Name: Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Poznaj metodę tworzenia siatkowych tkankowych struktur sercowych z ludzkich komórek iPS do regeneracji mięśnia sercowego. Technika ta umożliwia odbudowę funkcji serca w modelu zawału u szczura.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była finansowana przez Kosair Charities Pediatric Heart Research Program na Uniwersytecie w Louisville oraz Organoid Project w RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. Wirusy HiPSC użyte w naszych opublikowanych protokołach zostały dostarczone przez Centrum Badań i Zastosowań Komórek iPS na Uniwersytecie w Kioto w Kioto w Japonii.

1. Utrzymanie hiPSC i różnicowanie układu sercowo-naczyniowego
<ol>
	<li>Rozszerzanie i utrzymywanie hiPSC na cienkowarstwowej matrycy błony podstawnej (zredukowany czynnik wzrostu, rozcieńczenie 1:60) w kondycjonowanym podłożu wyekstrahowanym z mysich fibroblastów embrionalnych (MEF-CM) z ludzkim podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (hbFGF)4. 
	UWAGA: Użyliśmy linii hiPSC (4-czynnikowej (Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-Myc): 201B6). Dodaj hbFGF w odpowiednim stężeniu dla każdej linii komórkowej. Fragment Lamininy-511 może być również stosowany do powlekania naczynia hodowlanego zamiast macierzy błony podstawnej. Dostępna na rynku pożywka przeznaczona do hodowli hiPSC bez karmienia może być stosowana jako substytut MEF-CM.</li>
	<li>Użyj Versene (0,48 mM roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)) do odłączenia i dysocjacji komórek, gdy zbieg komórek osiągnie 90\u2012100%. 
	UWAGA: Można również stosować inne dostępne na rynku produkty do dysocjacji komórek.</li>
	<li>Płytki komórkowe o gęstości 10 000 komórek/mm2 na pokrytych matrycą płytkach do hodowli komórkowych w MEF-CM z hbFGF i hodowla przez dwa do trzech dni.</li>
	<li>Gdy hodowla stanie się w pełni zlewająca, przykryj komórki matrycą (rozcieńczenie 1:60 z MEF-CM) na jeden dzień.</li>
	<li>Wymień MEF-CM na RPMI 1640 + B27 medium. Dodaj 100 ng/ml aktywiny A i 100 ng/ml Wnt3A do pożywki na jeden dzień. 
	UWAGA: To jest dzień 0 różnicowania. Aby zwiększyć kanoniczną sygnalizację Wnt, zamiast Wnt3A można również stosować inhibitory GSK3β.</li>
	<li>W 1. dniu różnicowania zmień pożywkę na nową RPMI 1640 + B27 z 10 ng/ml BMP4 i 10 ng/ml hbFGF. Hodowla komórek przez dwa (protokół MC) lub cztery (protokół CM+EC) dni bez zmiany pożywki5. 
	UWAGA: Protokół CM+EC jest zoptymalizowany pod kątem jednoczesnej indukcji kardiomiocytów (CM) i komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC). Protokół MC jest zoptymalizowany pod kątem preferencyjnej indukcji komórek ściennych naczyń krwionośnych (MC).</li>
	<li>Protokół CM+EC do indukcji CM i EC (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Zastąp pożywkę w 5 dniu różnicowania RPMI 1640 + B27 uzupełnioną 50 ng/ml VEGF165.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę co 48 godzin do 13. dnia różnicowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół MC do indukcji komórek ściany naczyniowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B)
	<ol>
		<li>Zastąp pożywkę RPMI1640 + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w 3. dniu różnicowania.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę co 48 godzin do 13. dnia różnicowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie komórek i analiza linii w dniu różnicowania 13\u201215
<ol>
	<li>Umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Ca2+ i Mg2+ (PBS).</li>
	<li>Dodać roztwór do dysocjacji komórek (zawierający proteazy, kolagenazy i DNAzy) do naczynia do hodowli komórkowych, aby przykryć płytkę. Inkubować płytkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji zebrać i zdysocjować komórki za pomocą pożywki hodowlanej za pomocą pipety.</li>
	<li>Przydziel 1 x 106 komórek do analizy linii za pomocą cytometrii przepływowej. Aby wyeliminować martwe komórki, zabarwić je możliwym do naprawienia barwnikiem żywotności.</li>
	<li>Wybarwić komórki markerami powierzchni błony w PBS za pomocą 5% FBS. Stosować następujące rozcieńczenia przeciwciała w buforze barwiącym do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS): anty-PDGFRβ (1:100), kadheryna anty-VE (1:100), anty-TRA-1-60 (1:20).</li>
	<li>W przypadku białek wewnątrzkomórkowych należy ponownie zawiesić i utrwalić komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS.</li>
	<li>Wybarwić komórki antysercową izoformą troponiny T (cTnT) w PBS z 5% FBS i 0,75% saponiny, a następnie oznaczyć przeciwciało cTnT 488 mysią IgG1 (rozcieńczenie 1:50).</li>
	<li>Ponownie zawiesić wybarwione komórki w PBS z 5% FBS i umieścić je w probówkach FACS z sitkiem do komórek.</li>
