Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo
9 czerwca 2020
Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.
Protokół ten opisuje szlachetną i łatwą metodę tworzenia inżynieryjnych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich części ciała i komórek serca pochodzących z komórek STEM. Elastyczność geometrii tkanki i skalowalność zachowanej funkcji tkanki to główne zalety tej techniki. Wszczepione ECT w kształcie siatki mogą przywrócić strukturę i funkcję serca w modelu zawału mięśnia sercowego u szczurów.
Potwierdzenie jego możliwości zastosowania w terapii regeneracyjnej serca. Techniki te wymagają powtarzalnego przetwarzania ludzkich komórek macierzystych i umiejętności hodowli tkankowej w celu uzyskania spójnych wyników. Zacznij od przycięcia utwardzonego arkusza PDMS do odpowiedniego rozmiaru, aby umożliwić połączenie arkusza za pomocą kleju silikonowego w celu wytworzenia prostokątnej tacy o wymiarach 21 na 20,5 milimetra z prostokątnymi słupkami o długości siedmiu milimetrów, szerokości 0,5 milimetra i wysokości 2,5 milimetra w naprzemiennych pozycjach.
Poziomy odstęp między dwiema liniami słupków powinien wynosić 2,5 milimetra. Tackę należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 20 minut, a następnie pokryć formę 1% Poloxamerem 407 w PBS przez godzinę. Następnie dokładnie przepłucz formę PBS i umieść formę w jednym dołku sześciodołkowej płytki.
W celu analizy linii połącz komórki z kardiomiocytów oraz protokoły komórek śródbłonka i naczyń krwionośnych. Tak więc końcowe stężenie komórek ściennych wynosi od 10 do 20% w całkowitej liczbie komórek sześć razy 10 do sześciu komórek na konstrukt. Wymieszaj 133 mikrolitry rozpuszczalnego w kwasie roztworu kolagenu typu pierwszego ze szczurzego ogona i 17 mikrolitrów buforu alkalicznego z 17 mikrolitrami 10X Minimum Essential Medium na lodzie.
Następnie dodaj 67 mikrolitrów Basement Membrane Matrix do roztworu kolagenu. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 167 mikrolitrach pożywki Dulbecco Minimal Essential Medium o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami. Wymieszaj komórki na roztworze matrycowym z lodem.
Następnie ostrożnie wlać 400 mikrolitrów zawiesiny macierzy komórkowej na formę tkankową PDMS pokrytą poloksamerem 407. Mieszaninę macierzy komórkowej inkubować w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 60 minut. Gdy tkanka się uformuje, ostrożnie namocz formę czterema mililitrami pożywki hodowlanej ECT i włóż płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych na 14 dni.
Przed implantacją elektrowstrząsów wysterylizowałeś cienkie kleszcze, aby ostrożnie usunąć elektrowstrząsy ze słupków załadunkowych. Formy tkankowe mogą być wytwarzane z różnymi wzorami, długościami słupków i odstępami między słupkami, aby wygenerować różne końcowe geometrie ECT. Do tej analizy użyto formy z siedmiomilimetrowymi słupkami o szerokości 2,5 milimetra.
Poloxamer 407 zapobiega przywieraniu komórek do formy i umożliwia wytworzenie charakterystycznej struktury siatki, po szybkim zagęszczeniu żelu w ciągu 14 dni. Struktura jest zachowana nawet po uwolnieniu ECT z formy. Sfabrykowana tkanka ma około 1,5 centymetra szerokości i 0,5 milimetra grubości.
A szerokość każdej wiązki w siatce wynosi średnio około 0,5 milimetra. Możliwe jest wygenerowanie siatki ECT o końcowej szerokości 3 centymetrów zawierającej 24 miliony komórek z czterokrotnie większej formy o tej samej konstrukcji słupka naprzemiennego. Ten ECT o większej siatce można również łatwo usunąć z formy i generuje lokalny akt siły równoważny ECT z mniejszą siatką.
Ważne jest, aby równomiernie wlać mieszaninę macierzy komórkowej do formy tkankowej bez generowania pęcherzyków, aby zapobiec odczuwaniu defektów w końcowym żelu. Charakterystyka funkcjonalna wykonawcy. a relacje czwartej częstotliwości mogą być realizowane za pomocą wbudowanych systemów.
Naszym ostatecznym celem jest przełożenie paradygmatów ECT na terapie kliniczne, które wykorzystują badania przedkliniczne na dużych zwierzętach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje nową i prostą metodę tworzenia inżynieryjnych tkanek serca o strukturze siatki, pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Technika ta umożliwia badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca, w szczególności w ratym modelu zawału mięśnia sercowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkanki serca
- Terapia komórkami macierzystymi
- Medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Sztucznie wytworzone tkanki serca mogą przywrócić strukturę i funkcję serca.
- Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste stanowią cenny zasób do pozyskiwania komórek serca.
- Elastyczność geometrii tkanki jest kluczowa dla skutecznej implantacji.
