Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli
20 maja 2020
Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to test izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych (iNAAT), który wzbudził szerokie zainteresowanie w dziedzinie wykrywania patogenów. W tym miejscu przedstawiamy zatwierdzony przez wiele laboratoriów protokół Salmonella LAMP jako szybką, niezawodną i solidną metodę badań przesiewowych Salmonelli w żywności zwierzęcej i potwierdzania przypuszczalnej obecności Salmonelli w izolacji hodowli.
Ta metoda Salmonella LAMP została włączona do Bakteriologicznego Podręcznika Analitycznego FDA, zarówno jako metoda przesiewowa w karmie zwierzęcej, jak i metoda potwierdzania dla wszelkich przypuszczalnych izolatów Salmonelli. Metoda jest szybka, niezawodna i solidna. W porównaniu z PCR, jego główne zalety to szybkie testy, proste oprzyrządowanie, niski odsetek wyników fałszywie ujemnych i elastyczny przepływ pracy.
Szybkie badania przesiewowe w kierunku patogenów, takich jak salmonella, odgrywają ważną rolę w szybkim wykrywaniu potencjalnie skażonego produktu i mogą zapobiegać chorobom lub epidemiom u ludzi i zwierząt. Zacznij od przygotowania matryc DNA do testu LAMP. Istnieją dwa rodzaje próbek używanych do tworzenia matryc DNA.
Aby przygotować szablony z próbek pokarmu dla zwierząt, należy w asepcie zważyć 25 gramów próbki żywności w sterylnym worku filtrującym. Dodaj 225 mililitrów sterylnej buforowanej wody peptonowej do torebki i inkubuj w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji przenieść jeden mililitr z przefiltrowanej strony worka do mikroprobówki wirówkowej.
Odwirować probówkę o temperaturze 900 razy G przez jedną minutę. Następnie przenieść supernatant do nowej mikroprobówki wirówkowej. Odwirować próbkę w temperaturze 16 000 razy G przez dwie minuty.
Aby odrzucić supernatant, ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach odczynnika do przygotowania próbki i podgrzej go w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut w suchym bloku grzewczym. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej i przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Drugi rodzaj próbki do tego testu LAMP pochodzi bezpośrednio z przypuszczalnych kultur salmonelli.
Aby przygotować matryce DNA, przenieś 500 mikrolitrów nocnej kultury salmonelli do mikroprobówki wirówkowej i podgrzewaj ją w bloku grzewczym o temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej i przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, należy fizycznie oddzielić obszary używane do przygotowania LAMP Master Mix i dodania matryc DNA.
Oczyść powierzchnie robocze izopropanolem i roztworem rozkładającym DNA i DNA. Następnie wyczyść pipety i uchwyty pasków probówek. Rozmrozić izotermiczny Master Mix, 10X Primer Mix, wodę molekularną, DNA kontroli pozytywnej i matryce DNA w temperaturze pokojowej.
Włącz przyrząd LAMP i wprowadź odpowiednie sample informacje. Przygotować LAMP Master Mix zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, zwirować i krótko odwirować, a następnie rozprowadzić 23 mikrolitry Master Mix do każdego dołka paska probówki. Zwiruj wszystkie matryce DNA i krótko je odwiruj.
Następnie dodaj dwa mikrolitry matrycy DNA do odpowiedniego dołka i szczelnie zakryj studzienkę. Wyjmij pasek probówki z uchwytu i potrząśnij nim, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki zebrały się na dnie probówki. Załaduj taśmę rurową do przyrządu LAMP i rozpocznij pracę LAMP.
Podczas gdy reakcja LAMP jest w toku, dotknij kart Temperatura, Amplifikacja i Wyżarzanie, aby zobaczyć dynamiczne zmiany różnych parametrów podczas przebiegu LAMP. Wyniki LAMP można przeglądać na tablicy wskaźników LAMP w czasie rzeczywistym lub za pomocą oprogramowania LAMP. Aby zinterpretować wyniki na tablicy wskaźników, otwórz interesujący Cię przebieg LAMP.