	<li>Analizuj skład komórkowy barwionych komórek z każdego protokołu różnicowania za pomocą cytometrii przepływowej, aby ułatwić generowanie zawiesin komórkowych o zdefiniowanym rozkładzie linii. 
	UWAGA: Podczas wykonywania tej procedury pozostała zawiesina komórek dla ECT jest przechowywana w lodówce o temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Produkcja formy tkankowej PDMS
<ol>
	<li>Odlać warstwę polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 0,5 mm i ponad 30 mm x 30 mm, mieszając prepolimer i roztwór sieciujący w stosunku 10:1, a następnie utwardzając w temperaturze 80 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Wytnij arkusz PDMS i połącz go klejem silikonowym, aby wytworzyć prostokątną tacę o wymiarach 21 mm x 20,5 mm z prostokątnymi słupkami o długości 7 mm, szerokości 0,5 mm i wysokości 2,5 mm w pozycji naprzemiennej. Poziomy odstęp między dwoma liniami słupków wynosi 2,5 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Autoklawować tackę w temperaturze 120 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Pokryj tackę 1% poloksamem 407 w PBS przez 1 godzinę. Przed użyciem wypłucz poloksamer 407 i wystarczająco wypłucz formę PBS.</li>
</ol>
4. Konstrukcja ECT
<ol>
	<li>Po analizie linii komórkowej połącz komórki z protokołów CM+EC i MC tak, aby końcowe stężenie MC wynosiło od 10 do 20% w całkowitej liczbie komórek wynoszącej sześć milionów komórek na konstrukt5.</li>
	<li>Zawiesić wymieszane sześć milionów komórek w pożywce hodowlanej ECT (minimalna niezbędna pożywka alfa uzupełniona 10% FBS, 50 μM 2-merkaptoetanolem i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny).</li>
	<li>Przygotowanie roztworu matrycowego
	<ol>
		<li>Wymieszaj 133 μl rozpuszczalnego w kwasach roztworu kolagenu typu I z ogona szczura (2 mg/ml, pH 3) z 17 μl 10 razy minimalnej pożywki (MEM). Następnie wymieszać roztwór z 17 μl buforu alkalicznego (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES i 0,1 M NaOH). 
		UWAGA: Kolagen należy przechowywać na lodzie (4 °C). Sprawdź kolor buforu i jeśli podłoże nie stanie się różowawe po zmieszaniu wszystkich roztworów, dodaj dodatkowy bufor alkaliczny do podłoża. Etapy mieszania muszą polegać na wymieszaniu kolagenu I + 10x MEM, a następnie dodać bufor alkaliczny. NIE zmieniaj tej kolejności. NIE generuj bąbelków w mieszance.</li>
		<li>Dodać 67 μl macierzy błony podstawnej do zneutralizowanego roztworu kolagenu. 
		UWAGA: Wymieszany roztwór należy przechowywać na lodzie (4 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować przygotowaną zawiesinę komórkową zawierającą sześć milionów komórek z prędkością 1 100 obr./min (240 x g) przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki 167 μl DMEM o wysokiej zawartości glukozy + 20% FBS + 1% penicyliny-streptomycyny (100x).</li>
	<li>Wymieszać zawiesinę komórkową i roztwór matrycy. Całkowita objętość mieszaniny komórka/matryca dla jednego konstruktu wynosi 400 μL. 
	UWAGA: Na tym etapie mieszanina komórka/matryca powinna być nielepka i mieć różowawy kolor. Trzymaj go na lodzie, ponieważ żel zestala się w temperaturze pokojowej. Końcowe stężenie kolagenu typu I wynosi 0,67 mg/ml.</li>
	<li>Mieszaninę komórka/matryca wylać równomiernie na formę tkankową PDMS pokrytą poloksamerem 407, którą umieszcza się na sześciodołkowej płytce hodowlanej12. 
	UWAGA: Mieszaninę nalewać ostrożnie, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, aby zapobiec defektom wypełnienia w nalewanym żelu.</li>
	<li>Mieszaninę komórka/matryca inkubować w standardowym inkubatorze CO2 (37 °C, 5 % CO2 ) przez 60 minut.</li>
	<li>Po uformowaniu tkanki namocz formę tkankową w 4 ml pożywki hodowlanej ECT. 
	UWAGA: Chociaż komórka/matryca jest usieciowana w ciągu 60 minut, konstrukcja jest nadal bardzo delikatna. Delikatnie dodaj podłoże, aby go nie uszkodzić.</li>
	<li>Hoduj tkankę przez 14 dni z pożywką codziennie zmieniaj.</li>
	<li>Przed implantacją ECT należy delikatnie usunąć ECT ze słupków załadowczych za pomocą wysterylizowanych drobnych kleszczy. 
	UWAGA: Końcowe wymiary ECT po wyjęciu z formy są mniejsze niż oryginalna forma. Forma o wymiarach 2,1 cm x 2,05 cm generuje uwolniony ECT o wymiarach około 1,5 cm x 1,5 cm. Większa forma o wymiarach 3,9 cm x 4,05 cm generuje ECT o wymiarach około 3 cm x 3 cm. Nienaładowane elektrowstrząsy wykazują wewnętrzne spontaniczne dudnienie w ciepłym pożywce hodowlanej. Chociaż początkowo zachowuje strukturę siatki, nieobciążony ECT z czasem kurczy się i kondensuje. Możliwe jest delikatne przytrzymanie tkanki za pomocą cienkich kleszczy, a następnie użycie jedwabnego szwu 7-0 do przymocowania ECT do nasierdzia.</li>
</ol>

