż 38 minut (Rysunek 2A,B i Rysunek 3A,B). Pozytywne wyniki są monitorowane za pomocą fluorescencji w czasie rzeczywistym (Rysunek 2C i Rysunek 3C,D) i można je wykryć już po 5 minutach26. Faza wyżarzania służy jako dodatkowe potwierdzenie specyficzności LAMP, ponieważ tylko próbki o prawidłowym Tm (około 90 °C) są zgłaszane jako dodatnie (rysunek 2D,E i rysunek 3E−G). Wrażliwość 1 komórki Salmonelli w czystej kulturze i < 1 jtk/25 g w karmie zwierzęcej była zgłaszana wcześniej26.
Ponieważ LAMP jest dość skuteczny i generuje dużą ilość DNA1, bardzo ważne jest, aby stosować najlepsze praktyki laboratoryjne w celu zapobiegania zanieczyszczeniu krzyżowemu, które może obejmować fizyczne oddzielenie obszarów do przygotowania mieszanki wzorcowej LAMP i dodanie matryc DNA, unikanie wytwarzania aerozoli, używanie końcówek do pipet filtrujących, częstą zmianę rękawiczek i powstrzymanie się od otwierania probówek reakcyjnych LAMP po amplifikacji.
Swoistość tej metody Salmonella LAMP została wcześniej przetestowana przy użyciu 300 szczepów bakteryjnych (247 Salmonelli ze 185 serowarów i 53 nie-Salmonella) i wykazano, że jest w 100% swoista26. W szczególności zaobserwowano znaczące różnice w Tmax między dwoma gatunkami Salmonelli, S. enterica i Salmonella bongori, oraz między podgatunkami S. enterica, zwłaszcza subsp. arizonae (IIIa)26. Niemniej jednak były to nadal ważne pozytywne wyniki zgodnie z zasadami interpretacji wyników LAMP. W naszym wielolaboratoryjnym badaniu dotyczącym suchej karmy dla psów, w którym uczestniczyło 14analityków19, sporadycznie obserwowano próbki o niespójnych wynikach w zduplikowanych seriach LAMP. Zazwyczaj były to próbki z opóźnionymi wynikami dodatnimi (Tmax > 15 min). Powtórzenie obu przebiegów niezależnie zwykle rozwiązywało problem. Rzadziej obserwowaliśmy próbki z prawidłowymi wartościami Tm, ale bez lub nieregularnymi wartościami Tmax (< 5 min). Było to zwykle spowodowane pęcherzykami powietrza w rurce reakcyjnej.
Przez cały cykl życia opracowywania metody LAMP, oceny, badań przedzespołowych i walidacji w wielu laboratoriach zaobserwowaliśmy wysoką tolerancję LAMP na inhibitory w różnych karmach zwierzęcych lub matrycach żywnościowych i pożywkach hodowlanych 4,19,22,23,24, podkreślając solidność metody i współpracując z wieloma innymi badaniami na skalę globalną 8. Jest to lepsze rozwiązanie w porównaniu z PCR lub PCR w czasie rzeczywistym, które zwykle wymaga wewnętrznej kontroli amplifikacji, aby upewnić się, że negatywne wyniki nie są spowodowane hamowaniem macierzy28. Co więcej, LAMP wykazał podobną (lub wyższą) swoistość i czułość w porównaniu z PCR lub PCR w czasie rzeczywistym w zdecydowanej większości badań8. Koszt odczynników LAMP wynosi około 1 USD za reakcję. Instrumenty LAMP używane w tym protokole są małe, łatwe w utrzymaniu i przenośne. Mogą poradzić sobie z każdą metodą amplifikacji izotermicznej, która wykorzystuje wykrywanie celu za pomocą pomiaru fluorescencji, w tym LAMP. Za pomocą oprogramowania LAMP można generować kompleksowe raporty w wielu formatach (pdf, tekst i obraz).
Walidacja metody jest krytycznym krokiem, zanim nowa metoda będzie mogła zostać przyjęta do rutynowego użytku. Warto zauważyć, że zgłoszony tutaj protokół LAMP pomyślnie przeszedł walidację w wielu laboratoriach19. Oczekuje się, że wraz z niedawnym włączeniem tego protokołu LAMP do amerykańskiego raportu FDA BAM Chapter 5 Salmonella27, metoda ta zyska znacznie szersze zastosowanie, zarówno jako szybka metoda przesiewowa w żywności zwierzęcej, jak i jako wiarygodna metoda potwierdzania przypuszczalnych izolatów Salmonelli ze wszystkich kategorii żywności.