Obserwuj pięć kart skojarzonych z każdym uruchomieniem. Zakładki Profil i Temperatura pokazują zaprogramowane i rzeczywiste temperatury w studzienkach na próbki w miarę postępu reakcji LAMP. Zakładki Amplifikacja i Wyżarzanie pokazują odczyty fluorescencji i zmiany fluorescencji odpowiednio podczas fazy amplifikacji i wyżarzania.
Zakładka Wyniki pokazuje tabelaryczny widok wyników LAMP, które można interpretować zgodnie ze wskazówkami manuskryptów. Drugim sposobem przeglądania wyników LAMP jest użycie oprogramowania LAMP. Aby zinterpretować wyniki za pomocą oprogramowania, kliknij ikonę Komputer na lewym panelu i przejdź do lokalizacji pliku, aby załadować interesujący Cię przebieg LAMP.
Zwróć uwagę na siedem kart skojarzonych z każdym uruchomieniem. Zakładki Profil i Temperatura pokazują zaprogramowane i rzeczywiste temperatury w studzienkach na próbki w miarę postępu reakcji LAMP. Zakładki Amplification (Szybkość wzmocnienia) i Amplification Rate (Szybkość wzmocnienia) pokazują odczyty fluorescencji i zmiany fluorescencji w fazie amplifikacji.
Zakładki Wyżarzanie i Pochodna wyżarzania pokazują odczyty fluorescencji i zmiany fluorescencji podczas fazy wyżarzania. Na karcie Wyniki wyświetlany jest tabelaryczny widok wyników LAMP. Istnieją cztery kolumny zatytułowane Nazwa wykresu, Numer studni, Nazwa studni i Wartość szczytowa.
Pokazano czas wzmacniacza i pochodne wyżarzania wszystkich ośmiu próbek. Wyniki mogą być interpretowane zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Tablica przyrządów LAMP i oprogramowanie LAMP mogą być używane do wyświetlania wyników testu.
W tym przebiegu LAMP próbki od S1 do S6 są dziesięciokrotnymi seryjnymi rozcieńczeniami serowara Salmonella enterica Infantis ATCC 51741, w zakresie od 1,1 miliona do 11 jednostek tworzących kolonie na reakcję. Kontrolą pozytywną lub PC jest Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 w ilości 17 000 jednostek tworzących kolonie na reakcję, a kontrola bez matrycy lub NTC to woda o jakości molekularnej. Studzienka NTC ma ślepą próbę Tmax i temperaturę anealu wynoszącą około 81 stopni Celsjusza na tablicy przyrządów LAMP oraz ślepą wartość Tmax i pustą temperaturę wyżarzania w oprogramowaniu LAMP.
Studzienka kontroli dodatniej ma Tmax wynoszący siedem minut i 45 sekund oraz temperaturę wyżarzania około 90 stopni Celsjusza na obu platformach. Próbki od S1 do S6 mają Tmax od sześciu minut do 30 sekund oraz 12 minut i 15 sekund, a temperatura wyżarzania wynosi około 90 stopni Celsjusza, co wskazuje na pozytywne wykrycie. LAMP jest bardzo skuteczny i generuje dużą ilość DNA.
Dlatego tak ważne jest, aby stosować najlepsze praktyki laboratoryjne w celu zapobiegania zanieczyszczeniu krzyżowemu. Stosuj podobne praktyki podczas tworzenia szablonów DNA, ponieważ wzbogacenia z zanieczyszczonej żywności zwierzęcej mogą mieć wysoki poziom salmonelli. Dodatnie wyniki badania przesiewowego próbki żywności dla zwierząt za pomocą LAMP należy potwierdzić poprzez izolację kultury zgodnie z procedurami zawartymi w Podręczniku Analizy Bakteriologicznej FDA.