- Powtarzalność procesów przetwarzania komórek macierzystych jest niezbędna dla uzyskania spójnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia inżynieryjnych tkanek serca w formie siatki.
- Ocena przydatności tych tkanek w terapii regeneracyjnej serca.
- Zbadanie przywrócenia funkcji serca po implantacji.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie prostokątnej tacki z wykorzystaniem PDMS i kleju silikonowego.
- Tworzenie słupków do podtrzymywania inżynieryjnie hodowanych tkanek.
- Implantacja inżynieryjnie hodowanych tkanek serca w modelu szczura.
- Ocena przywrócenia struktury i funkcji serca.
Główne wyniki
- Siatkowate, inżynieryjne tkanki serca skutecznie przywróciły funkcje serca.
- Metoda ta wykazała skalowalność oraz elastyczność w zakresie geometrii tkanki.
- Spójne wyniki osiągnięto dzięki powtarzalnemu przetwarzaniu komórek macierzystych.
- Technika ta jest możliwa do zastosowania w regeneracyjnej terapii serca.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia niezawodną metodę tworzenia inżynierowanych tkanek serca.
- Tkanki o strukturze siatki mogą skutecznie przywracać funkcje serca w modelu zawału mięśnia sercowego.
- Opisane podejście daje nadzieję na przyszłe terapie regeneracyjne serca.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia skalowalną produkcję inżynieryjnych tkanek sercowych o strukturze siatki z ludzkich komórek sercowo-naczyniowych pochodzących z iPSC, oferując powtarzalną platformę dla strategii naprawy mięśnia sercowego. Podejście to wspiera przedkliniczną ocenę integracji tkanki i przywrócenia funkcji w modelach uszkodzeń niedokrwiennych, wypełniając krytyczną lukę w kardiologii regeneracyjnej. Dzięki zapewnieniu konstrukcji o regulowalnej geometrii i skalowalności, metoda ta ułatwia translacyjne ograniczanie ryzyka terapii opartych na komórkach macierzystych w leczeniu niewydolności serca.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ocenę integracji strukturalnej i funkcjonalnej pochodnych komórek sercowych z hiPSC in vivo.
- Wartość operacyjna: Zapewnia znormalizowany, powtarzalny format tkankowy, pozwalający na spójne odczyty przedkliniczne w różnych badaniach.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne parametry strukturalne (np. wyrównanie wiązek włókien mięśniowych, synchronizacja skurczu) służące do opracowywania testów funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Wspiera skalowalność do większych konstruktów (do 3,0 cm), co umożliwia badanie zależności dawka-odpowiedź oraz testowanie spójności serii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje możliwość przywrócenia struktury i funkcji serca w szczurzym modelu zawału mięśnia sercowego, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez ustandaryzowane procedury implantacji i oceny funkcjonalnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta pozycjonuje siatkowate ECT jako pomost między etapem odkryć a badaniami przedklinicznymi, umożliwiając weryfikację hipotez we wczesnej fazie odkrywania oraz walidację funkcjonalną na etapach przedklinicznych dzięki skalowalnej i powtarzalnej produkcji tkanek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez umożliwienie kontrolowanej oceny integracji oraz funkcji elektromechanicznych komórek serca pochodzących z hiPSC.
- Przesiewy: Dostarcza standaryzowane tkanki gotowe do analizy z mierzalnymi wynikami (synchronizacja uderzeń, orientacja włókien) w celu porównania związków lub warunków.
- Analityka: Zapewnia odczyty strukturalne i funkcjonalne (wymiary konstruktu, średnica miofibry, synchronizacja skurczów), umożliwiając analizę porównawczą między grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od dojrzewania in vitro do funkcjonalnej regeneracji in vivo, wspierając decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy technologię platformową adaptowalną do różnych geometrii i skal, co sprzyja powtarzalności międzyprojektowej i efektywności zasobów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w procesie engraftmentu komórek macierzystych i ich funkcjonalnego wkładu w regenerację serca.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i skalowalność dzięki określonym proporcjom komórek, formulacji macierzy oraz geometrii formy.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie powtarzalnych danych o skuteczności przedklinicznej, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do regeneracji serca z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną wydajność tkanki i skalowalność.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w różnicowaniu ludzkich iPSC, specyfikacji linii sercowo-naczyniowych oraz technikach hodowli tkankowej 3D.
- Zależne od dostępu do sprzętu do formowania z PDMS, możliwości sterylizacji oraz precyzyjnego dozowania cieczy w celu mieszania matrycy z komórkami.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie pozyskiwania komórek, przygotowania matrycy i protokołów inkubacji, aby zapewnić spójność między partiami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów przy skalowaniu do większych konstrukcji lub alternatywnych geometrii, szczególnie w odniesieniu do dyfuzji składników odżywczych i sprzężenia elektrycznego.
- Ograniczone przez obecną zależność od modeli gryzoni w celu walidacji funkcjonalnej, co wymaga zastosowania większych systemów przedklinicznych w celu translacji klinicznej.