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to nowatorski test izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych (iNAAT) wynaleziony w 2000 roku przez grupę japońskich naukowców1. Poprzez tworzenie specyficznej dla celu struktury DNA pętli macierzystej podczas początkowych etapów, LAMP wykorzystuje polimerazę DNA wypierającą nić, aby skutecznie amplifikować ten materiał wyjściowy quasi-wykładniczo, co skutkuje 109 kopiami celu w czasie krótszym niż 1 h1. W porównaniu z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR), szeroko stosowaną metodą NAAT, LAMP ma kilka zalet. Po pierwsze, reakcje LAMP przeprowadza się w warunkach izotermicznych. Eliminuje to potrzebę stosowania wyrafinowanego przyrządu do cykli termicznych. Po drugie, LAMP jest wysoce tolerancyjny na podłoża hodowlane i substancje biologiczne2 z odpornością wykazaną zarówno w zastosowaniach klinicznych, jak i spożywczych3,4. Upraszcza to przygotowanie próbki i minimalizuje liczbę wyników fałszywie ujemnych5. Po trzecie, LAMP jest podatny na wiele platform detekcji, takich jak zmętnienie, kolorymetria, bioluminescencja, fluorescencja i mikrofluidyka6. Po czwarte, LAMP jest bardzo specyficzny, ponieważ używa od czterech do sześciu specjalnie zaprojektowanych starterów do kierowania na sześć do ośmiu określonych regionów1,7. Po piąte, LAMP jest ultraczuły, a liczne badania wykazały jego wyższą czułość na PCR lub real-time PCR8. Wreszcie, LAMP jest szybszy, ponieważ wiele testów przyjmuje teraz standardowy czas trwania 30 minut, podczas gdy testy typu PCR zwykle trwają 1−2 h8.
Te atrakcyjne cechy przyczyniły się do zastosowania LAMP w szerokich obszarach wykrywania patogenów, w tym w diagnostyce in vitro9, Animal disease diagnostics10, oraz Food and Environmental testing11. Warto zauważyć, że WHO zaleciła LAMPĘ DO GRUŹLICY (LAMP do Mycobacterium tuberculosis) jako ważny test zastępczy do mikroskopii rozmazowej plwociny w diagnostyce gruźlicy płuc w warunkach peryferyjnych12. Aplikacja LAMP wykracza również poza identyfikację mikrobiologiczną i obejmuje wykrywanie alergenów, gatunków zwierząt, oporności na leki, organizmów modyfikowanych genetycznie i pestycydów13.
Nietyfusowa Salmonella jest odzwierzęcym patogenem o dużym znaczeniu dla bezpieczeństwa żywności i zdrowia publicznego na całym świecie14. Został również zidentyfikowany jako ważne zagrożenie mikrobiologiczne w żywności dla zwierząt (tj. żywności dla zwierząt)15,16. Aby zapobiec chorobom/epidemiom Salmonelli spowodowanym skażoną żywnością dla ludzi i zwierząt, konieczne jest posiadanie szybkich, niezawodnych i solidnych metod testowania Salmonelli w różnych matrycach. W ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne wysiłki na arenie międzynarodowej w zakresie rozwoju i zastosowania testów Salmonella LAMP w szerokiej gamie matryc żywnościowych, co niedawno podsumowano w obszernym przeglądzie8. Kilka testów LAMP na obecność Salmonelli, w tym ten przedstawiony tutaj, pomyślnie przeszło walidację w wielu laboratoriach zgodnie z dobrze znanymi międzynarodowymi wytycznymi17,18,19,20.
Nasz test Salmonella LAMP jest ukierunkowany na gen inwazji Salmonelli invA (numer dostępu GenBank M90846)21 i jest szybki, niezawodny i wytrzymały w wielu matrycach żywności4,22,23,24,25,26. Metoda została zwalidowana na sześciu matrycach pokarmów zwierzęcych w badaniu przedzespołowym26 oraz na suchej karmie dla psów w wielolaboratoryjnym badaniu zespołowym19. W rezultacie, przedstawiona tutaj metoda Salmonella LAMP została niedawno włączona do Bakteriologicznego Podręcznika Analitycznego (BAM) Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) Rozdział 5 Salmonella27, aby służyć dwóm celom, po pierwsze jako szybka metoda przesiewowa na obecność Salmonelli w żywności zwierzęcej, a po drugie jako wiarygodna metoda potwierdzania przypuszczalnej Salmonelli wyizolowanej ze wszystkich pokarmów.

