Preparat ekstraktu białkowego i koimmunoprecypitacja z Caenorhabditis elegans

Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku pobierania próbek, przygotowania ekstraktu i immunoprecypitacji w celu potwierdzenia udanego ściągania białka i wykrycia interesujących białek współimmunostrąconych. Preparat ekstraktu białkowego może być wykonywany dla maksymalnie 24 próbek i jest kompatybilny z wieloma dalszymi zastosowaniami, w tym z immunoprecypitacją i eksperymentami z RNA pull-down. Metoda ta może być dostosowana w celu ułatwienia badania interakcji między dwoma lub więcej endogennymi, endogennie znakowanymi lub nadmiernie eksprymowanymi białkami C.elegans w różnych tłach genetycznych.

Wizualna demonstracja tego protokołu ma na celu sprawienie, aby naukowcy poczuli się komfortowo z przygotowywaniem ekstraktu białkowego i immunoprecypitacją, miejmy nadzieję, zachęcając tych, którzy są nowicjuszami w tych technikach, do wykorzystania ich w swoich badaniach. Aby pobrać próbkę robaka, najpierw wysiewaj robaki w stadium mieszanym lub zsynchronizowanym na stałych płytkach pożywki wzrostowej nicieni w wymaganej temperaturze i pozwól robakom rosnąć do pożądanego etapu. Pod koniec inkubacji użyj buforu M9, aby umyć robaki do 15-mililitrowej stożkowej rurki i osadzać robaki przez odwirowanie.

Pod koniec wirowania usunąć supernatant i umyć robaki dodatkowo trzy do pięciu razy w świeżym buforze M9 na przemycie. Gdy supernatant nie jest już mętny, wykonaj ostatnie płukanie wodą podwójnie destylowaną i przenieś luźne osady robaków do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. Osadzać robaki za pomocą dodatkowego wirowania i wyrzucić pozostały supernatant, aby uzyskać upakowaną osadkę robaka.

Aby przygotować ekstrakt z zebranego osadu robaka, dodaj równą objętość lodowatego buforu do lizy 2X do zalecanej objętości 300 mikrolitrów i energicznie wymieszaj powstałą zawiesinę. Zakręć próbkę, aby zebrać mieszaninę na dnie probówki i przenieś zawartość probówki do 1,5 mililitrowej probówki wolnej od RNAzów zawierającej metalowe kulki. Po szczelnym zamknięciu probówki umieścić próbkę w homogenizatorze w młynku perełkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zwracając uwagę, aby próbka była zrównoważona wewnątrz homogenizatora.

Homogenizować próbkę z najwyższą prędkością przez cztery minuty przed przeniesieniem próbki do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej bez kulek. Odwirować próbkę, aby sklarować ekstrakt białkowy i przenieść supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki na lodzie bez przenoszenia białego, mętnego osadu na wierzch próbki. Odłożyć na bok 10 mikrolitrów oczyszczonego ekstraktu w celu określenia całkowitego stężenia białka zgodnie ze standardowymi protokołami i natychmiast rozcieńczyć próbkę do pięciu lub 10 miligramów białka na mililitr lodowatego buforu do lizy 1X na lodzie.

W celu immunoprecypitacji interesującego białka należy najpierw ponownie zawiesić kulki magnetyczne przez odwrócenie i przenieść 150 mikrolitrów zawiesiny kulek 50X do rurki o pojemności 1,5 mililitra. Namagnesuj koraliki na lodzie na stojaku magnetycznym przez około minutę. Gdy roztwór jest klarowny, należy wyrzucić sklarowany nad osadem.

Wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego i umyj kulki trzema 300 mikrolitrami objętości buforu do lizy 1X. Po ostatnim praniu ponownie zawieś kulki w 150 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy i przenieś 75 mikrolitrów zawiesiny kulek na dwa miligramy próbki ekstraktu białkowego. Po godzinnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem umieścić probówkę z próbką w magnesie na lodzie na około jedną minutę.

Gdy kulki są w pełni namagnesowane, a próbka jest czysta, przenieś supernatant do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra, nie naruszając kulek. Odłóż na bok 10% próbki do analizy Western blot i dodaj 20 mikrogramów oczyszczonego przeciwciała o powinowactwie do wstępnie oczyszczonego lizatu na jednogodzinną inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem. Pod koniec inkubacji dodać pozostałe 75 mikrolitrów wstępnie umytej zawiesiny kulek do mieszaniny lizatu przeciwciał na dodatkową godzinną inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem.

Pod koniec inkubacji umieść próbkę z powrotem na magnesie na około jedną minutę. Gdy kulki są w pełni namagnesowane, a próbka jest czysta, umyj kulki zawierające immunoprecypitat trzykrotnie w 450 mikrolitrach buforu do przemywania na lodzie. Po ostatnim praniu ponownie zawieś granulkę kulki w 20 mikrolitrach buforu ładującego żel białkowy 2X SDS beta-merkaptoetanol i gotuj próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

W celu wykrycia białek immunoprecypitowanych za pomocą analizy Western blot, należy załadować zdenaturowaną próbkę białka do żelu SDS-PAGE bez przenoszenia kulek i przeprowadzić analizę Western blot zgodnie ze standardowymi protokołami przy użyciu odpowiednich przeciwciał dla interesujących białek, a następnie wykryć prążki za pomocą chemiluminescencji opartej na peroksydazie chrzanowej. Zademonstrowany protokół homogenizatora w młynie perełkowym jest porównywalny pod względem całkowitej ekstrakcji białek z metodami opartymi na dounce w celu efektywnej ekstrakcji białek jądrowych i cytoplazmatycznych. W tej analizie ustalono, że białka Argonaute oddziałują z członkami rodziny białek GW182, tworząc indukowane mikroRNA kompleksy wyciszające, które wiążą się z docelowymi informacyjnymi RNA i hamują ich ekspresję.

Zademonstrowane protokoły ekstrakcji i immunoprecypitacji mogą być również wykorzystane do skutecznego odzyskiwania koimmunoprecypitatów specyficznych dla ALG-1 i HRPK-1. Ponadto testy interakcji ALG-1:AIN-1 w różnych tłach genetycznych wykazały, że HRPK-1 nie jest potrzebny do składania kompleksu wyciszającego indukowanego przez ALG-1:AIN-1. Ważne jest, aby upewnić się, że ekstrakcja białek i immunoprecypitacja są przeprowadzane w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na lodzie, aby utrzymać stabilność próbek.

Ten preparat z ekstraktem białkowym jest kompatybilny z eksperymentami immunoprecypitacji białek i ściągania mikroRNA przy użyciu komplementarnego oligonukleotydu mikroRNA i ułatwia dalsze pobieranie zarówno składników białka, jak i RNA.