Name: Model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Poznaj model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do badania łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni. Ta metoda pozwala ocenić zmiany behawioralne i fizjologiczne po TBI.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy R. Gettensowi, N. St. Johnsowi, P. Bennetowi i J. Robsonowi za ich wkład w rozwój modelu TBI. Granty NARSAD dla młodych badaczy z Brain & Behavior Research Foundation (F.P. i M.J.R.), grant badawczy z Darrell K. Royal Research Fund for Alzheimer's Disease (F.P.) oraz PhRMA Foundation Award (M.J.R.) wsparły te badania. Praca ta była wspierana przez stypendia przeddoktoranckie Amerykańskiej Fundacji Edukacji Farmaceutycznej (A.F.L i B.P.L.).

Protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Cincinnati i Uniwersytetu Zachodniej Wirginii. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) i zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami Przewodnika Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych.
1. Instalacja zestawu TBI do obróbki strumieniowo-ściernej
<ol>
	<li>Zaopatrz się we wszystkie części robocze, które są wymagane do konfiguracji, w tym: rurę amortyzującą składającą się ze stalowej sekcji napędzanej i sterownika, membranę poliestrową, zabezpieczające, czujniki ciśnienia, osłonę rury z polichlorku winylu (PVC) chroniącą narządy obwodowe, przewód hydrauliczny wysokiego ciśnienia 9,53 mm i szybkozłączki męskie i żeńskie, reduktor gazu o wysokim przepływie oraz butlę z gazem ze wspornikiem do montażu na ścianie (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A, B i Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Specyfikacje sekcji napędzanej i sterującej użytej tutaj (patrz <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2 i Tabela materiałów) zostały ustalone w celu wytworzenia spójnej, krótkotrwałej, skalowanej fali uderzeniowej (patrz <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3C, D) w celu wywołania łagodnego do umiarkowanego TBI u myszy. W tym celu wybrano krótką sekcję zabieraka o konstrukcji stożkowej (stożek 6°). Długość i średnicę sekcji napędzanej i sterującej można modyfikować w celu zbadania fali uderzeniowej29,30,31,32, compression wave18, lub shock wave dynamics33. W przypadku eksperymentów na szczurach wymiary rurki uderzeniowej muszą być dostosowane tak, aby uzyskać porównywalne siły zgodnie z odpowiednimi parametrami skalowania ciała17 (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Zainstaluj poszczególne części robocze zestawu na stołach przesuwnych maszyny, które są zamocowane na stabilnej, łatwej do czyszczenia powierzchni (najlepiej ze stali nierdzewnej do stosowania u gryzoni) w przestrzeni laboratoryjnej zatwierdzonej do eksperymentów na zwierzętach. 
	UWAGA: Eksperymenty z falą uderzeniową wytwarzają znaczny poziom hałasu; Dlatego wybierz miejsce w dźwiękochłonnej przestrzeni laboratoryjnej, w którym hałas nie będzie przeszkadzał innym eksperymentom/grupom laboratoryjnym.
	<ol>
		<li>Zamocuj osłonę rury PVC prostopadle do układu rurki uderzeniowej, tak aby ciało gryzonia było całkowicie zakryte i wystawała tylko głowa. 
		UWAGA: W przypadku opisanej tutaj standardowej procedury wywoływania łagodnego do umiarkowanego TBI, środek głowy znajduje się 5 cm od końca napędzanej sekcji u myszy.</li>
		<li>Butla gazowa do montażu na ścianie w pobliżu konfiguracji zgodnie z OSHA i wszystkimi innymi odpowiednimi przepisami bezpieczeństwa. 
		UWAGA: Sprężone powietrze, hel lub azot są powszechnie używane do generowania fal uderzeniowych w modelach rur uderzeniowych gryzoni. Wszystkie przedstawione tutaj dane zostały wygenerowane przy użyciu helu, ponieważ gaz ten wytwarza wyższe nadciśnienie w krótszym czasie34, co pozwala na odpowiednie skalowanie dla badanych myszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena konfiguracji i właściwości fali uderzeniowej za pomocą nagrań z czujnika ciśnienia.
<ol>
	<li>Przygotuj rurkę uderzeniową.
	<ol>
		<li>Ostrożnie przeciąć membranę poliestrową bez zginania i tworzenia pęknięć, aby zapewnić równomierne pękanie.</li>
		<li>Włóż membranę między sekcję napędzaną a część sterownika. Zabezpiecz sekcje, dokręcając łączące.</li>
		<li>Sprawdź, czy system jest szczelny, a membrana jest szczelnie zamocowana między sekcją sterownika a sekcją napędzaną.</li>
		<li>Podłącz zbiornik gazu za pomocą wysokociśnieniowego węża hydraulicznego 9,53 mm i szybkozłączek do rury amortyzatora 
		UWAGA: Sekcje napędowe i napędzane są obrabiane z zachowaniem precyzyjnych tolerancji, aby zapewnić pełne uszczelnienie membrany między sekcjami. Pozwala to na brak wycieków gazu i wyklucza stosowanie jakiejkolwiek formy materiału uszczelki/o-ringu oraz pozwala na większą spójność generowanego kształtu fali.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj czujniki ciśnienia do monitorowania fal uderzeniowych (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1C).
	<ol>
		<li>Umieść jeden czujnik ciśnienia w obszarze umieszczenia głowicy, a trzy czujniki na wyjściu rurki uderzeniowej (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C i 2).</li>
		<li>Rozpocznij nagrywanie z czujników ciśnienia, tuż przed wykonaniem fali uderzeniowej. Rejestruj dane dotyczące fal ciśnienia z prędkością 500 000 klatek na sekundę za pomocą kondycjonera sygnału czujnika i karty akwizycji danych (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Nosić nauszniki zatwierdzone przez OHSA, aby zapewnić odpowiednią ochronę słuchu.</li>
		<li>Całkowicie otwórz główny zawór zbiornika sprężonego gazu, aby przepływ gazu wytworzył nagły, szybki skok ciśnienia. 