<table><tbody><tr><td>Bulion do infuzji serca (BHI)</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>299070</td><td>Płynna pożywka wzrostowa stosowana w uprawie Salmonelli.</td></tr><tr><td>Buforowana woda peptonowa (BPW)</td><td>BD Systemy diagnostyczne, iskry, MD</td><td>218105</td><td>Pożywka do wstępnego wzbogacania do odzyskiwania Salmonelli z próbek żywności zwierzęcej.</td></tr><tr><td>DNA AWAY</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>7010</td><td>Eliminuje niechciane DNA i DNazę z laboratoryjnego stołu, szkła i plastiku bez wpływu na kolejne próbki DNA.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Genie Explorer</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Wielka Brytania</td><td>Wersja 2.0.6.3</td><td>Obsługuje zdalną obsługę instrumentów Genie, w tym uruchamianie LAMP i analizę danych.</td></tr><tr><td>Genie II lub Genie III (instrument LAMP)</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Wielka Brytania</td><td>GEN2-02 lub GEN3-02</td><td>Mały instrument zdolny do kontroli temperatury do 100 stopni Celsjusza; C z &plusmn; 0,1 &stopni; Dokładność C i jednoczesna detekcja fluorescencji poprzez kanał FAM. Genie II składa się z 2 bloków (A i B) z 8 próbkami w każdym bloku. Genie III ma pojedynczy blok, który mieści 8 próbek.</td></tr><tr><td>Genie strip</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Wielka Brytania</td><td>OP-0008</td><td>8-dołkowe paski do mikroprobówek ze zintegrowanymi nasadkami blokującymi i objętością roboczą od 10 do 150 μl.</td></tr><tr><td>Uchwyt pasków Genie</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Wielka Brytania</td><td>GBLOCK</td><td>Używany do przytrzymywania pasków Genie podczas ustawiania reakcji LAMP, aluminiowy uchwyt może być również używany jako fajny blok.</td></tr><tr><td>Roztwór kwasu solnego (HCl), 1 N</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SA48-500</td><td>Dostosowuje pH próbek pokarmu zwierzęcego po dodaniu BPW i przed wzbogacaniem przez noc.</td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>88-860-022</td><td>Podgrzewa próbki w temperaturze 100 &plusmn; 1 oC w celu ekstrakcji DNA.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>3960</td><td>Standardowy inkubator laboratoryjny.</td></tr><tr><td>ISO-001 izotermiczna mieszanka główna</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Wielka Brytania</td><td>ISO-001</td><td>Zoptymalizowana mieszanka główna upraszczająca montaż reakcji LAMP, zawierająca duży fragment polimerazy DNA GspSSD z Geobacillus spp., termostabilną nieorganiczną pirofosfatazę, bufor reakcyjny, MgSO4, dNTP i dwuniciowy barwnik wiążący DNA (kanał wykrywania FAM).</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>A416</td><td>Dezynfekuje powierzchnie robocze.</td></tr><tr><td>Startery LAMP</td><td>Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA</td><td>Niestandardowe</td><td>startery LAMP ze szczegółowymi informacjami w Tabeli 1.</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf North America, Hauppauge, NY</td><td>22620207</td><td>MiniSpin plus osobista mikrowirówka.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>05-408-129</td><td>Standardowe probówki do mikrowirówek.</td></tr><tr><td>Woda klasy molekularnej</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>AM9938</td><td>Stosowana do wytwarzania podkładów, mieszanin starterów i mieszanin reakcyjnych LAMP.</td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), 1 N</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SS266-1</td><td>Dostosowuje pH próbek pokarmu zwierzęcego po dodaniu BPW i przed wzbogaceniem przez noc.</td></tr><tr><td>Nieselektywny agar (np. agar z krwią, agar odżywczy i agar sojowy z tryptykazą)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>R01202</td><td>Stałe podłoże wzrostowe stosowane w uprawie Salmonelli.</td></tr><tr><td>Woda peptonowa</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>218071</td><td>Rozcieńcza przez noc kultury Salmonelli w celu wytworzenia pozytywnego DNA kontrolnego.</td></tr><tr><td>Pipety i końcówki</td><td>Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA</td><td>Pipet Lite LTS</td><td>Standardowe pipety i końcówki laboratoryjne.</td></tr><tr><td>Odczynnik do przygotowania próbek PrepMan Ultra</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>4318930</td><td>Prosty zestaw służący do szybkiego przygotowania matryc DNA do użycia w reakcji LAMP.</td></tr><tr><td>Szczep referencyjny Salmonella LT2</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>700720</td><td>Szczep referencyjny Salmonella stosowany jako kontrola pozytywna.</td></tr><tr><td>Rosół sojowy z tryptykazy (TSB)</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>211768</td><td>Płynne podłoże wzrostowe stosowane w uprawie Salmonelli.</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY</td><td>SI-0236</td><td>Standardowy laboratoryjny mieszalnik wirowy.</td></tr><tr><td>Worek filtracyjny Whirl-pak</td><td>Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI</td><td>B01318</td><td>Worki filtracyjne do przechowywania próbek karmy dla zwierząt w celu wstępnego wzbogacenia.</td></tr></tbody></table>

amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) stała się potężnym testem amplifikacji kwasu nukleinowego do szybkiego wykrywania licznych czynników bakteryjnych, grzybiczych, pasożytniczych i wirusowych. Salmonella jest patogenem bakteryjnym budzącym obawy dotyczące bezpieczeństwa żywności na całym świecie, w tym żywności dla zwierząt. Przedstawiono tutaj zatwierdzony przez wiele laboratoriów protokół Salmonella LAMP, który może być wykorzystany do szybkiego badania żywności dla zwierząt pod kątem obecności zanieczyszczenia Salmonellą, a także może być wykorzystany do potwierdzenia przypuszczalnych izolatów Salmonelli odzyskanych ze wszystkich kategorii żywności. Test LAMP jest ukierunkowany konkretnie na gen inwazji Salmonelli (invA) i jest szybki, czuły i wysoce specyficzny. Matrycowe DNA są przygotowywane z bulionów wzbogacających karmę zwierzęcą lub czystych kultur przypuszczalnych izolatów Salmonelli. Mieszaninę odczynników LAMP przygotowuje się przez połączenie izotermicznej mieszanki wzorcowej, starterów, matrycy DNA i wody. Test LAMP przebiega w stałej temperaturze 65 °C przez 30 minut. Pozytywne wyniki są monitorowane za pomocą fluorescencji w czasie rzeczywistym i można je wykryć już po 5 minutach. Test LAMP wykazuje wysoką tolerancję na inhibitory w karmie zwierzęcej lub pożywce hodowlanej, służąc jako szybka, niezawodna, solidna, opłacalna i przyjazna dla użytkownika metoda badań przesiewowych i potwierdzania Salmonelli. Metoda LAMP została niedawno włączona do Bakteriologicznego Podręcznika Analitycznego (BAM) Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration's Bacteriological Analytical Manual, BAM) Chapter 5.