<ol><li>Sanganalmath, S. K., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+heart+failure%3A+A+comprehensive+overview+of+experimental+and+clinical+studies%2C+current+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions.</a> Circulation Research. 113, 810-834 (2013).</li>
<li>Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-Analysis+of+Cell+Therapy+Trials+for+Patients+With+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure.</a> Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).</li>
<li>Menasché, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+for+severe+heart+failure+treatment%3A+first+clinical+case+report%3A+Figure+1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1.</a> European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-engineered+cardiac+tissue+sheets+with+cardiomyocytes+and+vascular+cells+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration.</a> Scientific Reports. 4, 6716(2014).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myocardial+regenerative+potential+of+three-dimensional+engineered+cardiac+tissues+composed+of+multiple+human+iPS+cell-derived+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages.</a> Scientific Reports. 6, 29933(2016).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Fujimoto, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+fetal+cardiac+graft+preserves+its+cardiomyocyte+proliferation+within+postinfarcted+myocardium+and+sustains+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function.</a> Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).</li>
<li>Lancaster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+treatment+for+heart+failure%3A+cell-based+therapy+with+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Vessel+Plus%22%5BJournal%5D)">Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue.</a> Vessel Plus. 2019, (2019).</li>
<li>Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+hydrogel+molding+to+control+the+3D+geometry+of+bioartificial+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues.</a> Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).</li>
<li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+differentiate+to+cardiomyocytes+and+form+biosynthetic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues.</a> PloS one. 8, 65963(2013).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Cell+Composition+and+Geometry+on+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Engineered+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue.</a> Scientific Reports. 7, 45641(2017).</li>
<li>Kowalski, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Cardiomyocyte+Alignment+from+Three-Dimensional+%283D%29+Confocal+Microscopy+of+Engineered+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue.</a> Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów finansowych ani naukowych.