		UWAGA: Nadciśnienie gazu rozrywa membranę poliestrową, uwalniając falę uderzeniową, która przechodzi w falę ściskającą w sekcji napędzanej i wychodzi z rurki w kierunku obszaru umieszczenia głowicy.</li>
		<li>Natychmiast po zabiegu należy wyłączyć dopływ gazu. 
		UWAGA: Zestaw może być wyposażony w zawór ze sprężyną powrotną, który automatycznie i szybko zatrzymuje przepływ gazu.</li>
		<li>Analizuj nagrania fal ciśnienia za pomocą niestandardowego napisanego programu komputerowego, aby określić szczytowe nadciśnienie i wykres danych. Dane mogą być przedstawiane na wykresach z każdym czujnikiem osobno lub nakładane na siebie, aby zademonstrować płaskość generowanej fali (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3C,D). 
		UWAGA: Technicznie rzecz biorąc, analizę można przeprowadzić przy użyciu łatwiej dostępnego oprogramowania, ale ze względu na duże zbiory danych programy te mają duże opóźnienia w generowaniu wykresów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustal warunki eksperymentalne, które są odpowiednie dla celu wyznaczonego badania TBI i potwierdź, że model wytwarza stałą falę uderzeniową o szczytowym nadciśnieniu, czasie trwania i pomiarze impulsu porównywalnym z falą Friedlandera (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Sprawdź te parametry za pomocą wyżej wymienionego oprogramowania komputerowego.
	<ol>
		<li>Skalibruj konfigurację, powtarzając kroki od 2.1.1. do 2.2.5. i użyj zapisów fal ciśnienia, aby określić, czy konfiguracja wymaga regulacji (dla reprezentatywnych danych patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Zmodyfikuj konfigurację (w razie potrzeby). 
		UWAGA: Właściwości fali uderzeniowej można dostosować poprzez drobne modyfikacje konfiguracji. Na przykład odległość głowicy od końca napędzanej sekcji wpływa na siłę fali uderzeniowej na poziomie głowicy. Grubość membrany poliestrowej określa poziom szczytowego nadciśnienia, przy czym grubsze membrany zwiększają poziomy szczytowe (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3A,B). Dodatkowo konfiguracja pozwala wybrać kierunek, w którym fala uderzeniowa uderza/przenika do głowy (tj. czołowo, z boku, na górze lub pod spodem), dzięki czemu można badać różne aspekty, takie jak uraz spowodowany samą falą uderzeniową lub w połączeniu z obrażeniami spowodowanymi przez szybkie siły obrotowe.</li>
		<li>Powtórz kroki od 2.1.1 do 2.2.4, aby ustalić pożądane właściwości fali uderzeniowej (jeśli jest to konieczne) i kontrolować odtwarzalność.</li>
		<li>Powtórz kroki od 2.1.1 do 2.2.4 z membranami poliestrowymi o różnej grubości, aby ocenić skalowalność konfiguracji (dla reprezentatywnych danych patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3A,B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie zestawu doświadczalnego i indukcja łagodnego TBI u gryzoni
UWAGA: Przenieś gryzonie do obszaru przetrzymywania 30 minut do 1 godziny przed rozpoczęciem eksperymentów TBI, aby się zaaklimatyzować. Wybierz obszar trzymania, na który minimalnie wpływa hałas zabiegu.
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie materiały potrzebne do eksperymentu i sprawdź konfigurację pod kątem prawidłowej instalacji (np. Dostosuj parametry zgodnie z celem badania) (~5 – 10 minut). 
	UWAGA: Stopień obrażeń można dostosować, wybierając grubość membrany poliestrowej. Na podstawie naszych badań, grubość membrany od 25,4 do 102 μm jest stosowana do łagodnego do umiarkowanego TBI u myszy35. Wcześniej używaliśmy membran o grubości od 76,2 do 127 μm do wytwarzania łagodnego do umiarkowanego TBI u szczurów19.
	<ol>
		<li>Ostrożnie odetnij membranę poliestrową, włóż ją między sekcję napędzaną i napędową i zabezpiecz, dokręcając łączące.</li>
		<li>Podłącz zbiornik gazu do rurki amortyzatora za pomocą szybkozłączek. Upewnij się, że membrana jest szczelnie zamocowana między sekcją napędową a napędzaną.</li>
		<li>Umieść trzy czujniki ciśnienia na wyjściu rurki uderzeniowej, w odległości 120° od siebie, aby monitorować właściwości fali uderzeniowej podczas indukcji TBI, jak opisano w krokach 2.2.2 i 2.2.5.</li>
		<li>Upewnij się, że odległość od końca rurki uderzeniowej jest prawidłowa dla każdego obiektu za pomocą zainstalowanego mikrometru. Utrzymuj stałą pozycję głowy gryzonia (tj. pozycję, odległość) w badaniach, aby umożliwić spójną ocenę urazu. 
		UWAGA: Jak stwierdzono w 1.2.1., różne rodzaje urazów można wywołać, wybierając kierunek, w którym fala uderzeniowa uderza w głowę. W opisanej tutaj procedurze wywoływania łagodnego do umiarkowanego TBI, ciało umieszcza się prostopadle do rurki uderzeniowej, w którą fala uderzeniowa uderza w bok głowy. W tym ustawieniu głowa ma swobodę ruchów, a zatem jest wystawiona na działanie fali uderzeniowej i szybkich sił obrotowych, co pozwala na generowanie efektów zamachu i kontrataku.</li>
		<li>Zainicjuj rejestrację z czujników ciśnienia za pomocą graficznego interfejsu użytkownika (GUI) oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie i ułożenie gryzoni w konfiguracji
	<ol>
		<li>Przenieś gryzonie z pomieszczenia przetrzymywania i wywołaj znieczulenie za pomocą 4% izofluranu w tlenie i utrzymuj za pomocą 2% izofluranu w tlenie, aby zmniejszyć stres i ból. 
		UWAGA: Przed kontynuowaniem upewnij się, że zwierzę nie reaguje na szczypanie palca u nóg lub ogona. Upewnij się, że indukcja znieczulenia jest spójna dla wszystkich zwierząt doświadczalnych, w tym dla pozorowanych grup kontrolnych. Ta procedura wymaga niskiego poziomu i krótkiego czasu znieczulenia.</li>