Rysunek 2 oraz Rysunek 3 przedstawiają reprezentatywne wykresy/tabele LAMP wyświetlane na obu platformach. W tym przebiegu LAMP próbki S1 do S6 stanowią 10-krotne rozcieńczenia seryjne S. enterica serowar Infantis ATCC 51741 w zakresie od 1,1 x 106 CFU do 1 CFU na reakcję. Kontrolą pozytywną jest S. enterica serowar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) w stężeniu 1,7 x 104 CFU na reakcję, a NTC to woda klasy molekularnej.
Jak pokazano na Rysunku 2E oraz Rysunku 3G, zarówno studzienki NTC, jak i PC stanowią poprawne kontrole. W studzience NTC wartość Tmax jest pusta, natomiast Tm wynosi &lt; 83 °C na panelu instrumentu LAMP i jest pusta w oprogramowaniu LAMP, co wskazuje na wynik negatywny. Studzienka PC wykazuje Tmax wynoszący 7 min 45 sec oraz Tm ok. 90 °C na obu platformach, co wskazuje na wynik pozytywny. Próbki od S1 do S6 mają Tmax w przedziale od 6 min 30 sec do 12 min 15 sec, co oznacza, że wszystkie są pozytywne pod kątem obecności Salmonella.
Po wykonaniu powtórnych analiz tego samego zestawu próbek, raportowane są końcowe wyniki LAMP dla tych próbek. Ten reprezentatywny przebieg reakcji LAMP pokazuje, że metoda ta skutecznie wykrywa Salmonella w szerokim zakresie stężeń w próbkach.
<img alt="Analiza PCR z użyciem urządzenia Genie II; wykresy wyników eksperymentu wyświetlone na ekranie w pięciu etapach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki LAMP wyświetlone na panelu urządzenia LAMP. (A) The Profil Tabela przedstawia zaprogramowany profil temperatury. (B) The Temperatura tabela przedstawia rzeczywiste temperatury w dołkach z próbkami w miarę przebiegu reakcji LAMP.C) The Amplifikacja Tabela przedstawia odczyty fluorescencji podczas amplifikacji LAMP.D) The Wyżarzanie tabela przedstawia zmiany fluorescencji (pochodną) podczas fazy wyżarzania.E) The Wyniki karta przedstawia tabelaryczny widok wyników LAMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza danych spektroskopowych; wykresy i wyniki badań emisji oraz absorpcji; konfiguracja spektrometru." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki LAMP wyświetlone w oprogramowaniu LAMP. (A) The Profil tabela przedstawia zaprogramowany profil temperatury. (B) The Temperatura tabela przedstawia rzeczywiste temperatury w dołkach z próbkami w miarę postępu reakcji LAMP. (C) The Amplifikacja tabela przedstawia odczyty fluorescencji podczas amplifikacji LAMP.D) The Szybkość amplifikacji tabela przedstawia zmiany fluorescencji (stosunek fluorescencji) podczas amplifikacji metodą LAMP.E) The Wyżarzanie Tabela przedstawia odczyty fluorescencji podczas fazy przyłączania. (F) The Hybrydyzacja pochodnej tabela przedstawia zmiany fluorescencji (pochodna) podczas fazy hybrydyzacji. (G) The Wynik zakładka przedstawia wyniki metody LAMP w formie tabeli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to test izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych (iNAAT), który wzbudził szerokie zainteresowanie w dziedzinie wykrywania patogenów. W tym miejscu przedstawiamy zatwierdzony przez wiele laboratoriów protokół Salmonella LAMP jako szybką, niezawodną i solidną metodę badań przesiewowych Salmonelli w żywności zwierzęcej i potwierdzania przypuszczalnej obecności Salmonelli w izolacji hodowli.

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, ...