Próbki ujemne mogą być zgłaszane jako takie. Włączenie tej metody LAMP do Bakteriologicznego Podręcznika Analitycznego FDA otwiera drogę do szerszego zastosowania tej szybkiej, solidnej i przyjaznej dla użytkownika technologii w testach bezpieczeństwa żywności.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zweryfikowany protokół amplifikacji izotermicznej z pętlą (LAMP) do szybkiego wykrywania Salmonella w żywności pochodzenia zwierzęcego. Metoda oferuje zalety w porównaniu z tradycyjną techniką PCR, w tym szybsze wyniki i niższy wskaźnik wyników fałszywie ujemnych, co czyni ją niezawodnym narzędziem do identyfikacji potencjalnego zanieczyszczenia.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Wykrywanie patogenów
- Amplifikacja kwasów nukleinowych
- Bezpieczeństwo żywności
Tło
- Znaczenie szybkiego wykrywania patogenów w produktach spożywczych
- Potrzeba niezawodnych metod przesiewowych dla Salmonella
- Ograniczenia tradycyjnych metod PCR
Zastosowane metody
- Amplifikacja izotermiczna z pętlą (LAMP)
- Salmonella spp.
- Zastosowanie specyficznych protokołów przygotowania DNA
Główne wyniki
- Wykazanie skuteczności LAMP w wykrywaniu Salmonella
- Podkreślenie niskiego wskaźnika wyników fałszywie ujemnych metody
- Weryfikacja poprzez porównanie wielolaboratoryjne
Wnioski
- Badanie ustanawia LAMP jako wiarygodną metodę przesiewową i potwierdzającą obecność Salmonella w produktach spożywczych.
- Podkreśla znaczenie szybkich testów w celu zwiększenia bezpieczeństwa żywności i zapobiegania ryzyku zdrowotnemu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid pathogen detection in animal food is critical for preventing contamination events that could impact both animal and human health. The LAMP method provides a reliable, inhibitor-tolerant nucleic acid test that supports timely screening and confirmation workflows in food safety testing. Its incorporation into the FDA BAM underscores its value as a standardized, deployable tool for biopharma and food safety laboratories seeking to reduce false negatives and accelerate decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of Salmonella presence in complex matrices like animal food enrichments.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing of contamination risk without requiring culturing timelines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for real-time monitoring of amplification kinetics.
- Operational Value: Delivers results in as little as 5 minutes with tolerance to inhibitors commonly found in food or culture samples.
- Strategic Value: Facilitates high-throughput screening readiness due to simple instrumentation and minimal hands-on time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms presumptive isolates from culture, bridging phenotypic and genotypic detection methods.
- Operational Value: Uses standardized DNA preparation protocols applicable to both food enrichment broths and pure cultures.
Pipeline & Workflow Integration
The LAMP method fits within food safety testing workflows as a rapid screening tool followed by culture-based confirmation when positive, supporting a tiered testing strategy.
- Discovery Biology: Enables early detection of Salmonella in pre-enriched animal food samples to inform hazard assessment.
- Screening: Provides inhibitor-resistant amplification suitable for complex food matrices after enrichment.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence data with defined Tmax and annealing temperature thresholds for result interpretation.
- Translational Research: Confirms LAMP-positive results via culture isolation, ensuring continuity between molecular and phenotypic validation.
- Enterprise Reuse: Compatible with existing LAMP instruments and software, allowing reuse across multiple sample types and laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High specificity via invA gene targeting reduces false positives in pathogen detection.
- Operational Value: Simple workflow with minimal equipment needs (heat block, centrifuge, LAMP instrument) increases accessibility.
- Strategic Value: Low false-negative rate improves confidence in negative results, supporting release decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of samples for further testing, optimizing resource use in safety programs.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic sample preparation and DNA template generation from enrichment broths or cultures.
- Needs access to a LAMP-capable fluorometer or real-time isothermal amplification instrument.
- Demands standardized reagent handling, including primer mixes and master mix preparation per manufacturer guidelines.
- Requires physical separation of master mix preparation and template addition zones to prevent amplicon contamination.
- Relies on proper cold storage (-20°C) of prepared DNA templates to maintain integrity between extraction and amplification.