		<li>Umieść w pełni znieczulonego gryzonia w osłonie rury PVC z amortyzacją, aby chronić narządy obwodowe przed falą uderzeniową. 
		UWAGA: Osoby kontrolne są znieczulane i umieszczane w pobliżu zestawu, ale nie są bezpośrednio poddawane działaniu fali uderzeniowej. Upewnij się, że elementy sterujące są narażone na hałas generowany przez rurkę uderzeniową.</li>
		<li>Umieść głowę gryzonia w obszarze ułożenia głowy i podeprzyj ją od dołu, za pomocą podpory wbudowanej bezpośrednio w aparat ekranujący lub gaziku. Określ ułożenie głowy zgodnie z anatomią każdego gryzonia, z kłykciem potylicznym wyrównanym z krawędzią osłony ochronnej. 
		UWAGA: Unikaj kierowania fali ciśnienia bezpośrednio w kierunku pnia mózgu, aby zmniejszyć śmiertelność. Wiadomo, że uraz centrum oddechowego pnia mózgu i rdzenia kręgowego szyjnego przyczynia się do nieprawidłowości oddychania, a nawet śmierci w modelach gryzoni TBI36,37,38.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Narażenie gryzoni na falę uderzeniową.
	<ol>
		<li>Szybko otwórz główny zawór zbiornika sprężonego gazu, aby wytworzyć skok ciśnienia, który rozrywa membranę i wytwarza głośną eksplozję, która potwierdza powstanie fali ciśnienia. Membrana zostanie wizualnie pęknięta po usunięciu po eksperymencie. 
		UWAGA: Szybka kamera może być użyta do uchwycenia skutków przewrotu i odzysku przyspieszenia obrotowego doświadczanego przez gryzonia w celu dalszej analizy.</li>
		<li>Wyłącz dopływ gazu natychmiast po usłyszeniu eksplozji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powrót do zdrowia po ekspozycji na falę uderzeniową
	<ol>
		<li>Po wystawieniu na działanie fali uderzeniowej wyjmij gryzonia z aparatu i umieść go na płaskiej powierzchni bezpośrednio przylegającej do rurki uderzeniowej po ich boku.</li>
		<li>Monitoruj pacjentów, aby określić czas odruchu prostowania (RRT). Użyj stopera, aby zarejestrować czas od ekspozycji na falę uderzeniową, aż odzyskają naturalny odruch prostowania. (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
		<li>Gdy tylko badani odzyskają odruch prostowania, umieść ich w odpowiedniej klatce domowej, gdzie są monitorowani pod kątem działań niepożądanych (tj. drgawek, trudności w oddychaniu, krwawienia z otworu ciała) przez następne 24 godziny.</li>
		<li>Po początkowym okresie monitorowania osoby badane mogą być analizowane przy użyciu różnych testów biochemicznych, neuropatologicznych, neurofizjologicznych i behawioralnych wybranych przez badacza (patrz poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj konfigurację i miejsce na następny eksperyment.
	<ol>
		<li>Wyczyść konfigurację detergentem, aby usunąć nieprzyjemny zapach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dalsze zastosowania dla gryzoni narażonych na działanie fal uderzeniowych/sił obrotowych i kontroli
UWAGA: W poprzednich badaniach, efekty łagodnego do umiarkowanego TBI w różnych punktach czasowych po ekspozycji na falę uderzeniową i siły rotacji były oceniane u gryzoni za pomocą dalszych zastosowań, w tym analiz biochemicznych, neuropatologicznych, neurofizjologicznych i behawioralnych19.
<ol>
	<li>Analiza biochemiczna
	<ol>
		<li>W określonych punktach czasowych eksperymentu (godziny do dni po łagodnym TBI) należy pobrać tkankę (np. mózg, krew) do analizy biochemicznej przy użyciu standardowych protokołów, jak opisano19.</li>
		<li>Wykorzystać tkankę do analizy biochemicznej (tj. immunoblottingu, ELISA itp.), aby ocenić wpływ łagodnego TBI na procesy neurobiologiczne i patofizjologiczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza neuropatologiczna
	<ol>
		<li>W określonych eksperymentalnych punktach czasowych (godziny do dni po łagodnym TBI) perfuzjuj gryzonie przezsercowo roztworem soli fizjologicznej, a następnie 4% roztworem paraformaldehydu, aby utrwalić tkankę zgodnie z opisem19. 
		UWAGA: Niektóre aplikacje nie są kompatybilne z utrwalaniem paraformaldehydu (np. barwienie srebrem, niektóre przeciwciała immunohistochemiczne).</li>
		<li>Użyj perfundowanej, utrwalonej tkanki do analiz anatomicznych, histologicznych i molekularnych, aby ocenić zmiany neuropatologiczne związane z łagodnym TBI, w tym zapalenie nerwów, neurodegenerację i zmiany neurochemiczne, jak opisano19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza neurofizjologiczna w wycinkach mózgu
	<ol>
		<li>W określonych punktach czasowych eksperymentu (godziny do dni po łagodnym TBI) złóż w ofierze gryzonie przez ścięcie, usuń mózg i przygotuj plasterki mózgu zgodnie z opisem19.</li>
		<li>Wykonaj zapisy elektrofizjologiczne zgodnie z opisem19, aby ocenić wpływ łagodnego TBI na podstawowe właściwości synaptyczne i plastyczność synaptyczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza behawioralna
	<ol>
		<li>W określonych eksperymentalnych punktach czasowych (godziny do dni po łagodnym TBI) oceń wydajność behawioralną, w tym funkcje motoryczne (np. otwarte pole, rotarod, aktywność lokomotoryczna; zobacz <silna klasa = "xfig">Rysunek 4D) oraz uczenie się i pamięć (np. warunkowanie strachu, labirynt Barnesa, labirynt wodny Morrisa).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Przedstawiamy tutaj przedkliniczny model łagodnego TBI, który jest opłacalny, łatwy do skonfigurowania i wykonania oraz pozwala na uzyskanie wysokowydajnych, wiarygodnych i powtarzalnych wyników eksperymentalnych. Model ten zapewnia osłonę ochronną narządów obwodowych, aby umożliwić ukierunkowane badanie łagodnych mechanizmów TBI, jednocześnie ograniczając zmienne zakłócające urazy ogólnoustrojowe. Natomiast inne modele wybuchów są znane z tego, że powodują uszkodzenia narządów obwodowych</su...