Ta metoda Salmonella LAMP została włączona do Bakteriologicznego Podręcznika Analitycznego FDA, zarówno jako metoda przesiewowa w karmie zwierzęcej, jak i metoda potwierdzania dla wszelkich przypuszczalnych izolatów Salmonelli. Metoda jest szybka, niezawodna i solidna. W porównaniu z PCR, jego główne zalety to szybkie testy, proste oprzyrządowanie, niski odsetek wyników fałszywie ujemnych i elastyczny przepływ pracy.Szybkie badania przesiewowe w kierunku patogenów, takich jak salmonella, odgrywają ważną rolę w szybkim wykrywaniu potencjalnie skażonego produktu i mogą zapobiegać chorobom lub epidemiom u ludzi i zwierząt. Zacznij od przygotowania matryc DNA do testu LAMP. Istnieją dwa rodzaje próbek używanych do tworzenia matryc DNA.Aby przygotować szablony z próbek pokarmu dla zwierząt, należy w asepcie zważyć 25 gramów próbki żywności w sterylnym worku filtrującym. Dodaj 225 mililitrów sterylnej buforowanej wody peptonowej do torebki i inkubuj w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji przenieść jeden mililitr z przefiltrowanej strony worka do mikroprobówki wirówkowej.Odwirować probówkę o temperaturze 900 razy G przez jedną minutę. Następnie przenieść supernatant do nowej mikroprobówki wirówkowej. Odwirować próbkę w temperaturze 16 000 razy G przez dwie minuty.Aby odrzucić supernatant, ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach odczynnika do przygotowania próbki i podgrzej go w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut w suchym bloku grzewczym. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej i przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Drugi rodzaj próbki do tego testu LAMP pochodzi bezpośrednio z przypuszczalnych kultur salmonelli.Aby przygotować matryce DNA, przenieś 500 mikrolitrów nocnej kultury salmonelli do mikroprobówki wirówkowej i podgrzewaj ją w bloku grzewczym o temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej i przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, należy fizycznie oddzielić obszary używane do przygotowania LAMP Master Mix i dodania matryc DNA.Oczyść powierzchnie robocze izopropanolem i roztworem rozkładającym DNA i DNA. Następnie wyczyść pipety i uchwyty pasków probówek. Rozmrozić izotermiczny Master Mix, 10X Primer Mix, wodę molekularną, DNA kontroli pozytywnej i matryce DNA w temperaturze pokojowej.Włącz przyrząd LAMP i wprowadź odpowiednie sample informacje. Przygotować LAMP Master Mix zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, zwirować i krótko odwirować, a następnie rozprowadzić 23 mikrolitry Master Mix do każdego dołka paska probówki. Zwiruj wszystkie matryce DNA i krótko je odwiruj.Następnie dodaj dwa mikrolitry matrycy DNA do odpowiedniego dołka i szczelnie zakryj studzienkę. Wyjmij pasek probówki z uchwytu i potrząśnij nim, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki zebrały się na dnie probówki. Załaduj taśmę rurową do przyrządu LAMP i rozpocznij pracę LAMP.Podczas gdy reakcja LAMP jest w toku, dotknij kart Temperatura, Amplifikacja i Wyżarzanie, aby zobaczyć dynamiczne zmiany różnych parametrów podczas przebiegu LAMP. Wyniki LAMP można przeglądać na tablicy wskaźników LAMP w czasie rzeczywistym lub za pomocą oprogramowania LAMP. Aby zinterpretować wyniki na tablicy wskaźników, otwórz interesujący Cię przebieg LAMP.Obserwuj