Po zakończeniu naszych badań nad formatem liniowym, ECT5 pochodzącym z hiPSC, dostosowaliśmy protokół do mieszania CM, EC i MC pochodzących z hiPSC, aby ułatwić ekspansję in vitro komórek naczyniowych w ECT, a następnie sprzężenie naczyniowe in vivo między ECT a mięśniem sercowym biorcy.
Aby ułatwić generowanie większych, wszczepialnych geometrii ECT siatki, użyliśmy cienkich arkuszy PDMS do zaprojektowania form 3D ze słupkami załadowczymi ustawionymi w pozycji naprzemi...

Liczne badania przedkliniczne i próby kliniczne potwierdziły skuteczność komórkowych terapii regeneracyjnych serca w przypadku niewydolności serca1,2,3. Wśród różnych typów komórek, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są obiecującym źródłem komórek ze względu na ich zdolność do proliferacji, potencjał do generowania różnych linii sercowo-naczyniowych4,5 i allogeniczność. Ponadto technologie inżynierii tkankowej umożliwiły przeniesienie milionów komórek do uszkodzonego serca5,6,7,8.
Poprzednio informowaliśmy o generowaniu trójwymiarowych (3D) liniowo modyfikowanych tkanek serca (ECT) z linii sercowo-naczyniowych pochodzących od hiPSC, przy użyciu komercyjnie dostępnego systemu hodowli dla biosztucznych tkanek 3D5,7. Stwierdziliśmy, że współistnienie komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i komórek ściennych z kardiomiocytami w obrębie ECT ułatwiało strukturalne i elektrofizjologiczne dojrzewanie tkanek. Ponadto zweryfikowaliśmy potencjał terapeutyczny wszczepionych hiPSC-ECT w immunologicznym modelu zawału mięśnia sercowego szczura w celu poprawy funkcji serca, regeneracji mięśnia sercowego i zwiększenia angiogenezy5. Jednak liniowe ECT skonstruowane tą metodą miały cylindry o wymiarach 1 mm na 10 mm i dlatego nie nadawały się do implantacji w badaniach przedklinicznych z udziałem większych zwierząt lub do użytku klinicznego.
Na podstawie udanego wykorzystania form tkankowych do generowania porowatych formacji tkanek przy użyciu mioblastów szkieletowych i kardiomiocytów szczurów9, ludzkie kardiomiocyty pochodzące z ESC10 i mysie iPSCs11, opracowaliśmy protokół do generowania skalowalnej większej tkanki implantalnej pochodzącej z hiPSC przy użyciu form polidimetylosiloksanu (PDMS). Oceniliśmy szereg geometrii formy, aby określić najbardziej efektywne charakterystyki formy. ECT w kształcie siatki z wieloma wiązkami i połączeniami wykazywały doskonałe cechy w zakresie żywotności komórek, funkcji tkanek i skalowalności w porównaniu z formatami zwykłymi arkuszami lub liniowymi, które nie miały porów ani połączeń. Wszczepiliśmy elektrowstrząs w kształcie siatki do modelu zawału mięśnia sercowego u szczura i potwierdziliśmy jego efekty terapeutyczne podobne do wszczepionych cylindrycznych ECT12. W tym miejscu opisujemy protokół generowania elektrowstrząsu w kształcie siatki pochodzącego z hiPSC.