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) odpowiada za ponad dwa miliony wizyt w szpitalu każdego roku w samych Stanach Zjednoczonych. Łagodne TBI często wynikające z wypadków samochodowych, wydarzeń sportowych lub upadków stanowią około 80% wszystkich przypadków TBI1. Łagodne TBI jest uważane za "cichą chorobę", ponieważ pacjenci często nie doświadczają żadnych widocznych objawów w dniach i miesiącach następujących po początkowym znieważeniu, ale mogą rozwinąć poważne powikłania związane z TBI w późniejszym życiu2. Co więcej, łagodne TBI wywołane wybuchem jest powszechne wśród członków służby wojskowej i jest związane z przewlekłą dysfunkcją OUN3,4,5,6. Ze względu na rosnącą częstość występowania łagodnego TBI7,8, przedkliniczne modelowanie procesów neurobiologicznych i patofizjologicznych związanych z łagodnym TBI stało się zatem przedmiotem zainteresowania przy opracowywaniu nowych interwencji terapeutycznych w TBI.
Historycznie rzecz biorąc, badania nad TBI koncentrowały się głównie na ciężkich formach neurourazów, pomimo stosunkowo mniejszej liczby ciężkich przypadków TBI u ludzi. Opracowano przedkliniczne modele gryzoni dla ciężkiego TBI u ludzi, w tym modele kontrolowanego wpływu korowego (CCI)9,10 i płynne urazy udarowe (FPI)11, które są dobrze ugruntowane, aby dawać wiarygodne efekty patofizjologiczne12,13. Modele te położyły podwaliny pod to, co obecnie wiadomo o zapaleniu nerwów, neurodegeneracji i naprawie neuronów w TBI. Chociaż rozwinięto znaczną wiedzę na temat patofizjologii TBI, obecnie nie ma skutecznych, zatwierdzonych przez FDA metod leczenia TBI.
Ostatnio zakres badań nad TBI został poszerzony o szersze spektrum patologii związanych z TBI, a ostatecznym celem jest opracowanie skutecznych interwencji terapeutycznych. Niemniej jednak stworzono niewiele modeli przedklinicznych łagodnego TBI, które wykazały mierzalne efekty, a tylko niewielka liczba badań dotyczyła łagodnego spektrum TBI2,14,15. Ponieważ łagodne TBI stanowi zdecydowaną większość wszystkich przypadków TBI, pilnie potrzebne są wiarygodne modele łagodnego TBI, aby ułatwić badania nad etiologią i neuropatofizjologią stanu ludzkiego w celu opracowania nowych strategii terapeutycznych.
We współpracy z inżynierami biomedycznymi i fizykami lotniczymi ustaliliśmy skalowalny, zamknięty model fali uderzeniowej dla łagodnego do umiarkowanego TBI. Ten przedkliniczny model gryzoni został specjalnie opracowany w celu zbadania wpływu dynamiki siły, w tym fal uderzeniowych i ruchu przyspieszania/zwalniania, które są związane z łagodnym TBI u ludzi uzyskanym w walce wojskowej, imprezach sportowych, wypadkach samochodowych i upadkach. Ponieważ fale uderzeniowe korelują z dynamiką siły, która powoduje łagodne TBI u ludzi, model ten został zaprojektowany w celu wytworzenia spójnego kształtu fali Friedlandera z impulsem, który jest mierzony w funtach na cal kwadratowy (psi)*milisekunda (ms). Poziom impulsu jest skalowany tak, aby spadł poniżej zdefiniowanych krzywych śmiertelności płuc dla myszy i szczurów w celu przeprowadzenia badań przedklinicznych16,17,18. Ponadto model ten pozwala na badanie obrażeń spowodowanych gwałtownym ruchem sił obrotowych głowy zwierzęcia. Ten rodzaj urazu jest nieodłącznie związany z kilkoma typami klinicznych prezentacji TBI, w tym obserwowanymi zarówno w populacjach wojskowych, jak i cywilnych. Dlatego ten wszechstronny model wpisuje się w potrzebę, która obejmuje wiele klinicznych prezentacji TBI.
Prezentowany tutaj model przedkliniczny daje wiarygodne i powtarzalne zmiany patofizjologiczne związane z klinicznym łagodnym TBI, jak wykazano w wielu wcześniejszych badaniach17,19,20,21,22,23. Badania z tym modelem wykazały, że szczury poddane działaniu fali uderzeniowej o niskiej intensywności wykazywały zapalenie nerwów, uszkodzenie aksonów, uszkodzenie mikronaczyń krwionośnych, zmiany biochemiczne związane z uszkodzeniem neuronów oraz deficyty krótkotrwałej plastyczności i pobudliwości synaptycznej19. Jednak ten łagodny model TBI nie wywołał żadnych makroskopowych zmian neuropatologicznych, w tym uszkodzenia tkanek, krwotoku, krwiaka i stłuczenia19, które były powszechnie obserwowane w badaniach z użyciem umiarkowanych do ciężkich inwazyjnych modeli TBI10,24. Poprzednie badania19,21,22,23 wykazały, że ten model przedkliniczny może być wykorzystany do scharakteryzowania procesów neurobiologicznych i patofizjologicznych leżących u podstaw etiologii łagodnego i umiarkowanego TBI17,19,20,21,22,23. Model ten pozwala również na testowanie nowych związków i strategii terapeutycznych, a także identyfikację nowych, odpowiednich celów dla rozwoju skutecznych interwencji TBI19,21,22,23.
Ten model został opracowany do badania efektów wywołanych przez fale uderzeniowe, jak również szybkie siły rotacji na wyniki molekularne, komórkowe i behawioralne u gryzoni. Analogicznie do przedstawionego tutaj modelu fali uderzeniowej, opracowano szereg modeli przedklinicznych, które próbują podsumować łagodne do umiarkowanego TBI za pomocą fal nadciśnienia napędzanych gazem2,14,17,25,26,27,28. Niektóre z ograniczeń innych modeli obejmują: zwierzę jest przymocowane do noszy z siatki drucianej, a głowa jest unieruchomiona po uderzeniu; Narządy obwodowe są narażone na działanie fali oprócz mózgu, co tworzy zmienne zakłócające poliurazu; a modele są duże i nieruchome, co ogranicza zmianę i dostosowanie krytycznych parametrów do lepszych warunków modelowych przypominających ludzkie TBI.
Korzyści płynące z tej stacjonarnej, napędzanej gazem rury amortyzującej to stosunkowo niski koszt zakupu i kosztów eksploatacji, a także łatwość instalacji i użytkowania. Co więcej, konfiguracja pozwala na wysokowydajną pracę i generowanie kontrolowanych, powtarzalnych fal uderzeniowych oraz wyników in vivo zarówno u myszy, jak i szczurów. W celu kontroli stałych warunków testowych (tj. stałej fali uderzeniowej i nadciśnienia) zestaw jest wyposażony w czujniki ciśnienia. Zaletą tego modelu dla TBI jest skalowalność ciężkości urazu oraz to, że łagodne TBI jest indukowane za pomocą nieinwazyjnej procedury z zamkniętą głową. Szczytowe nadciśnienie i wynikające z niego uszkodzenie mózgu zwiększają się wraz z grubszymi membranami poliestrowymi w spójny, skalowalny sposób17. Możliwość skalowania nasilenia TBI na podstawie grubości błony jest użytecznym narzędziem do określenia poziomu, przy którym określone miary wyników (np. zapalenie nerwów) stają się widoczne. Zapewnienie osłony ochronnej dla narządów obwodowych umożliwia również ukierunkowane badanie łagodnych mechanizmów TBI poprzez unikanie lub zmniejszanie zmiennych zakłócających urazem ogólnoustrojowym, takich jak uszkodzenie płuc lub klatki piersiowej. Co więcej, taka konfiguracja pozwala wybrać kierunek, w którym fala uderzeniowa uderza/przenika w głowę (tj. czołowo, z boku, z góry lub pod spodem), a zatem można badać różne rodzaje zniewag wywołujących TBI. Opisana tutaj standardowa procedura wywoływania łagodnego do umiarkowanego TBI wykorzystuje ekspozycję boczną do oceny skutków uszkodzenia przez falę uderzeniową w połączeniu z urazem typu coup i contrecoup spowodowanym szybkimi siłami obrotowymi. Ponadto, w celu zbadania wyłącznie urazów spowodowanych wybuchem, w tym modelu można zastosować ekspozycję na falę uderzeniową od góry do dołu.