pięć kart skojarzonych z każdym uruchomieniem. Zakładki Profil i Temperatura pokazują zaprogramowane i rzeczywiste temperatury w studzienkach na próbki w miarę postępu reakcji LAMP. Zakładki Amplifikacja i Wyżarzanie pokazują odczyty fluorescencji i zmiany fluorescencji odpowiednio podczas fazy amplifikacji i wyżarzania.Zakładka Wyniki pokazuje tabelaryczny widok wyników LAMP, które można interpretować zgodnie ze wskazówkami manuskryptów. Drugim sposobem przeglądania wyników LAMP jest użycie oprogramowania LAMP. Aby zinterpretować wyniki za pomocą oprogramowania, kliknij ikonę Komputer na lewym panelu i przejdź do lokalizacji pliku, aby załadować interesujący Cię przebieg LAMP.Zwróć uwagę na siedem kart skojarzonych z każdym uruchomieniem. Zakładki Profil i Temperatura pokazują zaprogramowane i rzeczywiste temperatury w studzienkach na próbki w miarę postępu reakcji LAMP. Zakładki Amplification (Szybkość wzmocnienia) i Amplification Rate (Szybkość wzmocnienia) pokazują odczyty fluorescencji i zmiany fluorescencji w fazie amplifikacji.Zakładki Wyżarzanie i Pochodna wyżarzania pokazują odczyty fluorescencji i zmiany fluorescencji podczas fazy wyżarzania. Na karcie Wyniki wyświetlany jest tabelaryczny widok wyników LAMP. Istnieją cztery kolumny zatytułowane Nazwa wykresu, Numer studni, Nazwa studni i Wartość szczytowa.Pokazano czas wzmacniacza i pochodne wyżarzania wszystkich ośmiu próbek. Wyniki mogą być interpretowane zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Tablica przyrządów LAMP i oprogramowanie LAMP mogą być używane do wyświetlania wyników testu.W tym przebiegu LAMP próbki od S1 do S6 są dziesięciokrotnymi seryjnymi rozcieńczeniami serowara Salmonella enterica Infantis ATCC 51741, w zakresie od 1,1 miliona do 11 jednostek tworzących kolonie na reakcję. Kontrolą pozytywną lub PC jest Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 w ilości 17 000 jednostek tworzących kolonie na reakcję, a kontrola bez matrycy lub NTC to woda o jakości molekularnej. Studzienka NTC ma ślepą próbę Tmax i temperaturę anealu wynoszącą około 81 stopni Celsjusza na tablicy przyrządów LAMP oraz ślepą wartość Tmax i pustą temperaturę wyżarzania w oprogramowaniu LAMP.Studzienka kontroli dodatniej ma Tmax wynoszący siedem minut i 45 sekund oraz temperaturę wyżarzania około 90 stopni Celsjusza na obu platformach. Próbki od S1 do S6 mają Tmax od sześciu minut do 30 sekund oraz 12 minut i 15 sekund, a temperatura wyżarzania wynosi około 90 stopni Celsjusza, co wskazuje na pozytywne wykrycie. LAMP jest bardzo skuteczny i generuje dużą ilość DNA.Dlatego tak ważne jest, aby stosować najlepsze praktyki laboratoryjne w celu zapobiegania zanieczyszczeniu krzyżowemu. Stosuj podobne praktyki podczas tworzenia szablonów DNA, ponieważ wzbogacenia z zanieczyszczonej żywności zwierzęcej mogą mieć wysoki poziom salmonelli. Dodatnie wyniki badania przesiewowego próbki żywności dla zwierząt za pomocą LAMP należy potwierdzić poprzez izolację kultury zgodnie z procedurami zawartymi w Podręczniku Analizy Bakteriologicznej FDA.Próbki ujemne mogą być zgłaszane jako takie. Włączenie tej metody LAMP do Bakteriologicznego Podręcznika Analitycznego FDA otwiera drogę do szerszego zastosowania tej szybkiej, solidnej i przyjaznej dla użytkownika technologii w testach bezpieczeństwa żywności.