<table><tbody><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli komórkowych 100x20 mm styl</td><td>Falcon/ Thomas scientific</td><td>9380C51</td><td></td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych 6well 50/CS</td><td>Falcon / Thomas scientific</td><td>6902A01</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM-105</td><td></td></tr><tr><td>BMP4, rekombinowany (10&mikro; g)</td> <td>R& D</td><td>RSD-314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen, roztwór typu I z ogona szczura</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel o obniżonym czynniku wzrostu</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki VEGF (165) IS, klasa premium</td><td>Miltenyi</td><td>130-109-385</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0,2 i mikro; m filtrowane (10% roztwór w wodzie)</td> <td>Sondy molekularne</td><td>P-6866</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki bFGF</td><td>WAKO</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana aktywina ludzka/mysz/szczura (50&mikro; g)</td> <td>R& D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>rh Wnt-3a (10&mikro; g)</td> <td>R& D</td><td>5036-WN</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Versene</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana i suplementy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11430</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptro Etanol</td><td>SIGMA</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement minus insulina</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>A1895601</tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza</td><td>Gibco</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (500 ml)</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (500 ml)</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (5000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 podłoże</td><td>Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11900024</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cytometria przepływowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60, FITC, klon: TRA-1-60, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560380</td><td></td></tr><tr><td>anty-troponina T, izoforma serca Ab-1, klon: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision</td><td>Fisher</td><td>MS-295-P0</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Clean Roztwór</td><td>BD</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSPodcień pochewki dolnej</td><td>BD</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSRinse Roztwór</td><td>BD</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówka Falcon z nasadką sitka komórkowego (opakowanie 500 szt.)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (500ml)</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do barwienia martwych komórek Aqua do wzbudzenia 405 nm</td><td>Sondy molekularne</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRb; anty-CD140b, R-PE, Klon: 28D4, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>558821</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47306-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>VEcad-FITC; anty-CD144, FITC, Klon: 55-7H1, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 488 Mysz IgG1 Zestaw do etykietowania</td><td>sond molekularnych</td><td>Z25002</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek ips do naprawy mięśnia sercowego in vivo

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Obecny protokół opisuje metody generowania skalowalnych, siatkowych tkanek serca (ECT) składających się z komórek sercowo-naczyniowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), które są rozwijane w celu zastosowania klinicznego. Kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki ścienne naczyń krwionośnych pochodzące z HiPSC miesza się z matrycą żelową, a następnie wlewa się do formy tkankowej z polidimetylosiloksanu (PDMS) z prostokątnymi wewnętrznymi schodkowymi słupkami. Do 14 dnia hodowli ECT dojrzewają do struktury siatki o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm z wiązkami włókien mięśniowych o średnicy 0,5 mm. Kardiomiocyty ustawiają się w linii długiej każdej wiązki i spontanicznie biją synchronicznie. Podejście to można przeskalować do większej siatki (3,0 cm x 3,0 cm) ECT przy zachowaniu dojrzałości i funkcji konstrukcji. W związku z tym ECT w kształcie siatki generowane z komórek serca pochodzących z hiPSC mogą być wykonalne dla paradygmatów regeneracji serca.

Rycina 1A,B przedstawia schematy protokołów CM+EC oraz MC. Po indukcji CM i EC zgodnie z protokołem CM+EC oraz MC zgodnie z protokołem MC, komórki są mieszane z taką regulacją końcowych stężeń MC, aby stanowiły one od 10 do 20% wszystkich komórek. Formę tkankową o szerokości 2 cm wykonano zgodnie z rysunkiem technicznym z arkusza PDMS o grubości 0,5 mm (Rycina 2A,B). Sześć milionów komórek CM+EC+MC połączono z kolagenem I i maci...

Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Protokół ten opisuje szlachetną i łatwą metodę tworzenia inżynieryjnych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich części ciała i komórek serca pochodzących z komórek STEM. Elastyczność geometrii tkanki i skalowalność zachowanej funkcji tkanki to główne zalety tej techniki. Wszczepione ECT w kształcie siatki mogą przywrócić strukturę i funkcję serca w modelu zawału mięśnia sercowego u szczurów.Potwierdzenie jego możliwości zastosowania w terapii regeneracyjnej serca. Techniki te wymagają powtarzalnego przetwarzania ludzkich komórek macierzystych i umiejętności hodowli tkankowej w celu uzyskania spójnych wyników. Zacznij od przycięcia utwardzonego arkusza PDMS do odpowiedniego rozmiaru, aby umożliwić połączenie arkusza za pomocą kleju silikonowego w celu wytworzenia prostokątnej tacy o wymiarach 21 na 20,5 milimetra z prostokątnymi słupkami o długości siedmiu milimetrów, szerokości 0,5 milimetra i wysokości 2,5 milimetra w naprzemiennych pozycjach.Poziomy odstęp między dwiema liniami słupków powinien wynosić 2,5 milimetra. Tackę należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 20 minut, a następnie pokryć formę 1% Poloxamerem 407 w PBS przez godzinę. Następnie dokładnie przepłucz formę PBS i umieść formę w jednym dołku sześciodołkowej płytki.W celu analizy linii połącz komórki z kardiomiocytów oraz protokoły komórek śródbłonka i naczyń krwionośnych. Tak więc końcowe stężenie komórek ściennych wynosi od 10 do 20% w całkowitej liczbie komórek sześć razy 10 do sześciu komórek na konstrukt. Wymieszaj 133 mikrolitry rozpuszczalnego w kwasie roztworu kolagenu typu pierwszego ze szczurzego ogona i 17 mikrolitrów buforu alkalicznego z 17 mikrolitrami 10X Minimum Essential Medium na lodzie.Następnie dodaj 67 mikrolitrów Basement Membrane Matrix do roztworu kolagenu. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 167 mikrolitrach pożywki Dulbecco Minimal Essential Medium o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami. Wymieszaj komórki na roztworze matrycowym z lodem.Następnie ostrożnie wlać 400 mikrolitrów zawiesiny macierzy komórkowej na formę tkankową PDMS pokrytą poloksamerem 407. Mieszaninę macierzy komórkowej inkubować w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 60 minut. Gdy tkanka się uformuje, ostrożnie namocz formę czterema mililitrami pożywki hodowlanej ECT i włóż płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych na 14 dni.Przed implantacją elektrowstrząsów wysterylizowałeś cienkie kleszcze, aby ostrożnie usunąć elektrowstrząsy ze słupków załadunkowych. Formy tkankowe mogą być wytwarzane z różnymi wzorami, długościami słupków i odstępami między słupkami, aby wygenerować różne końcowe geometrie ECT. Do tej analizy użyto formy z siedmiomilimetrowymi słupkami o szerokości 2,5 milimetra.Poloxamer 407 zapobiega przywieraniu komórek do formy i umożliwia wytworzenie charakterystycznej struktury siatki, po szybkim zagęszczeniu żelu w ciągu 14 dni. Struktura jest zachowana nawet po uwolnieniu ECT z formy. Sfabrykowana tkanka ma około 1,5 centymetra szerokości i 0,5 milimetra grubości.A szerokość każdej wiązki w siatce wynosi średnio około 0,5 milimetra. Możliwe jest wygenerowanie siatki ECT o końcowej szerokości 3 centymetrów zawierającej 24 miliony komórek z czterokrotnie większej formy o tej samej konstrukcji słupka naprzemiennego. Ten ECT o większej siatce można również łatwo usunąć z formy i generuje lokalny akt siły równoważny ECT z mniejszą siatką.Ważne jest, aby równomiernie wlać mieszaninę macierzy komórkowej do formy tkankowej bez generowania pęcherzyków, aby zapobiec odczuwaniu defektów w końcowym żelu. Charakterystyka funkcjonalna wykonawcy. a relacje czwartej częstotliwości mogą być realizowane za pomocą wbudowanych systemów.Naszym ostatecznym celem jest przełożenie paradygmatów ECT na terapie kliniczne, które wykorzystują badania przedkliniczne na dużych zwierzętach.

preparation-mesh-shaped-engineered-cardiac-tissues-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu macierzy z tkanki decelularyzowanej oraz jego wstrzykiwania do mięśnia sercowego szczura in vivo.

Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Ten protokół opisuje metodę opartą na pleśni sieciowej do tworzenia trójwymiarowych, wolnych od rusztowań tkanek serca o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia.

Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

Tutaj prezentujemy protokół indukcji kriouszkodzenia lewej komory, po którym następuje wszczepienie łaty mięśnia sercowego, pochodzącej z ludzkich kardiomiocytów komórek iPS w modelu świnki morskiej.

Implantacja plastrów sercowo-mięśniowych pochodzących z hiPSC po urazie mięśnia sercowego w modelu świnki morskiej

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Prezentowany tutaj jest zestaw protokołów do generowania i kriokonserwacji sferoid serca (CS) z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, hodowanych w wysokoprzepustowym, wielowymiarowym formacie. Ten trójwymiarowy model funkcjonuje jako solidna platforma do modelowania chorób, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i zachowuje swoją funkcjonalność po krioprezerwacji.

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj metodę tworzenia siatkowych tkankowych struktur sercowych z ludzkich komórek iPS do regeneracji mięśnia sercowego. Technika ta umożliwia odbudowę funkcji serca w modelu zawału u szczura.

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

Przeglądaj więcej filmów