<table><tbody><tr><td>Wysokociśnieniowy wąż hydrauliczny 3/8 SAE</td><td>Eaton Aeroquip</td><td>R2-6-6-36M</td><td>Dostępne w Grainger</td></tr><tr><td>3/8'' Szybkozłączki żeńskie Wtyki żeńskie</td><td>Karcher</td><td>KAR 86410440</td><td></td></tr><tr><td>3/8'' Szybkozłączki męskie</td><td>Karcher</td><td>KAR 86410440</td><td></td></tr><tr><td>ANY-labirynt oprogramowanie do śledzenia wideo</td><td>Stoelting Co.</td><td>Oprogramowanie ANY-labirynt</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta membrana Mylar</td><td>ePlastics.com</td><td>POLYCLR0.003</td><td>http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Przezroczysta membrana Mylar sprzedawana jest w różnych grubościach. Wszystkie są sprzedawane przez dostawców wymienionych powyżej.</td></tr><tr><td>Złożony stół przesuwny (X2)</td><td>Grizzly Industrial</td><td>G5757</td><td></td></tr><tr><td>Zawór kulowy do kontroli gazu Deadman</td><td>Coneraco Inc.</td><td>71-502-01</td><td>"Apollo", dostępny w Grainger</td></tr><tr><td>Sterownik i sekcja napędzana (mysz)</td><td>własny projekt/produkcja</td><td>nie dotyczy</td><td>W celu uzyskania dalszych informacji prosimy o kontakt z autorami</td></tr><tr><td>Sterownik i sekcja napędzana (szczur)</td><td>własny projekt/produkcja</td><td>nie dotyczy</td><td>W celu uzyskania dalszych informacji prosimy o kontakt z</td></tr><tr><td>autorami Nauszniki przeciwhałasowe</td><td>3M</td><td>37274</td><td>Dostępne w Grainger</td></tr><tr><td>Reduktor gazu - Hi Flow 3500-600-580</td><td>Harris</td><td>3003539</td><td></td></tr><tr><td>Helium Gas</td><td></td><td>AirGas HE 300</td><td>Zbiorniki są dostępne w różnych rozmiarach</td></tr><tr><td>System znieczulenia wziewnego</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Moduł wejściowy</td><td>National Instruments</td><td>NI 9223</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>Zamówione przez lekarza weterynarii</td></tr><tr><td>Zegar laboratoryjny/stoper</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-550-352</td><td></td></tr><tr><td>Labview wersja 12.0</td><td>Oprogramowanie do pozyskiwania danych</td><td>National Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny wskaźnik zegarowy/mikrometr</td><td>Grizzly Industrial</td><td>G9849</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy zapisu ciśnienia</td></tr><tr><td>Regulator tlenu</td><td>Medline</td><td>HCS8725M</td><td></td></tr><tr><td>Komputer do przetwarzania danych</td><td></td> Rurki z polichlorku winylu Dell <td></td><td></td></tr><tr><td>- 25,4 mm</td><td>FORMUFIT</td><td>P001FGP-WH-40x3</td><td></td></tr><tr><td>Czujniki ciśnienia</td><td>PCB Piezotronics</td><td>102A05</td><td></td></tr><tr><td>Odbiornik Obudowa USB</td><td>National Instruments</td><td>DAQ-9171</td><td></td></tr><tr><td>Kondycjoner sygnału czujnika</td><td>PCB Piezotronics</td><td>482C</td><td></td></tr> <tr><td>seriesStół montażowy ze stali nierdzewnej NSF</td><td>Gridmann</td><td>GR06-WT2448</td><td></td></tr><tr><td>Klucz imbusowy z uchwytem T - 3/16'</td><td>'S& K</td><td>73310</td><td></td></tr></tbody></table>