loop-mediated-isothermal-amplification-for-screening-salmonella

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Opisujemy metodę multipleksowej reakcji PCR do szybkiego wykrywania serowarów Salmonella enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium. Konkretne serowary Salmonella można zidentyfikować, kierując multipleksową reakcję PCR na geny i sekwencje unikalne dla klastra biosyntezy antygenu O oraz flagelliny danego serowaru. Następnie izolatowi Salmonella przypisuje się serowar na podstawie pojawienia się specyficznych amplikonów (produktów PCR) o określonej wielkości, odpowiadających...

PCR allelotypowania w celu identyfikacji serowarów Salmonella enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium

Źródło: Domesle, K. J. i in. Pętlowane wzmacnianie izotermiczne do wykrywania salmonelli w karmach zwierzęcych i potwierdzania izolacji salmonelli w hodowli kulturowej.  J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje technikę amplifikacji izotermicznej z pętlą (LAMP) do wykrywania docelowego genu bakteryjnego poprzez amplifikację DNA w stałej temperaturze. Mieszanina reakcyjna przygotowuje się poprzez dodanie izotermicznej mieszanki głównej, specyficznych starterów dla docelowego genu oraz próbek...

Pętlowa amplifikacja izotermiczna do wykrywania genów bakteryjnych

Protokół oparty na PCR został dostosowany do wykrywania Cronobacter spp., Salmonella enterica i Listeria monocytogenes z powierzchni ciała i kanałów pokarmowych pojedynczych dziko żyjących much. Celem tego protokołu jest wykrycie i wyizolowanie patogenów bakteryjnych od poszczególnych owadów zebranych w ramach programu pobierania próbek środowiskowych podczas badań epidemii przenoszonych przez żywność.

Wykrywanie patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność przez pojedyncze muchy brudne

Diagnoza zakażenia Eimeria u kurcząt pozostaje wymagająca. Podejścia oparte na morfologii pasożytów i patologii żywiciela są zwykle niejednoznaczne, podczas gdy podejścia molekularne oparte na PCR okazały się wymagające pod względem kosztów i wiedzy specjalistycznej. Celem tego protokołu jest ustanowienie amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) jako prostej diagnostyki molekularnej infekcji eimeriana.

Testy amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do specyficznego dla gatunku wykrywania emerii, które infekują kurczaki

Ten protokół opisuje wykrywanie integronów klasy 1 i związanych z nimi kaset genowych w produktach spożywczych.

Badania przesiewowe środków spożywczych na obecność integronów klasy 1 i kaset genowych

Salmonella spp./Shigella spp. są częstymi patogenami przypisywanymi biegunce. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.

Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek DNA z mikrobiomów żywności i środowiska do wspólnego wykrywania i subtypowania Salmonelli poprzez sekwencjonowanie quasimetagenomiczne. Połączone zastosowanie wzbogacania hodowli, separacji immunomagnetycznej (IMS) i amplifikacji z wielokrotnym przemieszczeniem (MDA) pozwala na skuteczną koncentrację genomowego DNA Salmonelli z próbek żywności i środowiska.

Analiza quasi-metagenomiczna salmonelli z próbek żywności i środowiska

Tutaj przedstawiamy zasadę, strukturę i instrukcję inteligentnego, wysokoprzepustowego systemu testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów. Jego zastosowanie ilustruje przykład Salmonelli wyizolowanej z drobiu w Shandong w Chinach. Obliczany jest indeks Lar, a jego znaczenie w ocenie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest szczegółowo omawiane.

Zastosowanie inteligentnego, wysokowydajnego systemu badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów oraz wskaźnika Lar oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Dokładne określenie ilościowe Salmonelli u drobiu na niskich poziomach jest aktualnym wyzwaniem przemysłowym i regulacyjnym. Protokół ten opisuje test MPN, który umożliwia ilościowe określenie salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach drobiowych. Metoda ta jest szybka, czuła i zgodna z wytycznymi FSIS, zwiększając bezpieczeństwo żywności i wspierając wysiłki na rzecz zdrowia publicznego.

Zmodyfikowany test liczbowy "Najbardziej prawdopodobny" w celu ilościowego określenia salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach z kurczaka

Poznaj metodę LAMP do szybkiego wykrywania Salmonelli w karmie zwierzęcej. Ta technika izotermicznej amplifikacji oferuje krótszy czas badania i niższy wskaźnik fałszywie ujemnych wyników niż tradycyjna PCR.

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli (Wideo) | JoVE Journal

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli

Przeglądaj więcej filmów