model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni

Low-intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-head Mild Traumatic Brain Injury in Rodents

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) to duży problem zdrowia publicznego. Łagodne TBI jest najbardziej rozpowszechnioną formą neurotraumy i odpowiada za dużą liczbę wizyt lekarskich w Stanach Zjednoczonych. Obecnie nie ma zatwierdzonych przez FDA metod leczenia TBI. Zwiększona częstość występowania TBI wywołanego wybuchami w wojsku jeszcze bardziej uwypukla pilną potrzebę skutecznego leczenia TBI. W związku z tym nowe przedkliniczne modele zwierzęce TBI, które podsumowują aspekty TBI związanego z ludzkimi blastami, znacznie przyspieszą wysiłki badawcze nad procesami neurobiologicznymi i patofizjologicznymi leżącymi u podstaw łagodnego i umiarkowanego TBI, a także opracują nowe strategie terapeutyczne TBI.
Tutaj prezentujemy wiarygodny, powtarzalny model do badania molekularnych, komórkowych i behawioralnych skutków łagodnego do umiarkowanego TBI wywołanego blastem. Opisujemy krok po kroku protokół łagodnego TBI wywołanego wybuchem z zamkniętą głowicą u gryzoni przy użyciu konfiguracji laboratoryjnej składającej się z napędzanej gazem rurki uderzeniowej wyposażonej w piezoelektryczne czujniki ciśnienia w celu zapewnienia spójnych warunków testowych. Korzyści płynące z ustalonej przez nas konfiguracji to jej stosunkowo niski koszt, łatwość instalacji, łatwość obsługi i wysoka przepustowość. Dalsze zalety tego nieinwazyjnego modelu TBI obejmują skalowalność nadciśnienia piku wybuchu i generowanie kontrolowanych, powtarzalnych wyników. Odtwarzalność i znaczenie tego modelu TBI zostało ocenione w wielu dalszych zastosowaniach, w tym w analizach neurobiologicznych, neuropatologicznych, neurofizjologicznych i behawioralnych, wspierając wykorzystanie tego modelu do charakterystyki procesów leżących u podstaw etiologii łagodnego do umiarkowanego TBI.

Skalowalność układu fali uderzeniowej została przetestowana przy użyciu trzech różnych grubości membran: 25,4, 50,8 i 76,2 μm. Poziomy ciśnienia szczytowego oceniano w obszarze umieszczenia głowy oraz na wylocie aparatury rury uderzeniowej przy użyciu piezoelektrycznych czujników ciśnienia (patrz Rysunek 1 oraz Rysunek 2). Ciśnienia szczytowe wzrastały zgodnie z grubością membrany w obu lokalizacjach czujników (Rysunek 3A,B<...

Prezentujemy tutaj protokół modelu fali uderzeniowej dla gryzoni w celu zbadania neurobiologicznych i patofizjologicznych skutków łagodnego do umiarkowanego urazowego uszkodzenia mózgu. Stworzyliśmy zasilany gazem, laboratoryjny zestaw wyposażony w czujniki ciśnienia, co pozwala na niezawodne i powtarzalne generowanie łagodnych lub umiarkowanych urazowych uszkodzeń mózgu wywołanych wybuchem.

Model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of ...

Protokół ten powoduje nieinwazyjne uszkodzenie mózgu z zamkniętą głową, które podsumowuje ludzkie doświadczenie związane z kontuzją sportową lub narażeniem na wybuch na otwartym polu. Podstawową zaletą tego protokołu jest to, że pozwala na ruch głowy w celu uchwycenia zdarzeń przyspieszania/zwalniania nieodłącznie związanych z wieloma postaciami TBI. Model ten ma na celu podsumowanie ludzkiego doświadczenia z różnymi czynnikami TBI i pozwala na ocenę klinicznie istotnych następstw TBI.Ze względu na efekty przyspieszenia/spowolnienia modelu, odtwarzamy czynniki i doświadczenia nieodłącznie związane z powszechnymi postaciami TBI obserwowanymi klinicznie. Zacznij od nabycia wszystkich części roboczych potrzebnych do konfiguracji i zainstaluj je pojedynczo na stołach przesuwnych maszyny, zamocowanych na stabilnej, łatwej do czyszczenia powierzchni ze stali nierdzewnej w przestrzeni laboratoryjnej zatwierdzonej do eksperymentów na zwierzętach. Zamocuj osłonę rury PVC prostopadle do układu rurki amortyzującej, tak aby ciało zwierzęcia było całkowicie zakryte, pozwalając tylko na wystające głowę.Zamontuj butlę z gazem na ścianie w pobliżu instalacji, przestrzegając odpowiednich przepisów bezpieczeństwa. Po przygotowaniu wszystkich materiałów potrzebnych do eksperymentu, sprawdź konfigurację pod kątem prawidłowej instalacji, dostosowując parametry zgodnie z celem badania. Ostrożnie odetnij membranę poliestrową i włóż ją między sekcję napędzaną i zabierającą.Zabezpiecz go, dokręcając łączące. Umieść trzy czujniki ciśnienia na wyjściu rurki uderzeniowej pod kątem 120 stopni od siebie, aby monitorować właściwości fali uderzeniowej podczas indukcji TBI. Za pomocą mikrometru upewnij się, że odległość od końca aparatu z rurką uderzeniową jest prawidłowa dla każdego obiektu.Utrzymuj stałą pozycję głowy gryzonia w badaniach, aby umożliwić spójną ocenę obrażeń. Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika oprogramowania, zainicjuj rejestrację z czujników ciśnienia. Umieść w pełni znieczulonego gryzonia w osłonie rury PVC z amortyzacją, aby chronić narządy obwodowe przed falą uderzeniową.Umieść głowę w obszarze umieszczenia głowy i podpieraj się od dołu gazikiem. Określ ustawienie głowy zgodnie z anatomią każdego gryzonia z kłykciem potylicznym wyrównanym z krawędzią osłony ochronnej. Otwórz główny zawór zbiornika sprężonego gazu, aby wytworzyć skok ciśnienia, który rozrywa membranę i głośną eksplozję, która potwierdza wytworzenie fali ciśnienia.Membrana zostanie wizualnie pęknięta po usunięciu po eksperymencie. Wyłącz dopływ gazu natychmiast po usłyszeniu eksplozji. Wyjmij gryzonia z aparatu i połóż go na boku na płaskiej powierzchni bezpośrednio przylegającej do rurki uderzeniowej.Jak tylko odzyska odruch prostowania, umieść go w odpowiedniej klatce domowej i monitoruj go pod kątem działań niepożądanych przez następne 24 godziny. Wyczyść konfigurację detergentem, aby usunąć zapach i przygotuj się do następnego eksperymentu. Ciśnienia szczytowe wzrosły zgodnie z grubością membrany w obszarze umieszczenia głowicy i wyjściu aparatu z rurką uderzeniową, co pokazuje, że są one skalowalne.Myszy wystawione na działanie fali uderzeniowej wytworzonej za pomocą membrany o grubości 76,2 mikrometra wykazywały znaczny wzrost czasu odruchu prostowania w porównaniu z kontrolami pozorowanymi, co sugeruje, że ta fala uderzeniowa wywołuje utratę przytomności. W przeciwieństwie do tego, myszy wystawione na falę uderzeniową z membrany o średnicy 50,8 mikrometra nie wykazywały znaczącego wzrostu czasu odruchu prostowania, co wskazuje na łagodną postać TBI. Wystawienie na działanie fali uderzeniowej z membraną o średnicy 76,2 mikrometra spowodowało znaczny spadek temperatury ciała myszy z indukcją TBI w ciągu pierwszej godziny w porównaniu z ich pozorowanymi kontrolami, co sugeruje znaczący efekt fizjologiczny.Myszy poddane urazowemu uszkodzeniu mózgu z membraną o grubości 76,2 mikrometra wykazywały ostre, zależne od czasu zmniejszenie całkowitej masy ciała w ciągu jednego dnia po TBI w porównaniu z kontrolami pozorowanymi i znaczny spadek aktywności lokomotorycznej. Ważne jest, aby odpowiednio zabezpieczyć membranę w celu powtarzalnego generowania fali uderzeniowej. Przed eksperymentem in vivo fala uderzeniowa powinna zostać przechwycona i oceniona za pomocą czujników ciśnienia.Oceny neurologiczne, takie jak czas ostrego odruchu prostowania, lokomocja i/lub bardziej złożone behawioralne oceny funkcji poznawczych, można przeprowadzić zgodnie z protokołem TBI. Zapalenie nerwów i/lub neuropatologię można również ocenić za pomocą odpowiednich testów biochemicznych.

low-intensity-blast-wave-model-for-preclinical-assessment-closed-head

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiono metodę bocznego uderzenia płynnego (LFP), uznany model urazowego uszkodzenia mózgu u myszy. LFP spełnia trzy główne kryteria dla modeli zwierzęcych: poprawność, niezawodność i istotność kliniczną. Opisano procedurę składającą się z chirurgicznej kraniotomii, zamocowania adaptera oraz następującego po nich wywołania urazu, co prowadzi do powstania uszkodzeń ogniskowych i rozlanych.

Boczna perkusja płynowa: model urazowego uszkodzenia mózgu u myszy

Źródło: Logsdon, A. F.,  i wsp. Model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni. (2020)Ten film pokazuje indukcję łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu z zamkniętą głową w modelu mysim przy użyciu rurki do wstrząsu gazowego pod ciśnieniem. Wytworzona fala ciśnienia rozrywa membranę poliestrową, dostarczając falę uderzeniową do głowy myszy, która powoduje szybki ruch mózgu w czaszce, powodując łagodne urazowe uszkodzenie...

Generowanie łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu z zamkniętą głową w modelu mysim

Zmodyfikowana technika obniżania wagi jest łatwą, opłacalną procedurą stosowaną do indukcji łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u młodych szczurów. Ta nowatorska technika daje klinicznie istotne symptomy, które posuną naprzód badania nad łagodnym urazowym uszkodzeniem mózgu (mTBI) i wstrząśnieniem mózgu.

Nowy model łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u młodych szczurów

Ten artykuł opisuje nowy model pierwotnego uszkodzenia mózgu spowodowanego wybuchem. Rurka uderzeniowa napędzana sprężonym powietrzem służy do wystawiania in vitro mysich kultur hipokampa na pojedynczą falę uderzeniową. Jest to prosty i szybki protokół generujący powtarzalne uszkodzenie tkanki mózgowej o wysokiej przepustowości.

Nowatorski model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu

Tutaj opisujemy protokół indukcji mysiego urazowego uszkodzenia mózgu poprzez kontrolowane uderzenie w korę mózgową z otwartą głową.

Mysi model kontrolowanego wpływu na korę mózgową w celu indukcji urazowego uszkodzenia mózgu

Protokół opisuje łagodne urazowe uszkodzenie mózgu w modelu mysim. W szczególności w pełni wyjaśniony jest protokół krok po kroku mający na celu wywołanie łagodnego urazu głowy w linii środkowej oraz charakterystyka modelu zwierzęcego.

Elektromagnetycznie sterowany model zamkniętej głowy łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u myszy

Tutaj pokazano, jak model urazu głowy w stanie czuwania może być wykorzystany do zbadania wpływu powtarzających się łagodnych urazów mózgu (r-mTBI) na plastyczność synaptyczną w hipokampie. Model replikuje ważne cechy r-mTBI u pacjentów i jest stosowany w połączeniu z elektrofizjologią in vitro.

Ocena zmian plastyczności synaptycznej przy użyciu modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu w stanie czuwania

Tutaj prezentujemy model szczura z zamkniętą głową z łagodnym urazowym uszkodzeniem mózgu (mTBI) i jego walidację, wykazując niezwykłe podobieństwo do ludzkiego mTBI pod względem objawów behawioralnych podczas ostrych i podostrych etapów.

Szczurzy model łagodnego urazu urazowego z zamkniętą głową i jego walidacja

Ten protokół przedstawia zmodyfikowany mysi model powtarzalnego łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu (rmTBI) wywołanego metodą zamkniętego urazu głowy (CHI). Podejście to obejmuje cieńsze okienko czaszki i płynną stymulację w celu zmniejszenia stanu zapalnego często spowodowanego ekspozycją opon mózgowych, a także lepszą odtwarzalność i dokładność w modelowaniu rmTBI u gryzoni.

Zmodyfikowany mysi model powtarzającego się łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu z przerzedzonym okienkiem czaszki i płynną stymulacją

Przedstawione tutaj są metody wytwarzania powtarzających się ekspozycji na wybuchy o niskiej intensywności przy użyciu myszy.

Modelowanie wysoce powtarzalnej ekspozycji na podmuch o niskim poziomie u myszy

Protokół ten opisuje niestandardowy system powietrza nadciśnieniowego przeznaczony do wywoływania uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) układu zamkniętego (OUN) u myszy, w tym urazów oczu, mózgu i rdzenia kręgowego. Celem tego protokołu jest zapewnienie naukowcom ram do łatwego dostosowywania i rozszerzania systemu do ich unikalnych badań nad urazami OUN.

System do leczenia ogniskowych, zamkniętych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego

Poznaj model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do badania łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni. Ta metoda pozwala ocenić zmiany behawioralne i fizjologiczne po TBI.

Model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni

Przeglądaj więcej filmów